癌症化學治療的製作方法
2023-09-23 07:41:15 1
專利名稱：癌症化學治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及可以提高癌症化學治療功效的方法和組合物。
背景技術：
癌症，一種主要的致死性疾病，特徵是由過度細胞分裂引起的惡性組織的異常腫塊。癌症細胞擺脫了對細胞生長的常規限制，並且侵入和佔領其它細胞正常保留的區域。癌症可以通過手術、放射性治療、化學治療、激素治療等進行治療。
化學治療是應用抗癌藥物(或細胞毒素藥物)來抑制或破壞癌細胞。它通過靶向細胞生長周期的特定部分而抑制癌細胞生長。目前，存在多於50種批准用於臨床應用的化學治療藥物，並且多於百種的藥物正在研究中。化學治療藥物可以通過各種機制防止癌細胞進一步增殖。大多數化學治療藥物利用癌細胞在細胞生長和分裂中更加活躍的事實。因此，妨礙細胞生長周期或細胞分裂過程的藥物將選擇性地抑制癌細胞生長。
例如，多柔比星(阿黴素，Rubex，或鹽酸多柔比星脂質體)是一種通過插入和酶抑制實行其對癌細胞作用的蒽環黴素抗生素。作為一種嵌入劑，它插入DNA中並且防止DNA複製或轉錄。作為酶抑制劑，它抑制II型拓撲異構酶，導致DNA斷裂。由於活躍分裂的癌細胞需要具有DNA的合成和複製，多柔比星將比它影響正常細胞更多地影響活躍分裂的細胞(即，癌細胞)。由於多柔比星的作用機制是全面的，所以這種藥物有效用於治療廣泛範圍的癌症。
紫杉醇(泰素)或其類似物(諸如多西他賽(泰索帝))促進微管蛋白的聚合，由此通過破壞細胞分裂和重要的間期過程所需要的正常的微管動力學而引起細胞死亡。
已知維生素A代謝物、視黃酸(RAs)對發育、細胞增殖和分化、以及腫瘤生長和侵入具有深遠的作用。RAs對細胞增殖和遷移的廣泛範圍的作用表明，它們是用於許多類型的癌症的有效的化學治療劑。例如，全反式視黃酸(ATRA)已被成功地用作許多白血病，諸如急性早幼粒細胞白血病(APL)的「分化治療」。ATRA激活類視黃醇受體(RAR)並且引起早幼粒細胞分化(成熟)，從而防止這樣的細胞增殖。
這些年來，儘管化學治療在功效上得到了極大地改進並且減小了副作用，但是癌症化學治療的總體治癒率仍舊很低，並且遠遠不能令人滿意。因此，存在對於更有效的化學治療的需要。
發明概述本發明基於一個令人驚訝的發現，即，某些稠合的吡唑基化合物可以與化學治療藥劑一起應用以產生協同作用。這樣的協同作用在通過不同機製作用的化學藥劑上觀察到。因此，本發明所述稠合的吡唑基化合物通常可以與其它化學治療藥劑，諸如紫杉醇、多柔比星、或視黃酸一起應用，以提高功效和/或將化學治療藥劑的副作用(size effects)最小化。
一方面，本發明著重描述治療癌症的方法。所述方法包括給需要其的受試者施用有效量的化學治療藥劑(例如，紫杉醇、多柔比星、或視黃酸)和有效量的下式化合物 在這一式中，A是H或 Ar1，Ar2和Ar3每一個獨立地為苯基，噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，或嘧啶基；R1，R2，R3，R4，R5，和R6每一個獨立地為R，硝基，滷素，C(O)OR，C(O)SR，C(O)NRR』，(CH2)mOR，(CH2)mSR，(CH2)mNRR』，(CH2)mCN，(CH2)mC(O)OR，(CH2)mCHO，(CH2)mCH＝NOR，(CH2)mC(O)N(OR)R』，N(OR)R』，或者R1和R2一起，R3和R4一起，或R5和R6一起為O(CH2)mO，其中每個R和R』獨立地為H或C1～C6烷基；和m是0，1，2，3，4，5，或6，和n是0，1，2，或3。(CH2)m可以是有分枝的或線性的。注意上述任何取代基中所示的左側原子最靠近稠合的吡唑環。還注意當稠合的吡唑化合物中存在一個或多個R或(CH2)m部分時，所述R或(CH2)m部分可以是相同的或不同的。
在一些上述化合物中，Ar1可以是苯基，Ar2可以是呋喃基(例如，5』-呋喃基)，和Ar3可以是苯基。
上述化合物的一個子集是其中A為 的那些。在一些具體的實施方案中，Ar1是苯基，Ar2是5』-呋喃基，Ar3是苯基，和n是1。此外，每個R1，R2，R5，和R6是H，n是1，R3和R4中一個是H，和另一個是取代呋喃基位置2的CH2OH。這一子集的一個實例是1-苄基-3-(5』-羥甲基-2』-呋喃基)吲唑(化合物1)。
上述化合物的另一個子集是其中A是H的那些。在一些具體的實施方案中，Ar1是苯基，和Ar2是呋喃基。此外，每個R1和R2是H，和R3和R4中一個是H，和另一個是取代呋喃基的位置2的CH2OH。
術語「Ar」，當用在本文時，是指芳基和雜芳基。芳基，例如，苯基，是具有至少一個芳香環的烴環系統。雜芳基是具有至少一個其中含有至少一個雜原子，諸如O，N，或S的芳香環的烴環系統。雜芳基的實例包括，但不限於，噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，和嘧啶基。「Ar」可以在其環上含有1個，2個，3個，或更多個取代基。除了指定為R1，R2，R3，R4，R5，和R6的那些(參見上文)，所述取代基還可以是硝基，C2～C6鏈烯基，C2～C6炔基，芳基，雜芳基，cyclyl，或heterocyclyl。烷基，鏈烯基，炔基，烷氧基，芳基，雜芳基，cyclyl，和heterocyclyl，當用在本文時，任選地用C2～C6烷基、滷素、氨基、羥基、巰基、氰基、或硝基進行取代。注意術語「烷基」是指線性烷基和支鏈烷基。
如果可以應用的話，上述稠合的吡唑基化合物包括化合物本身，以及其鹽和其前體藥物。這樣的鹽，例如，可以通過在稠合的吡唑基化合物上的帶負電的取代基(例如，羧酸基)和陽離子之間相互作用而形成。適當的陽離子包括，但不限於，鈉離子，鉀離子，鎂離子，鈣離子，和銨基陽離子，諸如四甲銨(teteramethylammonium)離子。同樣地，正電荷的取代基(例如，氨基)可以與帶負電荷的相反離子形成鹽。適當的相反離子包括，但不限於，氯，溴，碘，硫酸根，硝酸根，磷酸根，或醋酸根。前體藥物的實例包括酯和其它藥用衍生物，當施用給受試者時，其能夠提供上述稠合的吡唑基化合物。
按照本發明的一個實施方案，與稠合的吡唑基化合物一起應用的化學治療劑可以通過各種機制起作用。例如，它可以通過DNA插入，通過調節微管動力學，通過誘導細胞分化，通過誘導程序性細胞死亡，或者調節細胞周期的任何機制而起作用。
當用於本說明書時，「癌症」包括細胞瘤/癌症，淋巴瘤，和白血病。該術語意欲包括所有類型的癌生長，遷移組織或惡性轉化的細胞、組織、或器官，而不考慮組織病理學類型或侵入的階段。癌症的實例包括，但不限於，癌和肉瘤，諸如白血病，肉瘤，骨肉瘤，淋巴瘤，黑素瘤，卵巢癌，皮膚癌，睪丸癌，胃癌，胰腺癌，腎癌，乳癌，前列腺癌，結腸直腸癌，頭頸癌，腦癌，食管癌，膀胱癌，腎皮層癌，肺癌，支氣管癌，子宮內膜癌，鼻咽癌，子宮頸癌，肝癌，或未知的原發位點的癌症。
含有一種或多種上述稠合的吡唑基化合物和用於治療癌症的化學治療劑的組合物，和應用這種組合物用來製備治療癌症的藥物也在本發明範圍內。
本發明的其它特徵，目的，和優點將通過詳述和通過權利要求而顯而易見。
附圖簡述
圖1顯示施用或不施用化合物1(YC-1)、ATRA、與ATRA組合的化合物1的BALB/c和WEHI-3/BALB/c小鼠(n＝8)的脾(A)和肝(B)重量的變化。結果表示為平均值±S.D.，並且組間差異通過單向ANOVA進行檢驗。對於WEHI-3B/BALB/c小鼠和各種治療的值之間的顯著差異顯示為*p＜0.05。
圖2顯示脾的石蠟切片的蘇木精和曙紅染色，所述脾來自對照小鼠(A)，WEHI-3/BALB/c白血病小鼠(B)，化合物1處理的白血病小鼠(C)，ATRA處理的白血病小鼠(D)和化合物1與ATRA組合治療的白血病小鼠(E)。在治療後14天，將小鼠處死。脾在4％甲醛中固定，並且在石蠟中包埋。將脾的切片用蘇木精和曙紅染色。(R紅髓；W白髓(while pulp)；↓滲透的未成熟的原粒細胞)圖3顯示化合物1，ATRA和與ATRA組合的化合物1對WEHI-3細胞分化和程序性細胞死亡的作用。(A)TUNEL/DAPI染色誘導的核形態變化，(B)NBT還原和TUNEL染色。化合物1，ATRA和與ATRA組合的化合物1處理的WEHI-3細胞在所有處理前培養24h，用TUNEL/DAPI(×400)染色，接著進行顯微鏡分析。結果表示為平均值±S.D.。
圖4顯示化合物1在WEHI-3細胞中通過(A)DNA斷裂和(B)胱天蛋白酶-3活性而誘導程序性細胞死亡的作用。對於DNA斷裂，將DNA提取物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳。胱天蛋白酶-3抑制劑對YC誘導的胱天蛋白酶-3活化的作用。將細胞用胱天蛋白酶-3抑制劑，Z-DEVE-FMK，預先處理1h，並且然後用5μM化合物1刺激。結果表示為平均值±S.D.，並且組間差異通過單向ANOVA檢驗。在0小時處理和多小時處理的值之間的顯著差異顯示為*p＜0.001。
發明詳述本發明涉及一種治療癌症(例如，腎癌(renal cancer)，肺癌，腎癌(kidney cancer)，或白血病)的方法，其通過給需要所述治療的受試者施用有效量的一種或多種稠合的吡唑基化合物和有效量的化學治療藥劑。術語「治療」是指將稠合的吡唑基化合物(或包括稠合的吡唑基化合物的組合物)和化學治療藥劑應用或施用給受試者，所述受試者具有癌症，癌症症狀，或易患癌症的體質，目的是治癒，康復，減輕，減緩，改變，補救，改善，提高，或影響癌症，癌症症狀，或易患癌症的體質。「有效量」是指活性藥劑的用量，當施用給需要所述治療的受試者時，需要其賦予對受試者的治療作用。有效劑量可以變化，如本領域的技術人員所公認的那樣，其取決於施用的途徑，賦形劑的應用，和與其它治療血管生成相關的疾病的藥劑共同應用的可能性。
用於實行本發明的方法的稠合的吡唑基化合物可以通過本領域熟練的技術人員公知的流程進行製備。例如，美國專利號5,574,168，其轉讓給本發明的受讓人並且通過參考完全併入本發明，描述了包括下述合成步驟的流程首先，通過芳基碳醯氯與另一種芳基化合物偶聯製備芳基芳基酮。每種芳基化合物任選地是單或多取代的。然後將所述酮與芳烷基肼反應，其芳基基團也任選地是單或多取代的，以形成含有3個芳基基團的腙。將腙基團通過亞烷基連接轉化到稠合的吡唑核上，另一芳基基團稠合到吡唑核的4-C和5-C上，和第三個芳基基團直接與吡唑核的3-C連接。稠合的吡唑基化合物的衍生物可以通過修飾任一芳基基團上的取代基而獲得。
用於上述合成途徑的化學藥品可以包括，例如，溶劑，反應劑，催化劑，保護基和去保護基試劑。所述合成途徑還可以在本文具體描述的步驟之前或之後額外地包括添加或移除適當的保護基的步驟，以最終允許合成稠合的吡唑基化合物。另外，可以以變化的順序或次序實行各個合成步驟，以給出需要的化合物。有效用於合成可應用的稠合吡唑基化合物的合成化學轉化和保護基方法學(保護和去保護)是本領域已知的，並且包括，例如，在R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)；TW.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版，John Wiley和Sons(1991)；L. Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser′sReagents for Organic Synthesis，John Wiley和Sons(1994)；和L.Paquette，編輯.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley和Sons(1995)以及其後續版本中描述。
如此合成的稠合吡唑基化合物可以進一步通過方法，諸如柱層析，高效液相色譜，或重結晶而進行純化。
已發現按照本發明的實施方案的稠合的吡唑基化合物具有抗血管生成的作用和抗癌作用，如美國專利申請號2003/0186996，2005/0107406，和2005/0209252中公開的那樣，它們都是Teng等的，並且被轉讓給本發明的受讓人。這些申請通過參考完全併入本發明。
例如，已發現1-苄基-3-(5』-羥甲基-2』-呋喃基)吲唑(化合物1，將在下文中詳細描述)是一種新型的抗血小板藥劑。機制研究揭示化合物1的抗血小板活性與可溶的鳥苷酸環化酶(sGC)的NO-不依賴性活化相關。最近，顯示化合物1具有抗癌活性；它通過增加細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)-抑制蛋白p21CIP1/WAP1和p27KIP1的表達而阻止人肝細胞癌HA22T細胞中處於G0/G1的細胞周期，和抑制低氧誘導因子α(HIF-1)活性而阻滯腫瘤的血管生成。化合物1還抑制Hep3B細胞中促紅細胞生成素和血管內皮生長因子的低氧誘導。
儘管先前發現化合物1具有針對某些癌症的抗癌作用，本發明的發明人出乎意料地發現本發明的吡唑基化合物可以與其它化學治療藥劑一起產生協同作用。用於實行本發明方法的化學治療藥劑是商購可獲得的，或者可以通過本領域公知的流程而合成。
與按照本發明的實施方案的稠合的吡唑基化合物一起應用的化學治療藥劑可以通過各種機制起作用。例如，它可以通過DNA插入，通過調節微管動力學，通過誘導細胞分化，通過誘導程序性細胞死亡，或者調節細胞周期的任何機制而起作用。
DNA插入或DNA結合化學治療藥劑可以將其本身結合或插入到雙鏈DNA中。因此，依賴DNA的RNA轉錄被抑制。另外，DNA複製也受到了妨礙。這些DNA結合劑中的一些還可以抑制拓撲異構酶I，其在DNA複製過程中是必需的。因此，這些DNA結合劑可以導致DNA單鏈或雙鏈斷裂。在細胞進入有絲分裂前，一些單鏈斷裂物可以得到細胞中DNA修復系統的修復。然而，沒有得到修復的單鏈斷裂物的部分和DNA雙鏈斷裂物可以引起細胞染色體異常並且甚至是細胞死亡。DNA結合或插入化學治療藥劑的實例可以包括，但不限於，多柔比星，柔紅黴素，放線菌素D，環磷醯胺和絲裂黴素C。
微管調節劑妨礙微管細胞骨架的裝配和解裝配。微管通過微管蛋白的聚合而形成。由於微管骨架在細胞功能的各個方面起著重要的作用，所以微管的聚合和解聚合是受控過程。可以妨礙微管的聚合和解聚合的藥劑可以用來調節細胞活性。秋水仙鹼，秋水仙胺，和nocadazol通過與微管蛋白結合和防止它加入到生長的微管的正端而抑制聚合。長春鹼和長春新鹼聚集微管蛋白並且引起微管解聚，這通過停滯間期的細胞而阻滯有絲分裂。泰素(紫杉醇)或環氧聚微管素通過與微管結合而穩定微管。
癌症可以由錯亂的細胞分裂或細胞沒有能力分化成為成熟的細胞型而引起。因此，分化誘導劑可以用來誘導癌細胞分化。分化治療藥劑的實例包括視黃酸代謝物和衍生物。例如，全反式視黃酸(ATRA)已經成功地用作各種白血病，諸如急性早幼粒細胞白血病(APL)的「分化治療」。ATRA激活類視黃醇受體(RAR)並且引起早幼粒細胞分化(成熟)，從而防止這樣的細胞增殖。
其它化學治療藥劑及其機制的實例包括，但不限於，順鉑(順式-二氨基二氯化鉑(II))，其通過與核DNA結合而誘導細胞毒性作用以妨礙正常轉錄和/或DNA複製；博來黴素，其通過形成自由基而引起DNA分解；託泊替康，伊立替康，或喜樹鹼，其抑制拓撲異構酶I；鬼臼毒素，其抑制有絲分裂器官中的微管裝配；普卡黴素，其與DNA結合併且以與放線菌素D相似的方式抑制DNA、RNA、和蛋白合成；或者5-氟尿嘧啶，其通過抑制胸腺嘧啶核苷的正常生產而抑制DNA合成。
上文所述是通常所用的化學治療藥劑和它們的作用機制。本領域的普通技術人員應該理解，這些是示例性實例，並且本發明的實施方案並不限於這些實例。相反，按照本發明的實施方案，稠合的吡唑基化合物可以與任何已知的化學治療藥劑一起應用。
為了實行本發明的方法，稠合的吡唑基化合物和化學治療藥劑可以同時或在不同的時間施用。例如，首先可以給癌症患者施用稠合的吡唑基化合物(或含有稠合的吡唑基化合物的組合物)，並且然後給患者施用藥用載體和含有化學治療藥劑與藥用載體的組合物。
在另一實例中，活性藥劑同時施用，例如，應用含有稠合的吡唑基化合物、化學治療藥劑、和藥用載體的組合物。任何上述組合物可以口服、腸胃外、通過吸入噴霧劑、或通過植入的儲存庫進行施用。當用於本文時，術語「腸胃外」包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、損傷內和顱內注射或灌輸技術。
口服施用的組合物可以是口服接受的劑量形式，包括，但不限於，片劑、膠囊、乳劑和水性混懸液、分散液和溶液。對於片劑通常所用的載體包括乳糖和玉米澱粉。潤滑劑，諸如硬脂酸鎂，也典型地添加到片劑中。對於以膠囊形式口服施用，有用的稀釋劑包括乳糖和幹玉米澱粉。當口服施用水性混懸液或乳劑時，所述活性成分可以被懸浮或溶解在與乳化或懸浮劑結合的油相中。如果需要，可以添加某些增甜劑、調味劑、或著色劑。
按照本領域已知的技術，應用適當的分散或溼潤劑(諸如，例如，吐溫80)和懸浮劑，可以配製無菌注射組合物(例如，水性的或油質混懸液)。無菌注射製備物還可以是在無毒的腸胃外可用的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或混懸液，例如，作為在1，3-丁二醇中的溶液。在可用的賦形劑和溶劑中，可以應用的是甘露醇、水、Ringer’s溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌的、不易揮發的(fixed)油便利地用作溶劑或混懸介質(例如，合成單或甘油二酯)。脂肪酸，諸如油酸和其甘油酯衍生物有效地用於製備注射劑，天然藥用油、諸如橄欖油或蓖麻油、特別是它們的聚氧乙烯化形式也是這樣。這些油溶液或混懸液還可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或類似的分散劑。
按照藥物配製領域公知的技術可以製備吸入組合物，並且可以製備成在鹽中的溶液，其應用苯甲醇或其它適當的防腐劑，提高生物利用度的吸收增強劑，碳氟化合物，和/或本領域已知的其它增溶或分散劑。
藥物組合物中的載體必須是「可接受的」，在該意義上，其與製劑的活性成分相容(和優選地，能夠穩定它)並且對要治療的受試者沒有毒害。例如，穩定劑，諸如環糊精(其與稠合的吡唑基化合物形成特異的、更加可溶的複合物)，可以用作藥物賦形劑來遞送稠合的吡唑基化合物。其它載體的實例包括膠狀二氧化矽，硬脂酸鎂，纖維素，硫酸月桂鈉，和DCYellow#10。
上述方法還可以包括放射性治療。放射可以在患者施用需要劑量的稠合的吡唑基化合物和化學治療藥劑之前，之中，或之後，應用到患者的癌症位點。放射可以是電離輻射和非電離輻射。電離輻射具有足夠的能量與原子相互作用並且從它們的軌道上移除電子，這使得原子變成帶電的或「電離的」。它包括具有γ射線、X射線、中子、電子、α粒子、和β粒子的輻射。非電離輻射是電磁輻射，其不具有足夠的能量將電子從它們的軌道上移除。它包括具有紫外線、可見光、紅外線、微波、和無線電波的輻射。輻射的劑量和時間應該足以賦予對所治療的患者的治療效果。它可以有變化，如本領域的那些技術人員所公認的那樣，取決於輻射的類型和強度，要治療的癌症的類型和位置，和患者的身體狀況。
適當的體外檢測可以用來初步評估一種或多種上述化合物和化學治療藥劑的組合在抑制某些癌症細胞系的生長中的功效。所述組合還可以通過體內檢測進一步檢驗它在治療癌症中的功效。例如，可以將所述組合施用給患有癌症的動物(例如，小鼠模型)，並且然後評估其治療功效。基於所述結果，還可以確定適當的劑量範圍和施用途徑。
無需更詳盡的描述，相信上述描述已經充分地能夠實現本發明。因此，下述具體的實施方案解釋為僅僅是舉例說明，並不是以任何方式限制本公開內容的餘下部分。本文所引用的所有的出版物，包括專利，通過參考完全併入本文。
實施例合成1-苄基-3-(5』-羥甲基-2』-呋喃基)吲唑(化合物1)首先通過將無水氯化鈣(88.8mg，0.8mmole)與硼氫化鈉(60mg，1.6mmole)在無水THF(20mL)中攪拌4hrs，而製備硼氫化鈣。然後，在30±2℃，將30mL含有88.0mg 1-苄基-3-(5』-甲酯基-2』-呋喃基)吲唑(0.27mmole)逐滴加入到硼氫化鈣溶液中。將所述混合物在回流下加熱6hrs，冷卻，在碎冰中終止，置於減小的壓力下以去除THF，並且過濾以獲得固體產物。將所述固體用二氯甲烷提取。將提取液濃縮至50mL，並且加入石油醚後固體沉澱下來。收集所述沉澱物，並且通過柱層析(矽膠-苯)進行純化，以獲得70.0mg 1-苄基-3-(5』-羥甲基-2』-呋喃基)吲唑，產率為87％。
mp108-109℃。
MS(％)，m/z304(M+)。
IR(KBr)vmax3350cm-1(-OH)。
1H-NMR(DMSO-d6，200MHz)δ4.51(2H，d，J＝5.5Hz，-CH2O-)，5.31(1H，t，J＝5.5Hz，-OH)，5.70(2H，s，＝NCH2-)，6.48(1H，d，J＝3.4Hz，H-4』)，6.97(1H，d，J＝3.4Hz，H-3』)，7.21-7.31(6H，m，H-5，苯基)，7.45(1H，t，J＝8.2Hz，H-6)，7.75(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-7)，8.12(1H.dd，J＝8.2.1.0Hz.C4-H)。
對癌細胞生長的抑制作用
將無胸腺的裸鼠(BALB/c nu/nu雌性，6-8周齡)飼養在22℃，12h光照/黑暗循環。將所述小鼠皮下注射A498腎癌細胞(107個細胞/小鼠)。培養15天後，腫瘤長至100-150mm3大小。然後將小鼠隨機分成6組(每組5隻小鼠)。組1(對照組)和組2的小鼠分別用0.5％羧甲基纖維素(CMC)和在0.5％CMC中的化合物1(10mg/kg/天)口服處理。組3和4的小鼠分別腹膜內注射紫杉醇和多柔比星(20mg/kg/周)。(紫杉醇和多柔比星為商業產品)。組5的小鼠先用在0.5％CMC中的化合物1口服處理(10mg/kg/天)，並且然後立即腹膜內注射紫杉醇(20mg/kg/周)。組6的小鼠先用在0.5％CMC中的化合物1口服處理(10mg/kg/天)，並且然後立即腹膜內注射多柔比星(20mg/kg/周)。每3-4天測量每隻小鼠中的腫瘤大小。當對照組的腫瘤大小達到1000-1500mm3時，將小鼠腹膜內注射戊巴比妥施以安樂死。將腫瘤小心移出並且稱重。
結果表明，用化合物1、紫杉醇、或多柔比星單獨處理的小鼠具有比對照組的腫瘤更小的腫瘤。它們還表明，用化合物1和紫杉醇結合或者化合物1和多柔比星結合處理的小鼠具有比用化合物1、紫杉醇、或多柔比星單獨處理的那些小鼠出乎意料更小的腫瘤。
化合物1和全反式視黃酸(ATRA)在治療白血病中的協同作用22-28g重量8周齡的雄性BALB/c小鼠獲得於實驗室動物中心，國立臺灣大學醫學院(Laboratory Animal Center，National Taiwan UniversityCollege of Medicine(臺北，臺灣))。鼠科骨髓單核細胞白血病細胞系WEHI-3獲得於食品工業研究和發展學院(Food Industry Research andDevelopment Institute(Hsinchu，臺灣))。鼠科WEHI-3白血病細胞系最先在1969年建立，並且表現出骨髓單核細胞白血病的特徵。這種細胞系可以在同基因(syngenic)BALB/c小鼠中誘導白血病，從而可用於評估藥物的抗白血病作用。(參見，He Q，Na X，「The effects and mechanisms of anovel 2-aminosteroid on murine WEHI-3B leukemia cells in vitro and in vivo，」Leuk.Res.25(6)455-61，(2001))。將所述細胞置於75-cm2組織培養瓶中，並且在37℃，在潮溼的5％CO2氣氛下，在補充了10％胎牛血清、1％青黴素-鏈黴素(10,000U/ml青黴素和10mg/ml鏈黴素)和1％穀氨醯胺的RPMI 1640培養基中生長。
為了檢測化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1對攜帶WEHI-3白血病細胞的BALB/c小鼠(WEHI-3/BALB/c小鼠)存活的效果，將化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1以30mg/kg/2天持續14天腹膜內(i.p.)施用給已經接種1×105個WEHI-3細胞的BALB/c小鼠。具體地，將BLAB/c小鼠分成4組。組I只用WEHI-3腹膜內(i.p.)注射。組II在WEHI-3細胞注射後14天開始化合物1治療(i.p.30mg/kg/2天持續14天)。組III在WEHI-3細胞注射後14天開始ATRA治療(i.p.30mg/kg/2天持續14天)。組IV在WEHI-3細胞注射後14天開始化合物1和ATRA治療(i.p.30mg/kg/2天持續14天)。在將所述動物稱重和採血以及處死用於進一步實驗之前，將對照小鼠和所有組的小鼠治療2周。
這些研究的結果表明，化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1顯著地延長了WEHI-3/BALB/c小鼠的平均存活時間(表1)。WEHI-3/BALB/c小鼠的平均存活時間為30天，並且當WEHI-3/BALB/c小鼠分別用30mg/kg/小鼠的化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1處理時，這增加到40，42和44天(P＜0.05，對數等級和普遍性Wilcoxon’s檢驗)。
表1.化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1對攜帶WEHI-3白血病細胞的BALB/c小鼠存活的作用。
QD*72天1次，共7次*p＜0.05，對數等級檢驗；*p＜0.05，普遍性Wilcoxon’s檢驗。
**p＜0.01，對數等級檢驗；**p＜0.01，普遍性Wilcoxon’s檢驗。
將脾和肝組織從個體動物分離，照相，稱重，並且進行組織病理學檢查。代表性的結果在圖1和2中顯示。這些結果表明，化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1在1個月的實驗內改善白血病小鼠的體重減少(數據未顯示)。與未治療的白血病小鼠中的相比較，在所有治療組中脾、淋巴結、肝轉移的增大被顯著地減小了(圖1)。另外，脾切片的H-E染色揭示成熟原粒細胞向脾紅髓的滲透在化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1治療組中減小了(圖2)。
為了研究化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1在WEHI-3細胞中體外對細胞周期的生長抑制作用，具有TUNEL染色的NBT還原被用來確定分化和程序性細胞死亡。在將細胞用化合物1(5μM)、ATRA(1μM)、和與ATRA組合的化合物1處理24h後，在ATRA和與ATRA組合的化合物1處理的WEHI-3細胞中觀察到明顯的G0/G1停滯。這種現象沒有在ATRA處理的WEHI-3細胞中發生，但是化合物1和與ATRA組合的化合物1處理的WEHI-3細胞具有增加的亞G1群體(數據未顯示)。
為了研究化合物1誘導程序性細胞死亡和ATRA誘導WEHI-3細胞分化的能力，在用化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1處理的WEHI-3細胞中評估NBT還原活性和TUNEL/DAPI染色。在用化合物1和與ATRA組合的化合物1培養24 h後，細胞表現出核收縮，染色質濃縮核DNA斷裂。在ATRA處理的WEHI-3細胞中沒有觀察到這一現象(圖3A)。同對照細胞相反，在用ATRA和與ATRA組合的化合物1處理的細胞中觀察到NBT還原的顯著增加。在化合物1、ATRA、和與ATRA組合的化合物1處理後，NBT陽性細胞的百分比分別為3.56，33.42和45.22％，和TUNEL陽性細胞分別為40.33，5.45和45.22％(圖3B)。這些結果表明，在WEHI-3細胞中ATRA誘導分化和化合物1誘導程序性細胞死亡。
對於程序性細胞死亡的進一步評估，在化合物1處理的WEHI-3細胞中我們檢驗了DNA斷裂和胱天蛋白酶-3活性檢測。瓊脂糖凝膠電泳表明，從用5μM化合物1處理12和24h的WEHI-3細胞提取的DNA斷裂成為180-200個鹼基對的梯子(圖4A)。為了確定對於由化合物1誘導的程序性細胞死亡是否需要胱天蛋白酶-3的活化，在暴露於50μM化合物1前，在WEHI-3細胞中，我們使用或不使用胱天蛋白酶-3抑制劑(Z-DEVD-FMK)預處理。如在圖4B中所示，YC-1處理12，18和24h引起胱天蛋白酶-3活性的快速誘導。所誘導的胱天蛋白酶-3活性受到了Z-DEVD-FMK預處理的阻滯。這些結果表明，化合物1對程序性細胞死亡的誘導是由胱天蛋白酶-3活性引起的特異性生化事件。
其它實施方案在本說明書中公開的所有特徵可以以任何組合方式組合。本說明書中公開的每一特徵可以由提供相同的、等價的、或類似的目的的備選特徵代替。因此，除非另外清楚地表述，公開的每一特徵僅是一類系列等價或相似特徵的實例。
從上述描述中，本領域的技術人員可以容易地確定本發明的本質特徵，並且不背離其精神和範圍，可以進行本發明的各種改變和改進以使之適於各種應用和狀況。例如，與稠合的吡唑基化合物結構類似的化合物也可以用於實行本發明。因此，其它實施方案也屬於本權利要求。
權利要求
1.一種治療癌症的組合物，其包括癌症化學治療藥劑和下式的化合物 其中A是H或 每個Ar1，Ar2和Ar3獨立地為苯基，噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，或嘧啶基；每個R1，R2，R3，R4，R5，和R6獨立地為R，硝基，滷素，C(O)OR，C(O)SR，C(O)NRR』，(CH2)mOR，(CH2)mSR，(CH2)mNRR』，(CH2)mCN，(CH2)mC(O)OR，(CH2)mCHO，(CH2)mCH＝NOR，(CH2)mC(O)N(OR)R』，N(OR)R』，或者R1和R2一起，R3和R4一起，或R5和R6一起為O(CH2)mO，其中每個R和R』獨立地為H或C1～C6烷基；和m是0，1，2，3，4，5，或6，和n是0，1，2，或3。
2.權利要求1的組合物，其中A是
3.權利要求1-2中任一項的組合物，其中Ar3是苯基。
4.權利要求1的組合物，其中A是H。
5.權利要求1-4中任一項的組合物，其中Ar1是苯基。
6.權利要求1-5中任一項的組合物，其中Ar2是呋喃基。
7.權利要求1-6中任一項的組合物，其中R3和R4中一個是H，和另一個是CH2OH。
8.權利要求1-7中任一項的組合物，其中每個R1，R2，R5，和R6是H。
9.權利要求1-8中任一項的組合物，其中所述化學治療藥劑是結合DNA的化學治療藥劑。
10.權利要求1-8中任一項的組合物，其中所述化學治療藥劑是微管穩定劑。
全文摘要
一種治療癌症的方法，其包括給需要其的受試者施用有效量的化學治療藥劑和有效量的下式的化合物，其中，A是H或式(Ⅱ)；每個Ar
文檔編號A61P35/00GK1986543SQ20061016939
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月20日 優先權日2005年12月23日
發明者郭盛助, 鄧哲明, 李芳裕, 潘秀玲, 顧記華 申請人:永信藥品工業股份有限公司