鑑別抑制1－脫氧－d－木酮糖－5－磷酸生物合成途徑的化學活性成分的方法以及所述...的製作方法

2023-09-23 05:21:40 4

專利名稱：鑑別抑制1－脫氧－d－木酮糖－5－磷酸生物合成途徑的化學活性成分的方法以及所述 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及鑑別適用於治療由單細胞或多細胞寄生蟲導致的寄生蟲病的活性成分的方法。醫學及製藥工業是本發明的應用領域。本發明還涉及蛋白質、蛋白質片段和編碼這些蛋白質和片段的DNA序列，這些DNA序列、蛋白質或其片段在鑑別作用於單細胞或多細胞寄生蟲的物質中的應用，以及由此方式鑑別的活性成分及這些活性成分在生產藥物組合物中的應用。
術語寄生蟲包括單細胞寄生蟲和多細胞寄生蟲，包括蠕蟲和anthropoidea。這些寄生蟲導致人和動物中的傳染性疾病。在本發明中，使用寄生蟲的嚴格科學定義，即單細胞寄生蟲是指原生動物門。
現已存在大量抗寄生蟲病的製劑。由於很快產生抗性，現有的製劑在治療人和動物時已變得無效。結果是有許多受瘧疾寄生蟲感染的區域對標準的藥物如氯喹已有抗性。對治療血吸蟲病的標準製劑(吡喹酮)產生抗性也已有報導。這些抗性的產生和其他因素已導致瘧疾和血吸蟲病成為熱帶最常見的疾病。據估計有3-5億人患有瘧疾，200-250萬人每年死於瘧疾。另外，新藥如甲氟喹的生產非常昂貴且有許多副作用。因此，非常需要治療人和動物的藥物組合物。
過去對開發抗寄生蟲特別是抗瘧疾和血吸蟲病病原體的化療組合物有許多嘗試。其中之一是抑制所謂的類異戊二烯生物合成。類異戊二烯是從各個異戊二烯單位(異戊烯二磷酸)形成的分子，其在細胞中發揮重要功能。這些包括甾醇、泛醌和寄生蟲寄生所需的其他分子。本申請中所進行的方法是基於在真菌和哺乳動物細胞中建立的模型。在真菌和哺乳動物細胞中，通過3個乙醯輔酶A分子縮合成HMG-CoA而形成亞單位異戊烯二磷酸。HMG-CoA然後從HMG-CoA還原酶轉化成甲羥戊酸，甲羥戊酸然後由作為中間體階段的甲羥戊酸磷酸酯轉化成異戊烯二磷酸(見圖7)。HMG-CoA還原酶抑制劑如洛伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀已被用作抑制寄生蟲的生長。儘管用非常高劑量洛伐他汀和辛伐他汀可以獲得體外抑制，但體內抑制失敗了。用洛伐他汀治療血吸蟲感染的小鼠導致對這些寄生蟲排卵的抑制，但是需使用非常高濃度的洛伐他汀以體內摧毀這些寄生蟲中的一些。
令人驚奇地，已發現寄生蟲特別是瘧原蟲和錐體蟲(瘧疾和昏睡病的致病因子)具有至少一個另外的代謝途徑來合成類異戊二烯。這一代謝途徑基於甘油醛與丙酮酸縮合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)。DOXP然後轉化成2-C-甲基-D-赤蘚糖-4-磷酸，後者轉化成作為異戊烯二磷酸中間體階段的2-C-甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸。這一代謝途徑涉及DOXP合酶和DOXP還原異構酶(見圖7)。過去，這一途徑僅在植物、藻類和某些細菌中有描述(Sprenger等，PNAS,94(1997)12857-62,Kuzuyama等，四面體通信39(1998)4509-12)。
通過本領域技術人員已知的技術抑制上述DOXP代謝途徑特別是DOXP合酶和DOXP還原異構酶適於在人和動物中防止和治療由單細胞和多細胞寄生蟲導致的感染。因為這一代謝途徑在人中不發生，所以其可作為寄生蟲的選擇性化療的理想靶。脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構酶特別適於作為化療靶。已證明對瘧疾的脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構酶的抑制具有特別低的副作用並且是合適的，因為人類不具有該酶的底物及其前體，也不具有酶的產物或酶本身。
本發明涉及獲得抑制DOXP代謝途徑的活性成分的方法，還涉及用於生產治療和預防由單細胞或多細胞寄生蟲導致的傳染性疾病的藥物組合物的這些活性成分。
本發明的目的是提供一種鑑別用於治療人和動物中的寄生蟲病的活性成分的新方法。另一個目的是開發獲得選擇性摧毀病原體並且具有很少副作用的藥物的方法。
這一目的由權利要求1的方法實現。本發明的方法和所發現的活性成分的特徵在於－在所謂的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸代謝途徑中的類異戊二烯生物合成被抑制。
所述的代謝途徑無一存在於人和動物中，僅存在於植物、藻類、某些真細菌和寄生蟲如瘧原蟲中；因此這一治療方法很少有副作用。
本發明還涉及參與此代謝途徑的酶和這些酶的片段。這些酶是適用於進行本發明的鑑別活性成分的方法的蛋白質。本發明還涉及編碼這些酶或這些酶的片段的DNA序列。
本發明涉及鑑別這些酶或其片段以及經重組技術產生酶或其片段的方法和抗體。
本發明還涉及這些酶或其片段或者編碼這些酶或這些酶的片段的DNA序列在鑑別抗單細胞或多細胞病原體的活性物質中的應用。
本發明還涉及用本發明的酶發現的活性成分。
以下本發明將參照附圖更詳細地描述。


圖1a示出編碼來自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的蛋白質1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶的基因的核苷酸序列。
圖1b示出編碼來自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的基因的核苷酸序列。
圖2a示出編碼來自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶的基因的核苷酸序列和相應胺基酸序列。
圖2b示出編碼來自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的基因的核苷酸序列和相應胺基酸序列。
圖3a示出來自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的蛋白質1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶的胺基酸序列。
圖3b示出來自惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)的蛋白質1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的胺基酸序列。
圖4a是圖1b的核苷酸序列的詳細說明。
圖4b是圖2b的核苷酸序列及相應胺基酸序列的詳細說明。
圖4c是圖3b的胺基酸序列的詳細說明。
圖5示出用3劑下述物質之一治療4天後寄生蟲血症值的體外數據甲醯基，相應於3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)-丙基-膦酸單鈉鹽，以及乙醯基，相應於3-(N-乙醯基-N-羥基氨基)-丙基-膦酸單鈉鹽。
圖6a示出加入3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)-丙基-膦酸單鈉鹽(空心圓)以及3-(N-乙醯基-N-羥基氨基)-丙基-膦酸單鈉鹽(實心圓)後對HB3株惡性瘧原蟲的生長的抑制。
圖6b示出加入3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)-丙基-膦酸單鈉鹽(空心圓)以及3-(N-乙醯基-N-羥基氨基)-丙基-膦酸單鈉鹽(實心圓)後對A2株惡性瘧原蟲的生長的抑制。
圖6c示出加入3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)-丙基-膦酸單鈉鹽(空心圓)以及3-(N-乙醯基-N-羥基氨基)-丙基-膦酸單鈉鹽(實心圓)後對Dd2株惡性瘧原蟲的生長的抑制。
圖7示出經典乙酸/甲羥戊酸生物合成途徑和旁路DOX-P-生物合成途徑的比較。
DOXP合酶和DOXP還原異構酶的編碼基因經遺傳方法檢測(圖1a,1b,2a,2b)。在用聚合酶鏈反應從惡性瘧原蟲基因組富集後，將這些基因克隆到細菌質粒中並確定其核苷酸序列。序列數據顯示這些基因與來自藻類、植物和細菌的相應基因具有高度同源性。這種非常高的同源性表明這3個基因編碼惡性瘧原蟲的DOXP合酶和DOXP還原異構酶。
在異源系統中表達後，將所述的酶作為重組蛋白純化並在無細胞系統中用於活性研究。DOXP合酶的活性通過將甘油醛-3-磷酸和丙酮酸轉化成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸而測定。DOXP還原異構酶的活性通過在NADPH存在下將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉化成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸而測定。對NADPH濃度變化的測量經參數變化而進行。這一方法是本領域技術人員公知的。
這些酶可由編碼它們的DNA序列(圖1a,1b,2a,2b)及其衍生的胺基酸序列(圖3a和3b)而定義。但是寄生蟲之間各個寄生蟲的酶可以有變化，這種胺基酸的差異通常是胺基酸交換。但是，總序列中也可有胺基酸的缺失、插入和添加。本發明的酶的大小和類型取決於表達其的細胞和細胞類型，其可以是糖基化的或非糖基化的。
本發明的酶或這些酶的片段通過在合適的表達系統如作為原核表達系統的細菌特別是大腸桿菌中，或真核表達系統特別是COS細胞或盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum)中表達本發明的DNA而產生。
藉助於本發明的核酸序列，可以在任何寄生蟲的基因組中尋找該編碼基因或其變體，並鑑別和分離編碼所述酶的所需編碼基因。這種方法和適合此目的的篩選方法是本領域技術人員公知的。
應用重組技術可以產生酶或酶片段的多個變體。這種衍生物可以被修飾，例如經取代、缺失或添加一或多個胺基酸而修飾。衍生可以經例如定點誘變而進行。本領域技術人員可容易地實施這種變異。僅僅需要保證酶的特性能得以保持。因此，本發明的另一主題是參與DOXP代謝途徑的酶，特別是DOXP合酶和DOXP還原異構酶，其a)是外源DNA的原核或真核表達產物，b)由圖1a,1b,2a和2b的序列編碼，c)由與圖1a,1b,2a和2b所示的DNA序列或這些DNA序列的片段(例如見圖4a和4b)在編碼成熟蛋白的DNA區域雜交的DNA序列編碼，或者d)由與b)和c)定義的序列非經遺傳密碼簡併性而雜交並編碼具有相同胺基酸序列的多肽的DNA序列編碼。
優選的酶是由圖1a,1b,2a和2b的核苷酸序列所編碼的酶，或由由於遺傳密碼簡併性而編碼具有相同胺基酸序列的多肽的DNA序列所編碼的酶。
本發明的兩種酶(圖3a和3b的序列)可被視作單細胞和多細胞寄生蟲，特別是單細胞寄生蟲的特異蛋白質的新原型。
本發明涉及編碼所述酶的核酸序列，其選自如下一組a)圖1a,1b,2a和2b所示的DNA序列或其互補序列，b)與a)中的序列之一雜交的核酸序列，c)與a)或b)所述的序列之一非經遺傳密碼簡併性而雜交的核酸序列。
本發明還涉及來自任何寄生蟲的基本上將丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP合酶)並將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉化成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(DOXP還原異構酶)的酶。
這些酶可以與來自瘧原蟲的酶類似地如下獲得，即用含有編碼瘧原蟲酶序列的雜交探針經本領域技術人員熟悉的方法篩選，或經瘧原蟲的酶的DNA和蛋白質序列與其他寄生蟲酶的DNA和蛋白質序列的比較而獲得。
藉助於核酸，可以可重複方式大量獲得本發明的酶。通過本領域技術人員熟悉的方法將核酸整合進合適的表達載體中以在原核和真核生物體中表達。這種表達載體優選含有可調節/可誘導啟動子。這些重組載體然後經已知方法導入用於表達的合適的宿主細胞，並在允許異源基因表達的條件下培養轉化的、轉染的或轉導的宿主細胞。合適的宿主細胞包括原核細胞，如大腸桿菌，以及真核細胞，特別是酵母(例如釀酒酵母，粟酒裂殖糖酵母，巴斯德畢赤氏酵母)，昆蟲細胞(例如黑腹果蠅的細胞系如S2細胞，苜蓿銀紋夜蛾，粉紋夜蛾)，脊椎動物細胞系，特別是畸胎癌細胞系如CHO或COS細胞，以及植物細胞系。
本發明的酶還可在轉基因植物和動物(如小鼠、綿羊、山羊、豬、豚鼠)中表達。有利的是，經本領域技術人員已知的技術安排表達系統，以使產生的酶經動物乳汁分泌，或可從容易獲得的植物部分(果實、葉、花、根和莖部)獲得。
特別合適作為脊椎動物細胞系表達載體的是從乳頭瘤病毒(如SV40)、反轉錄病毒、新培斯病毒、巨細胞病毒和痘苗病毒衍生的系統。特別適用於昆蟲細胞的表達載體是杆狀病毒系統，對於植物，特別合適的是基於根癌農桿菌ti質粒的細胞系統，以及用由核酸包被的粒子轟擊細胞。
本發明的酶的表達在粘菌如盤基網柄菌、Polysphondyliumpallidum和多頭絨孢菌中特別顯著，因為這些菌的細胞可在簡單培養基上大量經濟地培養。使用盤基網柄菌提供了另外的優點，因為這一微生物使用與惡性瘧原蟲類似的密碼子編碼各胺基酸，因此可實現本發明的酶的特別有效的產生。另外，用於盤基網柄菌的表達載體的可誘導啟動子(例如由於缺少食物所致)是已知的。由此，重組酶產量可進一步提高。
特別適用於表達本發明的酶的宿主細胞和生物體本身沒有將丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP合酶)和將1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸反應成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(DOXP還原異構酶)的固有酶。符合條件的是古細菌、動物、真菌、粘菌和某些真細菌。重組酶的檢測和純化由缺少這些固有酶活性而大大促進。另外，第一次可以在宿主細胞粗提物中經濟地測量本發明重組酶的活性，特別是各種化學物質和藥物組合物對本發明重組酶活性的抑制。
當要進行翻譯後修飾和多肽鏈的天然摺疊時，有利的是本發明的酶在真核細胞中表達。另外，作為表達系統的功能，在基因組DNA序列表達過程中，內含子經DNA剪接而消除，酶以寄生蟲特徵性多肽序列產生。通過重組技術也可從待表達DNA序列中消除編碼內含子的序列或可實驗性插入。
通過本領域技術人員公知的技術可從宿主細胞或宿主細胞培養物上清中分離蛋白質。酶的體外再活化可能也是需要的。
為促進純化，本發明的酶或酶片段可與各種肽鏈一起作為融合蛋白而表達。寡聚組氨酸序列和衍生自穀胱甘肽-S-轉移酶，硫氧還蛋白或鈣調蛋白結合肽的序列特別適於此目的。與硫氧還蛋白衍生序列的融合特別適合於原核表達，因為重組酶的可溶性由此提高。
另外，本發明的酶或酶的部分序列可與本領域技術人員已知的肽鍊表達，從而重組酶被轉運至胞外環境或進入宿主細胞的某些小室。由此，酶的生物學活性的純化和研究得以促進。
隨著本發明酶的表達，可有利地改變具體的密碼子。當寄生蟲所用的密碼子與異源表達系統所用的密碼子不同時，為保證蛋白質的最佳合成，明智的是在編碼區進行鹼基的特異交換。缺失5＇或3＇非翻譯區通常也是有利的，例如當多個導致不穩定性的序列基序ATTTA存在於DNA的3＇區時。這些在真核生物的優選表達中應缺失。這種變化包括鹼基的缺失、添加或交換，並也是本發明的主題。
本發明的酶還可在標準化條件下經本領域技術人員公知的技術由體外翻譯獲得。適合於此的系統是兔網織紅細胞和麥胚抽提物。另外，體外轉錄的mRNA也可在非洲爪蟾卵細胞中翻譯。
通過化學合成，可以產生寡肽和多肽，其序列衍生自本發明的酶的肽序列。通過合適地選擇序列，這種肽具有本發明的完整酶的特徵性特徵。這種肽可大量產生並特別適合於進行酶活性動力學、酶活性的調節、酶的三維結構、各種化學物質和藥物組合物對酶活性的抑制、以及各種配體的結合幾何學和結合親和性的研究。
具有來自圖1a,1b,2a和2b所示序列的核苷酸的DNA或圖4a和4b的片段優選地用於重組產生本發明的酶。
本發明還涉及通過從寄生蟲中分離而獲得參與DOXP代謝途徑的酶、特別是DXOP合酶和DOXP還原異構酶的方法。所述的酶經層析、電泳和其他本領域技術人員已知的技術從寄生蟲提取物中分離。通過測定各自酶活性或與合適抗體的反應性而發現酶。
重組產生酶的轉化的、轉染的或轉導的宿主細胞的檢測和蛋白質的純化優選通過與這些酶結合的抗體而進行。通過用本發明的酶或酶部分作為抗原或免疫原經已知方法可容易地獲得這種抗體。
其他寄生蟲的同源或交叉轉化蛋白可用抗本發明蛋白的抗體經例如Western印跡試驗而檢測。
本發明還涉及確定DOXP酶、特別是DOXP合酶和DOXP還原異構酶的酶活性的方法，其可根據已知的指導(Sprenger等，PNAS,94(1997)12857-62和Kuzuyama等，四面體通信39(1998)4509-12)確定。在此方法中，檢測丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP合酶)和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸轉化成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(DOXP還原異構酶)。本發明還涉及用這些測定方法獲得抑制相應酶活性的物質的用途。
應用重組技術可以多個酶或酶片段的變異體。這種衍生物可以例如經取代、缺失或添加而修飾一或多個胺基酸。例如，衍生可經定點誘變進行。本領域技術人員可容易地進行這種變異。僅必須保證酶的特徵得以保留。
藉助於本發明的酶及其同系物，可發現抗寄生蟲的新的特異活性成分。
具體地，上述檢測方法可用於合適的篩選物質的抗寄生蟲活性的測試試劑盒中。這些包括本領域技術人員已知的並適合於篩選來自菌群和動物區系、植物、藻類、細菌或動物的天然物質及其衍生物，化學文庫，以及經本領域技術人員已知技術產生的文庫如組合文庫的方法。(Pindur等，Pharmazie in unserer Zeit 26(1997)24-30；Broach等，自然384(1997)14-6；Lack等，Chimia50(1996)445-7；Czarnik und Ellmann，化學研究記錄29(1996)；化學及工程新聞749(1996)28-73;Lorin等，化學綜述96(1996)555-600;Weber等，Nachrichten aus Chemie,Technik und Laboratorium 42(1994)698-702)。
本發明還涉及蛋白質或這些蛋白質的片段包括有或無酶活性的蛋白質或蛋白質片段在本領域技術人員已知的確定蛋白質結構的技術、特別是鑑別適於開發對酶活性具有抑制效應的製劑的結合位點的方法中的應用。
用本發明的蛋白質獲得的活性成分對於醫學和獸醫學有重要作用。
藉助於本發明的蛋白質發現的活性成分具有有利的恆溫動物毒性，其適合於對抗在人類和畜牧業以及在家養、育種、動物園、實驗室飼養的動物，和實驗動物和寵物中存在的病原性寄生蟲。它們有效地抗破壞性寄生蟲發育的所有或各個階段，並且有效地抗抗性的和正常敏感的寄生蟲。作為抗寄生蟲的結果，疾病、死亡率和性質的降低(例如肉、奶、毛、皮、蛋等的產量)應降低，所以活性成分的應用使得畜牧業更容易且更經濟。
用本發明的這些方法包括熟知的分析，可以證明DOXP還原異構酶的活性由3-(N-乙醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸酯和衍生物3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸酯(fosmidomycin)抑制。兩種物質均來自醯基羥基氨基烷基膦酸衍生物的化學文庫。過去這一組化合物被描述為殺蟲劑和殺細菌劑(US 4693742,DE2733658)。用於獲得抗寄生蟲活性成分的系統的有效性在本文顯示。來自酶分析的結果可在瘧疾培養(見實施例)和動物實驗(見實施例)中證實。經這些酶分析發現的抑制劑能體外和體內抑制瘧原蟲的生長。對動物進行8天的治療顯示動物的康復。乙醯基形式的功效顯示比甲醯基形式高3倍。這一結果是非常令人驚奇的，因為需要相當高(高1000倍)濃度的3-(N-乙醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸酯抑制細菌的生長。
本發明的方法因此適用於鑑別活性成分，並且本發明的活性成分適用於對由寄生蟲、真菌或病毒導致的人和動物的感染的治療性和預防性治療。所述的化合物適合預防和治療由瘧疾和昏睡病以及Chagas氏病、弓形體病、阿米巴性痢疾、利什曼病、毛滴蟲病、肺囊蟲病、腸袋蟲病、隱孢子蟲病、肉孢子蟲病、棘阿米巴病、耐格裡原蟲病、球蟲病、賈第鞭毛蟲病和蘭氏鞭毛蟲病的病原體導致的感染。
本發明的方法和活性成分特別適用於治療瘧疾、昏睡病和利什曼病。
本發明的活性成分還適於抑制細菌和植物的代謝途徑。根據本發明鑑別的作為DOXP代謝途徑抑制劑的物質因此也適於用作除草劑以及用於治療人和動物中的細菌感染。
適於治療的家養動物和育種動物包括哺乳動物如牛、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、水牛、驢、兔、鹹水魚和淡水魚如鮭魚、鯉魚和鰻鱺。合適的實驗室動物和用於實驗的動物包括小鼠、大鼠、豚鼠、金倉鼠、狗、貓和豬。合適的寵物包括狗和貓。應用可以是預防性的和治療性的。活性成分可直接應用或以本領域技術人員已知的合適劑型應用，如腸道用、非腸道用、皮用和鼻用製劑。
本發明的活性成分可與本領域技術人員已知的任何抗感染劑聯合應用，這些包括具有抗細菌、抗寄生蟲、抗病毒或殺真菌作用的物質。這些物質包括列於紅目錄和專家文獻中的抗感染劑(Allegemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikololgie von Forth等，BI-Wissenschaftsverlag，曼海姆1998；Antibiotikatherapie vonSimon und Stille,Schattauer-Verlag，斯圖加特1993)。
由於某些寄生蟲同時具有甲羥戊酸代謝途徑和DOXP代謝途徑，本發明還涉及DOXP代謝途徑的抑制劑與抑制脂肪代謝途徑的製劑、包括脂類的合成或吸收的抑制劑特別是甲羥戊酸代謝途徑的抑制劑的聯合。HMG-CoA合酶的抑制劑和HMG-CoA還原酶的抑制劑特別製得關注。HMG-CoA還原酶的抑制劑中，特別包括洛伐他汀及衍生物、美伐他汀及衍生物、Compactin及衍生物、辛伐他汀及衍生物、普伐他汀及衍生物、Atorvastatin及衍生物、Fluvastatin及衍生物、Cerivastatin及衍生物。
實施例1編碼DOXP還原異構酶的惡性瘧原蟲基因的表達克隆用相應的基因組DNA序列作為基質經PCR擴增克隆編碼惡性瘧原蟲DOXP還原異構酶的基因。為獲得基因組DNA，用Kerzentopf方法(Tranger und Jensen(1976)，科學193,673-675)培養惡性瘧原蟲株HB3。培養基是補加10％人血清、0.3微克/毫升慶大黴素和0.1mM次黃嘌呤的RPMI 1640(含HEPES和L-穀氨醯胺，Gibco)，用人紅細胞調節血細胞比容為5％。將具有約4％寄生蟲血症的各含有35毫升培養物體積的15個培養皿用於製備DNA。離心收集感染的紅細胞並在載體緩衝液(57mM NaCl，58mM KCl，1mM NaH2PO4，7mM K2HPO4，11mM NaHCO3，14mM葡萄糖)中洗兩次。通過在冰上用1O倍體積的在載體緩衝液中的1％皂苷溶液裂解細胞沉澱5分鐘(根據Kilejian(1979)，美國科學院院刊76,4650-4653改進)而從紅細胞中釋放寄生蟲。通過與在載體緩衝液中的1％BSA溶液離心而洗滌游離的寄生蟲2次。根據標準程序從獲得的游離寄生蟲中製備DNA。然後用蛋白酶K消化寄生蟲。用苯酚/氯仿抽提分析物4次，對TE過夜透析DNA溶液，然後用異丙醇沉澱。用下述引物進行PCR擴增PfYAEMfor 5＇-CTGAATTTCATATTACAAAATTAATAGATG-3＇PfYAEMrev 5＇-GTACTATGAAGAATTATGTTTGTTGTATAT-3＇下述分析用於PCR轉化3微升10×PCR緩衝液2.4微升25mM MgSO42.4微升2.5mM Dntp2微升DNA基質(0.2微克/毫升)2微升引物1(7.5μM)2微升引物2(7.5μM)0.2微升taq聚合酶(5U/μl)1.6微升水擴增如下進行3個循環96℃1分鐘48℃1分鐘
72℃3分鐘32個循環95℃40秒48℃1分鐘72℃3分鐘最後一個循環後，將分析物在72℃繼續保溫10分鐘以延伸所有產物。合併這4個分析的PCR產物並用0.7％瓊脂糖凝膠純化。用DNA提取試劑盒(Millipore，貨號S667)從凝膠塊中洗脫DNA。用乙醇沉澱洗脫的DNA並溶於10微升水。然後用TA克隆試劑盒(Invitrogen)根據廠商指導克隆PCR產物。將20毫克插入DNA用於連接反應。經分析質粒製備和質粒的EcoRⅠ消化鑑別攜帶所需的重組質粒的細菌菌落。然後用標準正向和反向引物測序克隆的PCR產物，用Walkings引物技術完成序列。
將以相應方向存在於pCR2.1載體中的PCR產物重新克隆於表達載體pBK-CMV(Stratagene)中，用於在COS-7細胞中表達。用存在於兩個載體的多接頭的限制酶NotⅠ和BamHⅠ進行重新克隆。為轉染COS-7細胞，經陰離子交換層析(Qiagen)以製備規模產生具有PCR產物的表達載體。
克隆用的所有方法詳見J.Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis(1989)，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，美國。
在標準條件下，在含有10％FCS的DMEM培養基中培養COS-7細胞。每個細胞培養瓶裝30毫升培養基。用約50％鋪滿的細胞進行轉染，該細胞已在前一天分離。用DOTAP(Boehringer)作為轉染試劑。將40微升DNA溶液(0.5微克/毫升)與110微升20mMHEPES(pH7.4)混合。在聚苯乙烯容器中將100微升DOTAP與230微升20 mM HEPES(pH7.4)混合。然後將DNA溶液轉移至DOTP溶液中並在室溫保溫15分鐘。之後將反應物與20毫升培養基混合，並用此混合物替換COS-7細胞的培養基。第二天，將細胞轉移至具有新鮮培養基的新細胞培養瓶中。再保溫48小時後，收穫轉染的COS-7細胞。刮下細胞並在分析緩衝液(100mM TrisHCl(pH7.5)，1mM MnCl2)中離心洗滌3次。將細胞重懸於最小體積的分析緩衝液中並(在液氮中)凍融3次而消化。在1.5毫升轉化管中離心除去細胞碎片(13000rpm，10分鐘，4℃)，並將上清直接用於測定酶活性或純化酶。
實施例2惡性瘧原蟲的重組DOXP還原異構酶的純化將在COS-7細胞中表達的惡性瘧原蟲的重組DOXP還原異構酶純化至相當均質性進行更精確鑑定。純化經親和層析和凝膠滲透層析步驟進行。產生抗惡性瘧原蟲DOXP-還原異構酶的抗體以產生合適的親和層析柱。從衍生自DNA序列的胺基酸序列選擇預計具有特別高抗原效應的部分。合成合適的肽用於免疫兔。通過其與合成肽的反應性以及通過Western印跡測試證實所獲得的抗血清的質量。對於Western印跡測試(BM Western印跡試劑盒，Boehringer)，使用來自惡性瘧原蟲和重組COS細胞的提取物。
消除低分子量胺的抗血清對PBS透析以產生親和層析柱。將抗體與蛋白A-瓊脂糖結合併用DMP交聯(IgG定向試劑盒，Pierce)而共價偶聯。蛋白提取物如實施例1所述由含有轉染的COS-7細胞的55個細胞培養瓶中獲得，並上樣至用分析緩衝液平衡的柱。用過量分析緩衝液洗柱後，用洗脫緩衝液(100mM鹽酸甘氨酸(pH2.8)0.4％CHAPS)洗脫柱。洗脫液立即用1M TrisHCl(pH7.5)中和。主要組分經Western印跡分析鑑別。用生物素化抗體檢測以避免被從柱中小量洗脫的抗體破壞。合併主要組分，對分析緩衝液透析並超濾(30kDa,Amicon)濃縮。用分析緩衝液作為注入和洗脫緩衝液經凝膠滲透層析(Superdex 200,Pharmacia)進行進一步純化。如上所述鑑別主要組分，合併並濃縮，與20℃甘油反應並在-70℃凍存。在還原條件下的SDS-PAGE(12％丙烯醯胺)和銀染(Gel Code銀染試劑盒，Pierce)的結果是，惡性瘧原蟲的DOXP還原異構酶作為54kDa的單一條帶顯示。
實施例3確定純化的酶的活性並篩選抑制劑在一體外測試系統中證實純化的酶的DOXP還原異構酶活性。含有0.3mM NADPH，0.3mM DOXP和10微克重組酶的100微升分析緩衝液用於一典型測試分析。通過將DOXP加入完整分析物中開始轉化。NADPH的氧化通過在37℃在一微石英池中於340nm分光光度法測量。這一測試系統用於顯示各種物質對惡性瘧原蟲的重組DOXP還原異構酶的抑制。在向轉化分析中加入1μM 3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸單鈉鹽和1μM 3-(N-乙醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸單鈉鹽時，觀察到340nm處的吸收值無變化。在這些條件下，惡性瘧原蟲的DOXP還原異構酶被完全抑制。
實施例4體內測試物質抗瘧疾的效果經改良的Peters試驗測試各種衍生物。物質以四分之一半數致死量(LD50)應用。在測試分析中，用鼠瘧疾的病原體文氏鼠瘧原蟲感染10隻小鼠。經血液檢查證實感染後，治療4隻小鼠，未治療的6隻小鼠用作對照。用1-1000mg/kg/d 3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸單鈉鹽治療3天導致對小鼠血液中的瘧原蟲的破壞。僅1天後治療組即已無活寄生蟲。對照小鼠在感染5天後寄生蟲血症＞80％，不得不處死。進一步實驗顯示50mg/kg/d 3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸單鈉鹽對寄生蟲血症為80％的小鼠有療效。這些小鼠在治療1天後也無活寄生蟲。3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸單鈉鹽和3-(N-乙醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸單鈉鹽的進一步結果見圖5所示。
實施例5在使用感染小鼠的實驗中抗瘧疾的保護作用用體重20-25克的雄性小鼠(BALB/c株)測試化合物體內抗瘧疾的效果。在感染前1天，4隻小鼠經腹膜內給予50mg/kg 3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸單鈉鹽而處理，然後用文氏鼠瘧原蟲感染小鼠。事先未用所述物質處理的小鼠用作對照。在處理的小鼠中未檢測到感染，而5天後對照小鼠的寄生蟲血症超過80％。感染後8周處理的小鼠也無寄生蟲。
實施例6根據IC50確定原則(寄生蟲存活率降低一半時所需濃度)體外抑制瘧原蟲的生長為確定IC50值，在抑制劑存在下首先將瘧原蟲培養完整的48小時周期，在接下來的24小時經[3H]次黃嘌呤摻入測定存活率。將20微升等份的10倍連續稀釋的3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)丙基膦酸單鈉鹽置於微滴板上，然後向每孔中加入180微升在培養基中的寄生蟲懸液。使用約0.4％寄生蟲血症和2％血細胞比容的非同步培養物。然後保溫微滴板48小時，之後每孔加入30微升[3H]次黃嘌呤。保溫24小時後，收穫細胞並測定摻入的放射性。使用已知對其他抗瘧疾藥物有抗性的HB3、A2和Dd2株的結果見圖6a,6b和6c所示。在所有株中，IC50值均低於0.5μM。這些株的抗性為惡性瘧原蟲HB3(宏都拉斯)抗乙胺嘧啶。
惡性瘧原蟲Dd2(印度支那)抗氯喹、奎寧、乙胺嘧啶、環氯胍和磺胺多辛。
惡性瘧原蟲A2(甘比亞)抗氯喹和環氯胍。
沒有發現與抗瘧疾製劑的交叉抗性。
序列表110朱馬·哈桑120鑑別抑制1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸生物合成途徑的化學活性成分的方法及所述活性成分13015514140PCT/EP99/024631411999-04-13150DE19843279.81511998-09-22150DE19816196.41511998-04-14150DE19828097.11511998-06-24150DE19825585.31511998-06-09150DE19831637.21511998-07-15150DE19831639.91511998-07-15150DE19831638.01511998-07-151604170PatentIn Ver.2.121012111467212DNA213惡性瘧原蟲220221CDS222(1)..(1467)220221基因222(1)..(1467)220221mRNA222(1)..(1467)4001atg aag aaa tat att tat ata tat ttt ttc ttc atc aca ata act att48Met Lys Lys Tyr Ile Tyr Ile Tyr Phe Phe Phe Ile Thr Ile Thr Ile1 5 10 15aat gat tta gta ata aat aat aca tca aaa tgt gtt tcc att gaa aga96Asn Asp Leu Val Ile Asn Asn Thr Ser Lys Cys Val Ser Ile Glu Arg20 25 30aga aaa aat aac gca tat ata aat tat ggt ata gga tat aat gga cca 144Arg Lys Asn Asn Ala Tyr Ile Asn Tyr Gly Ile Gly Tyr Asn Gly Pro35 40 45gat aat aaa ata aca aag agt aga aga tgt aaa aga ata aag tta tgc 192Asp Asn Lys Ile Thr Lys Ser Arg Arg Cys Lys Arg Ile Lys Leu Cys50 55 60aaa aag gat tta ata gat att ggt gca ata 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1.用於獲得適於治療由單細胞或多細胞寄生蟲導致的感染性疾病的化學活性成分的方法，其特徵在於將參與1-脫氧-D-木酮糖-5-膦酸代謝途徑的蛋白質或其類似作用衍生物與待檢測活性成分接觸，以確定其對寄生蟲的活性，並選擇抑制所述蛋白質或其衍生物的活性成分。
2.權利要求1的方法，其特徵在於所述蛋白質參與下述步驟a)-i)中的至少一個步驟，a)轉化甘油醛和丙酮酸成為1-脫氧-D-木酮糖，b)轉化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成異戊烯二磷酸，c)形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，d)轉化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，e)轉化1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，f)形成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，g)轉化1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸成為2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，h)轉化2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，i)轉化2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸成為異戊烯二磷酸。
3.權利要求1或2的方法，其特徵在於所述活性成分抑制所涉及的酶或輔因子的產生、特別是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶或1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶的轉化，或者所述活性成分促進所涉及的酶或輔因子的降解。
4.參與1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸代謝途徑的具有或不具有1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶活性的蛋白質，其a)由圖1b和2b所示的DNA序列編碼，或b)由與圖1b或2b所示的DNA序列或這些DNA序列的片段在編碼成熟蛋白的DNA區域雜交的DNA序列編碼。
5.參與1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸代謝途徑的具有或不具有1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶活性的蛋白質，其特徵在於其a)由圖1a和2a所示的DNA序列編碼，或b)由與圖1a或2a所示的DNA序列或這些DNA序列的片段在編碼成熟蛋白的DNA區域雜交的DNA序列編碼。
6.權利要求4或5的蛋白質以及參與1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸代謝途徑的另外的蛋白質，其特徵在於它們可用層析和電泳技術從寄生蟲的培養物上清或消化的寄生蟲中獲得。
7.權利要求4-6任一項的蛋白質，其特徵在於其a)是外源DNA的原核或真核表達產物，b)由序列1a,1b,2a或2b編碼，或由與圖1a,1b,2a或2b所示的DNA序列或這些DNA序列的片段在編碼成熟蛋白的DNA區域雜交的DNA序列編碼，或c)由與b)所定義的序列非經遺傳密碼的簡併性而雜交並編碼具有相應胺基酸序列的多肽的DNA序列所編碼。
8.權利要求4-7任一項的蛋白質，其特徵在於其由序列2a,2b,3a或3b的胺基酸組成。
9.權利要求4-8任一項的蛋白質，其特徵在於所述蛋白質是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶或1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶。
10.編碼權利要求4-9任一項的蛋白質的核酸，其特徵在於其選自a)圖1a,1b,2a和2b所示的DNA序列或其互補序列，b)與a)中的序列雜交的核酸序列，c)與a)或b)所述的序列之一非經遺傳密碼簡併性而雜交的核酸序列。
11.DNA，其特徵在於其具有選自圖1a所示序列、圖1b所示序列、圖2a所示序列和圖2b所示序列的序列。
12.含有編碼權利要求4-9任一項的蛋白質的DNA的重組表達載體，其在轉化的微生物或轉化真核細胞或在動物或植物中表達編碼該蛋白質的DNA。
13.宿主細胞，特別是原核宿主細胞、真核宿主細胞、動物和植物，其被編碼權利要求4-9任一項的蛋白質的DNA轉染並能產生所述蛋白質。
14.權利要求13的宿主細胞，其是大腸桿菌或哺乳動物細胞系。
15.編碼權利要求4-9任一項的蛋白質的DNA在轉染原核或真核生物體中的應用。
16.權利要求1-3任一項的方法，其特徵在於經層析和電泳技術從寄生蟲或寄生蟲培養物的上清中獲得所述蛋白質。
17.權利要求1-3和16任一項的方法，其特徵在於所述蛋白質通過在合適的宿主細胞中表達編碼權利要求4-9任一項的蛋白質的DNA並從宿主細胞或宿主細胞培養物上清中分離所述蛋白質而重組產生。
18.權利要求4-8任一項的來自1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸代謝途徑的蛋白質用作抗原或免疫原以產生結合此蛋白質的抗體。
19.抗權利要求4-9任一項的來自1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸代謝途徑的蛋白質的抗體，其可通過體外免疫技術獲得，或通過用前述任一項權利要求的蛋白質免疫動物並從免疫動物的血清或脾細胞分離抗體而獲得。
20.權利要求4-9任一項的蛋白質用於鑑別抗寄生蟲活性物質。
21.權利要求19的抗體用於鑑別抗寄生蟲活性物質。
22.鑑別編碼權利要求4-9任一項的蛋白質的核酸的方法，其特徵在於將待研究的樣品與選自如下一組的核酸探針保溫，所述的組為a)圖1a或1b所示的DNA序列或其互補序列，b)與a)序列之一雜交的核酸，所述的核酸探針與樣品的核酸保溫並且雜交任選地經核酸探針的另外的結合配偶體而檢測。
23.權利要求23的方法，其特徵在於待檢測的核酸在檢測前擴增。
24.用於鑑別抗寄生蟲活性物質的測試系統，其含有前述任一項權利要求的蛋白質。
25.用於生產治療由單細胞或多細胞寄生蟲導致的感染性疾病的藥物組合物的活性成分，其特徵在於其用權利要求24的測試系統鑑別。
26.用於生產殺蟲劑或治療由細菌導致的感染性疾病的藥物組合物的活性成分，其特徵在於其用權利要求24的測試系統鑑別。
27.用於生產治療由單細胞或多細胞寄生蟲導致的感染性疾病的藥物組合物的活性成分，其特徵在於其抑制1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸代謝途徑的酶或輔因子。
28.權利要求25或27的活性成分，其特徵在於其抑制下述步驟a)-i)中的至少一個步驟，a)轉化甘油醛和丙酮酸成為1-脫氧-D-木酮糖，b)轉化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成異戊烯二磷酸，c)形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，d)轉化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，e)轉化1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸，f)形成2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，g)轉化1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸成為2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，h)轉化2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸，i)轉化2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸成為異戊烯二磷酸。
29.權利要求25、27或28的活性成分，其特徵在於所述活性成分抑制所涉及的酶或輔因子的產生、特別是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶或1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶的轉化，或者所述活性成分促進所涉及的酶或輔因子的降解。
30.權利要求25-27任一項的活性成分，其特徵在於所述活性成分是3-(N-乙醯基-N-羥基氨基)-丙基膦酸酯或3-(N-甲醯基-N-羥基氨基)-丙基膦酸酯。
31.權利要求25、27-30任一項的活性成分在生產治療由單細胞或多細胞寄生蟲導致的感染性疾病、特別是瘧疾、昏睡病和利什曼病的藥物組合物中的應用。
32.權利要求31的應用，其特徵在於所述的藥物組合物還包括選自脂肪代謝途徑、膽固醇合成或膽固醇吸收的抑制劑的一或多個組分。
33.權利要求32的應用，其特徵在於脂肪代謝的抑制劑是HMG-CoA還原酶抑制劑或HMG-CoA合酶抑制劑，特別是洛伐他汀、美伐他汀、Compactin、辛伐他汀、普伐他汀、Atorvastatin、Fluvastatin、Cerivastatin。
全文摘要
本發明涉及獲得適於治療由單細胞或多細胞寄生蟲導致的感染性疾病的化學活性成分的方法。在此方法中,參與1－脫氧－D－木酮糖－5－膦酸代謝途徑的蛋白質或其類似活性衍生物與待檢測活性成分接觸,以確定其對寄生蟲的活性,並選擇抑制所述蛋白質或其衍生物的活性成分。本發明還涉及所發現的用於產生抗寄生蟲感染的藥物組合物的活性成分。
文檔編號A61P33/00GK1297532SQ99805023
公開日2001年5月30日 申請日期1999年4月13日 優先權日1998年4月14日
發明者朱馬·哈桑 申請人:朱馬·哈桑