Lycogen在用於製備促進糖尿病傷口癒合及輔助抑制癌移轉的醫藥組合物中的應用的製作方法

2023-09-23 02:00:05

本發明涉及一種類茄紅素在用於製備促進糖尿病患者的傷口修復，以及在用於製備輔助抑制癌轉移的類茄紅素組合物中的應用。

背景技術：

糖尿病在現今社會中是一常見的疾病，在臺灣每年有超過一百萬人次因糖尿病而求醫。然而糖尿病是一種無法根治的慢性病，一旦罹患糖尿病則病患終其一生都須進行嚴謹的血糖控制，以避免其嚴重影響生活質量甚至威脅生命。根據衛服部統計，糖尿病目前已高居國人十大死因前五名。

然而有許多糖尿病患並不知自己罹病，原因是糖尿病的症狀常常是慢慢發展，因此在病程剛開始時往往不易察覺。而長期處於高血糖及代謝異常的狀態則會影響身體的血管及神經異常，因而帶來許多慢性併發症，包括小血管病變(如視網膜病變、腎臟病變)及大血管病變(又稱動脈硬化症)。一旦病情控制不佳，易引起心臟病、中風，造成眼睛、腎臟、下肢血管等併發症，甚至造成失明、洗腎和截肢。

許多糖尿病患者因神經系統受到損傷導致反應遲鈍而沒有注意到身體有傷口。又因血管病變使得受傷部位周邊組織缺血缺氧、生長因子不足、白血球、紅血球、血小板也會受到影響，且血液黏稠度增加，使得傷口反覆感染機會更高，導致傷口需花費更長時間復原。因此若能在傷口剛發生時給予輔助加速傷口癒合、阻隔傷口碰觸到外界汙染，則可避免傷口反覆感染擴大傷口範圍。故本發明提供一類茄紅素組合物，以促進糖尿病者的整體傷口癒合速度及外觀表皮修復的應用。

目前在臺灣癌症已是十大死因的第一名，而幾乎所有的癌症都可能成為轉移性腫瘤。而一旦發生遠程轉移，癌細胞會移轉至身體各處，造成治癒機率將大大降低。癌細胞的轉移(metastasis)擴散往往是造成癌症病人病灶復發致死的最主要原因之一。癌細胞的轉移包含了細胞與細胞外基質(extracellular matrix,ECM)之間結合能力(adhesion)的改變，細胞與細胞間相互作用力的破壞，細胞外基質的分解，緊接著癌細胞會穿過細胞外基質，侵入到循環系統中的血管或淋巴管(invasion)，逃過免疫系統的防護，最後貼附在內皮細胞上，穿破血管或淋巴管到達新的組織器官，接著大量的增殖並誘發血管增生(angiogenesis)。癌細胞便藉新生的血管奪取正常組織器官的養分而造成正常組織器官功能的耗弱，最後造成癌症病人的死亡。

換言之，血管增生的發生，主要是由於腫瘤能夠產生誘導血管新生的血管生成因子，促使血管內皮細胞進行血管增生作用，新生的血管可以為腫瘤的生長帶來營養和氧氣。近幾十年來，已有許多動物及人體研究也證實腫瘤生長與移轉是需要依靠血管增生作用。因此，若能抑制癌細胞的轉移或侵入至循環系統，則可降低癌病患因癌移轉導致的死亡機率。故本發明提供一類茄紅素組合物，以輔助抗癌藥物應用於抑制癌轉移之功效的應用。

在發明人先前的研究中發現，Lycogen可明顯抑制細胞內基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)的分泌。MMP和血管內皮細胞的血管增生息息相關為微血管內皮細胞最初形成新生血管的首要成分，其主要功能為協助血管內皮細胞移行及分解細胞間基質，以利新血管的形成。其中以MMP-2及MMP-9具有分解基底膜基質第五型膠原蛋白的能力，與血管增生及癌細胞轉移最為相關。而且在癌細胞轉移的過程中，血管增生扮演著重要關鍵的角色。因此，Lycogen是否具有抑制血管增生是值得探討的。而本發明進一步證實Lycogen與抗癌藥物可發生協同作用，抑制MMP的活性與分泌，進而輔助抗癌藥物的作用。

技術實現要素：

本發明所述的「類茄紅素」(Lycogen)為參考中華民國專利公告第I406942號的「類茄紅素萃取物及其組合物」，此專利全文內容併入本發明作為參考，本發明依據該專利的實施內容來進行製備類茄紅素。該類茄紅素萃取物包含活性成分選自ζ-胡蘿蔔素(ζ-carotene)、鏈孢紅素(neurosporene)、球形烯醇(spheroidenone)及/或甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)。而該類茄紅素萃取自突變的光合菌，由野生或培養的原生光合菌經紫外線照射使其變性而來。該突變的光合菌為一球形紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)，已保藏於布達佩斯條約的德國微生物與細胞搜集中心(DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，保藏編號為DSM 25056，保藏地址為德國布倫瑞克茵霍芬大街7B D-38124，保藏日期為2011年8月1日。該菌株也保藏於臺灣新竹食品工業發展研究所，保藏標號為BCRC910406。

在一具體實施例中，該ζ-胡蘿蔔素的含量多於該類茄紅萃取物的10重量百分比。在另一具體實施例中，該鏈孢紅素的含量多於該類茄紅萃取物的10重量百分比。在另一具體實施例中，該球形烯醇的含量多於該類茄紅萃取物的30重量百分比。在另一具體實施例中，該甲氧基鏈孢紅素的含量多於該類茄紅萃取物的30重量百分比。

本發明提供一種類茄紅素在用於製備促進糖尿病傷口癒合的類茄紅素組合物的應用，其中該組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。

本發明透過製造傷口於糖尿病個體的皮膚後給予Lycogen，並觀察傷處的復原程度。結果顯示Lycogen可減緩受傷區的肉芽組織(Granulation tissue)的生成、並減少組織液的產生，使傷口維持較為乾燥的狀態，且相較於控制組(並未給予傷口任何處理)顯著促進整體傷口的癒合及外觀表皮修復。給予Lycogen處理的糖尿病傷口，其白血球浸潤情形相較於控制組而言較為減少、膠原組織的排列較有條理、並且較無水腫情形，因此可證明Lycogen具有促進表皮層及角質層復原的功效。

在一具體實施例中，所述類茄紅素組合物用於促進糖尿病傷口癒合的有效劑量濃度為1.25-20mg/mL。在另一具體實施例中，所述類茄紅素組合物的有效劑量濃度為2.5-10mg/mL。而在一較佳具體實施例中，所述類茄紅素組合物的有效劑量濃度為5mg/mL。

本發明還提供一類茄紅素在用於製備輔助抗癌藥物抑制癌移轉(metastasis)的類茄紅素組合物的應用，其中該組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。本發明以誘發血管形成，並針對各項血管增生指標進行評估，包括測定細胞的凋亡、移行、脈管形成、MMPs活性等。本發明將Lycogen合併抗癌藥物進行血管增生試驗，確定Lycogen具有抑制細胞脈管形成的效用，並且可抑制細胞的移動能力和MMP-9的活性。因此Lycogen確實能與抗癌症藥物發生協同作用，進而可減少抗癌症藥物的使用量，以降低副作用。

在一具體實施例中，該類茄紅素組合物抑制癌細胞生長的有效劑量濃度為5-200μM。在另一具體實施例中，所述類茄紅素組合物的有效劑量濃度為10-150μM。而在一較佳具體實施例中，所述類茄紅素組合物的有效劑量濃度為50-100μM。

在一具體實施例中，該類茄紅素組合物輔助抗癌藥物用於抑制癌移轉的有效劑量濃度為2-200μM。在另一具體實施例中，所述類茄紅素組合物的有效劑量濃度為5-150μM。而在一較佳具體實施例中，所述類茄紅素組合物的有效劑量濃度為10-100μM。

本發明所述的類茄紅素組合物單獨使用也具有降低癌細胞轉移的功效，且僅需5μM的Lycogen即可抑制癌細胞移行(migration)及侵襲(invasion)(如圖16及18)，進而可抑制癌移轉。

文中所提「糖尿病個體」一詞包括那些具有高血糖的個體(包括具有慢性高血糖、胰島素過多、葡萄糖代謝或耐受受損、及胰島素抵抗的個體)。高血糖個體的血糖濃度包括，例如，用可靠的診斷儀器確定葡萄糖濃度比正常值高。這種高血糖個體有危險或易於出現明顯糖尿病臨床症狀。此處所提「個體」一詞包含但不限於哺乳動物或人類。

該術語「癌症」可以是指上皮癌(carcinoma)、肉瘤(sarcomas)、腺癌、淋巴瘤、白血病、固態癌、及淋巴癌等等。不同類型的癌症例子包括但不限於肺癌(例如：非小型細胞肺癌或是NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、結腸直腸癌、肝癌(即hepatocarcinoma)、腎臟癌(即腎細胞癌，renal cell carcinoma)、膀胱癌、乳癌、甲狀腺癌、胸膜癌(pleural cancer)、胰臟癌、子宮癌、子宮頸癌、睪丸癌、肛門癌、胰臟癌、膽管癌、胃腸道類癌瘤、食道癌、膽囊癌、闌尾癌、小腸癌、胃(gastric)癌、中樞神經系統的癌症、皮膚癌、絨毛膜癌；頭與頸部癌症、血癌、骨原性肉瘤、纖維肉瘤、神經胚細胞瘤、神經膠瘤、黑色素瘤、B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、小細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、單核球白血病、骨髓性白血病、急性淋巴球白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、及多發性骨髓瘤。在一些特定實施例中，本發明的組合物及方法對於治療癌症是有用的。

附圖說明

圖1為各組別對糖尿病鼠的切割傷口癒合結果分析圖。

圖2為各組別的傷口組織免疫染色圖。

圖3為各組別的傷口組織免疫染色圖。

圖4為各組別的膠原蛋白I免疫反應呈色圖。

圖5為各組別的Vimentin(波形蛋白)表現量圖。

圖6為各組別的TNF-alpha表現量圖。

圖7為各組別的IL-1beta表現量圖。

圖8為各組別的VEGF(血管內皮生長因子)表現量圖。

圖9為Lycogen對細胞增生的抑制表現結果。

圖10為Lycogen結合5-FU對血管增生的抑制效用之結果。

圖11為Lycogen結合5-FU對細胞移行的抑制效用之結果。

圖12為Lycogen結合5-FU對MMP-9的活性抑制效用之結果。

圖13為Lycogen的濃度與細胞存活率。

圖14為ERK蛋白活性的免疫染色分析。

圖15為AKT蛋白活性的免疫染色分析。

圖16為Lycogen結合5-FU對癌細胞移行的抑制效用的統計結果。

圖17為Lycogen結合5-FU對癌細胞侵襲的抑制效用的螢光顯微鏡拍攝結果。

圖18為Lycogen結合5-FU對癌細胞侵襲的抑制效用的統計結果。

具體實施方式

下列實施例僅代表本發明的各種態樣與特徵，並非限制本發明的範圍。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

Lycogen用於糖尿病個體之傷口修復

傷口癒合測試

在一實施例中於每一隻糖尿病鼠身上利用165℃的銅塊(2×2cm)緊密接觸糖尿病鼠10秒以製造傷口，形成全層皮膚的燒燙傷口，再分別給予溶劑(vehicle)及Lycogen凝膠持續觀察至第15天。溶劑組的傷口每一天塗0.2ml的凝膠，Lycogen組則是塗抹添加了Lycogen於同樣的凝膠，Lycogen含量為1mg/0.2ml。

在另一實施例中，於糖尿病鼠身上製造切割傷口，進行15天的塗抹試驗，並分成三組，每組4隻糖尿病鼠：(A)控制組(wound):切割傷口未塗抹任何物質之糖尿病鼠傷口；(B)溶劑組(vehicle):切割傷口僅塗抹0.2ml乳液；(C)實驗組(Lycogen):切割傷口每日塗抹1mg的Lycogen+0.2ml乳液。圖1可清楚看出Lycogen組的傷口癒合程度明顯比控制組及溶劑組好。利用定量軟體圈畫出每兩天的傷口大小(比例尺為1公分)，再以折線圖呈現整體復原情形。計算方式：純受傷-治療組(傷口面積％)的各時間積分總和；數值越大代表治療效果越好。利用純受傷組與治療組每天的傷口面積算出圖1左上的曲線圖，再利用曲線圖做出每天的面積總合再相加求平均，做出組別整體的面積，即為AUC(Area under curve曲線下面積圖)。

參照圖2，接著將15天後的傷口進行組織染色，由染色結果可看出，控制組的表皮在受傷初期會產生大量白血球浸潤情形、組織較為鬆散、且角質層復原緩慢。而溶劑組相較於正常組則有較好的修復狀態，有可能是因為凝膠蓋布傷口阻隔感染的情況。在Lycogen組可見到切割傷口白血球浸潤情形大量降低、表皮層及角質層復原完整、膠原組織排列較有條理且較無水腫情形，整體而言糖尿病傷口復原狀況比正常組及溶劑組良好。結果顯示給予Lycogen的治療組有顯著促進糖尿病傷口癒合之作用。(P值計算方式：以wound+vehicle與wound+Lycogen進行T-Test分析。)

圖3也可看出在Lycogen組的皮膚深處發炎細胞較少，且有許多纖維母細胞；而表皮處已重新生成表皮層，並分化出角質細胞。然而vehicle組別則較不明顯。

膠原蛋白I免疫活性及vimentin含量測試

在一實施例中進行了膠原蛋白I免疫活性及Vimentin表現量的測試。膠原蛋白為傷口癒合的重要因子，用於協助傷口的組織修復。Vimentin(波形蛋白)是一間質細胞的marker，可調控細胞結構完整性、影響細胞貼附和遷移、細胞凋亡及免疫防禦等功能。由圖4及圖5的免疫染色圖顯示Lycogen組別的膠原蛋白免疫反應性及vimentin的含量分別是控制組(control)的6倍及25倍。Vehicle組為僅給予0.2ml乳液的組別。

TNF-α、IL-1β、VEGF表現量測試

在另一實施例中進行了TNF-α、IL-1β、VEGF含量測試。TNF-α及IL-1β皆為發炎相關因子，有發炎反應時表現量會上升。VEGF(血管內皮生長因子)會在傷口癒合過程中分泌。參考圖6至圖8，組為無受傷組別、injury組為受傷但未進行任何處理的組別、injury+vehicle組為受傷但僅給予凝膠組、而injury+lycogen組為受傷並給予1mg的Lycogen組別。由圖6至圖8顯示，在injury+lycogen組別的TNF-α、IL-1β及VEGF含量具有顯著的下降，並恢復至接近未受傷組別的狀態。由圖8更可得知，Lycogen具有加速糖尿病個體的傷口癒合的效用，使傷口癒合至後期，所以在取樣之際的VEGF含量較少。

Lycogen用於輔助抑制癌轉移

細胞增生分析

在一實施例中，將Lycogen溶於四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)以形成不同濃度的Lycogen試劑(0、10、50、及100μM)，並分別與HUVEC細胞培養24-72小時，每組至少三重複，並以MTT試驗進行細胞增生分析。試驗結果以百分比呈現。

圖9顯示HUVEC細胞經Lycogen培養24-72小時後，HUVEC細胞數顯著地隨劑量和時間增加而減少。10μM的Lycogen在培養24-48小時內對細胞並無顯著性毒性，但50μM的lycogen則在培養48小時後開始顯著地抑制HUVEC細胞的增生。若以100μM的lycogen培養HUVEC細胞，則在24小時便開始顯著抑制HUVEC細胞的生長。由此結果可作為日後Lycogen使用劑量及時間的對照依據。

血管增生分析

體外血管增生試驗常被用來研究各種抗血管增生營養素或藥物的模式，該試驗方便性較高且快速。因此，本實施例利用此模式探討Lycogen能否加乘性地抑制HUVEC細胞脈管形成。本發明先在基質膠(matrigel)中以H2O2誘發脈管形成進行評估Lycogen對於血管增生指標的影響。將HUVEC細胞溶於含有10％血清的培養基裡，再將HUVEC細胞以每格1*104顆種在以matrigel披覆的24孔盤裡。控制組以外的組別分別以溶劑、5-FU、5-FU加10μM lycogen、5-FU加30μM lycogen、及5-FU加50μM lycogen對HUVEC進行處理。每個條件進行二重複，且此試驗重複兩次。進行處理後6小時，並以位相差顯微顯微鏡(phase contrast photomicrograph)以100倍放大倍率進行呈像。

如圖10中顯示H2O2確實誘發細胞脈管的形成，而溶劑對照組對脈管形成的影響則與控制組相似，因此溶劑對試驗並無影響。另外5-FU確實能抑制細胞脈管的形成，而加上不同濃度(10-30μM)Lycogen後證實隨著Lycogen劑量增加，5-FU對脈管的抑制能力就越強。

細胞移行分析

在另一實施例中，進行Lycogen對細胞的移行能力分析。以與上述血管增生分析同樣的條件進行試驗。圖11顯示5-FU確實能抑制細胞移動的能力；而5-FU再加進不同濃度的Lycogen(以THF為溶劑調製出10-50μM的Lycogen)，則隨著Lycogen劑量增加，細胞移動的數量就越低，即表示Lycogen對於5-FU抑制細胞移動的能力具有輔助效果。

在另一實施例中，分析lycogen對人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926細胞株移行的影響。將EA.hy926細胞株用各種濃度的lycogen(0、2、5、和10μM)或25μg/mL的5-FU處理24小時後，進行EA.hy926細胞株移行的分析，並算出移行面積的差異。

結果如圖16顯示，5-FU具有抑制癌細胞移行的效果，而5μM及10μM的Lycogen也具有抑制癌細胞移行的效果。且在5-FU與Lycogen共同作用下，僅須2μM的Lycogen即可以明顯的增加癌細胞移行的抑制效果。

MMP-9活性分析

MMP(基質金屬蛋白酶，Matrix metalloproteinase)和血管內皮細胞的血管增生息息相關，是微血管內皮細胞最初形成新生血管的首要成分，其主要功能為協助血管內皮細胞移行及分解細胞間基質，以利新血管的形成，其中以MMP-2及MMP-9與血管增生最為相關。癌細胞中MMPs會受到活性氧活化而增加合成與分泌量，其作用已證實是用來作局部侵入和遠處轉移，以便助長癌細胞穿透基底膜，並由血管滲入組織而達到轉移的目的。因此，在另一實施例中進行MMP-9的活性分析。圖12顯示Lycogen與5-FU合併使用後可抑制MMP-9活性，且具劑量關係，即Lycogen劑量越高則MMP-9的活性越低。

癌細胞侵襲分析

利用人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926分析Lycogen對於抑制癌細胞侵襲的能力。將EA.hy926細胞用各種濃度lycogen的(0、2、5、和10μM)或為25μg/mL的5-FU處理24小時後，利用Matrigel進行侵入分析，並於倒置螢光顯微鏡拍攝細胞侵入(Invasion)的情形。

Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在無聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯濾膜上，能在DMEM培養基中重建形成膜結構，這種膜結構與天然基質膜結構極為相似。

將細胞培養Transwell細胞培養盤上，培養盤上有一層半透膜，擬生物體內狀況進行細胞入侵的實驗，利用腫瘤細胞會破壞基底膜(basal membrane)侵入周圍組織的特性，在細胞培養皿中，加入小鼠肉瘤的基底膜萃取物，並以無菌Tip或是棉線刮出一條無細胞通道(acellular space)，接著依據實驗需求分別以藥劑處理細胞株，最後再將細胞染色並利用螢光顯微鏡計數膜內的細胞，用以得知細胞是否會移動通過通道的能力。

結果如圖17及圖18所示，由顯微鏡下拍攝到的結果可以發現，添加5-FU可以明顯看到侵入細胞的數目減少(相對於對照組0μg/ml)，而對於僅添加Lycogen的部分，隨著濃度增加2μM、5μM、10μM，侵入的細胞數也有明顯的減少趨勢，且在5-FU與Lycogen共同作用下，僅須2μM的Lycogen即可有顯著抑制癌細胞侵入的效果，顯示Lycogen與5-FU具有協同抑制癌細胞侵襲的效應。

Lycogen用於輔助抑制癌細胞分析

抑制癌細胞生長試驗

在另一較佳實施例中，以攝護腺癌細胞株DU145與LNCap細胞株進行分析，觀察Lycogen對於癌細胞的生長是否有抑制作用，並利用One-way ANOVA及Independent Samples T-Test統計分析方法進行相關分析。

將攝護腺癌細胞株DU145以抗氧化劑EGCG(Epigallocatechin gallate)處理24及48小時，並分析其結果。請參照表格1，Lycoge均達到顯著的抑制攝副腺癌細胞增生的效果(p<0.05)。此結果顯示Lycogen對攝副腺癌細胞株DU145具有較迅速的抑制效果。而在細胞株LNCap的試驗中，在48小時下，Lycogen也達到顯著的抑制癌細胞效果(p<0.05)。由結果顯示，Lycogen具有抑制攝護腺癌細胞的存活。

DU145

LNCaP

表格1.攝護腺癌細胞存活率one-way ANOVA顯著性分析

接著測試不同濃度的lycogen對DU145的細胞存活率測試分析。圖13顯示Lycogen在攝護腺癌細胞株DU145中，具有濃度越高則癌細胞存活率越低的趨勢。

通過Independent Samples T-Test顯著性分析發現，在表格2中，Lycogen在24小時下，40μM的濃度即可有效抑制DU145細胞的生長，在48小時下，5至40μM的濃度均可以有效抑制DU145細胞的生長。

表格2.攝護腺癌細胞存活率Independent Samples T-Test顯著性分析

Lycogen用於抑制攝護腺癌細胞的ERK及AKT活性測試

在另一實施例中進行相關蛋白的活性分析，包括ERK及Akt的蛋白活性。Akt透過抑制細胞凋亡的過程而參與細胞存活路徑。Akt可以阻斷細胞凋亡並促進細胞存活，故已有許多文獻證明Akt在多種腫瘤中有主要作用。ERK可與許多的轉錄因子、磷酸激酶、去磷酸酶以及細胞凋亡蛋白作用，因此當細胞的ERK訊息傳導路徑持續活化時，會導致細胞增生與存活，進而導致腫瘤的生成。

在圖14及圖15中顯示Lycogen具有抑制ERK及AKT蛋白活性的效果，通過抑制ERK及AKT的磷酸化反應而達到抑制蛋白活性。