藍舌病病毒vp7基因重組表達質粒載體、vp7表達抗原以及製備方法
2023-09-23 09:14:00 1
專利名稱：藍舌病病毒vp7基因重組表達質粒載體、vp7表達抗原以及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於製備藍舌病病毒診斷試劑的生物製劑，尤其是能夠對動物藍舌病進行檢測的生物製劑以及這種生物製劑的製備方法。
背景技術：
藍舌病(Bluetongue，BLU)是由呼腸孤病毒科環狀病毒屬的藍舌病毒(Bluetongue Virus，BTV)引起的，由庫蠓傳播的反芻動物的一種嚴重傳染病。該病1905年在南非發生以來，給世界畜牧業和國際貿易產生重大影響。國際獸疫局(OIE)確定其為動物A類傳染病。迄今共有25個血清型。其基因組含有10個分子量大小不一的雙鏈RNA片段(dsRNA)，總共由19218個bp組成。BTV的10個片段雙股RNA包裹於雙層蛋白質衣殼內，編碼7種結構蛋白(VP1~VP7)和4種非結構蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3A)，7種結構蛋白的4種形成雙層蛋白衣殼，外殼主要由VP1和VP5構成，而內殼主要由VP3和VP7構成。VP7基因為保守片段，VP7攜帶有群特異性抗原決定簇，由病毒抗原決定簇產生的抗體多數是針對VP7的。因此，在BLU的群特異性血清抗體檢測中，VP7作為首選的抗原。以群特異性抗原單克隆抗體和基因表達抗原為基礎上的競爭酶聯免疫吸附試驗(c-ELISA)，具有特異、敏感、穩定和安全的特點，試劑和試劑盒的製備和組裝簡便，易於商品化，是近年來廣泛應用的抗體檢測技術。
目前，BLU最常用的血清學診斷方法是競爭酶聯免疫吸附試驗(c-ELISA)，c-ELISA具有快速、特異、敏感、簡便和安全的優點，被廣泛採用。通過組織培養方法，將病毒接種在細胞中大量繁殖，經過分離、純化的病毒作為c-ELISA包被抗原，這種方法不僅操作繁鎖，不穩定，產量低，成本高，而且有一定的生物安全隱患。另據報導，應用分子克隆和基因重組技術已在原核和真核系統中表達了VP7蛋白，但原核表達的蛋白抗原性差，真核表達的抗原提取煩瑣、成本高。
發明內容
本發明的目的在於提供一種能穩定、高效表達具有良好抗原性的藍舌病病毒VP7抗原基因重組表達質粒載體。
本發明的第二個目的在於提供可用於藍舌病診斷的VP7重組表達抗原。
本發明的第三個目的在於提供上述重組表達載體以及VP7表達抗原的製備方法。
本發明所述的藍舌病病毒VP7基因重組表達質粒載體命名為p BAD-B5，其編碼VP7融合蛋白的核苷酸序列為
圖1所示，所述BTV VP7基因DNA序列已經在GenBank中註冊，註冊號為AY386682。
本發明所述的藍舌病病毒VP7基因重組表達質粒載體所獲得的表達產物命名為VP7融合蛋白，其胺基酸序列為圖2所示。
本發明所述的藍舌病病毒VP7基因重組表達載體的製備方法由以下步驟組成一、將BTV編碼群特異性抗原VP7基因片段克隆至pMD18-T質粒載體中，構建VP7基因克隆重組質粒，進行核苷酸序列分析；二、亞克隆插入pBAD/Thio TOPO表達載體；三、轉化TOP10細胞，經抗性培養、PCR、限制性內切酶分析、測序鑑定；四、篩選獲得BTV VP7基因片段正向插入、有正確讀碼框的陽性克隆，即構建了BTV群特異性抗原VP7的重組表達載體。
本發明所述的藍舌病病毒診斷基因重組表達質粒載體所獲得的表達產物的製備方法由以下步驟組成一、將篩選獲得的含有BTV群特異性抗原VP7表達重組質粒陽性克隆載體的工程菌株，接種於含100μg/mL Amp的LB培養基，37℃振蕩培養12h；二、上述培養物按1％的體積接入含100μg/mL Amp的LB培養基，37℃振蕩培養4h；三、在培養基中加入阿拉伯糖至最終濃度為0.02％，溫度降至30℃，繼續振蕩培養，緩慢誘導表達5h；
四、收集菌液以4℃下5000r/min離心30min，將沉澱菌體按1∶10(W/V)懸浮於TE緩衝液，置冰水浴中300~400W反覆超聲破菌，每次15s，間隔15s；五、菌體裂解液以4℃下5000r/min離心30min，取上清液為粗提的BTV VP7重組融合蛋白；六、用ELISA試驗測定BTV VP7重組融合蛋白抗原效價。
本發明的優點和積極效果為1、該表達載體生產的VP7為抗原的競爭酶聯免疫吸附試驗(c-ELISA)，具有快速、特異、敏感、簡便和安全的優點，克服了通過組織培養方法生產完整病毒作為c-ELISA包被抗原而造成的操作繁鎖、不穩定、產量低、成本高、有生物安全隱患的缺點。
2、用pBAD/Thio-TOPO原核表達系統對藍舌病病毒的VP7蛋白進行表達，生產的抗原以可溶性形式高效表達，融合蛋白有完全生物學活性。也克服了真核系統中表達VP7蛋白抗原的提取煩瑣、成本高的缺陷，該方法生產VP7抗原具有簡便、快捷和高效的特點。
3、該表達載體含有阿拉伯糖啟動子，它的調控快速而靈敏。
4、用表達產物作為抗原進行c-ELISA方法具有較強的特異性和更高的敏感性，不與相關環狀病毒發生交叉反應。包被的酶標板在4℃可以存放2個月，在-20℃可保存6個月以上。本試驗生產的重組VP7蛋白抗原可以代替完整病毒作為c-ELISA檢測用的標準抗原。
具體實施例方式
(一)藍舌病病毒VP7抗原基因的克隆和表達重組質粒的構建根據BTV10型VP7基因序列，設計、合成一對引物，擴增長度為1044bp。VP7-P15』-GAC ACT ATC GCT GAC AGA GCA CT-3』 ，在S7基因的位置第21~43位；VP7-P25』-CAC ATA GGC GGC GCG TGC AAT AG-3』，在S7基因的位置第1064~1042位。PCR產物在10g/L瓊脂糖上進行電泳檢測。按照寶生物工程(大連)有限公司生產的pMD18-T載體試劑盒(產品號D504CA)使用說明書要求，回收純化的PCR目的片段插入pMD18-T載體，轉化E.Coli.JM109感受態細胞，PCR和測序鑑定，獲得含有BTV-VP7基因1044bp片段的陽性克隆。該基因在GenBank登錄號為AY386682。
從BTV VP7基因陽性重組質粒中亞克隆目的基因，設計引物時去除目的基因的起始密碼子和終止子，使目的基因插入pBAD/Thio TOPO載體後表達融合蛋白，以提高特異性抗原的免疫原性和穩定性。PCR反應循環參數為94℃ 1min、65℃1min、72℃2min，30個循環，72℃延伸10min，取10μL PCR反應產物在10g/L瓊脂電泳檢測。按照Invitrogen公司生產的p BAD/TOPOThioFusionTM表達試劑盒(產品號K370-01)說明書要求，回收純化後的目的片段連接插入p BAD/Thio-TOP載體，轉化TOP10感受態細菌，在含100μg/mL Amp的LB培養基上選擇培養24h。用雞尾酒-PCR體系法高效、快速分析鑑定菌落，根據載體和目的基因上的酶切位點，用NCOI+ECORV雙酶切鑑別出正向插入BTV VP7基因的重組質粒。對重組表達質粒中的插入片段進行序列測定，獲得的重組子命名為p BAD-B5。在該載體中BTV VP7基因的編碼序列全長為1044bp，其編碼332個胺基酸。表達融合蛋白的N端是分子量為13kD的HP-Thioredoxin，C端是分子量為3kD的V5 epitope和6個組氨酸，中間是分子量為38.5 kD的BTV VP7蛋白，整個表達融合蛋白的分子量為54.5kD。
(二)大腸桿菌TOP10感受態細胞的製備與轉化、質粒的製備大腸桿菌TOP10感受態細胞製備，採用氯化鈣製備法，具體方法參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社(1998)，第55-56頁。只是採用由0.75mmol/LTris-HCl代替水為溶劑配製0.1mol/LCaCl2。感受態細胞的轉化方法，參照上述參考文獻進行。質粒的製備參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社(1998)，第26-28頁，採用鹼裂解法製備，用PEG沉澱法純化。
(三)BTV VP7重組表達質粒載體在大腸桿菌中的誘導表達、重組蛋白抗原製備具體方法按照Guzman L M，Belin D和Carson M J等.《Tight Regulation，Modulation，and High-Level Expression by Vectors Containing the Arabinose PQADPromoter》.J.Bacteriol，1995，1774121-4130。將已轉化p BAD-B5的TOP10細菌接種在含100μg/mL Amp的LB培養基中，37℃振蕩培養12h；參照楊麗琛、常團結和陳宛新等《CpTI蛋白在大腸桿菌中的高效融合表達及其純化與活性測定》，生物工程學報，2003年第1期，第63-67頁，製備含100μg/mL Amp的LB培養基，按1％的體積接入上述製備的種子菌液，37℃振蕩培養4h，加入阿拉伯糖至最終濃度為0.02％，溫度降至30℃，繼續振蕩培養，緩慢誘導表達5h，收集菌液以4℃下5000r/min離心30min，稱量菌體溼重。將菌體按1∶10(W/V)懸浮於TE緩衝液，置冰水浴中300~400W反覆超聲破菌，每次15s，間隔15s，塗片染色鏡檢至完全裂解菌體，以4℃下5000r/min離心30min，取上清液為粗提的BTV VP7重組蛋白抗原。
(四)ELISA和瓊脂擴散試驗(AGID)檢測按照花群義等《競爭酶聯免疫吸附試驗檢測藍舌病抗體的研究》，動物醫學進展，2002年第2期，第66頁至第69頁。用上述方法製備表達菌株的重組蛋白粗提物和陰性對照菌株的粗提物，用BTV特異性抗血清和HRP-protein G進行酶聯免疫吸附試驗，測定表達菌株的重組蛋白粗提物和陰性對照菌株的粗提物中表達產物的特異性ELISA滴度，採用方陣滴定法測定最適包被抗原的濃度。
用經上述測定包被抗原濃度的重組蛋白作為包被抗原，按照花群義、周曉黎和徐自忠等《藍舌病競爭酶聯免疫吸附試驗操作規程》(中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準(SN/T1165.1-2002))和賈建軍、周曉黎和楊晶焰等《藍舌病瓊脂免疫擴散試驗操作規程》(中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準(SN/T1165.2-2002))所述進行藍舌病c-ELISA方法和AGID試驗檢測。
(五)按上述(三)所製備BTV VP7重組抗原方法，100mL含100μg/mL Amp的LB培養基可獲得約30mL藍舌病競爭酶聯免疫吸附試驗(C-ELISA)包被抗原和1mL瓊脂免疫擴散試驗(AGID)抗原。
(六)按上述(四)方法，BTV VP7重組抗原試劑在全國檢驗檢疫系統相關部門和動物防疫部門進行了應用，製備並提供給應用單位近13萬頭份，證明VP7重組抗原在診斷藍舌病方面具有較強的特異性和更高的敏感性，不與相關環狀病毒發生交叉反應。該方法生產VP7抗原具有簡便、快捷和高效的特點。本發明利用原核表達載體pBAD/Thio TOPO成功高效表達BTV VP7群特異性抗原，首次創立原核表達藍舌病病毒群特異性抗原VP7，研製藍舌病診斷試劑的新策略。
下列所示的為BTV VP7基因重組表達質粒載體中表達VP7融合蛋白的核苷酸序列。
gacactatcg ctgcaagagc acttactgtg atgcgagcat gtgctacgct tcaagaagca agaattgtgttggaagctaa cgtgatggag atactgggga tagcaatcaa cagatataat ggattaactt tacgaggggtgacgatgcgc ccgacctcat tggcgcagag aaatgagatg ttttttatgt gtttagatat gatgctgtccgcggctggga taaacgtagg accgatatct ccagattata cccaacatat ggctacaatt ggtgtactagcgacgccaga gatacctttt acaacggaag cggcgaatga gattgctcgc gtgactgggg agacttcgacgtgggggcca gcccgtcagc cttatggttt cttccttgaa actgaggaaa ccttccagcc cggacgttggttcatgcgtg ccgcccaagc agcaactgcg gtagtgtgtg gtccggatat gattcaagtg tcactgaatgctggagcaag aggagatgtg cagcagatat ttcagggtcg taacgacccc atgatgatat atctagtttggagaagaatt gaaaacttcg cgatggcgca gggtaactca cagcaaactc aagcaggcgt gactgttagcgttggtggag tagatatgcg ggcggggcgt atcatagcgt gggatggaca ggctgctcta catgtgcgcaatccaacaca acagaatgcg atggttcaga tacaggtcgt gttctacatt tctatggata agaccttaaatcaataccct gccttgactg ctgaaatctt taatgtttat agcttcagag atcacacatg gcacgggcttagaacggcta tacgcaacag aactacactg ccgaatatgc tgccacccat ctttccacca aacgatcgagatagtatcct gactcttttg cttttgtcta cgcttgctga tgtttatact gttttaagac ctgagttcgcgatgcacggc gtaaacccaa tgccttggcc gctcacagct gctattgcac gcgccgccta tgtg。
下列所示的為VP7融合蛋白的胺基酸序列。
MGSDKIIHLT DDSFDTDVLK ADGAILVDFW AHWCGPCKMI APILDEIADE YQGKLTVAKL 60NIDHNPGTAP KYGIRGIPTL LLFKNGEVA4 TKVGALSKGQ LKEFLDANLA GSGSGDDDDK 120LALDTIAARA LTVMRACATL QEARIVLEAN VMEILGIAIN RYNGLTLRGV TMRPTSLAQR 180NEMFFMCLDM MLSAAGINVG PISPDYTQHM ATIGVLATPE IPFTTEAANE IARVTGETST 240WGPARQPYGF FLETEETFQP GRWFMRAAQA VTAVVCGPDM IQVSLNGGAR GDVQQIFQGR 300NDPMMIYLVW RRIENFAMAQ GNSQQTQAGV TVSVGGVDMR AGRIIAWDGQ AALHVHNPTQ 360QNAMVQIQVV FYISMDKTLN QYPALTAEIF NVYSFRDHTW HGLRTAILNR TTLPNMLPPI 420FPPNDRDSIL TLLLLSTLAD VYTVLRPEFA IHGVNPMPGP LTRAIARAAY VKGELEGKPI480PNPLLGLDSTRTGHHHHHH.......... .......... .......... .......... 498
權利要求
1.一種藍舌病病毒VP7基因重組表達質粒載體，其特徵在於命名為p BAD-B5重組表達質粒載體，其表達VP7融合蛋白的核苷酸序列為gacactatcg ctgcaagagc acttactgtg atgcgagcat gtgctacgct tcaagaagca agaattgtgt tggaagctaa cgtgatggagatactgggga tagcaatcaa cagatataat ggattaactt tacgaggggt gacgatgcgc ccgacctcat tggcgcagagaaatgagatg ttttttatgt gtttagatat gatgctgtcc gcggctggga taaacgtagg accgatatct ccagattata cccaacatatggctacaatt ggtgtactag cgacgccaga gatacctttt acaacggaag cggcgaatga gattgctcgc gtgactggggagacttcgac gtgggggcca gcccgtcagc cttatggttt cttccttgaa actgaggaaa ccttccagcc cggacgttgg ttcatgcgtgccgcccaagc agcaactgcg gtagtgtgtg gtccggatat gattcaagtg tcactgaatg ctggagcaag aggagatgtgcagcagatat ttcagggtcg taacgacccc atgatgatat atctagtttg gagaagaatt gaaaacttcg cgatggcgca gggtaactcacagcaaactc aagcaggcgt gactgttagc gttggtggag tagatatgcg ggcggggcgt atcatagcgt gggatggacaggctgctcta catgtgcgca atccaacaca acagaatgcg atggttcaga tacaggtcgt gttctacatt tctatggata agaccttaaatcaataccct gccttgactg ctgaaatctt taatgtttat agcttcagag atcacacatg gcacgggctt agaacggcta tacgcaacagaactacactg ccgaatatgc tgccacccat ctttccacca aacgatcgag atagtatcct gactcttttg cttttgtcta cgcttgctgatgtttatact gttttaagac ctgagttcgc gatgcacggc gtaaacccaa tgccttggcc gctcacagct gctattgcac gcgccgcctatgtg。
2.一種藍舌病病毒VP7基因重組表達質粒載體所表達獲得的VP7表達抗原，其特徵在於命名為BTV VP7融合蛋白，其胺基酸序列為HP-ThioredoxinMGSDKIIHLT DDSFDTDVLK ADGAILVDFW AHWCGPCKMI APILDEIADE YQGKLTVAKL 60NIDHNPGTAP KYGIRGIPTL LLFKNGEVAA TKVGALSKGQ LKEFLDANLA GSGSGDDDDK 120LALDTIAARA LTVMRACATL QEARIVLEAN VMEILGIAIN RYNGLTLRGV TMRPTSLAQR 180NEMFFMCLDM MLSAAGINVG PISPDYTQHM ATIGVLATPE IPFTTEAANE IARVTGETST 240WGPARQPYGF FLETEETFQP GRWFMRAAQA VTAVVCGPDM IQVSLNGGAR GDVQQIFQGR 300NDPMMIYLVW RRIENFAMAQ GNSQQTQAGV TVSVGGVDMR AGRIIAWDGQ AALHVHNPTQ 360QNAMVQIQVV FYISMDKTLN QYPALTAEIF NVYSFRDHTW HGLRTAILNR TTLPNMLPPI 420FPPNDRDSIL TLLLLSTLAD VYTVLRPEFA IHGVNPMPGP LTRAIARAAY VKGELEGKPI480PNPLLGLDSTRTGHHHHHH.......... .......... .......... ..........498V5 epitope 6His tag。
3.按照權利要求1所述的藍舌病病毒VP7基因重組表達質粒載體的製備方法，其特徵在於由以下步驟組成(一)、將BTV編碼群特異性抗原VP7基因片段克隆至pMD18-T質粒載體中，構建VP7基因克隆重組質粒，進行核苷酸序列分析；(二)、亞克隆插入pBAD/Thio TOPO表達載體；(三)、轉化TOP10細胞，經抗性培養、PCR、限制性內切酶分析、測序鑑定；(四)、篩選獲得BTV VP7基因片段正向插入、有正確讀碼框的陽性克隆，即構建了BTV群特異性抗原VP7的重組表達載體。
4.按照權利要求2所述的藍舌病病毒VP7基因重組載體表達所獲得的BTVVP7抗原的製備方法，其特徵在於由以下步驟組成(一)、將篩選獲得的含有BTV群特異性抗原VP7表達重組質粒陽性克隆載體的工程菌株，接種於含100μg/mL Amp的LB培養基，37℃振蕩培養12h；(二)、上述培養物按1％的體積接入含100μg/mL Amp的LB培養基，37℃振蕩培養4h；(三)、在培養基中加入阿拉伯糖至最終濃度為0.02％，溫度降至30℃，繼續振蕩培養，緩慢誘導表達5h；(四)、收集菌液以4℃下5000r/min離心30min，將沉澱菌體按1∶10W/V懸浮於TE緩衝液，置冰水浴中300~400W反覆超聲破菌，每次15s，間隔15s；(五)、菌體裂解液以4℃下5000r/min離心30min，取上清液為粗提的BTVVP7重組融合蛋白；(六)、用ELISA試驗測定BTV VP7重組融合蛋白抗原效價。
全文摘要
本發明涉及一種對動物藍舌病進行檢測的生物製劑以及這種生物製劑的製備方法。本製劑包括藍舌病病毒VP7基因重組表達質粒載體以及由其表達所獲得的藍舌病病毒VP7重組抗原，其製備方法為一、將BTV編碼群特異性抗原VP7基因片段克隆至pMD18－T質粒載體中，構建VP7基因克隆重組質粒；二、亞克隆插入pBAD/Thio TOPO表達載體；三、轉化TOP10細胞；四、篩選獲得BTV VP7基因片段正向插入、有正確讀碼框的陽性克隆，即構建了BTV群特異性抗原VP7的重組表達載體；五、該重組質粒載體用含100μg/mL Amp的LB培養基進行培養，可穩定、高效表達BTV VP7重組抗原，可作為藍舌病診斷試劑。
文檔編號G01N33/53GK1563383SQ200410008748
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月17日 優先權日2004年3月17日
發明者花群義, 徐自忠, 董俊, 楊晶焰, 楊雲慶, 周曉黎, 賈建軍, 肖榮海, 龍忠保 申請人:雲南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心