人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型的製作方法

2023-10-16 18:26:49 1

人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型的製作方法
【專利摘要】本發明屬於組織解剖學【技術領域】，具體涉及人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型。本發明的技術方案是人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型，採用如下方法製備得到：a、組織切片；b、染色；c、圖像採集；d、圖像配準；e、圖像二值化處理；f、三維重建可視化。本發明的模型可用於人皮膚中主要纖維成分網狀結構的3D列印、仿生材料製備、皮膚生理功能的研究等。
【專利說明】人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型
【技術領域】
[0001]本發明屬於組織解剖學【技術領域】，具體涉及人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型。
【背景技術】
[0002]醫學圖像三維重建技術是計算機圖形學和圖像處理在生物醫學工程中的重要應用。在醫學診斷學領域，計算機斷層掃描(CO、核磁共振成像(MRI)等對人體組織器官進行三維重建後，可以呈現給醫生立體直觀的3D影像，便於醫生診斷病情，確定治療方案；在生物醫學領域，各種新型三維重建技術和儀器不斷湧現，如微計算機斷層掃描技術(Micro-CT)、雷射掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)等。
[0003]但是，目前的三維重建技術有諸多不足:首先，對軟組織三維重建能力較差。皮膚中膠原纖維、彈性纖維難以成像；其次，CT、MRI解析度較低。如計算機斷層掃描(CT)空間解析度為約400微米，因此難以辨認微觀組織結構；雷射掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)雖有較高解析度(小於I微米)，但是存在螢光標記不均勻等問題。
[0004]皮膚是保護機體的重要的天然屏障，也是人體最大的器官。組織工程皮膚是體表皮膚缺損(燒傷、整形、美容)最理想的替代物之一。
[0005]目前組織工程皮膚支架根據有無細胞分類可分為含細胞支架和無細胞支架；根據支架層次分類分為單層支架和雙層支架；根據原材料分類可分為天然材料支架和人工合成材料支架。天然材料支架是指以自然界中存在的(植物或者動物來源)蛋白質類、多聚糖等天然材料構建的支架。其中蛋白質包括膠原、纖連蛋白等，多聚糖類包括(藻朊酸鹽、粘多糖、殼聚糖、透明質酸、硫酸軟骨素、明膠等。如殼聚糖-明膠-透明質酸(Cs-Gel-HA)多孔支架、戊二醛交聯的殼聚糖/膠原支架等。人工合成材料支架主要包括羥基乙酸衍生物、乳酸衍生物以及其他的聚酯纖維衍生物。目前報導的有乳酸-羥基乙酸-膠原網狀聚合物、膠原-聚己內酯的複合薄膜、聚維酮(Povidone) -多糖等。
[0006]世界上第一種商品化的人工皮膚Integra (Life Science)是一種膠原類真皮替代品。它的下層是由牛的I型膠原蛋白與6-硫酸軟骨素(GAG)複合交聯而成，呈多孔狀結構，孔徑30-120um ;上層由娃橡膠薄膜製成。另一種人工皮膚Apligraf (Organogenesis)是由牛肌腱膠原提取的膠原蛋白交聯，內含從新生兒包皮分離培養的成纖維細胞，同時表面種植上皮細胞。
[0007]然而，目前的組織工程產品尚有諸多不足，特別是仿生程度不高(皮膚支架纖維是隨機分布的，與人體生理結構不同)，導致效果不盡人意。
[0008]2013年4月，第六屆全國組織工程與再生醫學大會(西安)中，曾有專家提出，材料學家難以製造高度仿生的生物支架，是因為解剖學家不能提供詳盡的結構數據。令人遺憾的是，人皮膚中主要纖維(膠原纖維、彈性纖維)的空間分布的三維圖尚未見報導。

【發明內容】
[0009]本發明要解決的技術問題是為人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型的建立提供一種新選擇。
[0010]本發明的技術方案是人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型，採用如下方法製備得到:
[0011]a、組織切片:取新鮮屍體大腿內側全層皮膚，固定液固定，石蠟包埋，切片；
[0012]b、染色:對步驟a中所得到的組織切片進行醛品紅染色法染色；
[0013]C、圖像採集:利用全景掃描顯微鏡掃描步驟b得到切片，獲得切片全景圖；
[0014]d、圖像配準:從步驟c的全景圖片中選取連續且包含同一個毛囊的圖片，截取每張圖片中的該毛囊區域為ROKRegion of Interest，即圖片中需要處理的區域)，以該毛囊為配準標誌以該毛囊為配準標誌，利用Adobe PhotoshopCS5軟體或者PhotoLinel8.01軟體進行手工配準；
[0015]e、圖像二值化處理:對步驟d中配準後的圖像進行圖像分割，分割出膠原纖維、彈性纖維的區域，利用 Matlab7.10.0 軟體、Microsoft Visual Studio2008、MicrosoftVisual C++6.0、dev-c++5.5.3或linux系統下的GCC軟體,分別獲得膠原纖維、彈性纖維的二值圖；
[0016]f、三維重建可視化:將步驟e得到的膠原纖維、彈性纖維的二值圖分別導入三維可視化軟體；由此可分別導出膠原纖維、彈性纖維的三維數字模型，或/和得到包含上述兩種纖維的三維數字模型。
[0017]其中，步驟a中切片200張，切片厚度為5?8μπι。小於5 μ m的切片容易損壞，難以製備；大於8 μ m的切片則會損失大量斷層信息。
[0018]具體的,步驟a中固定液為Zamboni’s固定液,其配置方法為多聚甲醒20g,飽和苦味酸 150mL,加 Karasson-Schwlt』 sPB (Karasson-Schwlt，s 憐酸鹽緩衝液)至 10OOmT,;其中 Karasson-Schwlt』 sPB 配置方法為，取 NaH2PO4.H203.31g, Na2HPO4.7H2033.77g，加雙蒸水至 1000mL。
[0019]具體的，步驟b中醛品紅染色法所需試劑包括醛品紅染液、0.5%高錳酸鉀溶液、1%草酸水溶液、50%酒精、70%酒精、95%酒精、100%酒精、1%亮綠溶液、二甲苯溶液；其中，醛品紅染色配方為:鹼性品紅0.5g，濃鹽酸lmL，三聚乙醛lmL，70%酒精100mL。
[0020]其中，步驟d中選取圖片完整，無破損，無皺褶；纖維染色清晰，與周圍對比鮮明的全景圖片。
[0021]其中，步驟f中三維可視化軟體為Materialise Mimicsl0.01軟體,Thresholds設置為 Min: 226，Max: 3056。
[0022]本發明還提供了所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型在3D列印中的用途。
[0023]本發明還提供了所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型在仿生材料製備中的用途。
[0024]優選的，所述的仿生材料製備為皮膚仿生支架的設計。
[0025]本發明還提供了所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型在皮膚生理功能研究中的用途。
[0026]具體的，所述的皮膚生理功能研究為皮膚纖維形態評估、纖維含量計算或皮膚力學特性分析。
[0027]本發明方法可以將皮膚中主要纖維成分(膠原纖維、彈性纖維)的網狀結構清晰、直觀、高解析度的展示出來，皮膚顯微結構清晰，解析度高，解析度小於I微米。所得到的模型高度仿生，纖維分布與正常人體相同。該三維模型可用於正常皮膚和疤痕組織中纖維形態評估，含量計算和其他生理功能研究。除皮膚之外，該方案可用於其它軟組織、器官的三維重建，彌補常規影像學技術對於軟組織重建的不足。該模型可以作為高仿生生物材料的模板。該三維模型有望應用於高仿生產業，製造與人體結構最相近的仿生皮膚。該模型可以直接導入3D印表機的控制系統，指導3D印表機進行列印操作。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1:新鮮屍體大腿內側全層皮膚(固定於Zamboni’s固定液中)
[0029]圖2:皮膚切片全景圖(真皮層厚度約1.46mm，膠原纖維著綠色，彈性纖維著紫色，北京優納PRECICS500)
[0030]圖3a:帶有毛囊的部分真皮區域(圖中左下角毛囊為配準標誌)
[0031]圖3b:圖像分割後，膠原纖維二值圖
[0032]圖3c:圖像分割後，彈性纖維二值圖
[0033]圖4:人皮膚纖維成分網狀結構三維可視模型(黃色代表膠原纖維模型，綠色代表彈性纖維模型)圖4a:側面圖圖4b:正面圖
[0034]圖5:人皮膚膠原纖維網狀結構三維可視模型圖5a:側面圖圖5b:正面圖
[0035]圖6:人皮膚彈性纖維網狀結構三維可視模型圖6a:側面圖圖6b:正面圖
[0036]圖7:3D印表機控制系統操作界面，左圖列印中的界面，右圖為列印完成後的界面
[0037]圖8:3D印表機列印出的膠原纖維模型圖8a:側面圖圖8b:正面圖
[0038]圖9:真皮各層中膠原纖維分布圖。真皮由淺到深，膠原纖維先增多，後減少。
[0039]圖10:真皮各層中彈性纖維分布圖。真皮由淺到深，彈性纖維先增多，後減少。
[0040]圖11:染色後切片圖像
[0041]圖12:將圖11圖像劃分為三部分。A:毛囊區B:毛囊附近C:遠離毛囊區
[0042]圖13:脫細胞真皮(ADM)內孔徑分布圖
[0043]圖14:脫細胞真皮(ADM)內孔隙壁厚度分布圖
[0044]圖15 = MicroCT掃描人脫細胞真皮(ADM)圖像比例尺:1mm
[0045]圖15A:正面圖圖15B:橫切面之一圖15C:橫切面之二
[0046]圖15D:背面圖圖15E:縱切面之一圖15F:縱切面之二
[0047]圖15G:孔徑分布圖(不同顏色代表不同孔徑大小)
[0048]圖15H:孔徑分布圖縱切面之一
[0049]圖151:孔徑分布圖縱切面之二
【具體實施方式】
[0050]圖像配準精確度直接影響到三維重建的真實性。圖像配準選取149張序號連續且包含同一個毛囊的圖片。截取每張圖片中的毛囊區域。以該毛囊為配準標誌，利用AdobePhotoshop CS5軟體進行手工配準。配準後的圖像保存為BMP格式的圖片(尺寸3140*3004，24位)。對於缺失或損壞的圖片，則複製上一張圖片來替代。也可以使用其他具有圖像旋轉、平移、透明化、填塗功能以及圖層處理功能的其他圖像處理軟體，如PhotoLinelS.0l軟體。
[0051]具體的，步驟a切片張數由切片厚度和目標模型厚度有關。如切片200張，厚度為5 μ m，則目標模型厚度為1000 μ m。
[0052]其中，步驟d中配準後的圖像保存為BMP格式的圖片，尺寸3140X3004,24位。具體的圖片格式和尺寸可選擇。其決定因素為:後期處理能力；目標模型的寬度；需包含完整的組織學結構。
[0053]其中，從步驟c的張全景圖片中選取圖片是的標準為:圖片完整，無破損，無皺褶；纖維染色清晰，與周圍對比鮮明。
[0054]其中，步驟e中圖像分割後將圖像尺寸轉換為1024X979。具體的圖片格式和尺寸可選擇。其決定因素為:後期處理能力；目標模型的寬度；需包含完整的組織學結構。
[0055]本發明所使用的新鮮屍體指的是死亡24小時內的屍體，皮膚沒有脫水，沒有壞死。
[0056]實施例1採用本發明方法獲得人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型
[0057]I)皮膚組織顯微切片:取新鮮屍體大腿內側全層皮膚(IcmXlcmXlcm，第三軍醫大學西南醫院燒傷科皮庫提供)，修剪皮膚邊緣，利用Zamboni’s固定液固定(見圖1)。將組織塊進行脫水、透明、石蠟包埋後，利用組織切片機(Leica)連續切取切片200張。每張切片間距5微米。將切片平鋪於防脫玻片(惠利試劑公司)中央，按切下的先後順序標號。
[0058]Zamboni’s固定液配方:多聚甲醒20g,飽和苦味酸150mL,力口Karasson-Schwlt，sPB 至 1000ml。其中 Karasson-Schwlt，sPB 配方:NaH2P04.H203.31g,Na2HPO4.7Η2033.77g，加雙蒸水至 1000mL。
[0059]2)膠原纖維、彈性纖維染色:對步驟I)中每張切片進行醛品紅染色法染色，膠原纖維著綠色，彈性纖維著紫色。
[0060]醛品紅染色法所需試劑:醛品紅染液、0.5%高錳酸鉀溶液、1%草酸水溶液、酒精(濃度分別為50%、70%、95%、100%)、1%亮綠溶液、二甲苯溶液。其中醛品紅染色配方為:鹼性品紅0.5g，濃鹽酸1ml，三聚乙醛lmL，70%酒精100mL。
[0061]3)切片全景圖像採集:利用全景掃描顯微鏡(優納科技UNIC Technologies Inc.賽睿PRECICS500系列全自動數字病理掃描系統物鏡40倍武警總醫院病理科)掃描步驟2)中每張切片，獲得200張切片全景圖，見圖2。
[0062]4)圖像配準:從步驟3)的200張切片全景圖中，選取149張序號連續且包含同一個毛囊的圖片。截取每張圖片中的該毛囊區域為R0I。ROI:ff=4000,H=4000,Area =1140624(μ mX μ m)0以該毛囊為配準(圖3a),利用Adobe PhotoshopCS5軟體進行手工配準。配準後的圖像保存為BMP格式的圖片(尺寸3140 X 3004，24位)。對於缺失或損壞的圖片，則複製上一張圖片來替代。
[0063]5)圖像二值化處理:對步驟4)中配準後的圖像進行圖像分割。目的是分割出膠原纖維、彈性纖維的區域。將圖像尺寸轉換為1024X979。利用Matlab7.10.0(R2010a, Mathfforks)軟體，分別獲得膠原纖維、彈性纖維的二值圖(見圖3b和3c)。
[0064]6)三維重建可視化:將步驟5)得到的膠原纖維、彈性纖維的二值圖分別導入Materialise Mimicsl0.01 軟體。Thresholds 設置為 Min: 226，Max: 3056。由此可分別導出膠原纖維、彈性纖維的三維數字模型，也可以得到包含上述兩種纖維的三維數字模型。
[0065]三維模型截圖為圖4、5、6。可見膠原纖維較粗，結構緻密；彈性纖維較細，結構疏鬆，與正常人體相同。
[0066]實施例2圖像配準
[0067]I)打開Adobe PhotoshopCS5軟體,導入I號圖片(基準圖片)。
[0068]2)導入2號圖片，設置不透明度為50%_70%。打開自由變換功能(Ctrl+T)。以I號圖片中的毛囊為配準標誌，自由變換2號切片位置，使兩張圖片達到最大程度重合。恢復2號圖片不透明度為100%。將2號圖片保存為BMP格式(Ctrl+S)。
[0069]3)導入3號圖片，依次按照上述方法操作。
[0070]按照上述操作，可以完成圖像配準。
[0071 ] 實施例33D印表機列印該三維模型的可行性測試
[0072]以膠原纖維三維可視模型為例:
[0073]1、從Materialise Mimicsl0.01軟體中導出重建好的膠原纖維三維可視模型(stl格式)。
[0074]2、將該模型導入3D印表機控制軟體(第三軍醫大學西南醫院關節外科組織工程中心Zprint450三維印表機)3D印表機控制系統操作界面見圖7。
[0075]3、利用石膏粉末為原料，開始列印操作。列印完畢。耗時52分47秒，使用16.3mL膠水。列印出來的模型約為5cmX5cmXlcm。
[0076]列印完畢，如圖8所示。缺口處為毛囊位置，可見大量孔隙結構。雖然列印原料為石膏粉，而非膠原纖維，但是該操作證實了利用3 D印表機列印該三維模型是可行的。
[0077]實施例4人皮膚真皮層中，由淺到深膠原纖維、彈性纖維分布規律分析
[0078]1、截取全景圖中真皮層區域圖片(R0I)。利用windows2007自帶的畫圖軟體,填充毛囊、汙點、汗腺等非纖維成分為白色。
[0079]2、利用Matlab7.10.0 (R2010a, Mathfforks)軟體,將真皮層平均分為10層，計算每一層中，膠原纖維像素、彈性纖維像素與該層總像素的比值，結果見表1。
[0080]3、同方法2，將真皮層平均分為100層，計算每一層中，膠原纖維像素、彈性纖維像素與該層總像素的比值，結果見圖9和圖10。
[0081]4、利用SPSS13.0軟體對數據進行數理統計分析。
[0082]表1真皮分層情況分析
[0083]
【權利要求】
1.人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型，其特徵在於:採用如下方法製備得到: a、組織切片:取新鮮屍體大腿內側全層皮膚，固定液固定，石蠟包埋，切片； b、染色:對步驟a中所得到的組織切片進行醛品紅染色法染色； C、圖像採集:利用全景掃描顯微鏡掃描步驟b得到切片，獲得切片全景圖； d、圖像配準:從步驟c的全景圖片中選取連續且包含同一個毛囊的圖片，截取每張圖片中的該毛囊區域為ROI ;以該毛囊為配準標誌，利用Adobe PhotoshopCS5軟體或PhotoLinel8.01軟體進行手工配準； e、圖像二值化處理:對步驟d中配準後的圖像進行圖像分割，分割出膠原纖維、彈性纖維的區域，利用 Matlab7.10.0 軟體、Microsoft Visual Studio2008、MicrosoftVisualC++6.0或dev_c++5.5.3、linux系統下的GCC軟體,分別獲得膠原纖維、彈性纖維的二值圖； f、三維重建可視化:將步驟e得到的膠原纖維、彈性纖維的二值圖分別導入三維可視化軟體Materialise Mimicsl0.01或Amira5.4.3軟體；由此可分別導出膠原纖維、彈性纖維的三維數字模型，或/和得到包含上述兩種纖維的三維數字模型。
2.如權利要求1所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型，其特徵在於:步驟a中切片厚度為5~8 μ m。
3.如權利要求1或2所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型，其特徵在於:步驟a中固定液為Zamboni』 s固定液,其配置方法為多聚甲醒20g,飽和苦味酸150mL,加Karasson-Schwlt』 s憐酸鹽緩衝液至10OOmT,;其中Karasson-Schwlt』 sPB配置方法為，取 NaH2PO4.Η203.31g, Na2HPO4.7Η2033.77g，加雙蒸水至 1000mL0
4.如權利要求1~3任一項所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型，其特徵在於:步驟b中醛品紅染色法所需試劑包括醛品紅染液、0.5%高錳酸鉀溶液、1%草酸水溶液、50%酒精、70%酒精、95%酒精、100%酒精、1%亮綠溶液、二甲苯溶液；其中，醛品紅染色配方為:鹼性品紅0.5g，濃鹽酸lmL，三聚乙醛lmL，70%酒精100mL。
5.如權利要求1~4任一項所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型，其特徵在於:步驟d中選取圖片完整，無破損，無皺褶；纖維染色清晰，與周圍對比鮮明的全景圖片。
6.如權利要求1~5任一項所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型，其特徵在於:步驟f中三維可視化軟體為Materialise Mimicsl0.01軟體，Thresholds設置為 Min:226, Max:3056。
7.權利要求1~6任一項所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型在3D列印中的用途。
8.權利要求1~6任一項所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型在仿生材料製備中的用途。
9.如權利要求8所述的用途，其特徵在於:所述的仿生材料製備為皮膚仿生支架的設計。
10.權利要求1~6任一項所述的人皮膚中主要纖維成分網狀結構三維可視模型在皮膚生理功能研究中的用途。
11.如權利要求10所述的用途，其特徵在於:所述的皮膚生理功能研究為皮膚纖維形態評估、纖維含量計算或皮膚力學特性分析。
【文檔編號】G06T19/00GK103761771SQ201410036372
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2014年1月24日
【發明者】王玉振, 徐瑞, 賀偉峰, 羅高興, 吳軍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院