聚酮化合物及其合成的製作方法

2023-09-23 00:31:00

專利名稱：聚酮化合物及其合成的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過重組合成製備12元、14元和16元大環內酯的方法和材料(包括酶系統、核酸、載體和培養物)，還涉及如此產生的新的聚酮化合物(polyketide)。可以操作聚酮化合物生物合成基因或其部分，使得可以生產具有預測結構的特定的新聚酮化合物，諸如12元、14元和16元大環內酯，其中所述聚酮化合物生物合成基因或其部分可以衍生自不同的生物合成基因簇。本發明具體涉及用其它基因取代編碼天然起子(starter)單位的遺傳材料，以便製備優選具有乙酸(acetate)起子單位的大環內酯、優選具有丙酸(propiotate)起子單位的大環內酯或優選具有不常見起子單位的大環內酯，(或優選具有丙酸單位的大環內酯、或優選具有不常見的起子單位的大環內脂)而同時使含不同起子單位的副產物形成減至最少。
聚酮化合物是一大類結構多樣的天然產物，包括具有抗生特性或其它藥理學特性的許多化合物，諸如紅黴素、四環素、雷帕黴素、除蟲菌素、莫能菌素、epothilones和FK506。特別是，鏈黴菌屬(Streptomyces)細菌和相關的放線菌大量產生聚酮化合物。通過以類似於脂肪酸生物合成的方式重複分步縮合醯基硫酯，合成聚酮化合物。由於選擇(通常的)乙酸或丙酸作為「起子」單位或「延伸」單位，以及在每次縮合後觀察到的β-酮基的不同加工程度，因而導致了在天然聚酮化合物發現的更大的結構多樣性。加工步驟的實例包括還原為β-羥醯基-、還原後脫水為2-烯醯-、以及完全還原為飽和醯基硫酯。這些加工步驟的立體化學結果對於每個鏈延伸循環也是特化的。
聚酮化合物的生物合成由一組稱為聚酮化合物合酶的鏈形成酶引發。在放線菌中已經描述了兩類聚酮化合物合酶(PKS)。一類稱為Ⅰ型PKS，其代表為大環內酯紅黴素、夾竹桃黴素、除蟲菌素和雷帕黴素的PKS，由一組聚酮化合物鏈延伸的每個循環不同的酶或酶「組件(module)」組成。一個實例參見

圖1(Cortés,J.等Nature(1990)348:176-178；Donadio,S.等Science(1991)2523:675-679；Swan,D.G等Mol.Gen.Genet.(1994)242:358-362；MacNeil,D.J.等Gene(1992)115:119-125；Schwecke,T.等Proc.Natl.Acad.Sci USA(1995)92:7839-7843)。
本文所用的術語「延伸組件」是指完成一個聚酮化合物鏈延伸循環的一組連續的結構域，從β-酮脂醯(ketoacyl)-ACP合酶(「KS」)結構域至下一個醯基載體蛋白(「ACP」)結構域。術語「裝載組件」用來指完成將起子單位裝載至所述PKS並因此使其可被第一個延伸組件的KS結構域利用的任一組連續的結構域。在紅黴素生物合成的情況下，通過對紅黴素生產PKS的含有鏈釋放硫酯酶/環化酶活性的酶結構域採用基因工程進行特定的再定位，已經改變了所形成的聚酮化合物的長度(Cortés等Science(1995)268:1487-1489；Kao,C.M.等J.Am.Chem.Soc.(1995)117:9105-9106)。
已經表明，符合讀框地缺失編碼紅黴素生產PKS組件5(也稱為6-脫氧紅黴內酯B合酶，DEBS)的部分酮還原酶結構域的DNA，導致形成紅黴素類似物5,6-二脫氧-3-α-碳黴糖基(mycarosyl)-5-氧代紅黴內酯B、5,6-二脫氧-5-氧代紅黴內酯B和5,6-二脫氧，6β-環氧-5-氧代紅黴內酯B(Donadio,S.等Science(1991)252:675-679)。同樣，通過對相應的PKS編碼DNA進行遺傳工程，改變DEBS組件4的烯醯還原酶結構域中的活性位點殘基，並將其引入紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)中，導致產生6,7-脫水紅黴素C(Donadio,S.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:7119-7123)。
國際專利申請WO 93/13553描述了對DEBS基因進行的能夠產生改變的聚酮化合物的其它類型的遺傳操作。然而，據報導許多這樣的努力沒有結果(Hutchinson,C.R.和Fujii,I.Annu.Rev.Microbiol.(1995)49:201-238，第231頁)。已經公開了得自吸水鏈黴菌(Streptomyceshygroscopicus)的編碼模塊(modular)Ⅰ型PKS的基因的完整DNA序列，所述PKS支配大環免疫抑制性聚酮化合物雷帕黴素的生物合成(Schwecke,T.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7839-7843)。所述DNA序列存貯於EMBL/Genbank資料庫中，登錄號為X86780。
第二類PKS稱為Ⅱ型PKS，以芳族化合物的合酶為代表。Ⅱ型PKS僅含有單組鏈延伸的酶活性，它們在連續的循環中被適當地再使用(Bibb,M.J.等EMBO J.(1989)8:2727-2736；Sherman,D.H.等EMBO J.(1989) 8:2717-2725；Fernandez-Moreno,M.A.等J.Biol.Chem.(1992)267:19278-19290)。Ⅱ型PKS的「延伸」單位通常是乙酸單位，特異性環化酶的存在指出將所完成的鏈環化為芳族產物的優選途徑(Hutchinson,C.R.和Fujii,I.Annu.Rev.Microbiol.(1995)49:201-238)。通過將含Ⅱ型PKS基因的DNA克隆引入到含有不同類型Ⅱ型PKS基因簇的另一菌株中，例如通過將得自放線菌紫素(得自天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)的一種藍色色素的聚酮化合物)基因簇的DNA引入到加利利鏈黴菌(Streptomyces galileus)的蒽醌聚酮化合物生產菌株中，已經獲得了雜合聚酮化合物(Bartel,P.L.等J.Bacteriol.(1990)172:4816-4826)。
當在天藍色鏈黴菌宿主細胞中表達時，Ⅱ型PKS上的聚酮化合物鏈延伸所需的最少數目的結構域(「最小PKS」)已經在例如國際專利申請WO 95/08548中確定為含有作為actⅠ基因產物的以下三種多肽首先是KS；第二是稱為CLF的多肽，其首尾胺基酸序列與所述KS具有相似性，但其中所述KS的必需活性位點(即半胱氨酸殘基)或者被穀氨醯胺殘基取代，或者在孢子色素(諸如whiE基因產物)的PKS的情況下(Chater,K.F.和Davis,N.K.Mol.Microbiol.(1990)4:1679-1691)被穀氨酸殘基取代(圖2)；最後是ACP。例如在國際專利申請WO 95/08548中，所述CLF已經被敘述為決定最小PKS產生的聚酮化合物鏈長度的因子。然而，已經發現(Shen,B.等J.Am.Chem.Soc.(1995)117:6811-6821)，當在淡青鏈黴菌(Streptomyces glaucescens)宿主細胞中用辛酮化合物(octaketide)放線菌紫素的CLF取代癸酮化合物(decaketide)丁省黴素時，發現聚酮化合物產物沒有由癸酮化合物改變為辛酮化合物，因此所述CLF的真正作用仍不清楚。已經提出了一種替代的命名法，其中將KS命名為KSα，而將CLF命名為KSβ，反映出對其缺乏了解(Meurer,G.等Chemistry and Biology(1997)4:433-443)。尚不了解將乙酸起子單位和乙酸延伸單位裝載到Ⅱ型PKS的機制，但推測宿主細胞的脂肪酸合酶的丙二醯-CoA:ACP醯基轉移酶可以完成Ⅱ型PKS的相同功能(Revill,W.P.等J.Bacteriol.(1995)177:3946-3952)。
國際專利中請WO 95/08548描述了用來自其它Ⅱ型PKS基因簇的異源DNA取代放線菌紫素的PKS基因，以獲得雜合聚酮化合物。同一國際專利申請WO 95/08548描述了本質上缺乏放線菌紫素天然基因簇的天藍色鏈黴菌的一個菌株的構建，也描述了在該菌株中應用衍生自低拷貝載體SCP2*(分離自天藍色鏈黴菌(Bibb,M.J.和HopWood,D.A.J.Gen.Microbiol.(1981)126:427))的質粒載體pRM5，並且其中異源PKS編碼DNA可以在放線菌紫素基因簇的背馳(divergent)actⅠ/act Ⅲ啟動子區控制之下表達(Fernandez-Moreno,M.A.等J.Biol.Chem.(1992)267:19278-19290)。質粒pRM5也含有得自放線菌紫素生物合成基因簇的編碼特異性激活蛋白ActⅡ-orf4的基因的DNA。ActⅡ-orf4蛋白是置於actⅠ/actⅡ雙向啟動子控制之下的基因轉錄所需的，並且在營養菌絲體從生長轉變為穩定期期間激活基因表達(Hallam,S.E.等Gene(1988)74:305-320)。
已知鏈黴菌屬中的Ⅱ型基因簇通過途徑特異性激活蛋白的基因激活(Narva,K.E.和Feitelson,J.S.J.Bacteriol.(1990)172:326-333；Stutzman-Engwall,K.J.等J.Bacteriol.(1992)174:144-154；Femandez-Moreno,M.A.等Cell(1991)66:769-780；Takano,E.等Mol.Microbiol.(1992) 6:2797-2804；Takano,E.等Mol.Microbiol.(1992)7:837-845)。DnrⅠ基因產物互補天藍色鏈黴菌的actⅡ-orf4基因中的一個突變，暗示DnrⅠ和ActⅡ-orf4蛋白作用於相似的靶。已經描述了一個基因(srmR)(EP 0524832A2)，該基因位於大環內酯聚酮化合物螺旋黴素的Ⅰ型PKS基因簇附近。該基因特異性地激活大環內酯抗生素螺旋黴素的產生，但尚未發現這樣一種基因的其它實例。此外，尚未描述過ActⅡ-orf4/DnrⅠ/RedD激活蛋白家族的同系物作用於Ⅰ型PKS基因。
儘管已經鑑定出大量的治療上重要的聚酮化合物，但仍需要獲得特性增強的或具有全新生物活性的新的聚酮化合物。由Ⅰ型PKS產生的複雜的聚酮化合物特別有價值，因為它們包括已知可用作驅蠕蟲藥、殺蟲劑、免疫抑制劑、抗真菌劑或抗細菌劑的化合物。因為它們結構上的複雜性，這類新的聚酮化合物不容易通過全化學合成獲得，或不容易通過已知的聚酮化合物的化學改性而獲得。
也需要開發可靠並且特異性的方法，以在實踐中配置單個組件，使得構建的所有或大部分雜種PKS基因是有活力的，並且產生所需的聚酮化合物產物。
待審的國際專利申請PCT/GB97/01819公開了一種PKS基因組合(gene assembly)(特別是Ⅰ型)編碼一個裝載組件(module)、然後編碼至少一個延伸組件。因此，圖1顯示DEBS基因的組構。第一個可讀框編碼第一種多酶或盒(DEBS 1)，它由三個組件組成裝載組件(ery-裝載)和兩個延伸組件(組件1和組件2)。裝載組件包括一個醯基轉移酶和一個醯基載體蛋白。可以將其與WO 93/13663 (上文提及的)的圖1相對比。這顯示ORF1僅由兩個組件組成，其中第一個組件實際上同時為裝載組件和第一延伸組件。
PCT/GB97/01819概括地描述了包含一個裝載組件和至少一個延伸組件的一個雜種PKS基因組合的產生。PCT/GB97/01818也描述了(也參見Marsden,A.F.A.等Science(1998)279:199-202)通過將生產除蟲菌素的聚酮化合物合酶的特異性廣的裝載組件，移植到紅黴素PKS的第一多酶組分(DEBS 1)上，以取代正常的裝載組件，來構建一種雜種PKS基因組合。採用雜種PKS基因組合，可以製備某些新的聚酮化合物，如待審的國際專利申請(PCT/GB97/01810)所述。國際專利申請PCT/GB97/01819還描述了，通過將生產雷帕黴素的聚酮化合物合酶的裝載組件移植到紅黴素PKS的第一多酶組分(DEBS 1)上，以取代正常的裝載組件，來構建一種雜種PKS基因組合。雷帕黴素PKS的裝載組件與DEBS和除蟲菌素PKS的裝載組件的不同之處在於它包含一個CoA連接酶結構域、一個烯醯還原酶(「ER」)結構域和一個ACP，使得包括天然起子單位3,4-二羥基環己烷羧酸在內的合適的有機酸可以在PKS裝載結構域上原位活化，同時由ER結構域還原或不還原，然後轉移至ACP，以進行延伸組件1的KS的分子內裝載(Schwecke,T.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:7839-7843)。
已經公開了幾種支配16元大環內酯聚酮化合物生產的Ⅰ型PKS基因簇的DNA序列，所述聚酮化合物包括得自弗氏鏈黴菌(Streptomyces fradiae)的泰樂黴素PKS(EP 0791655A2)、得自天青鏈黴菌(Streptomyces caelestis)的尼達黴素PKS(Kavakas,S.J.等J.Bacteriol.(1998)179:7515-7522)和得自產二素鏈黴菌(Streptomycesambofaciens)的螺旋黴素PKS(EP 0791655A2)。所有這些基因序列的共同之處是，它們顯示出其PKS的裝載組件不同於DEBS和除蟲菌素PKS的裝載組件，因為它們由一個類似延伸組件KS結構域的結構域、一個AT結構域和一個ACP組成(圖3)。所述額外的N末端KS樣結構域已經命名為KSq，因為每種情況下它與延伸KS的不同之處在於β-酮脂醯-ACP合酶活性必需的活性位點半胱氨酸殘基被穀氨醯胺(以單字母表示時為Q)殘基取代。KSq結構域的功能尚不清楚(Kavakas,S.J.等J.Bacteriol.(1998)179:7515-7522)，但其在這些16元大環內酯PKS中存在使人感到意外，因為泰樂黴素、尼達黴素和螺旋黴素的起子單位看來分別是丙酸、乙酸和乙酸，亦即與DEBS中的起子單位類型相同。與KSq結構域相鄰的AT在此命名為ATq結構域。
當用泰樂黴素PKS的完整裝載組件取代產二素鏈黴菌中螺旋黴素的類似裝載組件(Kuhstoss等Gene(1996)183:231-236)時，顯示出起子單位的本質由乙酸轉變為丙酸。由於尚不了解KSq結構域的作用，因此沒有具體的公開內容或者揭示KSq結構域的重要性，或者揭示這些含KSq裝載組件甚至在大環內酯高生產水平下，在確保所述聚酮化合物產物在起子單位方面的純度的可能用途。對這些結果的解釋敘述為「因此，我們相信，本文描述的實驗為下述假說提供了強有力的實驗支持Ⅰ型PKS系統中的AT結構域選擇合成中每一步驟的合適底物」(Kuhstoss等Gene(1996)183:231-236，第235頁)。這些作者注意到與Ⅱ型PKS系統中CLF蛋白的類似性，並且所述CLF蛋白被認為參與決定鏈長度。他們敘述到「KSq可能起相似作用，儘管不清楚為什麼這樣一種功能在這些16元聚酮化合物合成中是必需的，而其它複雜的聚酮化合物諸如6-DEB或雷帕黴素的合成不需要這樣一種功能。在任何情況下，KSq都不可能參與每一個合成步驟的底物選擇。」(Kuhstoss等Gene(1996)183:23l-236)。
已經表明，當採用遺傳工程來去除DEBS的裝載組件時，紅色糖多孢菌中所得的截短的DEBS繼續產生低水平的含丙酸起子單位的紅黴素(Pereda,A.等Microbiology(1995)144:543-553)。同一出版物表明，當在這種截短的DEBS中，延伸組件1的甲基丙二醯-CoA特異性AT被得自雷帕黴素PKS延伸組件的丙二醯-CoA特異性AT取代，產物也是低水平含丙酸起子單位的紅黴素，證明起子單位的來源不是由組件1的AT將裝載到該酶上的(甲基)丙二醯基脫羧的結果，而是丙醯-CoA對延伸組件1的KS直接醯化的結果。這與先前的報導形成對比，先前的報導採用部分純化的DEBS1+TE，這是一種得自DEBS的截短的雙組件PKS(Kao,C.M.等J.Am.Chem.Soc.(1995)117:9105-9106)，並且在功能上等同於DEBS1-TE(Brown,M.J.B.等J.Chem.Soc.Chem.Commun.(1995)1517-1518；Cortés,J.等Science(1991)2523:675-679)，所述先前的報導表明DEBS的起子單位的來源可以包括甲基丙二酸(methylmalonate)單位，它被裝載到組件1上，並由組件1的KS脫羧(Pieper,R.等Biochemistry(1997)36:1846-1851)。現在已經發現，當將DEBS1-TE蛋白從重組紅色糖多孢菌中完全純化時，它不含這樣的特異性脫羧酶活性(Weissmann,K.等(1998)Biochemistry,37,11012-11017)，這進一步證實起子單位事實上的確不是通過延伸組件1的KS介導的延伸單位的脫羧而產生的。
已知DEBS裝載組件的特異性僅比丙酸略廣，特別是當含這種裝載組件的PKS是或者在紅黴素生產的天然宿主紅色糖多孢菌中表達的PKS(參見例如Cortés,J.等Science(1995)268:1487-1489)的一部分，或者是在諸如天藍色鏈黴菌的異源宿主中表達的PKS(Kao,C.M.等J.Am.Chem.Soc.(1994)116:11612-11613；Brown,M.J.B.等J.Chem.Soc.Chem.Commun.(1995)1517-1519)的一部分時，在體外和體內均使用乙酸起子單位。在採用純化的DEBS1-TE的體外實驗中，已經證明，丙醯-CoA和乙醯-CoA是分別有效供應給裝載組件丙酸或乙酸單位的替代底物(Wiessman,K.E.H.等Chemstry and Biology(1995)2:583-589；Pieper,R.等J.Am.Chem.Soc.(1995)117:11373-11374)。乙酸和丙酸之間競爭的結果受所用宿主細胞中佔優勢的丙醯-CoA和乙醯-CoA的相應細胞內濃度影響(參見例如Kao,C.M.等Science(1994)265:509-512；Pereda,A.等Microbiology(1995)144:543-553)。它也由宿主PKS表達的水平決定，使得如例如在待審的國際專利申請PCT/GB97/01819中公開的，當重組DEBS或另一種含DEBS裝載組件的雜種PKS在紅色糖多孢菌中過量表達時，產物通常為混合物，其組分之間的不同之處僅在於不是存在乙酸起子單位就是存在丙酸起子單位。
需要開發可靠的方法，來避免形成既具有乙酸起子單位也具有丙酸起子單位的聚酮化合物的混合物，並且使得可以特異性地摻入不常見的起子單位。現在已經意外地發現，16元大環內酯泰樂黴素、尼達黴素和螺旋黴素的PKS中的裝載結構域，其作用不同於除蟲菌素PKS和DEBS的裝載結構域的作用。已經認識到，泰樂黴素PKS的KSq結構域和相關的AT結構域(在此命名為ATq)一起負責高度特異性地產生乙酸起子單位，因為所述ATq特異性地裝載甲基丙二醯-CoA，而不是先前認為的特異性地裝載丙醯-CoA；所述KSq負責將所述酶結合的甲基丙二酸單位特異性脫羧，形成連接至裝載組件的ACP結構域的丙酸單位，並且將其適當地放置，以轉移至延伸組件1的KS，以引發鏈延伸。螺旋黴素和尼達黴素PKS的ATq和相鄰的KSq以類似的方式負責特異性地裝載丙二酸酯單位，而不是如先前認為的裝載乙酸單位，並且將其隨後特異性脫羧，提供乙酸起子單位以進行聚酮化合物鏈延伸。
在這一點上，現在也發現，不僅上述16元大環內酯的PKS，而且某些14元大環內酯、特別是得自抗生鏈黴菌(Streptomycesantibioticus)的夾竹桃黴素PKS(圖4)以及某些聚醚實電解質聚酮化合物、特別是得自肉桂地鏈黴菌(Streptomyces cinnamonensis)的推定的莫能菌素(圖4)，均具有一個裝載結構域，該結構域包括一個KSq結構域、一個ATq結構域和一個ACP。在圖4中顯示了已經鑑定的所述KSq結構域和相鄰連接的ATq結構域的序列對比，顯示出所述KSq結構域中保守的活性位點穀氨醯胺(Q)殘基和一個在所有延伸AT結構域中保守且也在ATq結構域中完全保守的精氨酸殘基。在或者DEBS或者除蟲菌素PKS裝載組件的AT結構域中，所述AT的底物是非羧化醯基-CoA酯，該殘基在特性上不是精氨酸(Haydock,S.F.等FEBSLetters(1995)374:246-248)。縮寫ATq在此用來簡單地將發現緊接KSqC末端的AT結構域與延伸AT區別開來，該標記沒有其它意義。
一方面，本發明提供PKS多酶或其部分，或編碼它的核酸(一般為DNA)，所述多酶或部分包含一個裝載組件和多個延伸組件，其中(a)所述裝載組件被改變為裝載丙二醯或取代的丙二醯殘基，然後實現所裝載殘基的脫羧，提供乙醯殘基或取代的乙醯基(該術語包括丙醯基)以轉移至延伸組件；和(b)所述延伸組件或至少一個延伸組件(最好至少鄰接所述裝載組件的那個延伸組件)與實現任選取代的丙二醯殘基脫羧的裝載組件不是天然連接的。
一般而言，所述裝載組件也包括一個ACP(醯基載體蛋白)結構域。
最好是，所述裝載組件的脫羧功能性由KS(酮合酶(ketosynthase))型結構域提供。合適的是，這與常規延伸組件的KS的不同之處在於在活性位點中擁有一個穀氨醯胺殘基，而不是必需的半胱氨酸殘基。它稱為Ksq。它可以是「天然的」或遺傳工程改造的，例如通過定點誘變編碼不同KS(諸如延伸組件的KS)的核酸而產生的基因工程改造。
或者，所述脫羧功能性可以由Ⅱ型PKS系統中存在的一般類型的CLF型結構域提供。
最好是，所述裝載功能性由類似常規延伸組件的AT結構域的AT(醯基轉移酶)型結構域提供，常規延伸組件的AT結構域在活性位點具有一個精氨酸殘基，而裝載乙酸或丙酸的裝載組件的AT結構域的情況不是這樣，例如在DEBS或除蟲菌素PKS系統中。它可以稱為Atq。再一次，它可以是「天然的」或例如通過對延伸組件的AT誘變而遺傳工程改造的。
所述裝載組件通常為以下形式Ksq-ATq-ACP其中ACP為醯基載體蛋白。
另一方面，本發明提供一種方法，通過提供一種加入上文定義的特異性提供所需起子單位的裝載組件的PKS多酶，來合成基本上僅有所需起子單位的聚酮化合物。這可以包括提供編碼所述多酶的核酸，並將其引入可以將其表達的生物體中。再一方面，本發明提供含有編碼所述多酶的載體和轉化生物體和培養物。一個優選實施方案是一種培養物，所述培養物產生一種特徵為基本上不存在具有不同起子單位的、具有所需起子單位的聚酮化合物。因此，例如可以產生這樣的紅黴素所述紅黴素基本上不含因為摻入乙酸起子單位而不是丙酸起子單位而產生的類似物。
所述雜種PKS最好編碼一個裝載組件和2-7個延伸組件以及一個鏈終止酶(一般為硫酯酶)。為製備僅含有或幾乎僅含有乙酸起子單位的12元、14元或16元大環內酯，給產生12元、14元或16元大環內酯的PKS基因組合提供KSq-ATq-ACP型裝載組件特別有用，甚至當這樣的PKS基因組合在放線菌宿主細胞中以高水平表達時也是如此。用於此目的的特別合適的PKS是用於生物合成以下大環內酯的PKS的組分紅黴素、酒黴素、夾竹桃黴素、泰樂黴素、螺旋黴素、麥迪黴素和尼達黴素，所有這些PKS的基因和組件組構至少部分是已知的。特別合適的編碼KSq-ATq-ACP型裝載組件的基因來源是夾竹桃黴素、螺旋黴素、尼達黴素、酒黴素和莫能黴素的裝載組件，它們特異性地裝載丙二酸酯單位，然後將其脫羧為乙酸起子單位。
大環內酯利福黴素、除蟲菌素、雷帕黴素、免疫黴素(immunomycin)和FK506的PKS的裝載組件具有與眾不同的特異性(並且所有這些大環內酯的基因和組件組構至少部分是已知的)，同樣，為產生僅含有或幾乎僅含有乙酸起子單位的大環內酯，給產生這些大環內酯的PKS基因組合提供KSq-ATq-ACP型裝載組件特別有用，甚至當這樣的PKS基因組合在放線菌宿主細胞中以高水平表達時也是如此。編碼KSq-ATq-ACP型裝載組件的特別合適的基因來源是夾竹桃黴素、螺旋黴素、尼達黴素、酒黴素和莫能黴素的裝載組件，它們特異性地裝載丙二酸酯單位，然後將其脫羧為乙酸起子單位。
為製備僅含有或幾乎僅含有丙酸起子單位的12元、14元或16元大環內酯，給產生12元、14元或16元大環內酯的PKS基因組合提供KSq-ATq-ACP型裝載組件同樣特別有用，甚至當這樣的PKS基因組合在放線菌宿主細胞中以高水平表達時也是如此。用於此目的的特別合適的PKS是用於生物合成以下大環內酯的PKS的組分紅黴素、酒黴素、夾竹桃黴素、泰樂黴素、螺旋黴素、麥迪黴素和尼達黴素，所有這些PKS的基因和組件組構至少部分是已知的。特別合適的編碼KSq-ATq-ACP型裝載組件的基因來源是泰樂黴素的裝載組件，它們特異性地裝載甲基丙二酸單位，然後將其脫羧為丙酸起子單位。大環內酯利福黴素、除蟲菌素、雷帕黴素、免疫黴素和FK506的PKS的裝載組件具有與眾不同的特異性(並且所有這些大環內酯的基因和組件組構至少部分是已知的)，為產生僅含有或幾乎僅含有丙酸起子單位的大環內酯，給產生這些大環內酯的PKS基因組合提供KSq-ATq-ACP型裝載組件同樣特別有用，甚至當這樣的PKS基因組合在放線菌宿主細胞中以高水平表達時也是如此。編碼KSq-ATq-ACP型裝載組件的特別合適的基因來源是泰樂黴素的裝載組件，它們特異性地裝載甲基丙二酸單位，然後將其脫羧為丙酸起子單位。
在KSq-ATq-ACP型的裝載組件中，它們的結構域或部分可以衍生自相同或不同的來源，包括或者天然結構域或者工程改造的結構域。例如，ATq結構域可以被衍生自Ⅰ型PKS、相應地或者特異性地裝載丙二酸酯單位或者特異性地裝載甲基丙二醯酯單位的任何延伸組件的AT結構域取代，只要選擇所述KSq結構域相應地或者對甲基丙二酸單位或者對丙二酸酯單位具有匹配特異性即可。
或者，在所提供的Ksq-ATq-ACP型裝載組件中的KSq結構域可以被Ⅱ型PKS的CLF多肽取代。先前鑑定所述CLF為唯一決定鏈長度的因子，現在看來顯然相反，所述CFL除了它可能具有的任何其它活性外，還是所述KSq結構域的類似物，並且對於結合的丙二酸酯單位可以用作脫羧酶。
對於Ⅱ型PKS的CLF結構域具有脫羧活性的這種了解，已經使得我們設計在Ⅱ型系統中有用的幹預，例如以提高在某些發酵中可獲得的產量。許多高產工業發酵由於摻入不想要的起子，往往得到混合物。在具有產生不常見起子的輔助基因的系統中，情況尤為如此。CLF基因可以用來產生不想要的醯基種類，產生摻入不想要的醯基單位的產物。
例如，土黴素的生產涉及一種不常見的丙二醯氨基起子。然而，CLF結構域的不想要的活性引起某些脫羧反應，而導致摻入乙醯基。道諾黴素合成同樣涉及一種不常見的起子，所述起子具有CLF結構域的所述「寄生」活性的傾向。
CLF結構域的活性位點(對於脫羧)一般包括一個穀氨醯胺殘基。我們發現，通過突變，將所述Gln殘基轉化為(例如)Ala，可以除去所述結構域的脫羧活性。
因此，另一方面，本發明提供用於合成Ⅱ型(芳族)聚酮化合物的系統和方法，其中Ⅱ型PKS的CLF結構域的gln殘基突變，以抑制脫羧活性。用於完成這一點的定點誘變的技術是本領域技術人員眾所周知的。
可以將Ksq-ATq-ACP型裝載組件連接至例如在PCT/GB97/01819和PCT/GB97/01810中產生的雜種PKS。將這樣一種裝載組件連接至編碼雜種PKS的基因組合上特別有用，所述雜種PKS例如如PCT/GB97/01819和PCT/GB97/01810中所述產生新的14元大環內酯衍生物。
本發明還提供裝配有Ksq-ATq-ACP型裝載組件的這種PKS組合、含有這種組合的載體以及可以表達所述組合的轉化生物體。轉化生物體可以帶有(harbour)重組質粒，或所述質粒可以整合。具有int序列的質粒將整合到宿主染色體的特定附著位點(att)中。轉化生物體可能能夠修飾初始產物，例如進行紅黴素(如圖5所示)和其它聚酮化合物的產生中正常的所有或某些生物合成修飾。可以使用突變生物體，使得阻斷某些正常途徑，例如以產生沒有一個或多個「天然」羥基或糖基的產物。本發明還提供可由轉化生物體直接或間接產生的新的聚酮化合物。這包括經過酶修飾的聚酮化合物。
在又一方面，本發明以在起子單位的特性方面比迄今可能獲得的更純形式提供先前獲得的大環內酯和新大環內酯。這些包括或者為「天然的」或者在以下方面可能不同於相應的「天然」化合物的12元環、14元環和16元環大環內酯a)在一個或多個所述酮(ketide)單位的氧化態方面(即從以下選擇可替代物-CO-、-CH(OH)-、烯烴-CH-和-CH2-)，其中任何-CH(OH)-的立體化學也是獨立可選擇的；b)在缺乏一個「天然」甲基側鏈方面；或c)在「天然」甲基的立體化學方面；和/或非甲基的環取代基方面。
製備與在以上a)-c)中的兩條或兩條以上鑑定的不同於所述天然產物的12元環、14元環和16元環大環內酯的衍生物也是可能的。
也可以製備已經由非PKS酶經過進一步加工的任何上述的聚酮化合物，所述加工例如為一次或多次的羥基化、環氧化、糖基化和甲基化。
本發明提供一種獲得已知的和新的複雜大環內酯的新方法，而同時不形成僅在或者具有乙酸起子單位或者具有丙酸起子單位方面不同的化合物。另外，本發明提供一種獲得新聚酮化合物的方法，在所述聚酮化合物中，所述起子單位是一種不常見的起子單位，該起子單位通過KSq結構域對具獨特特異性的AT的所述酶結合產物的作用而衍生，所述具獨特特異性的AT衍生自一種天然Ⅰ型PKS延伸組件。具體地說，FK506 PKS基因簇延伸組件4的AT優先摻入烯丙基側鏈；尼達黴素PKS基因簇延伸組件6的AT優先摻入結構為HOCH2-的側鏈；螺旋黴素延伸組件5和莫能黴素延伸組件5的AT摻入乙基側鏈。在所有情況下，所述KSq結構域均優先是天然丙酸特異性的KSq結構域。或者，通過定點誘變所述活性位點半胱氨酸殘基，以將其用另一殘基取代，最好是用穀氨醯胺取代，可以將得自Ⅰ型PKS延伸組件的任何KS轉變為能夠將結合的羧化醯基硫酯脫羧的KSq結構域。已知與Ⅰ型PKS共享許多機制特徵的動物脂肪酸合酶，在缺乏乙醯-CoA時，具有可證明的丙二醯-CoA脫羧酶活性(Kresze,G.B.等Eur.J.Biochem.(1977)79:191-199)。當用諸如碘乙醯胺的烷化劑處理時，通過特異性地修飾所述KS的活性位點半胱氨酸，使所述脂肪酸合酶失活，所產生的蛋白質具有增強的丙二醯-CoA脫羧酶活性。將脂肪酸KS結構域轉變為脫羧酶，反映出所述KS結構域和Ⅰ型PKS中的KSq結構域之間的遺傳決定的變化。實際上，穀氨醯胺側鏈的大小和極性特徵與羧醯胺-半胱氨酸的大小和極性特徵非常接近。待用於將獨特的烷基丙二酸酯單位脫羧的KSq最好選自提供所述獨特AT的同一種Ⅰ型PKS的同一延伸組件，以便使所述獨特的烷基丙二酸酯的脫羧最佳化，待使用的ACP最好也是同一延伸組件的ACP。
適用於表達加入了改變的裝載組件的PKS基因的質粒載體和基因工程細胞，是那些描述於PCT/GB97/01819的適用於表達Ⅰ型雜種PKS基因的載體和細胞。有效宿主的實例是紅色糖多孢菌、天藍色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌(Streptomyces avermitilis)、灰褐鏈黴菌(Streptomycesgriseofuscus)、肉桂地鏈黴菌、弗氏鏈黴菌、長孢黃色鏈黴菌(Streptomyces longisporoflavus)、吸水鏈黴菌、灰略紅小單胞菌(Micromonospora griseorubida)、拉沙裡鏈黴菌(Streptomyceslasaliensis)、委內瑞拉鏈黴菌(Streptomyces venezuelae)、抗生鏈黴菌、淺青紫鏈黴菌(Streptomyces lividans)、龜裂鏈黴菌(Streptomycesrimosus)、白色鏈黴菌(Streptomyces albus)、地中海擬無枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)和Streptomyces tsukubaensis。這些包括已知SCP2*-衍生的質粒在其中自主複製的宿主，諸如天藍色鏈黴菌、除蟲鏈黴菌和灰褐鏈黴菌；以及其它宿主，諸如其中SCP2*-衍生的質粒通過所述質粒插入片段上的序列和染色體上的序列的同源重組整合到染色體中的紅色糖多孢菌；和用自殺質粒載體轉化整合轉化的所有這樣的載體。
現在參考附圖提供本發明的某些實施方案，在附圖中圖1為一圖表，顯示6-脫氧紅黴內酯B合酶(DEBS)的作用方式(functioning),DEBS為生產紅黴素A前體6-脫氧紅黴內酯B(6-DEB)的組件(modular)PKS。
圖2給出了所述KS結構域和代表性Ⅱ型PKS基因簇的CLF結構域的胺基酸序列比較。KS結構域中的活性位點半胱氨酸(C)在圖中用箭頭指示，與所述CLF結構域的穀氨醯胺(Q)或穀氨酸(E)相對(align)。所用的縮寫和相關的Genbank/EMBL登錄號為GRA得自紫紅鏈黴菌(Streptomyces violaceoruber)的榴菌素(X63449)；HIR得自披髮糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsuta)的未知聚酮化合物(M98258)；ACT得自天藍色鏈黴菌的放線菌紫素(X63449)；CIN得自肉桂地鏈黴菌的未知聚酮化合物(Z11511)；VNZ得自委內瑞拉鏈黴菌的jadomycin(L33245)；NOG得自黑胡桃鏈黴菌(Streptomyces nogalater)的anthacyclines (Z48262)；TCM得自淡青鏈黴菌的丁省黴素(M80674)；DAU得自種名待定的鏈黴菌C5(Streptomyces sp.C5)的道諾黴素(L34880)；PEU得自波賽鏈黴菌(Streptomyces peucetius)的阿黴素(L35560)；WHI得自天藍色鏈黴菌的WhiE孢子色素(X55942)。
圖3顯示泰樂黴素、螺旋黴素和尼達黴素三種16元環大環內酯的PKS的基因組構。
圖4顯示尼達黴素、platenolide(螺旋黴素)、莫能黴素、夾竹桃黴素和泰樂黴素的PKS的KSq-ATq裝載二結構域的胺基酸序列對比。莫能黴素和夾竹桃黴素裝載二結構域的序列先前沒有公開。
圖5在紅色糖多孢菌中將6-脫氧紅黴內酯B轉化為紅黴素A的酶促步驟。
圖6為顯示質粒pJLK117構建的圖。
圖7顯示兩種寡核苷酸的結構。
現在描述本發明，但本發明將不受某些實施例的限制。
所有NMR譜均在CDCl3中測量，除非另有說明，都採用Bruker500MHz DMX波譜儀，峰的位置以四甲基矽烷為標準，以每百萬的份數(ppm)的低磁場場位移表示。NMR結構中顯示的原子數不代表標準命名法，但使NMR數據與該特定實施例相關。HPLC方法1色譜柱 Waters Symmetry 5_C18 2.1mm×150mm流速0.29ml/min流動相 梯度A∶B(22∶78)至A∶B(38∶62)，時間12分鐘；然後第15分鐘至A∶B(80∶20)。保持1分鐘。在下一個樣品之前再平衡。其中A=乙腈，B=0.01M乙酸銨在10％乙腈和0.02％TFA中的溶液方法B色譜柱 Waters Symmetry 5_C18 2.1mm×150mm流速0.29ml/min流動相 梯度28∶72乙腈∶10mM NH4OAc至50∶50，18分鐘；50∶50直至第25分鐘。回到28∶72，再平衡7分鐘。
儀器用配有APCI源的Hewlett-Packard 1050液相層析獲得自來水培養基葡萄糖 5g/升胰蛋白腖5g/升酵母提取物 2.5g/升EDTA36mg/升自來水 至1L總體積ERY-P培養基葡萄糖 50g/升NutrisoyTM粉30g/升(NH4)2SO43g/升NaCl5g/升CaCO36g/升自來水 至1L總體積將pH調至7.0實施例1重組載體pPFL43的構建如PCT/GB97/01819中所述製備質粒pCJR24。pPFL43是一種基於pCJR24的質粒，含有編碼雜種聚酮化合物合酶的基因，所述基因含有推定的莫能黴素PKS裝載組件(分離自肉桂地鏈黴菌)、DEBS延伸組件1和2以及鏈終止硫酯酶。如下構建質粒pPFL43使用以下合成的寡核苷酸5』-CCATATGGCCGCATCCGCGTCAGCGT-3』和5』-GGCTAGCGGGTCCTCGTCCGTGCCGAGGTCA-3』，用含有得自肉桂地鏈黴菌的推定的莫能黴素生產PKS基因的5』端的粘粒，或肉桂地鏈黴菌的染色體DNA用作為模板，擴增編碼推定的莫能黴素生產裝載組件。3.3kbp的PCR產物經凝膠電泳純化，用T4多核苷酸激酶處理，並連接至已經通過用SmaⅠ消化線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL40。通過限制圖譜和序列分析鑑定質粒pPFL40。
質粒pHD30His是一種pNEWAVETE的衍生物(PCT/GB97/01810)，它含有除蟲菌素裝載組件、紅黴素延伸組件1和2以及ery硫酯酶結構域。質粒pNEWAVETE用EcoRⅠ和HindⅢ切割，插入合成寡核苷酸接頭，所述合成寡核苷酸接頭編碼將C末端多組氨酸尾加至所述多肽。將以下寡核苷酸一起退火5』-AATTCACATCACCATCACCATCACTAGTAGGAGGTCTGGCCATCTAGA-3』和5』-AGCTTCTAGATGGCCAGACCTCCTACTAGTGATGGTGATGGTGATGTG-3』，將該雙鏈體連接至EcoRⅠ和HindⅢ切割的pNEWAVETE。所產生的質粒用NdeⅠ和XbaⅠ切割，並連接到預先已經用同樣兩種酶切割的質粒pCJR24中，產生質粒pND30His。
質粒pPFL40用NdeⅠ和NheⅠ消化，3.3kbp片段經凝膠電泳純化，連接至預先用NdeⅠ和NheⅠ消化並用鹼性磷酸酶處理的pND30-His。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL43。通過限制酶切分析鑑定質粒pPFL43。實施例2紅色糖多孢菌JC2/pPFL43的構建用質粒pPFL43轉化紅色糖多孢菌JC2的原生質體。在待審的專利申請PCT/GB97/01819中給出了基本上缺失常駐的DEBS基因的菌株JC的構建。在含有10μg/ml硫鏈絲菌肽的R2T20培養基中選擇硫鏈絲菌肽抗性菌落。通過將基因組DNA與DIG標記的含編碼所述裝載組件的mon PKS片段的DNA進行DNA印跡雜交，測試幾個克隆內整合到染色體中的pPFL43的存在。實施例3用紅色糖多孢菌JC2/pPFL43生產聚酮化合物將紅色糖多孢菌JC2/pPFL43的冷凍懸浮液接種到含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的eryP培養基中。讓接種的培養物於28-30℃生長7天。此後將肉湯過濾以除去菌絲體，並將pH調至pH=3.0。肉湯用兩體積的乙酸乙酯萃取2次，合併的萃取液用等體積飽和氯化鈉洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，並減壓除去乙酸乙酯，得到粗製產物。顯示所述產物具有下示結構，並且通過MS、GC-MS和1H NMR分析，發現與真正的樣品相同。 實施例4紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL43的構建用質粒pPFL43轉化紅色糖多孢菌NRRL2338的原生質體。在含有10μg/ml硫鏈絲菌肽的R2T20培養基中選擇硫鏈絲菌肽抗性菌落。通過將基因組DNA與DIG標記的含編碼所述裝載組件的mon PKS片段的DNA進行DNA印跡雜交，測試幾個克隆內整合到染色體中的pPFL43的存在。以該方式選擇出一個具有pPFL43整合拷貝的克隆。實施例5a用紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL43生產13-甲基-紅黴素A和B紅色糖多孢菌NRRL2338(pPFL43)如實施例2所述，通過用莫能黴素裝載件(loader)-D1TE DNA插入片段取代野生型裝載結構域而構建，將紅色糖多孢菌NRRL2338(pPFL43)培養物接種到300ml三角錐瓶中含有50μg/ml硫鏈絲菌肽的30ml自來水培養基中。於29℃培養3天後，用該燒瓶培養物接種300ml燒瓶中的300ml ERY-P培養基中。該肉湯以200rpm於29℃培養6天。此後，用NaOH將整個肉湯調至pH8.5，然後用等體積的乙酸乙酯萃取。用Zymark TurboVap LV蒸發器，將乙酸乙酯萃取物於45℃氮氣流下蒸發至幹，然後在0.0625體積的甲醇中重建，以將萃取物濃縮16倍。通過LC/MS、方法A證實產物的結構。觀察到作為主要組分的4.0min保留時間峰，m/z值為720(M+H)+，符合13-甲基-紅黴素A的要求。觀察到保留時間為6.4min的第二個峰，m/z值為704(M+H)+，符合13-甲基-紅黴素B的要求。實施例5b用紅色糖多孢菌NRRL2338(pPFL43)以/8L規模生產和回收13-甲基-紅黴素A和B將紅色糖多孢菌NRRL2338(pPFL43)接種到2.81費氏燒瓶中含有50μg/ml硫鏈絲菌肽的1000ml自來水培養基中。於29℃培養3天後，用該燒瓶培養物接種141 Microferm發酵罐(New Brunswick ScientificCo.,Inc.,Edison,NJ)中的8l ERY-P培養基中。該肉湯於28℃下培養，通氣率為8l/min，以800rpm攪拌，用NaOH或硫酸(15％)將pH保持在6.9-7.3。加入水，以24小時體積水平保持體積。繼續發酵167小時。此後用NaOH將從發酵罐取出肉湯樣品調至pH8.5，然後用等體積的乙酸乙酯萃取，證實13-甲基-紅黴素A和B的存在。用ZymarkTurbo Vap LV蒸發器，將乙酸乙酯萃取物於45℃氮氣流下蒸發至幹，然後在0.25體積的甲醇中重建，以將萃取物濃縮4倍。通過LC/MS、方法A證實產物的結構。觀察到作為主要組分的4.1min保留時間的峰，m/z值為720(M+H)+，符合13-甲基-紅黴素A的要求。觀察到保留時間為6.6min的第二個峰，m/z值為704(M+H)+，符合13-甲基-紅黴素B的要求。
加工含有約2.8克13-甲基-紅黴素A的約35升肉湯以回收產物。將肉湯通過中間試驗規模的Ceraflo陶瓷裝置過濾，並上樣至500mlXAD-16樹脂柱上。用100％甲醇稀釋產物。製備175ml CG-161吸附柱，並用20％甲醇/水平衡。將所述產物溶液的一部分調至20％甲醇溶液，上樣至該柱上，沒有觀察到產物穿透。用直至40％甲醇/水洗滌該柱也不能去除任何顯著水平的雜質。用50％甲醇/水洗脫，達到所述產物與兩種主要雜質的層析分離，所述主要雜質為13-甲基-紅黴素B和一種降解產物13-甲基-脫氫紅黴素A。合併最純的流分，採用蒸發將體積減少約75％，達到＜10％甲醇濃度。為了增強13-甲基-紅黴素A的提取，加入固體碳酸氫鈉直至獲得250mM的總濃度。用二氯甲烷2次萃取水性產物層，每次用總體積的一半。通過蒸發將體積減小，得到淺黃色固體。通過將粗製晶體於室溫下溶於二氯甲烷中，然後用己烷稀釋至15％二氯甲烷，純化13-甲基-紅黴素A。將渾濁的溶液置於-10℃下約30分鐘，此時將液體傾至第二個燒瓶中，留下作為油狀物的大多數雜質。將燒瓶於-10℃靜置過夜，然後在第二天過濾出灰白色的13-甲基-紅黴素A晶體。通過351肉湯體積的部分處理，分離出約300毫克的13-甲基-紅黴素A。
用100克蒸發的母液進一步分離13-甲基-紅黴素B。通過用乙酸水溶液(pH 5)重複萃取原始樣品，除去殘留的13-甲基-紅黴素A。隨後的二氯甲烷層在700g矽膠上層析分離，用20％甲醇的二氯甲烷溶液洗脫。將經LC/MS測定的13-甲基-紅黴素B富集部分合併並蒸發，產生約11.0克深色油狀物。將該油狀物溶於最小量的甲醇中，並上樣至500ml Amberchrom CG-161樹脂上。用40％甲醇的去離子水溶液，以2倍床體積/小時洗脫出13-甲基-紅黴素B。收集一倍床體積的部分，並經LC/MS分析。合併部分42-62，用去離子水稀釋至約20％甲醇，用碳酸氫鈉中和至pH7.5。所產生的溶液用41二氯甲烷萃取1次，將其濃縮至約500ml並經無水硫酸鎂乾燥。通過過濾除去硫酸鎂後，將濾液蒸發，得到約110mg淺褐色固體。將110mg粗製13-甲基-紅黴素B溶於約3.0毫升HPLC級乙腈中，並上樣至20cm×20cm、2mm厚的矽膠製備型薄層層析(PTLC)板上。該板用60∶40甲醇∶乙腈展層。取出得自PTLC板的所需矽膠部分(碘目測法)，用HPLC級丙酮萃取。將丙酮萃取液蒸發，得到12.1mg透明固體。
通過質譜(LC/MS方法B)和NMR光譜學，證實13-甲基-紅黴素A和13-甲基-紅黴素B的鑑定。13-甲基-紅黴素A樣品峰的保留時間為4.7min,m/z值為720(M+H)+，符合13-甲基-紅黴素A的要求。13-甲基-紅黴素B樣品峰的保留時間為7.6min,m/z值為704(M+H)+，符合13-甲基-紅黴素B的要求。NMR,13-甲基-紅黴素A #13C-ppm #H 1H-ppm1 221.9102 175.9903 103.6314.45496.8114.88583.7613.60679.8614.10778.3613.05875.500974.8701073.0701172.2515.191271.2513.261369.5313.531469.2413.971566.1614.061665.9612.481749.9633.361845.3612.791945.0712.812040.7332.322139.0013.152235.3022.42/1.612427.2031.502521.9231.282621.8231.272718.9931.322818.6031.222916.0731.193015.0831.193114.2331.263212.1231.1933 9.6031.153439.0021.98/1.753528.9021.72/1.273640.9412.05NMR,13-甲基-紅黴素B
實施例6重組載體pPFL42的構建pPFL42是一種基於pCJR24的質粒，含有編碼雜種聚酮化合物合酶的基因，所述基因含有泰樂黴素生產PKS裝載組件、紅黴素延伸組件1和2以及鏈終止硫酯酶。如下構建質粒pPFL42使用以下合成的寡核苷酸5』-CCATATGACCTCGAACACCGCTGCACAGAA-3』和5』-GGCTAGCGGCTCCTGGGCTTCGAAGCTCTTCT-3』，或者用cos6T(一種含有弗氏鏈黴菌泰樂黴素生產PKS基因的粘粒)作為模板，或者用得自弗氏鏈黴菌的染色體DNA作為模板，擴增編碼泰樂黴素生產裝載組件的DNA。3.3kbp的PCR產物經凝膠電泳純化，用T4多核苷酸激酶處理，並連接至已經通過用SmaⅠ消化線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL39。通過限制圖譜和序列分析鑑定質粒pPFL39。
質粒pPFL39用NdeⅠ和NheⅠ消化，所述3.3kbp片段經凝膠電泳純化，連接至預先用NdeⅠ和NheⅠ消化並用鹼性磷酸酶處理的pND30。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL42。通過限制酶切分析和序列分析鑑定質粒pPFL42。實施例7紅色糖多孢菌JC2/pPFL42的構建用質粒pPFL42轉化紅色糖多孢菌JC2的原生質體。在含有10μg/ml硫鏈絲菌肽的R2T20培養基中選擇硫鏈絲菌肽抗性菌落。通過將基因組DNA與DIG標記的含編碼裝載組件的tyl PKS片段的DNA進行DNA印跡雜交，測試幾個克隆內整合到染色體中的pPFL42的存在。以該方式鑑定出一個具有pPFL42整合拷貝的克隆。實施例8用紅色糖多孢菌JC2/pPFL42生產聚酮化合物用紅色糖多孢菌JC2/pPFL42的冷凍懸浮液接種含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的eryP培養基，並其於28-30℃生長7天。此後將肉湯過濾以除去菌絲體，並將pH調至pH=3。肉湯用兩體積的乙酸乙酯萃取2次，合併的萃取液用等體積飽和氯化鈉洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，並減壓除去乙酸乙酯，得到粗製產物。顯示所述產物具有下示結構，並且通過MS、GC-MS和1HNMR判斷，與真正的樣品相同 實施例9紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL42的構建用質粒pPFL42轉化紅色糖多孢菌NRRL2338的原生質體。在含有10μg/ml硫鏈絲菌肽的R2T20培養基中選擇硫鏈絲菌肽抗性菌落。通過將基因組DNA與DIG標記的含編碼裝載組件的tyl PKS片段的DNA進行DNA印跡雜交，測試幾個克隆內整合到染色體中的pPFL42的存在。以該方式鑑定出一個具有pPFL42整合拷貝的克隆。實施例10用紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL42生產聚酮化合物用紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL42的冷凍懸浮液接種含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的eryP培養基，並讓其於28-30℃生長7天。此後將肉湯過濾以除去菌絲體，並將pH調至pH=9。上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，並通過蒸發除去溶劑。產物經HPLC/MS分析，鑑定出具有與真正的紅黴素A相同的以下結構的大環內酯(以及其它產物，所述其它產物鑑定為相應的紅黴素B和D，為後-PKS不完全加工的結果)實施例11質粒pPFL35的構建質粒pPFL35是一種基於pCJR24的質粒，含有一個包含一個裝載組件、DEBS的第一和第二延伸組件和鏈終止硫酯酶的PKS基因。所述裝載組件包含與雷帕黴素PKS組件2的丙二醯-CoA特異性AT融合、得自夾竹桃黴素PKS裝載組件的KSq結構域DNA，該KSq結構域DNA再連接至DEBS裝載組件ACP。如下通過幾個中間質粒構建質粒pPFL35使用以下合成的寡核苷酸引物5』-TGGACCGCCGCCAATTGCCTAGGCGGGCCGAACCCGGCT-3』和5』-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCC-3』，通過PCR從紅色糖多孢菌中擴增從核苷酸1279延伸至核苷酸1690的411bp DNA區段(Donadio,S等，Science(1991)2523:675-679)。
名為pKSW的質粒衍生自pT7-7和DEBSl-TE，其中已經將新的PstⅠ和HindⅢ位點引入所述第一延伸組件的KS1的側翼，用質粒pKSW的DNA作為模板。用T4多核苷酸激酶處理所述441bp PCR產物，將其與已經通過用SmaⅠ消化而線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL26。位於所述插入片段邊界的新的MfeⅠ/AvrⅡ位點與pUC18中多接頭中的Eco RⅠ位點相鄰。通過限制圖譜和序列分析鑑定質粒pPFL26。
一個MfeⅠ限制位點位於距編碼DEBS裝載組件的丙醯-CoA:ACP轉移酶的DNA 5』端112bp。質粒pKSW用MfeⅠ和PstⅠ消化，並與通過用MfeⅠ和PstⅠ消化質粒pPFL26獲得的411bp插入片段連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL27。質粒pPFL27含有一個PKS基因，所述PKS基因包含DEBS裝載組件、DEBS的第一和第二延伸組件以及DEBS鏈終止硫酯酶。根據其限制圖譜鑑定質粒pPFL27。
質粒pPFL27用NdeⅠ和AvrⅡ消化，並連接至通過用NdeⅠ和AvrⅡ消化質粒pMO6(PCT/GB97/01819)得到的4.6kbp插入片段。質粒pMO6含有一個PKS基因，該PKS基因包含DEBS裝載組件、DEBS的第一和第二延伸組件以及DEBS鏈終止硫酯酶，只是所述第一延伸組件內的編碼甲基丙二酸特異性AT的DNA區段已經具體被rap PKS的組件2的丙二酸特異性AT取代。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL28。質粒pPFL28含有一個雜種PKS基因，所述雜種PKS基因包含DEBS裝載組件、rapPKS的組件2的丙二酸特異性AT、DEBS裝載組件的ACP，然後是DEBS的第一和第二延伸組件以及DEBS鏈終止硫酯酶。根據限制圖譜鑑定質粒pPFL28。
使用以下合成的寡核苷酸引物5』-CCACATATGCATGTCCCCGGCGAGGAA-3』和5』-CCCTGTCCGGAGAAGAGGAAGGCGAGGCCG-3』，採用抗生鏈黴菌的染色體DNA作為模板，通過PCR從抗生鏈黴菌的oleAⅠ基因中擴增從核苷酸1671延伸至核苷酸3385的編碼KSq結構域的一個DNA區段。用T4多核苷酸激酶處理所述PCR產物，將其與已經通過用SmaⅠ消化而線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL31。位於所述插入片段邊界的新的NdeⅠ位點與pUC18多接頭中的EcoRⅠ位點相鄰，而新的BspEⅠ位點位於所述接頭區的HindⅢ位點邊界處。
質粒pPFL31用NdeⅠ和AvrⅡ消化，將所述插入片段與已經用NdeⅠ和AvrⅡ消化的質粒pPFL28連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL32。根據限制圖譜鑑定質粒pPFL32。
質粒pPFL32用NdeⅠ和XbaⅠ消化，將所述插入片段與已經用NdeⅠ和XbaⅠ消化的質粒pCJR24連接，並經凝膠電泳純化。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL35。根據限制圖譜鑑定質粒pPFL35。實施例12紅色糖多孢菌JC2/pPFL35的構建用質粒pPFL35轉化紅色糖多孢菌JC2的原生質體。在含有10μg/ml硫鏈絲菌肽的R2T20培養基中選擇硫鏈絲菌肽抗性菌落。通過將基因組DNA與DIG標記的含編碼組件2的rap PKS片段的DNA進行DNA印跡雜交，測試幾個克隆內整合到染色體中的pPFL35的存在。以該方式鑑定出一個具有pPFL35整合拷貝的克隆。實施例13用紅色糖多孢菌JC2/pPFL35生產聚酮化合物用紅色糖多孢菌JC2/pPFL35的冷凍懸浮液接種含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的eryP培養基，並其於28-30℃生長7天。此後將肉湯過濾以除去菌絲體，並將pH調至pH=3。肉湯用兩倍體積的乙酸乙酯萃取2次，合併的萃取液用等體積飽和氯化鈉洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，並減壓除去乙酸乙酯，得到粗製產物。顯示所述產物具有下示結構，並且通過MS、GC-MS和1HNMR判斷，與真正的物質相同 實施例14紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL35的構建用質粒pPFL35轉化紅色糖多孢菌NRRL2338的原生質體。在含有10μg/ml硫鏈絲菌肽的R2T20培養基(Yamanoto等)中選擇硫鏈絲菌肽抗性菌落。通過將基因組DNA與DIG標記的含編碼裝載組件2AT的rapPKS片段的DNA進行DNA印跡雜交，測試幾個克隆內整合到染色體中的pPFL35的存在。以該方式選擇出一個具有pPFL35整合拷貝的克隆。實施例15用紅色糖多孢菌NRRL2338(pPFL35)生產13-甲基-紅黴素A和B紅色糖多孢菌NRRL2338(pPFL35)按照實施例14中所述，通過用夾竹桃黴素KSQ-雷帕黴素AT2-D1TE DNA插入片段取代野生型裝載結構域而構建，將紅色糖多孢菌NRRL2338(pPFL35)培養物接種到300ml三角錐瓶中含有50μg/ml硫鏈絲菌肽的30ml自來水培養基中。於29℃培養2天後，用該燒瓶培養物接種300ml燒瓶中的300ml ERY-P培養基中。該肉湯以200rpm於29℃培養6天。此後，用NaOH將整個肉湯調至pH8.5，然後用等體積的乙酸乙酯萃取。用ZymarkTurbo Vap LV蒸發器，將乙酸乙酯萃取物於45℃氮氣流下蒸發至幹，然後在0.25體積的甲醇中重建，以將萃取物濃縮4倍。通過LC/MS、方法A證實產物的結構。觀察到一個保留時間為4.0min、m/z值為720(M+H)+的峰，符合13-甲基-紅黴素A(C36H65NO13)的要求。觀察到保留時間為6.4min、m/z值為704(M+H)+的第二個峰，符合13-甲基-紅黴素B(C36H65NO12)的要求。實施例16重組載體pPFL44的構建pPFL44是一種基於pCJR24的質粒，含有編碼雜種聚酮化合物合酶的基因，所述基因含有螺旋黴素PKS裝載組件、紅黴素延伸組件1和2以及鏈終止硫酯酶。如下構建質粒pPFL44按照Hopwood等所述的方法(1985)，使用以下合成的寡核苷酸5』-CCATATGTCTGGAGAACTCGCGATTTCCCGCAGT-3』和5』-GGCTAGCGGGTCGTCGTCGTCCCGGCTG-3』，用得自螺旋黴素生產者產二素鏈黴菌的染色體DNA，擴增編碼螺旋黴素生產裝載組件的DNA。3.3kbp的PCR產物經凝膠電泳純化，用T4多核苷酸激酶處理，並連接至已經通過用SmaⅠ消化線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL41。通過限制圖譜和序列分析鑑定質粒pPFL41。
質粒pPFL41用NdeⅠ和NheⅠ消化，3.3kbp片段經凝膠電泳純化，連接至預先用NdeⅠ和NheⅠ消化並用鹼性磷酸酶處理的pND30(一種衍生自質粒pCJR24的質粒，具有作為插入片段的ave PKS裝載組件和DEBS的延伸組件1和2以及DEBS硫酯酶)(PCT/GB97/01810)。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個克隆的所需質粒pPFL44。通過限制酶切分析鑑定質粒pPFL44。實施例17紅色糖多孢菌JC2/pPFL44的構建用質粒pPFL44轉化紅色糖多孢菌JC2的原生質體。在含有10μg/ml硫鏈絲菌肽的R2T20培養基中選擇硫鏈絲菌肽抗性菌落。通過將基因組DNA與DIG標記的含編碼裝載組件的srm PKS片段的DNA進行DNA印跡雜交，測試幾個克隆內整合到染色體中的pPFL44的存在。以該方式鑑定出一個具有pPFL44整合拷貝的克隆。實施例18用紅色糖多孢菌JC2/pPFL44生產聚酮化合物用紅色糖多孢菌JC2/pPFL44的冷凍懸浮液接種含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的eryP培養基，並其於28-30℃生長7天。此後將肉湯過濾以除去菌絲體，並將pH調至pH=3。肉湯用兩體積的乙酸乙酯萃取2次，合併的萃取液用等體積飽和氯化鈉洗滌，經無水硫酸鈉乾燥，並減壓除去乙酸乙酯，得到粗製產物。顯示所述產物具有下示結構，並且通過GC-MS和1HNMR判斷，與真正的物質相同。 實施例19紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL44的構建用質粒pPFL44轉化紅色糖多孢菌NRRL2338的原生質體。在含有10μg/ml硫鏈絲菌肽的R2T20培養基中選擇硫鏈絲菌肽抗性菌落。通過將基因組DNA與DIG標記的含編碼裝載組件的螺旋黴素PKS片段的DNA進行DNA印跡雜交，測試幾個克隆整合到染色體中的pPFL44的存在。以該方式選擇出一個具有pPFL44整合拷貝的克隆。實施例20用紅色糖多孢菌NRRL-2338(pPFL44)生產13-甲基-紅黴素A和B紅色糖多孢菌NRRL2338(pPFL44)通過用螺旋黴素裝載件-D1TEDNA插入片段取代野生型裝載結構域而構建，將紅色糖多孢菌NRRL2338(pPFL44)培養物接種到300ml三角錐瓶中含有50μg/ml硫鏈絲菌肽的30ml自來水培養基中。於29℃培養3天後，用該燒瓶培養物接種300ml燒瓶中的300ml ERY-P培養基中。該肉湯以200rpm於29℃培養6天。此後，用NaOH將整個肉湯調至pH8.5，然後用等體積的乙酸乙酯萃取。用Zymark TurboVap LV蒸發器，將乙酸乙酯萃取物於45℃氮氣流下蒸發至幹，然後在0.0625體積的甲醇中重建，以將萃取物濃縮16倍。通過LC/MS、方法A證實產物的結構。觀察到一個保留時間為4.0min、m/z值為720(M+H)+的峰，符合13-甲基-紅黴素A(C36H65NO13)的要求。觀察到保留時間為6.4min、m/z值為704(M+H)+的第二個峰，符合13-甲基-紅黴素B(C36H65NO12)的要求。實施例21質粒pJLK114的構建pPFL114是一種基於pCJR24的質粒，含有一個PKS基因，所述基因含有ery裝載組件、ery PKS的第一和第二延伸組件以及ery鏈終止硫酯酶，只是醯基轉移酶的末端和所述第二ery延伸組件的ACP開始處之間的DNA區段，已經被含有以下限制酶識別位點的合成寡核苷酸接頭取代AvrⅡ、BglⅡ、SnaBⅠ、PstⅠ、SpeⅠ、NsiⅠ、Bsu36Ⅰ和HpaⅠ。如下通過幾種中間質粒構建該質粒(圖6)。質粒pJLK02的構建使用以下合成的寡核苷酸5』-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3』和5』-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3』，使用質粒pNTEP2(Oliynyk,M.等，Chemistry and Biology(1996)3:833-839；WO98/01546)作為模板，通過PCR擴增編碼紅色糖多孢菌eryAⅠ基因的約1.47kbp DNA片段。所述PCR產物用T4多核苷酸激酶處理，然後與已經通過用SmaⅠ消化線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜和DNA測序分析鑑定所需質粒pJLK02。質粒pJLK03的構建使用以下合成的寡核苷酸5』-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3』和5』-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC』，使用質粒pNTEPH作為模板，通過PCR擴增編碼紅色糖多孢菌eryAⅠ基因的約1.12kbpDNA片段。所述PCR產物用T4多核苷酸激酶處理，然後與已經通過用SmaⅠ消化線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜和DNA測序分析鑑定所需質粒pJLK03。質粒pJLK04的構建用PstⅠ和HpaⅠ消化質粒pJLK02，將1.47kbp插入片段與已經用PstⅠ和HpaⅠ消化的質粒pJLK03連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pJLK04。質粒pJLK05的構建用PstⅠ和AvrⅡ消化質粒pJLK01(PCT/GB97/01819)，將460bp插入片段與已經用PstⅠ和AvrⅡ消化的質粒pJLK04連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pJLK05。質粒pJLK07的構建用ScaⅠ和XbaⅠ消化質粒pJLK05，用NdeⅠ和ScaⅠ消化質粒pNTEPH，將這兩個片段與與已經用NdeⅠ和XbaⅠ消化的質粒pCJR24連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pJLK07。質粒pJLK114的構建將兩種合成的寡核苷酸Plf和Plb(圖7)分別溶於TE緩衝液中。將每種溶液(0.5mol/μl)各10μl混合併加熱2分鐘至65℃，然後緩慢冷卻至室溫。質粒JLK07用AvrⅡ和HpaⅠ消化，與所述退火的寡核苷酸連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pJLK114。
pJLK117是一種基於pCJR24的質粒，含有一個PKS基因，所述基因含有ery裝載組件、ery PKS的第一和第二延伸組件以及ery鏈終止硫酯酶，只是醯基轉移酶的末端和所述第二ery延伸組件的ACP開始處之間的DNA區段，已經被含有以下限制酶識別位點的合成寡核苷酸接頭取代AvrⅡ、BgⅡ、SnaBⅠ、PstⅠ、SpeⅠ、NsiⅠ、Bsu36Ⅰ和NdeⅠ。
如下通過幾種中間質粒構建該質粒(圖6)。質粒pJLK115的構建用NdeⅠ和XbaⅠ消化質粒pJLK114，將約9.9kbp插入片段與已經用NdeⅠ和XbaⅠ消化的質粒pUC18連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pJLK115。質粒pJLK116的構建用Bsu36Ⅰ和XbaⅠ消化質粒pJLK13(PCT/GB97/01819)，將1.1kbp片段與已經用Bsu36Ⅰ和XbaⅠ消化的質粒pJLK115連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pJLK116。質粒pJLK117的構建用NdeⅠ和XbaⅠ消化質粒pJLK116，將9.9kbp片段與已經用NdeⅠ和XbaⅠ消化的質粒pCJR24連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pJLK117。實施例11質粒pJLK29的構建pJLK29是一種基於pJLK117的質粒，只是編碼rap PKS組件10的還原型回折(loop)的DNA片段已經插入mcs中。如下通過幾種中間質粒構建該質粒(圖5)。質粒pJLK121.1的構建使用以下合成的寡核苷酸5』-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3』和5』-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3』，使用通過用ScaⅠ和SphⅠ消化粘粒cos 26(Schwecke,T.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7839-7843)獲得的約7kbp片段作為模板，通過PCR擴增吸水鏈黴菌rapB基因編碼組件10的還原性回折的約2.2kbp DNA區段。所述PCR產物用T4多核苷酸激酶處理，然後與已經通過用SmaⅠ消化線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜和DNA測序分析鑑定所需質粒pJLK121.1。質粒pJLK29的構建用BglⅡ和NdeⅠ消化質粒pJLK121.1，將2.2kbp片段與已經用BglⅡ和NdeⅠ消化的質粒pJLK117連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pJLK29。實施例24質粒pJLK50的構建使用以下合成的寡核苷酸5』-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3』和5』-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3』，使用質粒pBAM25(由Best,D.J等公開的pBK25,Eur J Biochem(1992)204:39-49)作為模板，通過PCR擴增紅色糖多孢菌紅黴素PKS基因簇編碼組件2的ACP開始處至組件3的ACP開始之處之間的約6.1kbp DNA區段。所述PCR產物用T4多核苷酸激酶處理，然後與已經通過用SmaⅠ消化線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜和DNA測序鑑定所需質粒pJLK50。實施例25紅色糖多孢菌菌株JLK10的構建菌株JLK10是菌株NRRL2338的一種變異體，其中ery組件2的還原性回折(即KR結構域)被雷帕黴素組件10的還原性回折取代。用如下構建的質粒pJLK54構建該菌株。質粒pJLK54的構建pJLK54是一種基於pCJR29的質粒，含有一個PKS基因，所述基因含有ery裝載組件、ery基因簇的第一、第二和第三延伸組件以及ery鏈終止硫酯酶，只是醯基轉移酶的末端和所述第二ery延伸組件的ACP開始處之間的DNA區段，已經被雷帕黴素PKS組件10的等同區段取代。
如下構建該質粒。
用NheⅠ消化質粒pJLK50，將6.1kbp插入片段與已經用NheⅠ消化的質粒pJLK29連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pJLK54。應用質粒pJLK54構建紅色糖多孢菌NRRL2338/pJLK54和生產TKL衍生物用約5μg質粒pJLK54轉化紅色糖多孢菌NRRL2338的原生質體，並分離穩定的硫鏈絲菌肽抗性菌落。從幾個菌落中獲得總DNA，並經DNA印跡雜交分析，以證實該質粒已經整合入所述TE。紅色糖多孢菌菌株JLK10的構建和用該菌株生產13-甲基-10,11-脫氫-紅黴素A紅色糖多孢菌菌株JLK10是紅色糖多孢菌NRRL2338的一種突變體，其中ery組件2的「還原性回折」(即酮還原酶結構域)被雷帕黴素組件10的「還原性回折」取代。由已經插入質粒pJLK54的紅色糖多孢菌NRRL2338開始，構建所述菌株。使紅色糖多孢菌NRRL2338/pJLK54經過幾輪非選擇性生長，導致第二次交換，同時失去所述整合的質粒。通過DNA印跡雜交，鑑定其中已經發生用突變形式的DEBS1取代紅黴素基因的克隆。其中一個克隆命名為紅色糖多孢菌菌株JLK10，用其接種SM3培養基(eryP培養基給出相似的結果)，讓其於28-30℃生長7-10天。此後，將肉湯離心，將上清液的pH調至pH9。然後上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，並通過蒸發除去溶劑。產物經HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鑑定出以下大環內酯C13甲基紅黴素A(伴有由後-PKS酶不完全加工的產物)。 實施例26質粒pPFL50的構建質粒pPFL50是一種基於pPFL43的質粒，已經從pPFL43中除去了編碼紅黴素PKS的KS1(部分)、ACP1和組件2以及紅黴素TE的DNA片段。該質粒如下構建。用SfuⅠ和XbaⅠ消化質粒pPFL43，以除去6.5kbp片段。用克列諾片段DNA聚合酶Ⅰ填平5』突出端，將該質粒再環化。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pPFL50。紅色糖多孢菌JLK10/pPFL50的構建用約5μg質粒pPFL50轉化紅色糖多孢菌菌株JLK10的原生質體，並分離出穩定的硫鏈絲菌肽抗性菌落。從幾個菌落中獲得總DNA，並經DNA印跡雜交分析，以證實該質粒已經整合入同源染色體DNA區。用紅色糖多孢菌菌株JLK10/pPFL50接種含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的SM3培養基(含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的eryP培養基給出相似的結果)，讓其於28-30℃生長7-10天。此後，將肉湯離心，將上清液的pH調至pH9。然後上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，並通過蒸發除去溶劑。產物經HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鑑定出大環內酯C13甲基10,11-脫氫-紅黴素A(伴有由後-PKS酶不完全加工的產物)。紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL50的構建用約5μg質粒pPFL50轉化紅色糖多孢菌NRRL2338的原生質體，並分離出穩定的硫鏈絲菌肽抗性菌落。從幾個菌落中獲得總DNA，並經DNA印跡雜交分析，以證實該質粒已經整合入染色體DNA的同源區。用紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL50接種含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的SM3培養基(含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的eryP培養基給出相似的結果)，讓其於28-30℃生長7-10天。此後，將肉湯離心，將上清液的pH調至pH9.5。然後上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，並通過蒸發除去溶劑。產物經HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鑑定出大環內酯C13甲基紅黴素A(伴有由後-PKS酶不完全加工的產物)。質粒pCB121的構建質粒pCB121是一種含有莫能黴素裝載組件和莫能黴素組件1的KS、後接紅黴素組件1AT和紅黴素組件1KR的部分的質粒。通過幾種中間質粒如下製備該質粒。質粒pPFL45的構建使用以下合成的寡核苷酸5』-CGTTCCTGAGGTCGCTGGCCCAGGCGTA-3』和5』-CGAAGCTTGACACCGCGGCGCGGCGCGG-3』，使用含有得自肉桂地鏈黴菌的莫能黴素PKS基因5』端的粘粒作為模板，或者採用肉桂地鏈黴菌的染色體DNA作為模板，通過PCR擴增肉桂地鏈黴菌莫能黴素PKS基因簇編碼裝載組件的ACP一部分和組件1的KS的約1.8kbp DNA區段。所述PCR產物用T4多核苷酸激酶處理，然後與已經通過用SmaⅠ消化線性化、然後用鹼性磷酸酶處理的質粒pUC18連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pPFL45。質粒pPFL47的構建用NdeⅠ和Bsu36Ⅰ消化質粒pPFL45，將約2.6kbp片段連接到已經用NdeⅠ和Bsu36Ⅰ消化的質粒pPFL43中。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pPFL47。質粒pCB135的構建用HindⅢ消化質粒pCJR24，用克列諾片段DNA聚合酶Ⅰ填平5』突出端並再連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜、根據缺乏HindⅢ識別位點鑑定所需質粒pCB135。質粒pKSW1的構建質粒pKS1W是一種衍生自pNTEP2(GB97/01810)的載體，含有DEBS1TE衍生的三酮化合物(triketide)合酶以及在KS1的邊界引入的獨特的限制位點。通過幾種中間質粒如下獲得pKS1W。質粒pMO09、pMO10和pMO13的構建為了經PCR擴增質粒pMO09，使用以下合成的寡核苷酸作為誘變引物，一種引物含有一個MunⅠ位點，另一種引物含有一個PstⅠ位點5』-GCGCGCCAATTGCGTGCACATCTCGAT-3』和5』-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCCG-3』。
為了經PCR擴增質粒pMO10，使用以下合成的寡核苷酸作為誘變引物，一種引物含有一個HindⅢ位點，另一種引物含有一個EcoRⅤ位點5』-GTCTCAAGCTTCGGCATCAGCGGCACCAA-3』和5』-CGTGCGATATCCCTGCTCGGCGAGCGCA-3』。
為了經PCR擴增質粒pMO13，使用以下合成的寡核苷酸作為誘變引物，一種引物含有一個PstⅠ位點，另一種引物含有一個HindⅢ位點5』-GATGGCCTGCAGGCTGCCCGGCGGTGTGAGCA-3』和5』-GCCGAAGCTTGAGACCCCCGCCCGGCGCGGTCGC-3』。
以pNTEP2(GB97/01810)作為模板，使用Pwo DNA聚合酶進行PCR，進行一個循環為96℃(1分鐘)；於50℃退火(3分鐘)；和於72℃延伸(1分鐘)，然後在存在10％(體積/體積)二甲基亞碸的情況下再進行25個循環96℃(1分鐘)；於50℃退火(1分鐘)和於72℃延伸(1分鐘)。將產物進行末端修補，克隆到用SmaⅠ消化的pUC18中，將連接混合物轉化到大腸桿菌DH10B中。從各個菌落製備質粒DNA。通過限制圖譜和DNA測序鑑定所需質粒pMO09(3.8kbp)、pMO10(3.9kbp)和pMO13(4.3kbp)。質粒pMO11的構建用HindⅢ消化質粒pMO13，將1.2kbp插入片段克隆到已經用HindⅢ消化的質粒pMO10中。將連接混合物轉化到大腸桿菌DH10B中。通過限制圖譜鑑定所需質粒(5.0kbp)並命名為pMO11。質粒pMO12的構建用PstⅠ消化質粒pMO09，將1.6kbp插入片段克隆到已經用PstⅠ消化的質粒pMO11中。將連接混合物轉化到大腸桿菌DH10B中。通過限制圖譜鑑定所需質粒(6.6kbp)並命名為pMO12。質粒pKS1W的構建用MunⅠ和EcoRⅤ消化質粒pMO12，將3.9kbp片段克隆到已經用MunⅠ和EcoRⅤ消化的質粒pNTEPH(參見下文)中。將連接混合物轉化到大腸桿菌DH10B中。通過限制圖譜鑑定所需質粒(13.kbp)並命名為pKSlW。質粒pNTEPH的構建通過除去HindⅢ位點，由pNTEP2獲得質粒pNTEPH。用HindⅢ消化質粒pNTEP2，用克列諾片段DNA聚合酶Ⅰ填平5』突出端並再連接。通過限制圖譜鑑定所需質粒(13.6kbp)。質粒pCB136的構建用NdeⅠ和XbaⅠ消化質粒pKSW1，將約11.2kbp片段與已經用NdeⅠ和XbaⅠ消化的質粒pCB135連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pCB136。質粒pCB137的構建用SfuⅠ和XbaⅠ消化質粒pCB136，以除去6.5kb片段。用克列諾片段DNA聚合酶Ⅰ填平5』突出端並再連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pCB137。質粒pCB121的構建用NdeⅠ和HindⅢ消化質粒pPFL47，將約4.4kbp片段與已經用NdeⅠ和HindⅢ消化的質粒pCB137連接。用連接混合物轉化電感受態大腸桿菌DH10B細胞，檢查各個菌落的質粒內容。通過限制圖譜鑑定所需質粒pCB121。實施例紅色糖多孢菌JLK10/pCB121的構建用約5μg質粒pCB121轉化紅色糖多孢菌JLK10的原生質體，並分離出穩定的硫鏈絲菌肽抗性菌落。從幾個菌落中獲得總DNA，並經DNA印跡雜交分析，以證實該質粒已經整合入同源染色體DNA區。用紅色糖多孢菌菌株JLK10/pCB121接種含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的SM3培養基(含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的eryP培養基給出相似的結果)，讓其於28-30℃生長7-10天。此後，將肉湯離心，將上清液的pH調至pH9。然後上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，並通過蒸發除去溶劑。產物經HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鑑定出大環內酯C13甲基-10,11-脫氫-紅黴素A(伴有由後-PKS酶不完全加工的產物)。實施例紅色糖多孢菌NRRL2338/pCB121的構建用約5μg質粒pCB121轉化紅色糖多孢菌NRRL2338的原生質體，並分離出穩定的硫鏈絲菌肽抗性菌落。從幾個菌落中獲得總DNA，並經DNA印跡雜交分析，以證實該質粒已經整合入同源染色體DNA區。用紅色糖多孢菌NRRL2338/pPFL50接種含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的SM3培養基(含有5μg/ml硫鏈絲菌肽的eryP培養基給出相似的結果)，讓其於28-30℃生長7-10天。此後，將肉湯離心，將上清液的pH調至pH=9。然後上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，並通過蒸發除去溶劑。產物經HPLC/MS、MS/MS和1H-NMR分析。鑑定出大環內酯C13甲基紅黴素A(伴有由後-PKS酶不完全加工的產物)。
儘管通過以上所列的實施例說明本發明，但它們不應該被認為限制本發明的範圍。以上描述首次描繪了Ⅰ型PKS基因組合的構建，所述基因組合包含含全部或部分異源KSq的裝載組件，也首次描繪了用其獲得可用作合成中間體或作為生物活性材料諸如抗生素的聚酮化合物產物。本領域技術人員容易想到，得自其它PKS基因系(gene set)的含全部或部分異源KSq的裝載組件能夠用來取代DEBS的裝載組件，或引入到(indeed into)一種相當不同的PKS基因組合中。本領域技術人員也容易聯想到通過由一種ATq更有效地鑑別甲基丙二醯-CoA和丙二醯-CoA、然後由一種KSq特異性地脫羧所提供的額外的特異性，比丙醯-CoA和乙醯-CoA之間的鑑別不完善更為可取，而後者為DEBS裝載組件和許多其它PKS裝載組件的特徵；因為這可使單一產物的產量最大，而不是生產在起子單位的性質上不同的混合物。避免樣的混合物提高了產量，並且避免需要冗長困難的分離步驟。
儘管通過以上所列的實施例說明本發明，但它們不應該被認為限制本發明的範圍。以上描述首次描繪了Ⅰ型PKS基因組合的構建，所述基因組合包含含全部或部分異源KSq的裝載組件，也首次描繪了用其獲得可用作合成中間體或作為生物活性材料諸如抗生素的聚酮化合物產物。本領域技術人員容易想到，得自其它PKS基因系(gene set)的含全部或部分異源KSq的裝載組件能夠用來取代DEBS的裝載組件，或引入到一種相當不同的PKS基因組合中。本領域技術人員也容易聯想到通過由一種ATq更有效地鑑別甲基丙二醯-CoA和丙二醯-CoA、然後由一種KSq特異性地脫羧所提供的額外的特異性，比丙醯-CoA和乙醯-CoA之間的鑑別不完善更為可取，而後者為DEBS裝載組件和許多其它PKS裝載組件的特徵；因為這可使單一產物的產量最大，而不是生產在起子單位的性質上不同的混合物。避免樣的混合物提高了產量，並且避免需要冗長困難的分離步驟。
權利要求
1．通過提供一種PKS多酶用於生產基本上僅具有所需起子單位的聚酮化合物的方法，所述PKS多酶包含一個裝載組件和多個延伸組件，其中所述裝載組件被改變為裝載任選取代的丙二醯殘基，然後實現所裝載殘基的脫羧，提供相應的任選取代的乙醯基以轉移至相鄰的一個所述延伸組件，並且其中至少其中一個所述延伸組件與實現脫羧的裝載組件不是天然連接的；前提是所述靶聚酮化合物不是由於摻入一個(未取代的)乙酸起子單位而產生的具有一個13-甲基的14元大環內酯。
2．權利要求1的系統，其中所述乙酸起子單位轉移到的所述相鄰的延伸組件與實現脫羧的裝載組件不是天然連接的。
3．權利要求1或2的系統，其中所述裝載組件的脫羧功能性由在所述活性位點具有一個穀氨醯胺殘基或其它非半胱氨酸殘基的酮合酶(ketosynthase)型結構域提供。
4．權利要求1或2的系統，其中所述裝載組件的脫羧功能性由CLF型結構域提供。
5．權利要求1-4中任一項的系統，其中所述裝載組件的裝載功能性由在所述活性位點具有一個精氨酸殘基的醯基轉移酶型結構域提供。
6．權利要求1-5中任一項的系統，其中所述裝載組件包括一個醯基載體蛋白。
7．權利要求1-3、5或6中任一項的系統，其中至少所述裝載組件的Ksq結構域對應於夾竹桃黴素、螺旋黴素、尼達黴素、酒黴素或莫能黴素的PKS多酶的裝載組件。
8．可由權利要求1-7中任一項的系統或具有合成所述聚酮化合物能力的變異體表達的PKS多酶。
9．編碼權利要求8的PKS多酶的核酸。
10．含有權利要求9中定義的核酸的載體。
11．包含按照權利要求1-7中任一項的系統的轉化生物體。
12．生產聚酮化合物的方法，所述方法包括培養按照權利要求11的生物體並回收所述聚酮化合物。
13．按照任一前述權利要求的系統、多酶、核酸、載體、生物體或方法，其中所述聚酮化合物選自(a)具有乙酸起子單位的12元和16元大環內酯，(b)具有丙酸起子單位的12元、14元和16元大環內酯，(c)具有乙酸起子單位或丙酸起子單位的利福黴素、除蟲菌素、雷帕黴素、免疫黴素(immunomycin)和FK506的變異體，(d)其中所述起子單位產生選自丙醯基和羥甲基的側鏈的聚酮化合物。
14．母體聚酮化合物的變異體，所述變異體在由所述起子單位提供的側鏈方面不同於所述母體聚酮化合物。
15．製備Ⅱ型聚酮化合物的方法，所述方法包括培養含Ⅱ型聚酮化合物合酶(「PKS」)的生物體，其中所述野生型合酶包括一個傾向於實現脫羧以產生不想要的起子的CLF結構域；其中所述生物體含有一個已經基因工程改造以抑制所述CLF結構域脫羧活性的PKS。
全文摘要
Ⅰ型聚酮化合物合酶(「PKS」)是一種複雜的多酶,包括連接於多個延伸組件的一個裝載組件。所述第一延伸組件從所述裝載組件接受一個醯基起子單位,每個延伸組件加入一個另外的可能經過加工(例如還原)的ketide單位。我們已經發現,某些PKS具有的Ksq結構域具有脫羧活性,例如由(取代的)丙二醯產生(取代的)醯基。Ⅱ型PKS的CLF結構域具有相似的活性。通過將包含這樣的結構域的裝載組件插入通常不具有這種裝載組件的PKS中,可能控制所用的起子單位。
文檔編號C07K19/00GK1316001SQ9981007
公開日2001年10月3日 申請日期1999年6月29日 優先權日1998年6月29日
發明者P·F·利德萊, J·斯湯頓, J·庫爾特斯, H·A·I·麥阿瑟 申請人:拜奧蒂卡技術有限公司