用於生產具有提高的抗原性的腸細菌的方法及包含此種細菌的疫苗的製作方法

2023-09-23 01:05:40

專利名稱：：用於生產具有提高的抗原性的腸細菌的方法及包含此種細菌的疫苗的製作方法
技術領域：
：本發明是1994年10月5日提交的共同未決的系列申請08/318,409的部分後繼。1.發明領域本發明總體上涉及誘導或提高腸細菌抗原和/或毒性因子的表達因而產生抗原性提高的腸道細菌的體外方法，涉及使用抗原性提高的腸道細菌的方法，涉及含有抗原性提高的腸細菌的疫苗。2.發明背景普遍認為，使用常規培養基和培養條件體外培養的細菌，其表達的特徵不同於在其自然的生活環境，包括在動物宿主的正常微生物體系和病原體體內生長，生長過程中所表達的特徵。因而，這種體外生長的病原菌不宜用作疫苗組分。然而，假如能夠確定引發或提高毒性因子的表達，相關生理學，或包括外表面抗原的抗原的條件，那麼重要的產品和治療學(如，疫苗的新抗原，抗生素的新靶點，和用於診斷應用的新的細菌特徵)能夠被快速地確定。已經確定了幾種影響細菌中毒性決定簇的表達的環境因子(Mekalanos，J.J.，J.Bacteriol.1741-7，1992)。例如，對於鐵和細菌，特別是志賀氏菌屬(Payne，Mol.MicroBiol.，31301-1306，1989)，奈瑟氏球菌屬(PayneandFinhelstein，J.Clin.Microbiol.，6293-297，1977)和巴斯德氏菌屬(Gilmour，etal.，Vaccine，9137-140，1991)細菌的毒性之間關係的研究已進行了很長時間。其它環境因子亦顯示出在植物和動物中控制多種細菌的協同調節的毒性決定簇的表達，包括酚類化合物，單糖，胺基酸，溫度，克分子滲透壓濃度，和其他離子(Mekalanos，J.Bacteriol.1741-7，1992)。通過腸道(即，口途徑)進入動物宿主的細菌病原體遭遇多種宿主環境成份和條件，這些都可能影響細菌病理學和毒性因子表達。這些成份和條件包括膽汁，膽汁酸或鹽，胃pH，微需氧的條件(腸道內CO2較高，O2較低)，克分子滲透壓濃度和其它尚未確定的因素。侵襲性腸病原菌需要從頭蛋白質合成以完成內在化(internalization)(HeadleyandPayne，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，874179-4183，1990)。因而，細菌可僅在應答普通情況下體外不存在的某些環境信號時最佳地產生這些侵襲因子。這些假說被最近的報導所支持針對常規生長的空腸彎曲桿菌製備的抗血清在阻斷體外內在化上僅有邊緣效應(Konkel，etal.，J.Infect.Dis.，168948-954，1993)。然而，用在上皮細胞單層出現，一種提高侵襲力，的條件下生長的彎曲桿菌提取物免疫兔，引起能明顯抑制細菌內在化的抗血清的產生。研究人員一直在研究在腸道環境下的細菌生長以確定相關毒性因子。例如，生長於兔迴腸環的彎曲桿菌菌株81-176表達了在實驗室常規體外培養條件下不表達的蛋白質(Panigrahi，etal.，Infect.Immun.604938-4944，1992)。用INT407細胞單層培養的彎曲桿菌，與沒有上皮細胞條件下培養的細菌相比，出現了新的，或提高的蛋白質的合成(Konkel，etal.，J.Infect.Dis.168948-954，1993)。而且，這些變化暫時地與空腸彎曲桿菌增加的侵襲力相關。在靜脈內或絨毛尿囊雞胚傳代時，空腸彎曲桿菌的無毒株的一些變化被誘導和增加，如細胞形態，鞭毛失去，新的外層膜蛋白的表達和細胞表面碳水化合物的改變(Field，etal.，J.Med.Microbiol.，38293-300，1993)。其他腸道組分，例如膽汁酸或鹽，已知能抑制某些細菌，但是膽汁酸通過影響細菌毒性表達而起到其他作用。Pope和Payne(93rdAmSoc.Microbiol.，B-147，1993)報導培養在含有鵝脫氧膽酸鈉肉湯中培養的弗氏志賀氏菌被證明具有提高3-5倍的對Hela細胞單層的侵染力。然而，他們報導，其他膽汁酸和去垢劑，包括膽酸鹽，甘氨膽酸鹽，牛磺脫氧膽酸、CHAPS系列，毛地黃皂苷和TritonX100和其鈉鹽，對於弗氏志賀氏菌的侵襲力沒有作用。而且，含有鵝脫氧膽酸的肉湯對於大腸桿菌或其它志賀氏無毒菌株的侵襲力沒有作用。弗氏志賀氏菌的新的蛋白的合成亦被生長培養基中改變的pH，溫度，和離子組成誘導。(Mekalanos，J.Bacteriol.，1741-7，1992)。公開於1993年11月11日的公開號為WO93/22423的PCT申請，公開了用於在脂質，例如磷脂醯絲氨酸，或粘液上生長細菌的方法，及由於在磷脂醯絲氨酸出現的情況下生長而提高其表達的蛋白分離。這一參考文獻既未公開也未揭示本發明的用於產生具有提高的毒性或抗原特性的腸細菌的方法。針對許多腸道病原體例如彎曲桿菌屬細菌和志賀氏菌屬細菌的疫苗，還未有得到，但是這些病因的流行病學使這些疫苗成為重要的目標。志賀氏菌病是全球性流行病，在發展中國家是每年因腹瀉而死亡的500萬兒重中的10％的死因。彎曲桿菌雖然只是在最近才被鑑定為腸病原菌，現在被認為發達國家和不發達國家的腹瀉病症的一個主要原因。估計每年發生4,000至5,000萬例彎曲桿菌腹瀉，且多於20萬例發生在美國。志賀氏菌病是結腸黏膜細菌侵襲的後果。這種侵襲與發現於所有侵襲性分離物中的質粒相關(Sansonetti等.，Infect.Immun.35852-860，1982)。該質粒的一個片段含有侵襲質粒抗原(Ipa)基因，IpaA，-B，-C，和-D。IpaB，-C和-D蛋白質是進入過程所必須的(Baudryetal.，J.Gen.Microbiol.，1333403-3413，1987)。雖然其預防效應尚未明確確立，但Ipa蛋白是合乎邏輯的疫苗候選者。IpaB和IpaC是免疫顯性蛋白(Hale.等.，Infect.Immun.，50620-629，1985)。而且，62kDaIpaB蛋白(開始細胞進入和在膜結合噬細胞液泡的溶胞中起作用的侵襲素)(High，etal.，EMBOJ.，111991-1999，1992)在志賀氏菌屬內高度保守。在沒有明顯的針對志賀氏Ipa的黏膜抗體的營養不良的兒童中所觀察到的久治不愈的病症提示針對Ipa的黏膜抗體的出現可能限制感染的傳播和嚴重性。雖然在動物和人類中試驗了一些志賀氏菌疫苗候選者，但未發現成功的一個。儘管Ipa蛋白的潛在的顯著毒性，多數被研究用來針對志賀氏菌病的多數疫苗候選者基於脂多糖抗原，它載有血清型特異的決定簇。已經研製了非經腸施用的多糖-蛋白結合疫苗，但是只是在動物中顯示出明顯的保護作用(Robbins等，Rev.Inf.Dis.13S362-365，1991)。一種類似施用的核糖體疫苗的確誘導黏膜免疫，但是其保護效力尚待證實(Levenson等.，Arch.AllergyAppl.Immunol.，8725-31，1988)。彎曲桿菌感染的致病機制沒能象志賀氏感染的致病機制那樣被深入研究。體外細胞侵襲研究(Konkel，等，J.Infect.Dis.，168948-954，1993)和組織病理學檢查(Russell，等，J.Infect.Dis.，168210-215，1993)提示結腸侵襲是很重要的。這一結論亦同以下觀察一致由彎曲桿菌引起的腹瀉與母株中的血相關，且是嚴重的。這一活性與免疫顯性62kDa鞭示蛋白相關。最近的報導表明鞭毛的出現對於彎曲桿菌跨越板化的上皮細胞的單層(Grantetal.，Infect.Immun.，611764-1771，1993)是必需的。沒有具體的彎曲桿菌抗原被研製用於保護。然而，低分子量(28-31kDa)蛋白，或PEB蛋白，和免疫顯性鞭毛蛋白被認為是在此領域內大有作為的(Pavlovskisetal.，Infect.Immun.，592259-2264，1992；BlaserandGotschich，J.Bio.Chem.26514529-14535，1990)。鞭毛蛋白與腸的移生，以及針對在Lior亞群範圍內感染的交叉菌株的保護的關係表明了鞭毛蛋白的重要性(Pavlovskisetal.，Infect.Immun.，592259-2264，1992)。然而，基於鞭毛蛋白的彎曲桿菌疫苗可能包括來自8-10個最為臨床相關Lior血清群的鞭毛蛋白抗原。因此，本發明的目的包括1)用於培養和處理腸細菌的體外培養條件，此培養條件可以最佳地誘導或提高侵染活性和/或包括細胞表面特性的某性細胞特性；2)相關的改變的侵襲力或細胞特性，其中包括抗原分布(profile)改變的表面特徵；3)這些生物體在小動物模型中提高的毒力；和4)用於體內或體外攻擊時，與製備用於抗傳統地生長的細菌的抗血清相比，具有提高的侵襲力或改變的特性包括表面特性，因而更有效地中和活的生物體的抗生物體抗血清。本發明涉及這些需要及其他。以上討論的文獻均未教導或提示本發明的體外方法，亦不涉及本發明的包含抗原性提高的腸細菌的疫苗。在本申請的這一章節或任何其他章節中，引述或肯定任一文獻，不應被解釋為表明這一文獻可能作為本發明的先有技術。3.發明概述本發明提供了腸細菌的明確的培養條件和加入培養介質的成分，以誘導或提高毒力因子和其他抗原的呈現。優選的，這一抗原是致免疫的。更優選地，這一致免疫的抗原與毒力的指徵相關。腸細菌生長於模擬生物體在體內天然所處的某些條件的條件和組分。本發明的方法產生了抗原性提高的腸細菌，該細菌具有表型改變，例如每細胞中增加的總蛋白，新的或增加的個別蛋白，改變的或增加的表面碳水化合物，改變的表面脂多糖，提高的粘附性能，提高的侵襲性能和/或提高的細胞內群遊現象。而且，本發明的方法適應於商業應用的實際上的大規模發酵。所述抗原性提高的腸細菌可以用於產生保護性疫苗，例如滅活的完整細胞或亞單位疫苗，或者出於診斷目的例如用於生產抗體和探測病原性腸細菌或用於生產抗生素。另外，本發明的改進的腸細菌所誘導的抗體可以用作被動疫苗。因此，本發明的一個目的是產生具有提高的抗原性的腸細菌的方法，這些腸細菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，包括將腸細菌在體外於下列條件的組合之下生長，包括a)0.05％至3％膽汁或0.025％至0.6％一種或多種膽汁酸或其鹽，在-30℃至42℃之間的溫度，直至生長期在大約早對數期，在早對數期和穩定期之間，或大約在穩定期，在空氣中或在一微需氧的條件下，例如5％至20％CO2和80％至95％空氣，5％至20％CO2和80％至95％N2；或5％至10％O2，10％至20％CO2，和70％至85％N2；和任選存在的二價陽離子螯合劑，例如，但不限於0至100μM，優選25μMBAPTA/AM，0至10mMEGTA，和0至100μMEGTA/AM；或者是b)，如a)中所述，除了存在二價陽離子螯合劑，例如1.0至100μM，優選25μMBAPTA/AM，0.5至10mMEGTA，或1至100μMEGTA/AM。而且沒有膽汁，膽汁酸或膽汁鹽。根據本發明，任何各別的膽汁酸或其鹽的濃度包括0.025％至0.6％，優選0.05％至0.5％，更優選0.05％至0.2％，最優選0.05％或0.1％。優選的方法中，所述膽汁酸或其鹽包括脫氧膽酸鹽或糖膽酸鹽。本發明的另一目的是腸道桿菌，它選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，其中所述腸細菌在體外在一些條件的組合下生長，以促進提高的抗原特性，所述的條件包括a)0.05％至3％膽汁或0.025％至0.6％一種或多種膽汁酸或其鹽，在30℃至42℃之間的溫度，直至生長期在大約早對數期。在早對數期和穩定期之間，或大約在穩定期，在空氣中或在一微需氧的條件下，例如5％至20％CO2和80％至95％空氣，5％至20％CO2和80％至95％N2；或5％至10％O2，10％至20％CO2，和70％至85％N2；和任選存在的二價陽離子螯合劑，例如，但不限於0至100μM，優選25μMBAPTA/AM，0至10mAEGTA，和0至100μMEGTA/AM；或者是b)，如a)中所述，除了存在二價陽離子螯合劑，例如1.0至100μM，優選25μMBAPTA/AM，0.5至10mMEGTA，或1至100μMEGTA/AM。而且沒有膽汁，膽汁酸或膽汁鹽。本發明的另一目的是含有完整腸細菌或其組分的疫苗，所述腸細菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，或其致免疫性片段或其衍生物，該疫苗具有提高的抗原特性；和任選地含有可藥用載體或稀釋劑。優選的疫苗包含完整的，滅活的，抗原性提高的腸細菌。本發明的另一目的是進一步包含一種佐劑的疫苗。本發明的另一目的涉及能夠特異性地結合於本發明的腸細菌的至少一種抗原決定簇的抗體(包括但不限於抗血清，純化的IgG或IgA抗體，Fab片段，等)。這樣的單克隆和多克隆抗體可用作免疫試劑，以檢測動物中或由其衍生的生物學樣品中的腸細菌。本發明的單克隆或多克隆抗體亦可用作被動疫苗，以用於預防腸細菌感染和疾病。本發明的另一目的是一種用於測試潛在的抗微生物劑的體外方法，包括步驟將具有提高的抗原特性的腸細菌和所述的潛在的化學劑接觸，且分析其殺細菌和制菌作用效能。其中，腸細菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌。本發明的又一目的，是一種用於檢測宿主的抗體產生或檢測動物中或由此衍生的生物學樣品中的腸細菌的體外方法，包括步驟將來自宿主的生物學樣品與本發明的具有提高的抗原特性的腸細菌，其抗原或其抗體相接觸。然後篩選抗體抗原相互作用，其中，所述腸細菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌。本發明的另一目的涉及用於檢測宿主的抗腸細菌的抗體的產生，或用於檢測腸細菌的診斷試劑盒，具有提高的抗原特性的腸細菌，或其抗體，和所有其他必需的試劑盒組分，其中，所述腸細菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌。本發明的各方面所優選涉及的腸細菌是空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni.)，大腸彎曲桿菌(CampylobacterColi)，小腸結腸炎耶爾森氏菌，鼠疫耶爾森氏菌，假結核耶爾森氏菌，大腸桿菌，弗氏志賀氏菌，宋內氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌，鮑地氏志賀氏菌，Helicobacterpylori，HelicobacterfelisGastrospirillumhominus，霍亂弧菌，副溶血弧菌，Vibriovulnificus，脆弱類桿菌，難辨梭狀芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，傷寒沙門氏菌，雞傷寒沙門氏菌，雛白痢沙門氏菌，豬霍亂沙門氏菌，腸炎沙門氏菌，肺炎克雷白氏桿菌，陰溝腸桿菌，和Enterococcusfaecalis。優選的大腸桿菌包括但不限於腸毒素性，腸溶血性，腸侵襲性，腸致病性或其他菌株。本發明部分地基於這一令人驚訝的發現本發明的抗原性提高的腸細菌誘導的免疫應答，與由生長於傳統培養條件下的同一腸細菌誘導的免疫應答相比，其交叉保護針對同種細菌的更廣範圍的株或血清型。在至少一種情況下，本發明的抗原性提高的腸細菌誘導的免疫反應交叉保護腸細菌的不同種。附圖簡述圖1A，1B和1C是來自空腸彎曲桿菌81-176的表面提取物水解物的單糖的高效液相色譜的結果的圖示說明。圖1A標準巖藻糖為「Fuc」，N-乙醯-半乳糖胺「GalNac」，N-乙醯-葡萄糖胺「GlcNac」，半乳糖「Gal」，葡萄糖「Glc」，甘露糖「Man」。圖1B傳統生長的細菌「BHI」的表面提取物。圖1C按照本發明的方法生長的細菌「DOC」的表面提取物。圖2圖示了十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)的結果，顯示了傳統生長的空腸彎曲桿菌81-176「BHI」和按照本發明的方法生長的空腸彎曲桿菌81-176(0.8％牛膽汁膽汁酸「OX」或0.1％脫氧膽酸「DOC」的完整細胞蛋白(泳道1，2，3)或表面提取物(泳道5和6)的比較結果。圖3圖示Westem印跡分析的結果，展示了與白鼬含IgA的粘液結合的蛋白比較結果，該粘液由用完整空腸彎曲桿菌81-176細胞感染而製得。傳統生長的完整空腸彎曲桿菌81-176細胞，「1」；或根據本發明的方法生長的完整空腸彎曲桿菌81-176細胞0.8％牛膽汁膽汁酸，「2」；或0.1％脫氧膽酸，「3」；或傳統生長的空腸彎曲桿菌81-176的表面提取物，「4」；或根據本發明的方法，且0.1％脫氧膽酸生長的空腸彎曲桿菌81-176表面提取物，「5」。圖4.圖示了Westem印跡分析的結果，展示了與鞭毛蛋白特異性單克隆抗體72C結合的蛋白的比較結果，該抗體來自按照本發明的方法生長的完整細胞空腸彎曲桿菌81-176，「3」；傳統生長的「2」；或按照本發明的方法，生長於發酵罐裡的，「1」。圖5，圖示了SDS-PAGE的結果，展示了完整的弗氏志賀氏菌2457T細胞的脂多糖的比較，傳統生長的，泳道「1」，或按照本發明的方法生長的，在0.1％脫氧膽酸存在下泳道「2」。圖6，圖示按照本發明的方法生長的空腸彎曲桿菌的免疫交叉反應性的提高。傳統生長的及如實施例5(DOC)例舉的根據本發明的方法生長的空腸彎曲桿菌81-176細胞被用於誘導抗體。展示了這兩類抗體(即抗BHI中培養的空腸彎曲桿菌81-176與抗DOC中培養的空腸彎曲桿菌81-176)對於不同的空腸彎曲桿菌血清型的凝集活性。詳見第9部分實施例32。圖7A，7B和7C圖示了含有滅活的空腸彎曲桿菌81-176完整細胞的疫苗在保護小鼠免受鼻腔遞送的活空腸彎曲桿菌81-176細胞的攻擊中的效力。以磷酸鹽緩衝液(PBS；實線)，PBS加L7佐劑(佐劑；虛線)，福馬林滅活的按照實施例5生長和收穫的空腸彎曲桿菌81-176完整細胞不加佐劑(CWC；空心圈/實線)，或加入LT佐劑(CWC+佐劑；實心圈/實線)接種小鼠。使用腸道移生實驗檢測疫苗效力。圖7A(上圖)顯示了每劑量使用3個105滅活細菌顆粒的口服劑量進行接種所提供的預防結果。圖7B(中圖)顯示了每劑量使用3個107滅活細菌顆粒的口服劑量進行接種所提供的預防結果。圖7C(下圖)顯示了每劑量使用3個109滅活細菌顆粒的口服劑量進行接種所提供的預防結果。詳見11部分實施例34。圖8A，8B和8C圖示了含有滅活的空腸彎曲桿菌81-176完整細胞的疫苗在保護小鼠免受鼻腔遞送的活空腸彎曲桿菌81-176細胞的攻擊中的效力。如圖7A，7B和7C的簡述所描述的那樣接種小鼠。使用腸道移生實驗檢測疫苗效力。圖8A(上圖)顯示了每劑量使用3個105滅活細菌顆粒的口服劑量進行接種所提供的預防結果。圖8B(中圖)顯示了每劑量使用3個107滅活細菌顆粒的口服劑量進行接種所提供的預防結果。圖8C(下圖)顯示了每劑量使用3個109滅活細菌顆粒的口服劑量進行接種所提供的預防結果。詳見9部分實施例34。圖9圖示了當弗氏志賀氏菌2457T細胞侵襲時的弗氏志賀氏菌培養物生長期的效應。傳統生長的弗氏志賀氏菌2457T(BHI)，或按照如實施例9所例舉的本發明的方法所生長的(DOC-EL)-當培養物處於對數早期時收穫細胞，或按照實施例9，但是在收穫細胞前，讓培養物達到對數晚期(DOC-LL)。顯示了這些不同的細胞製備物的侵襲力。詳見12部分實施例35。圖10圖示了當按照本發明的方法培養時，弗氏志賀氏菌細胞侵襲力的提高。宋內氏志賀氏菌和痢疾志賀氏菌按傳統方法培養(BHI)或如實施例9所例舉的本發明的方法培養。顯示了這些志賀氏菌細胞的不同製備物對於INT-407細胞的侵襲力。詳見12部分實施例35。圖11圖示了按照本發明的方法生長的志賀氏菌交叉免疫反應的提高。按照如實施例9例舉的本發明的方法生長的弗氏志賀氏菌2457T用於誘導抗體。圖示了，誘導對於傳統生長的(BHI)，或根據如實施例9例舉的本發明的方法生長的弗氏志賀氏菌，宋內氏志賀氏菌，痢疾志賀氏菌和鮑地氏志賀氏菌的血清型的抗體凝集活力，詳見12部分實施例36。圖12圖示了當HelicobacterpyloriNB3-2細胞粘附時，Helicobacterpylori培養物的膽汁濃度的效應，和生長期。H.pyloriNB3-2細胞生長在含有0％，0.025％，0.05％或0.1％膽汁的培養基中，和在接種後8，10，12和18小時收穫。顯示了這些不同的H.pyloriNB3-2製備物對於INT-407細胞的侵襲力，詳見14部分實施例38。圖13圖示了當HelicobacterpyloriG1-4細胞粘附時，Helicobacterpylori培養物的膽汁濃度的效應，和生長期。H.pyloriG1-4細胞生長在含有0％，0.1％或0.2％膽汁的培養基中，和在接種後6，8，10，12，14和16小時收穫。顯示了這些不同的H.pyloriG1-4製備物對於INT-407細胞的侵襲力，詳見15部分實施例38。發明詳述本發明的方法涉及在選擇用於誘導或提高抗原和/或毒力因子表達的某些條件和某些組分的組合之下，體外生長腸細菌。在此和在權利要求中所用的術語「腸」指正常地在動物胃腸道的任何部分發現或與之相關的細菌和引起動物胃腸道的任何部分感染的任何細菌。這樣的腸細菌包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。在此和在權利要求中所用術語「組分」和「條件」涉及與腸細菌自然體內環境相關的許多因素和其它因素。這些「組分」和「條件」包括但不限於、膽汁、膽汁酸或其鹽或其生物學前體如膽甾醇，pH，微需氧條件，滲透壓，和在期望的細菌生長期收穫和收集細菌。在此和在權利要求中所用術語「抗原」和其相關術語「抗原的」包括抗原或抗原特性，包括，但不限於，有助於細胞形態學或細胞運送性的大分子；蛋白質；更具體的是表面蛋白，脂多糖和碳水化合物。優選地，所述抗原是免疫原性的。在此和在權利要求中所用術語「免疫原性」是指當所述動物暴露於包含本發明產生的完整細菌或完整細菌的片段的組合物後，能夠在動物中誘導抗體產生的能力。在此和在權利要求中所用術語「抗原性提高的」或「提高的抗原特性」或「提高的」，是指按本發明的方法生長的腸細菌的抗原狀態。與傳統方法生長的同一細胞相比，具有某些免疫原性抗原的較高水平和/或新的免疫原性抗原。在此和在權利要求中所用術語「傳統的」涉及先有技術中已知的。在此和在權利要求中所用術語「微需氧條件」指厭氧條件或提高的CO2水平，例如5％至20％CO2和80％至95％的空氣，5％至20％CO2和80％至95％N2；或5％至10％O2和10％至20％CO2和70％至85％N2。在此和在權利要求中所用術語「毒力」是指腸細菌的那些與粘附和/或侵襲和/或在宿主中存活和/或引起病理狀況的因子。在此和在權利要求中所用術語「免疫交叉保護」是指由一種細菌菌株或血清型，以完整細胞或其他形式，誘導免疫應答以保護或減弱同一宿主被不同細菌菌株，血清型，或同屬的種的感染的能力。在此和在權利要求中所用術語「免疫交叉反應」是指由一種細菌菌株或血清型，以完整細胞或其他形式，誘導體液免疫應答，和不同細菌菌株，血清型，或同屬的種交叉反應(即，抗體結合)能力。免疫交叉反應性是細菌免疫原免疫交叉保護潛能的指徵。反之亦然。在此和在權利要求中所用術語「宿主」是指在體內，為動物，在體外為動物細胞培養物。在此和在權利要求中所用術語「動物」包括但不限於所有熱血生物例如哺乳動物和鳥類(e.g.，雞，火雞，鴨等)。根據本發明，在一包含抗原性提高的腸細菌或其免疫片段或其衍生物的疫苗中，腸細菌可以是活細菌或可以是滅活的，可以還包括一種佐劑，例如，但不限於，鋁，油-水乳劑，來自於腸毒性大腸桿菌非毒性形式(如mLT)的熱不穩定毒素和/或其單個亞基，卡介菌(BCG)，或弗氏佐劑，還可以包括一種合適的藥用載體包括但不限於鹽水，萄聚糖或其他水溶液。其他合適的藥用載體在Mack出版公司出版的Remington′sPharmaceuticalSciences中描述，這是該領域的一本標準參考書。在此和在權利要求中，術語「疫苗」也包括「被動疫苗」，包含與所尋求其感染或疾病保護的病原體特異性結合的抗體。在此和在權利要求中所用術語「滅活細菌」，是指不能夠感染和/或移生的腸細菌，包括減毒和殺死的細菌。減毒的細菌可以複製但不能引起感染或疾病。所述病毒的滅活可以本領域技術人員已知的任何方法完成。例如，細菌可以化學滅活，例如通過福馬林固定，或物理滅活，例如通過熱，超聲或輻射，這樣，造成它們不能夠複製和/或感染和/或引起疾病。應施用有效量的疫苗，其中「有效量」被定義為腸細菌或其免疫原性片段或其衍生物的能夠在受試者體內引起免疫應答的量。所需的量隨所使用的細菌，片段，或衍生物的抗原性，和待接種的受試者的種和體重而變化，但可用標準技術來確定。在本發明的一個優選的，非限制性實施方案中，有效量的疫苗造成至少是接種前抗體滴度兩倍的抗細菌抗體滴度的提高。在一優選的、具體的、非限制性的本發明實施方案中，給宿主施用大約107至1011，優選108至1010細菌。優選的是包含滅活的完整細菌的疫苗。術語「有效量」用於被動疫苗時，是能夠阻止或減弱一種細菌疾病或感染的抗體的量。所需的量隨抗體的種類和抗體的滴度，和待接種的受試者的種和體重而變動，但可用標準技術確定。本發明的疫苗可以用本領域已知任何方式局部或全身施用，包括但不限於，靜脈，皮下，肌肉，陰道內，腹膜內，鼻內，口服或其他黏膜途徑。疫苗可以在一合適的，非毒性藥用載體內給藥，可以包含於微膠囊中，和/或是含於緩釋植入物中。合意地，疫苗在幾個時間點施用，以維持抗體水平。本發明的疫苗可以同其他殺菌或制菌方法共同使用。本發明的抗體可以任何本領域技術人員已知的傳統方法獲得，例如，但不限於AntibodiesALaboratoryManual(EHarlow，D，Lane，冷泉港出版社。1989)。一般說來，用本發明的抗原性提高的腸細菌的完整細胞或其免疫原性片段或其衍生物，在有或沒有一種佐劑或將提高免疫原效力的任何化學劑的條件下，免疫動物(可以使用很大範圍的脊椎動物種，最常見的是小鼠，大鼠，豚鼠，倉鼠和兔)，在定期的時間間隔加強免疫。以任何便利的方法測試動物血清中所期望抗體的存在。所述動物的血清或血可以用作多克隆抗體的來源。就單克隆抗體而言，以上述方法處理動物。檢測到可接受的抗體滴度後，將動物實行安死術，無菌取脾以用於融合。脾細胞與特別選擇的永生化骨髓瘤細胞系混合，將混合物暴露於能夠促進細胞融合的化學劑，典型地是聚乙二醇等。在這一環境下，融合隨機地發生，融合的細胞和每一種未融合的細胞的混合物是生成的產物，用於融合的骨髓瘤細胞系是特別選擇的，這樣，通用使用選擇性培養基，例如HAT次黃嘌呤、氨基蝶呤、和胸腺嘧啶，在培養物中，來自於融合混和物的能夠持續存在的僅有的細胞是那些衍生自免疫供體的細胞和骨髓瘤細胞之間的雜種細胞，融合之後，將細胞稀釋，在選擇性培養基培養。培養基用於篩選對於選定的抗原有期望的特異性的抗體的出現。通過有限稀釋將含有選擇的抗體的培養物克隆，直至可以推定細胞培養物是單細胞來源的。本發明的抗體可以用作腸細菌感染和疾病的被動疫苗。用於在宿主體內檢測抗體或所述細菌的方法包括免疫反應。這些免疫反應是本領域已知的，包括但不限於放免實驗(RIA)，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，螢光免疫實驗，和螢光極性化免疫實驗(FPIA)。另一實施方案包括一種診斷試劑盒，其中包含進行根據本發明的所期待的免疫實驗所需的所有必需試劑。診斷試劑盒可以商業化包裝形式存在，是一個或多個裝有必需試劑的容器的組合。這樣一個試劑盒包含本發明的腸道桿菌，和/或本發明的單克隆或多克隆抗體，以及幾種傳統的試劑盒組分。傳統的試劑盒組分對本領域技術人員是顯而易見的，公開於多種出版物中、包括AntibodiesALaboratoryManual(E.Harlow.D.Lane，冷泉港實驗室出版社，1989)。傳統的試劑盒組分可以包括這些物品，例如，微滴度板，用於保持實驗混合物的pH的緩衝液(例如，但不限於Tris，HEPES，等)。結合的第二抗體，如過氧化物酶結合的抗鼠IgG(或任何抗第一抗體衍生來源動物的抗-IgG)等，和其他標準試劑。本發明的方法包括將腸細菌在一合適的基礎必需培養基生長，例如，但不限於可商購的腦心浸液肉湯「BHI」，Laria肉湯「LB」，羊血瓊脂「SBA」，Brucella肉湯，Meuller-Hinton肉湯，牛提取物蛋白酶水解腖肉湯，等。以及各種條件和組分，包括但不限於0.05％至3％膽汁或0.025％至0.6％的一種或多種膽汁酸或其鹽，或其生物學前體，例如膽甾醇，在30℃至42℃溫度下，直到其生長期處於大約早對數期，早對數期和穩定期之間，或大約在穩定期，在空氣中或微需氧條件下，例如5％至20％CO2和80％至95％空氣；5％至20％CO2和80％至95％N2；或5％至10％O2和10％至20％CO2和70％至85％N2；和任選的二價陽離子螯合劑的出現，例如，但不限於0至100μM，優選25μMBAPTA/AM(2′(亞乙基二氧基)二亞氨n，n.n′，n′-四乙酸/乙醯氧甲基酯；分子探針，Engene，OR)，0至10mMEGTA(亞乙基二(氧亞乙基次氮基)-四乙酸；西格瑪化學公司，St.Lovis，MO)，0至100μMEGTTA/AM(亞乙基二(氧亞乙基次氮基)-四乙酸/乙醯氧甲基酯，分子探針，Eugeme，OR)；這樣條件和組分的組合產生了抗原提高的腸細菌。根據另一實驗方案，本發明的方法亦包括將腸細菌生長於以上描述的條件，只有一點不同即在二價陽離子螯合劑出現的情況下生長，例如，但不限於1.0至100μM，優選25μMBAPTA/AM，0.5至10mMEGTA、或1.0至100μMEGTA/AM，但是沒有膽汁，膽汁酸或膽汁鹽。可用於本發明的膽汁或膽汁酸或其鹽包括任何由肝分泌正常情況下積聚於膽囊中的天然膽汁化合物，以及本領域技術人員熟知的那些合成膽汁酸，例如但不限於「OXGALL」(Difco實驗室底特律，密西根)，牛膽汁(SigmaChemicals，StLouis，密蘇裡)或其他可商購的製備物，膽酸，脫氧膽酸(DOC)，牛磺膽酸和甘氨膽酸。優選的是脫氧膽酸，它是可商購的膽汁酸，在體內出現在被某些腸細菌移生的小腸遠側和大腸的位點。同樣優選的有甘氨膽酸(GC)。根據本發明選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，卷旋桿菌屬，Gastrospirillumsp.，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌的腸細菌培養物可以用本領域技術人員熟知的方法製備成冷凍原種，於-80℃保藏備用。例如，可以通過在含有5％去纖維蛋白綿羊紅細胞(SBA)的胰酶水解大豆瓊脂上，於37℃，在5％O2，10％CO2，85％N2微需氧環境，「MC」將生物體生長20小時。來獲得空腸彎曲桿菌原種。可以通過在腦心浸液肉湯(「BHI」)生長生物體而製備大腸桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，Helicobacterpylori和弗氏志賀氏菌的原種。可用任何已知方式收穫細菌用於冷凍，例如拭取培養物重懸於含30％甘油的BHI中。用於分析實驗及用於發酵生產的培養物可以用任何已知的方法製備，例如將生物體於37℃，在含1.5％瓊脂的BHI，於MC或大氣條件下培養，然後將單菌落轉移到肉湯之中，按本發明描述的方法培養。用任何本領域專業人員熟知的方法例如離心收穫細菌備用。在一優選實施方案中，彎曲桿菌屬細菌，優選的是空腸或大腸，最優選是空腸81-176的抗原性提高的細胞，生長於基礎必需培養基，優選BHI肉湯，附加地包括大約0.1％DOC或大約0.8％膽汁，於37℃，大約10％至20％CO2與大約80％-90％空氣的混合物中，當培養物的生長達到晚對數期至穩定期，典型地是接種後20h之後收穫。在另一優選實施方案中，志賀氏菌屬細菌，優選的是弗氏或痢疾，最優選的是弗氏2457T菌株的抗原提高的細胞，生長與基礎必需培養基，優選BHI肉湯，附加地包括大約0.1％DOC或大約0.8％膽汁，於37℃，空氣中，當培養物的生長達到約早對數期後，典型地是接種早至中對數期培養物後30min之後收穫。在另一優選實施方案中，Helicobacterpylori，優選的是ATCC49503，NB3-2或G1-4的抗原性提高的細胞，生長於基礎必需培養基，優選BHI肉湯，附加地包括大約0.05％至大約0.2％膽汁或大約0.05％甘氨膽酸(GC)，於37℃，大約5％至20％CO2與大約80％-95％空氣或大約10％CO2和約5％O2和85％N2的混合物中，當培養物的生長達到大約對數期至大約穩定期收穫。在一更優選的實施方案中，在培養物大約達到對數期時收穫。根據本發明的方法培養的腸細菌具有改變的形態，和/或細胞遊動性和/或產生一些新蛋白。脂多糖和/或碳水化合物和/或與單用基礎培養基培養的細胞相比，具有水平改變的大分子。可以確定提高細胞產量的最佳培養條件，和病原性的指徵。採用這些培養條件可以確定提高的或誘導的毒力-相關抗原。通過鏡檢未處理的或染色的細菌，看到遊動性和肉眼可視的形態學改變。很可能其他的、可能由本發明的方法引起的形態學改變可以用電鏡和螢光顯微鏡看到。根據本發明的方法培養的腸細菌的形態學和粘液樣特徵提示可能誘導了莢膜和/或表面層的表達。為了檢測莢膜的產生，可以製備表面組分的苯酚提取物，如蛋白，碳水化合物和脂多糖。通過高壓液相色譜(HPLC)看到提高的碳水化合物。從在本發明的毒力提高的生長條件下生長的腸細菌製備的外膜的蛋白分布(profile)可以通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳表徵，並與來自於生長在傳統培養基的生物體的外膜蛋白分布相比較。進行SDS-PAGE以評價響應抗原性提高或改變條件在細菌細胞的和提取的蛋白中誘導的變化。這些數據提供了涉及提高的侵襲力或改變的抗原性相關的表面變化的定性和定量信息。誘導的或改變的蛋白抗原的免疫潛能可由WesternBlotting確定。由SDS-PAGE確定的誘導的或改變的細菌蛋白抗原的免疫原性可由如下所述且普遍接受的WesternBlotting技術來評價。任何來源的抗體均可用於測定細菌抗原，例如恢復期免疫兔或白鼬血清(來自於用傳統生長或根據本發明的方法生長的活生物體口服感染的動物的抗體來源)，腸道粘液(IgA抗體來源)，多克隆抗血清，或單克隆抗體，例如一個與空腸彎曲桿菌鞭毛抗原交叉反應的單抗。幾種這些細菌抗原的提高的產生伴隨著毒力相關特性的提高。這些特性包括培養的人腸道上皮細胞粘附和侵襲性，和剛果紅染料結合。剛果紅染料結合試驗是一普遍接受的方法，預言毒力，在下面Andrews等.(Infect.Immun603287-3295，1992)，和Yoder(AvianDis.33502-505，1989)中有所描述。細菌結合剛果紅表明結合氯化血紅素的能力，這種結合血紅素的能力與毒力相關。剛果紅結合亦相關於提高的上皮細胞的細菌侵襲。已前已證實多數傳統生長的空腸彎曲桿菌Lior血清型不是免疫交叉反應性的。基於此信息，製備和施用幾種Lior血清型菌株的多種疫苗或複合疫苗以獲得對於彎曲桿菌的普遍保護是必需的。根據本發明的方法產生的抗原性提高的彎曲桿菌與那些傳統生長獲得的彎曲桿菌相比，是針對更廣範圍的Lior血清型免疫-交叉反應性的。同樣的，根據本發明的方法產生的抗原性提高的志賀氏菌，與那些傳統生長獲得的志賀氏菌相比，針對更廣範圍的志賀氏菌菌種是免疫-交叉反應性的，和免疫-交叉保護性的。這些免疫-交叉反應性和免疫-交叉保護性的特性為下述凝集反應和疫苗研究的結果所證明。用於產生抗原性提高的腸細菌的本發明的方法關係到小動物模型中提高的毒力。幾種馴養的動物可以用作人類彎曲桿菌疾病的模型。大多數立足於免疫效力的研究是Caldwell等人(Infect.Immun.，421176-1182，1983)的可逆性腸結，成年兔腹瀉(RITARDModel)。這一模型也證明了Lior血清型和交叉-菌株保護之間的聯繫。然而，這一模型用來測量對移生的抗性，而不是對於疾病的抗性。Bell等人(Infect.Immun.，581848-1852，1990)的白鼬模型可能是一更有用的模型，因為該動物確實出現如人類彎曲桿菌疾病的疾病症狀。一個更新的模型是Bagar(感染和免疫，633731-3755，1995)的小鼠移生模型。該模型涉及免疫法，然後用活的彎曲桿菌鼻腔或口服攻擊免疫小鼠，然後經監測糞樣中彎曲桿菌的出現而檢查腸移生。就志賀氏菌來說，如Mallett等人(見下面13部分)描述的小鼠鼻攻擊實驗被用於評價毒力和疫苗效力。就Helicobacterpylori，陳等(柳葉刀，3391120-1121，1992)描述的Helicobacterfelis胃移生模型被用於評價由本發明的方法產生的H.pylori疫苗潛能。還有涉及腸細菌侵襲和感染的其他動物模型，它們可用於測試按本發明的方法產生的提高的腸細菌的疫苗效力。按本發明的方法產生的抗原性提高的腸道桿菌用於製備原型死的完整細胞或亞單位疫苗。當施用於動物時，這些疫苗可顯示出誘導抗體因而建立了疫苗保護性潛能。在一個細菌細胞中這些抗原的提高或誘導產生了製成更有效力疫苗的細胞。用本發明的方法產生的疫苗候選者製劑可用於多種黏膜免疫戰略以誘導腸免疫應答。成功的免疫法方案可以用於保護用有或沒有提高的免疫原性的病原體攻擊的動物。疫苗亦可作為複合疫苗配製和檢測，例如，志賀氏菌和彎曲桿菌或其組分可以複合成一個單一疫苗。下面描述的實驗性探索使檢測與提高的侵襲力相關的表面抗原和其他特性的改變成為可能。這些變化既是質的又是量的。最重要的，這些實驗證實了，本發明的方法提高了侵襲力，誘導了免疫原性相關抗原。這樣的抗原性提高的細菌誘導了與傳統生長細菌相比，保護免受更廣範圍的細菌菌株，血清型和/或種的細菌感染的免疫應答，因而可用作有效的疫苗。已有幾種完善建立的，本領域技術人員熟知的模型，並如下所述，可用於評價提高的抗原特性，細菌毒力和疫苗效力。下面描述了非限制性實施例。實施例產生提高的抗原細菌的方法實施例1。空腸彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發酵罐中於37℃溫孵20小時。拭取細菌層，接種至盛有1升在10％CO2，90％空氣中預平衡的、含有0.8％OXGALL(Difco，Detroit，MI)BHI培養基的三角瓶中。培養物在一密封瓶中，在l0％CO2，90％空氣中，於37℃振搖溫孵20小時，然後如上述收穫。實施例2。空腸彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發酵罐中於37℃溫孵20小時。拭取細菌層，接種至盛有1升在10％CO2中預平衡的、含有0.01％-0.1％脫氧膽酸鈉(DOC)BHI培養基的三角瓶中(將DOC作為與BHI培養基分開的母液而配製和高壓滅菌，並且在接種之前將其無菌地加至BHI培養基，使其終濃度為0.01％-0.1％是至關重要的)。培養物在5％O2，10％CO2，85％N2中，於37℃振搖溫孵不同時間，最多達20小時，然後如上述收穫。實施例3。空腸彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發酵罐中於37℃溫孵20小時。拭取細菌層，接種至盛有1升在10％CO2中預平衡的、含有0.01％至0.1％脫氧膽酸鈉的Brucella肉腸的三角瓶中。培養物在5％O2，10％CO2，85％N2中，於37℃振搖溫孵20小時，然後如上述收穫。實施例4。空腸彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發酵罐中於37℃溫孵20小時。拭取細菌層，接種至盛有1升在10％CO2中預平衡的、含有0.01％至0.1％脫氧膽酸鈉的Mueller-Hinton肉湯的三角瓶中。培養物在5％O2，10％CO2，85％N2中，於37℃振搖溫孵20小時，然後如上述收穫。實施例5。空腸彎曲桿菌81-176株在血瓊脂平板上劃線(含有胰酶水解大豆瓊脂，加5％去纖維蛋白綿羊紅細胞)在微需氧GasPak(BBLCockeysville，MD)發酵罐中於37℃溫孵20小時。拭取細菌層，接種至盛有1升在10％CO2中預平衡的、含有0.1％脫氧膽酸鈉的BHI培養基的三角瓶中。培養物在10％CO2，90％空氣中，於37℃緩慢振搖20小時，然後如上述收穫。實施例6。霍亂弧菌在BHI瓊脂平板上劃線在空氣中於37℃溫孵20小時。拭取細菌層，接種至盛有1升含有0.1％脫氧膽酸的BHI培養基的三角瓶中。培養物在空氣中，於37℃振搖溫孵20小時，然後如上述收穫。實施例7。霍亂沙門氏菌在BHI瓊脂平板上劃線在空氣中於37℃溫孵20小時。拭取細菌層，接種至盛有1升含有0.1％脫氧膽酸的BHI培養基的三角瓶中。培養物在空氣中，於37℃振搖溫孵20小時，然後如上述收穫。實施例8。鼠傷寒沙門菌在LB瓊脂平板上劃線，在空氣中於37℃溫孵20小時。拭取細菌層，接種至盛有1升含有0.1％脫氧膽酸鈉的BHI培養基的三角瓶中。培養物在10％CO2，90％空氣中，於37℃振搖溫孵20小時，將一個菌落轉移至1升含有0.1％脫氧膽酸鈉的LB培養基然後在密封瓶中於37℃緩慢振搖溫孵，12小時後，將60mL培養物稀釋至1升同種新鮮預熱培養基中，再溫孵30分鐘，然後如上述收穫。實施例9。弗氏志賀氏菌在剛果紅瓊脂平板上劃線，在空氣中於37℃溫孵20小時。將一紅色菌落接種至盛有1升BHI培養基的三角瓶中。振搖溫孵12小時，50mL這種培養物用於接種250mL預熱的含有0.1％脫氧膽酸鈉的BHI培養基。培養物在空氣中於37℃振搖4小時。這種培養物用預熱含有0.1％DOC的BHI稀釋至OD600為大約0.17，在空氣中於37℃振搖30分鐘，然後如上述收穫。實施例10。空腸彎桿菌81-176，81-116或HC株(在含有30％甘油的BHI中)快速解凍，在羊血瓊脂平板上劃線(SBA每板0.1mL)。接種平板在備有CampyPakPlus微需氧環境發生器的GasPak(BBLCockeysville，MD)發酵罐中於37℃溫孵20小時。拭取細菌層，細菌重懸於10mlBHI培養基中，接種至盛有1升在10％CO2，90％空氣中預平衡的、含有或不含有0.1％DOC的BHI培養基的2L三角瓶中。培養物加入預平衡的培養基中，直到OD625等於0.05。接種瓶返回10％CO2，90％空氣中，於37℃緩慢振搖溫孵20小時，然後如上述收穫。實施例11。Helicobacterpylori加入加了4％小牛血清的BHI。接種後，三角瓶中充入5％O2，10％CO2，85％N2，於37℃振搖溫孵22h。溫孵後，2.5mL培養物轉移到盛有含4％小牛血清的BHI培養基，或盛有與上述相同，另外還含0.05％甘氨膽酸鈉的培養基的三角瓶中，這些培養物再充入微需氧氣體混合物(5％O2，10％CO2，85％N2)。於37℃溫孵20-24小時，細菌如上述收穫。實施例12。鼠傷寒沙門氏菌(在帶有30％甘油的LB中)在LB瓊脂板上劃線，在空氣中於37℃培養18-20h挑取一個菌落，轉移到三角瓶中的1升LB或含0.1％DOC的LB中，三角瓶中充入10％CO2，5％CO2，85％N2，密封於37℃，振搖溫孵12h。該細菌然後用同一培養基稀釋至OD600為0.17，在同樣條件下溫孵到對數早期，典型地，是稀釋後30分鐘，細菌如上述收穫。實施例13。鼠傷寒沙門氏菌在LB瓊脂平板上劃線，於37℃空氣中溫孵18-20小時。挑取一個菌落轉至1LLB或含有0.1％DOC的LB中，於37℃空氣中溫孵12小時。培養物用同一新鮮培養基稀釋(1/5)，在相同條件下溫孵4小時。培養物再用同一新鮮培養基稀釋，至OD600為大約0.17，在相同條件下溫孵，直到培養物達到對數期，典型地，是稀釋後30分鐘，然後如上述收穫細胞。實施例14。肺炎克雷白氏菌在BHI瓊脂平板上劃線，於37℃空氣中溫孵18-20小時。挑取一個菌落轉移至1LBHI或含有0.1％DOC的BHI中，於37℃空氣中溫孵12小時。培養物用同一新鮮培養基稀釋至OD600為大約0.17，再生長30分鐘，然後如上述收穫。實施例15。Enterobactercloacae在BHI瓊脂平板上劃線，於37℃空氣中溫孵18-20小時。挑取一個菌落轉移至1LBHI或含有0.1％DOC的BHI中，於37℃空氣中溫孵12小時。培養物用同一新鮮培養基稀釋至OD600為大約0.17，再生長30分鐘，然後如上述收穫。實施例16。大腸桿菌0157H7在綿羊血瓊脂平板上劃線，於37℃空氣中溫孵18-20小時。挑取一個菌落接種至1LBHI或含有0.1％～0.2％DOC的BHI的三角瓶中，於37℃振搖12小時。培養物稀釋至OD600為大約0.17，再生長30分鐘，然後如上述收穫。實施例17。Enterococcusfaecalis在綿羊血瓊脂平板上劃線，於37℃振搖18-20小時。挑取一個菌落接種至1LBHI或含有0.1％DOC的BHI的三角瓶中，於37℃空氣中溫孵12小時。培養物稀釋至OD600為大約0.17，再生長30分鐘，然後如上述收穫。實施例18。難辨梭狀芽孢桿菌(在含30％甘油的改進碎肉培養基上)在含1.5％瓊脂的用於厭氧的牛肝培養基平板上劃線，於37℃在微需氧(5％CO2，95％N2)條件下培養。挑取一個菌落轉移至1L含有或不含有0.1％DOC的改進碎肉培養基中，細菌於37℃微需氧條件下溫孵12小時。然後如上述收穫。實施例19。脆弱類桿菌(在含30％甘油的改進碎肉培養基上)在改進的碎肉培養基瓊脂平板上劃線，於37℃在微需氧(5％CO2，95％N2)條件下培養。挑取一個菌落轉移至1L含有或不含有0.1％DOC的改進碎肉培養基中，細菌於37℃微需氧條件下溫孵12小時。然後如上述收穫。實施例20。假結核耶爾森氏菌(在含30％甘油的LB培養基)在LB瓊脂平板上劃線於30℃溫孵。將一個菌落轉移至1LLB中於30℃溫孵12小時。培養物用含有或不含有0.1％DOC的LB稀釋(1/5)，在37℃下溫孵4小時。培養物再用同一個新鮮培養基稀釋，至OD600為大約0.17，再溫孵30分鐘，然後如上述收穫細胞。實施例21。Helicobacterpylori加至加有4％牛血清的BHI肉湯中。接種後，將三角瓶充入5％O2、10％CO2，85％N2於37℃振搖溫孵22h。溫孵後，將2.5ml此種培養物轉移至盛有含4％牛血清的BHI的，或另外含有約0.1％至約0.2％牛膽汁的同樣培養基的三角瓶中。這些培養物再充入微需氧氣體混合物(5％O2，10％CO2，85％N2)，於37℃溫孵20-24h。細胞如上述收穫。7.實施例提高抗原性的細菌實施例22。細菌溼製片鏡檢被用於觀察遊動性和肉眼可見形態學。可通過印度墨水(苯胺墨)中染色莢膜來觀察表面層。空氣乾燥後，細胞用結晶紫復染計數。所有觀察均在1000X放在倍數下觀察。與那些在單獨的基礎培養基中(傳統生長的)培養的相比，按照本發明的方法培養的細菌(此後稱作「提高的」細菌)形態已改變。例如，「提高的」空腸彎曲桿菌聚生且形成大的細胞團塊，而傳統生長的細胞主要是單生的。從莢膜染色(資料未給出)明顯地看出使用本發明的方法進行培養，完成了細菌表面的改變。這種表面改變確實引起了「提高的」細胞對於來自於染料的苯胺黑顆粒的增長的結合。「提高的細菌」保持高度的遊動性。實施例23用苯酚提取分析空腸彎曲桿菌表面組分。提取物由傳統生長的或按上述實施例2培養的空腸彎曲桿菌81-176製得。空腸彎曲桿菌細胞用上述離心技術從培養基中收集。細胞沉澱物在室溫下用1％苯酚提取2h。離心45分鐘從提取物中分離完整細胞。含有提取的細胞表面組分的上清液用蒸餾水透析過夜。保留物在4℃105,000xg離心3h。提取的沉澱重新溶解於10％Nacl用兩倍體積的冷95％乙醇沉澱。重複沉澱，並冷幹樣品。然後，樣品以1mg/ml溶於水，用於進一步分析。採用葡萄糖作為標準物，用普遍接受的苯酚-硫酸法分析提取物的碳水化合物含量。糖醛酸含量系用咔唑試劑以Dische方法測定。苯酚提取物的總蛋白含量用biccichinoic酸試劑盒(PierceChem.Co，Rocrford，IL)測定。值得注意的是，提取物中無糖醛酸。許多典型的細菌莢膜由糖醛酸聚合物構成。令人驚訝地，空腸彎曲桿菌81-176表面提取物主要由蛋白構成。然而「提高」的細胞的總碳水化合物含量高於傳統生長的細胞。提取物的碳水化合物與蛋白質的比率在表1中表述。表1傳統生長的(BHI)或根據實施例2的方法生長的(提高的)空腸彎曲桿菌表面提取物的碳水化合物蛋白質比率加入後時間(h)BHI提高的10.020.0220.020.1040.020.1560.030.29在培養基中含有DOC和可提取的細菌表面碳水化合物提高的水平之間有直接的聯繫(表1)。根據本發明的方法培養的細菌，其表面可提取碳水化合物增加了多於8倍，而傳統生長細菌未見增加。在DOC培養基中培養的細菌細胞的群生現象看來應歸因於表面提取物的組分。再水合時，提取物在水中具有很高的成膠能力，使溶液高度粘稠且粘蛋白樣，在特性上同群生細菌一樣。提取物的函數性一致於粘蛋白樣糖蛋白。為了分析各個單糖，將提取物在密封容器裡，在1N三氟乙酸中水解。樣品在氮氣中乾燥2h，重懸於蒸餾水中。採用Dionex公司色譜基質和由3％0.5N.NaOH/97％H2O作為溶劑的溶劑系統進行HPLC來分離蔗糖。使用電流檢測法測量分離的單糖。一種人工的單糖標準物，其由果糖半乳糖胺，葡萄糖胺，半乳糖，葡萄糖，和甘露糖構成，也經受HPLC分析以供比較。水解表面提取物的HPLC分析揭示了幾種單糖的存在(圖1)。看來來自於傳統生長的和從按實施例2的方法生長的細菌的提取物的碳水化合物組成，未見質的差別，但是出現了微小的量的差別。實施例24。用SDS-PAGE和WesternBlotting分析細菌蛋白。採用Lugtenberg等人的凝膠系統(FEBSLetters58，254-258，1975)。該凝膠體系是不連續凝膠，由低含量丙烯醯胺(典型地4％)，pH6.8濃縮膠，和較高百分比丙烯醯胺，pH8.8分離膠構成，兩種膠都含有0.1％SDS，都使用緩衝液。按照分子大小進行蛋白質分離，採用8或12％丙烯醯胺分離膠。銀染固定的凝膠使分離的蛋白質可視化，分子大小的確定基於用作標準物的已知蛋白的Mr值。SDS-PAGE分離空腸彎曲桿菌細胞蛋白，銀染使之可視。在用DOC培養的細胞中，包括62kD2的蛋白在內的四種蛋白質被誘導或提高(圖2)。實施例25。通過苯酚提取分析弗氏志賀氏菌LPS。如上所述，通過離心從培養基中收穫傳統生長和或如實施例9中例舉的根據本發明生長的弗氏志賀氏菌。用Westphal和Jann(InR.Whistler，ed.，MethodsinCarbohvdrateChemistry，vol5p.83，1965)的方法提取脂多糖(CPS)。簡言之，培養於BHI或如上面實施例9例舉的細胞通過離心收集，在PBS中洗一遍。然後，在68℃用在水中的45％苯酚提取細胞15分鐘，提取物冷卻至10℃，並離心。吸出含有LPS上層水相，用蒸餾水透析。保留物於4℃，80,000xg離心7h，於105,000xg離心三次，每次3h。凍幹終沉澱。分析之前，LPS重懸於水(1mg/ml)。如上述對於碳水化合物那樣，表徵純化LPS，以及如下所述通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，如圖5所示，表徵純化LPS。使用這一具體的SDS-PAGE系統進行分析，在傳統生長的與「提高」的細胞之間，未見弗氏志賀氏菌蛋白分布顯示出重大差別。與BHI細胞提取物相比，來自於「提高的」細胞的碳水化合物與LPS乾重之比降低了。然而，弗氏志賀氏菌LPS經SDS-PAGE，然後氧化和銀染證明了LPS結構上的一個主要改變(圖5)。如，見凝膠上泳道「2」，來自於「提高的」弗氏志賀氏菌的LPS的O-抗原部分在其長度削減了。這一結果補充了來自於「提高的」細胞的碳水化合物/LPS乾重比降低的這一發現。這一結果提示在「提高的」細胞上出現了更短的O-抗原側鏈，潛在地，可能使細菌更為疏水。在腸道中，更疏水的細菌可能與疏水表面有更強的相互作用。實施例26。通過WesternBlotting確定蛋白質免疫原性。來源於傳統生長的或根據如上述實施例1或5例舉的本發明的方法生長的細菌的蛋白質通過SDS-PAGE分離，然後電轉移至硝酸纖維素或PVDF膜且用標準封閉劑封閉[3％BSA，50mMTris(pH8.5)，50mMNaCl，0.2％TWEEN20]。第一抗體加入封閉劑中，然後洗滌印漬加入第二抗體報告關聯物(cognate)。洗滌後，印漬是藉助於光可視的，或藉助於發色團嚴生底物可視。所用報告半體是辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶。圖3圖示了來自於用含IgA的免疫兔粘液進行的WesternBlotting的蛋白。正如所看到的，62kDa蛋白是免疫顯性蛋白。在用DOC或膽汁培養的細胞中，62kDa蛋白的抗原性極大地提高。該蛋白亦是用DOC培養的細胞表面提取物中的主要抗原。使用與彎曲桿菌鞭毛蛋白交叉反應的鼠單克隆抗體，證明這一提高的蛋白是空腸彎曲桿菌鞭毛蛋白(圖4)。這是一個意義重大的發現，因為幾個研究者證明空腸彎曲桿菌鞭毛蛋白參予了發病機制，並與細菌的侵襲特性相關。實施例27。用剛果紅染料結合試驗測定毒力。生長於含0.025％剛果紅的BHI瓊脂平板的傳統生長的(BHI)或根據本發明的方法(「提高」)生長的腸細菌重懸於蒸餾水，並用丙酮提取10分鐘。離心沉澱細胞碎片，用40％丙酮，60％水的空白溶液測定染料OD488。染料吸光度與660nm處細胞吸光度相比，表達為OD488/OD660。數據顯示於表2。表2.傳統生長(BHI)或按照本發明的方法(提高的)生長的腸致病菌剛果紅染料結合染料吸光率菌株BHIENHANCED空腸彎曲桿菌81-1760.070.49空腸彎曲桿菌81-1160.060.49鼠傷寒沙門氏菌0.050.30弗氏沙門氏菌0.020.13霍亂弧桿菌0.702.00表2顯示了對於幾種按照本發明的方法培養的腸細菌，剛果紅染料結合提高了。這些結果表明本發明的體外方法有用於誘導毒力，及其他已知對於其他細菌種體內發病機制相關的特性。實施例28。分析了細菌對於培養的上皮細胞的粘附。細菌粘附如Galen和Curtiss(美國國家科學院院報866383-6387，1989)中所描述的進行測定。組織培養細胞(INT-407或Henle細胞(ATCC#CCL6)，和CaCo-2(ATCC#HTB37)人腸細胞系)在24孔板中(37℃，5％CO2)培養，至60-80％鋪滿。培養基取決於所用細胞系，但是含有10％胎牛血清和50mg/ml的青黴素G和50mg/μl鏈黴素的Dulbecco′s改進Eagle′s培養基被用於Henle細胞，含有10％胎牛血清和50mg/ml青黴素G和50mg/μl鏈黴素的RPMI1640培養基被用於培養CaCo-2細胞。在實驗前至少3小時，培養基被移去，細胞在含鈣鎂的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)中洗兩遍。然後用不含抗生素的培養基塗覆單層。就粘附實驗而言，細菌如下製備。對於生長緩慢的腸細菌，如彎曲桿菌和卷旋桿菌，用新鮮的，預平衡的培養基將細菌培養物密度稀釋到OD625為0.1，然後用於測定，對於志賀氏菌和其他生長快的腸細菌，用新鮮的，預平衡的培養基將細菌培養物稀釋到OD625為0.17，然後用於實驗。細菌以每細胞10個細菌的感染倍數加入上皮細胞以避免飽和。接種到細胞培養孔中的細菌數量通過平板計數來確定。在5％CO2之下，對於彎曲桿菌為感染2h，志賀氏菌是30分鐘，在用0.1％膽酸裂解單層之前，用HBSS洗滌移去未結合細菌，用鋪板來確定粘附。下面表3中顯示了溫度對於空腸彎曲桿菌81-176粘附INT-407細胞的作用，其中空腸彎曲桿菌81-176是傳統生長的，或如實施例5所例舉的本發明的方法培養的。下面表4中顯示了幾株空腸彎曲桿菌粘附的差異，其中，空腸彎曲桿菌是傳統生長的，或如本發明的方法培養的。粘附百分比被表達為從單層中回收的集落形成單位(CFU)數目除以接種到單層中的CFU數目乘以100。表3溫度對於傳統生長的(BHI)或按照本發明的方法(提高的)生長的空腸彎曲桿菌粘附INT-407的影響BHI提高的溫度(％粘附)(％粘附)37℃5.562.342℃5.511.2表4傳統生長的(BHI)或按照本發明的方法生長的(提高的)不同空腸彎曲桿菌菌株對於INT-407的粘附(提高倍數)菌株BHI提高的81-1761.08.481-1761.012.5HC1.028.2在侵襲試驗中，上皮細胞按上述用於粘附實驗的方法生長和製備。傳統生長的或按照本發明的方法生長的細菌以每細胞10個細菌的感染倍數加入上皮細胞中，以避免飽和。接種到組織培養孔中的細菌數目通過平板計數來計算。在5％CO2下，對於彎曲桿菌是感染2h，志賀氏菌是30分鐘，吸出正在感染的細菌，用含有慶大黴素的生長培養基塗蓋單層，以殺死任何細胞外細菌。任何在這時保留的可培養的細菌已經侵入上皮細胞單層。在CO2氣氛之下，就空腸彎曲桿菌感染細胞而言，繼續溫孵3小時，就志賀氏感染細胞而言，是1.5h。用HBSS洗滌單層以移去慶大黴素，加入0.1％脫氧膽酸以裂解單層。平板計數以計數裂解物中的細菌，侵襲百分比表示為慶大黴素抗性細菌數除以接種細菌數目。侵襲被表達為進入細胞的細菌的百分比，通過將從慶大黴素處理過的單層中回收的克隆形成單位(CFU)除以接種到單層中CFU的數目再乘以100而確定。下面表5中顯示了溫度對於空腸彎曲桿菌81-176侵襲INT-407細胞的影響，其中，空腸彎曲桿菌是傳統生長的，或者按上面實施例5的方法生長的。下面表6中顯示了幾種不同空腸彎曲桿菌菌株對於INT-407細胞侵襲的差異，其中空腸彎曲桿菌菌株是傳統生長的，或按本發明的方法生長的。下面表7中顯示了DOC對於空腸彎曲桿菌81-176粘附和侵襲INT-407細胞的影響，其中，空腸彎曲桿菌細胞是傳統生長的，或者按上面實施例5的方法生長的。下面表8中顯示了DOC對於志賀氏粘附和侵襲INT-407細胞的影響，其中，志賀氏細胞是傳統生長的，或者按上面實施例5的方法生長的。表5溫度對於傳統生長的(BHI)或按照本發明的方法(提高的)生長的空腸彎曲桿菌81-176侵襲INT-407細胞的影響BHI提高的溫度(％侵襲)(％侵襲)37℃2.549.542℃4.07.1表6傳統生長的(BHI)或按照本發明的方法(提高的)生長的不同空腸彎曲桿菌菌株對於INT-407細胞的侵襲(提高倍數)菌株BHI提高的81-1761.09.281-1161.010.0HC1.026.7表7DOC濃度對於傳統生長的(BHI)或按照本發明的方法(提高的)空腸彎曲桿菌81-176粘附和侵襲的影響處理粘附(％)侵襲(％)BHI9.36.3提高的；0.025％DOC18.317.4提高的；0.1％DOC52.637.0表8DOC對於傳統生長的(BHI)或按本發明(提高的)方法生長的弗氏志賀氏菌侵襲(百分比)或粘附(百分比)INT-407細胞的影響性質BHI提高的粘附1.0140.0a侵襲1.094.4a由於在實驗過程中，細菌的生長，回收了多於最初加入的細菌向培養基中加入膽汁或脫氧膽酸，極大地提高了幾種空腸彎曲桿菌的人分離物(即81-116，81，176和HC)對於培養的INT-407細胞的粘附和侵襲(見表4和6)。最有效的DOC劑量是0.1％(表7)，最大應答在37℃，而不是在42℃獲得(彎曲桿菌傳統生長所處溫度)(表3和表5)。對於弗氏志賀氏菌也有類似發現(表8)。根據本發明的方法生長的志賀氏菌，其粘附和侵襲能力都極大提高。這些數據表明，本發明的方法提高了腸道病原菌的侵襲和粘附力。實施例29。快速玻片凝集反應被用於顯示免疫交叉反應。傳統生長的，和按如實施例5例舉的本發明的方法生長的空腸彎曲桿菌菌株暴露於血清IgG。該IgG來自用傳統生長或按照本發明生長(例，實施例5)的空腸彎曲桿菌81-176(Lior5)免疫的動物。IgG抗體固定化在蛋白A包被的膠乳珠上。假如在待測血清型和產生用來抗Lior5血清型的抗體之間有交叉反應表位，則幾乎立即可以看見細胞簇集(即，凝集)。這種簇集在反應進行一段很短的時間後，基於0至3的尺度來衡量，其中，0意味著無可見簇集，而3意味著高度凝集。四種菌株的結果在下面表9中給出。表9傳統生長的或按本發明的方法(提高的)生長的Lior血清型的交叉反應性a傳統生長的81-176誘導的抗體b按照如實施例5例舉的本發明的方法生長的81-176誘導的抗體表9表明所有四種待測的Lior血清型(L5，L2，L8，L21)均與產生於用提高的空腸彎曲桿菌81-176Lior血清型L5免疫的動物的抗體交叉反應。用空腸彎曲桿菌81-176感染的兔的腸灌洗粘液含有IgA，與按照本發明的方法生長的空腸彎曲桿菌的10種主要臨床血清型(即，人病原體)中的8個反應，與抗Lior5血清型菌株(見下面表16)的抗體交叉反應。該結果表明，本發明的方法極大地擴展了與來自於用空腸彎曲桿菌的Lior5血清型免疫的動物的抗血清交叉反應的Lior血清型的數目。而且，按照本發明的方法，而不是傳統生長的志賀氏菌的幾個種與來自於用生長於有DOC的環境的弗氏志賀氏菌2457T免疫的動物的IgG抗體交叉反應。8.實施例疫苗效力實施例30。用於研究彎曲桿菌致病機制的白鼬模型可以用作評價保護免受移生和/或疾病的疫苗效力的模型，因為感染白鼬可重複地產生三種見於人類的疾病現象中的兩種。二十四隻7至9周齡雄性白鼬分別用PBS(作對照)，福馬林固定的傳統生長的(BHI)或按實施例5的方法(提高的)生長的空腸彎曲桿菌81-176菌株進行口服免疫。分離血清以確定基線Ig滴度。所有的疫苗和PBS均在佐劑LT的出現下施用，相隔一周，施用兩次(0天和7天「接種」)。一周後收集血清(14天，「接種後」)以確定IgG抗體滴度。接種後四周(攻擊)，用ACE丙嗪氯胺酮麻醉白鼬，並用含有活空腸彎曲桿菌81-176(1×1010CFU)的10mlPBS溶液口服攻擊。其後，每日監測動物的粘液樣腹瀉，菌血症，彎曲桿菌從糞便裡排出，體重改變，潛血和糞便白血球。從麻醉白鼬頸靜脈中抽取1至2ml血，並將樣品在一通氣的(vented)胰酶水解大豆肉湯培養基中培養，以檢測菌血症。在攻擊後2，5，7天進行血瓊脂平板的亞培養。免疫前收集血清樣品(基線)。第二次免疫後一周，在攻擊時，和在攻擊後一周測定IgG滴定。通過在一個Hemacult卡上測試糞便材料來檢測潛血。糞便材料塗布在玻片上用亞甲基藍染色以檢測糞便白血球。在彎曲桿菌選擇性培養基平板(胰酶水解大豆瓊脂，5％綿羊血、三甲氧苄二胺嘧啶，萬古黴素，多粘菌素B、頭孢菌素I，和兩性黴素B，Remel，Lenexa，ks)上培養來自直腸拭子的塗片，以確定彎曲桿菌以糞便中排出。實驗結果見下面表10和11。表10在白鼬申接種、保護免受空腸彎曲桿菌81-176疫苗攻擊後5天，陽性集落形成a疾病bPBS6/61/6BHI0/62/6提高的0/5c0/6a陽性移生數/測試數b出現綠色粘液/未形成/水樣便c疾病狀態確定之後，移生計數之前，本組中有一隻動物死亡表11白鼬血清IgG幾何平均滴度組基線接種後一周攻擊時攻擊後一周PBS6.44.96.41380.4BHI6.494.094.0265053ENHANCED6.8234.41621.856234.1aa五隻存活動物的平均值表10顯示出當活體(live)攻擊時，用本發明的殺死的完整細胞疫苗的動物被保護免受移生和疾病。表11中的數據表明，由本發明的疫苗(提高的)引起的IgG抗體滴度比起傳統生長的腸細菌(BHI)所引起的要大得多。這些結果證明用本發明的疫苗可以獲得免疫原性(表11)和保護免受感染(表10)，而且比當用傳統生長細菌進行接種動物時所見的要強烈。因此本發明的方法形成的細菌可以有用地作為疫苗。保護哺乳動物免於感染。實施例31。與白鼬不同，小鼠不會自然地發生彎曲桿菌或志賀氏菌感染。但是它們被本領域技術人員用來展示當口服攻擊免疫動物時的對於腸移生的抗性，或通過肺感染免疫動物的疾病的抗性。鼠鼻內接種模型可用於預言疫苗用於其他動物或人類時的效力。該實驗為Mallet等人描述(疫苗，11190-196，1993)。幾組約16周齡雌性Balblc小鼠，每組10隻，用磷酸鹽緩衝液(PBS)，傳統生長的空腸彎曲桿菌(BHI)或按照實施例5生長的空腸彎曲桿菌(提高的)，其劑量是大約107CFU或109CFU口服免疫，然後攻擊。每組腸粘液的IgA滴度用ELISA測定，在下面表12中給出。表12小鼠中，用(107或109)彎曲桿菌完整細胞疫苗口服免疫後IgA應答免疫灌洗液IgA滴度a％應答者bPBS2314提高的(107)11475提高的(109)7875BHI(107)4025BHI(109)3212a灌洗液滴度表示從每組小鼠的每一個體中獲得的抗空腸彎曲桿菌IgA滴度平均值。b應答者被定義為其終點滴度比單獨接受PBS的動物的平均值超出2倍標準差的動物。表12表明用按照本發明的方法生長的細菌免疫的動物，比用傳統生長的細菌免疫的動物，具有被較高百分比的應答者遞呈的較高的腸IgA抗體滴度。9.實施例DOC引起的抗原改變或提高的機制雖然並不試圖將本發明限制於任何具體的作用機制，本發明者獲得了一些證據，提示脫氧膽酸(DOC)看來在改變或提高腸細菌抗原性上有兩重作用。證據表明DOC作用的一個方面是通過鈣依賴作用介導的，因為DOC結合鈣，因而降低了培養基中鈣濃度。證據如下。當空腸彎曲桿菌81-176在具有可透膜的鈣螯合劑BAPTA/AM和不具有DOC的情況下培養時，其對於INT-407細胞的侵襲性提高了接近10倍(見下表13)。然而，用BAPTA/AM處理不提高空腸彎曲桿菌81-176細胞的免疫交叉反應性。表13中所示結果是使用按照實施例5中描述的方案，除了以25μMBAPTA/AM替代了0.1％DOC外，培養的空腸彎曲桿菌81-176獲得的。侵襲試驗如下面7部分實施例28中所述的進行且評價。表13傳統生長的(BHI)或帶有BAPTA/AM生長的空腸彎曲桿菌對於INT-407細胞的侵襲培養條件菌株BHIBAPTA/AM空腸彎曲桿菌81-1763.036.9幾個易感由膽汁和膽汁鹽例如DOC引起的抗原性提高或改變的細菌屬(如，彎曲桿菌，志賀氏菌，卷旋桿菌)與來自耶爾森菌的低鈣應答(lcr)基因有基因同源性。已知lcr座位調節應答低鈣水平時耶爾森氏菌的毒力。兩個參予侵襲所必需的鞭毛蛋白(flaA，flbA)的表達和裝配的彎曲桿菌基因部分地受lcr產物的調節。傳統生長的或在本發明的毒力提高的條件下生長的彎曲桿菌flaA和flaB突變體行為的分析表明侵襲，但不是剛果紅染料結合或提高的交叉反應性，是鈣依賴的(見下面表14)。表14所示的結果是採用傳統培養的或如實施例5中例舉的本發明的方法培養的空腸彎曲桿菌獲得的。侵襲試驗如實施例28中描述而進行和評價。表14傳統生長(BHI)的或按照本發明的方法(提高的)空腸彎曲桿菌突變株侵襲INT-407細胞培養條件菌株BHI提高的空腸彎曲桿菌81-3.540.8176空腸彎曲桿菌flaA0.050.05空腸彎曲桿菌flbA0.010.04當用DOC培養時，空腸彎曲桿菌fla和flbA突變株確實展示了明顯提高的剛果紅結合和免疫交叉反應性(分別見表15和圖6)。表15和圖6所示的結果採用傳統生長的，或如實施例5例舉的本發明的方法生長的空腸彎曲桿菌獲得。剛果紅染料結合試驗。其結果如表15所示，如實施例26所述內容進行。免疫交叉反應性，其結果如圖6所示，如實施例29所述而完成。表15傳統生長的(BHI)或按照本發明的方法(提高的)空腸彎曲桿菌突變株的剛果紅染料結合培養條件菌株BHI提高的空腸彎曲桿菌81-0.071.68176空腸彎曲桿菌flaA0.101.60空腸彎曲桿菌flbA0.120.80flaA突變株不能表達鞭毛蛋白。甚至用DOC處理之後，FLAa突變株和flaA-flaB雙突變株(由C.Grant，NIH惠贈)都是非侵襲性的，表明鞭毛蛋白是侵襲所必需的。令人感興趣的是，在這些突變株中，沒有正常展示即非DOC誘導的出來的這些fla突變株的同基因親本株和一些其他空腸彎曲桿菌Lior血清型之間的免疫交叉反應性。然而，DOC處理可誘導這些鞭毛蛋白較少的突變株展示出提高的免疫交叉反應性和剛果紅結合。這些發現表明DOC通過鈣依賴(如侵襲性)和非鈣依賴(如剛果紅染料結合)機制在腸細菌中調節毒力功能。這些發現進一步提示由DOC誘導的提高的免疫交叉反應性和剛果紅結合是至少部分地鞭毛蛋白依賴的。10實施例DOC誘導提高的血清型和種空腸彎曲桿菌的免疫交叉反應性實施例33。用快速被片凝集反應來檢測根據本發明的方法生長的空腸彎曲桿菌的血清型免疫交叉反應性。該反應使用來自免疫的和非免疫兔的腸粘液來確定改變的培養條件在彎曲桿菌異源菌株的交叉反應性上的影響。兔用活的傳統生長的空腸彎曲桿菌81-176免疫。測定粘液抗體對於二十四種彎曲桿菌菌株的凝集活性。包括18種血清型，傳統地生長在BHI-YE培養基或按照如實施例5所例舉的本發明的方法生長。凝集反應的結果表明當菌株用本發明的方法培養時，比起它們傳統生長時，異源彎曲桿菌菌株的交叉凝集更廣泛，在許多情況下，也更強。具體地，在異源凝集反應性上有超過兩倍增長在抗-81-176免疫粘液中。24個傳統生長的異源菌株中的6個以+水平或更高凝集水平，而在DOC條件下生長的同樣24個菌株中的14個以+水平或更高凝集水平。另外，當在傳統生長時，異源菌株中的18個被證明是微弱(±)或不凝集，當在「提高的」培養條件下(如，含DOC的培養基)生長時，這些菌株中的11個顯示了增強的凝集應答。表16說明了抗-81-176免疫兔粘液對於19個異源Lior血清型的交叉反應性。這些血清型包含22個傳統生長(BHI-YE)的，或採用實施例5(提高的)方法生長的菌株。雖然這一實驗僅分析了已知Lior血清型(VC/67)的一部分，結果表明，本發明的方法誘導了Lior血清型之間巨大的免疫交叉反應。這一結果還進一步表明彎曲桿菌中DOC誘導或提高的抗原在分泌型IgA應答中看來是重要的，這種應答與彎曲桿菌引起的腸感染的抗性和恢復相關。另外還需注意Lior血清型8菌株是不同種，大腸彎曲桿菌。在抗-81-176免疫兔粘液中，這個血清型中的2個菌株強烈地凝集(3+)，這一結果表明衍生於空腸彎曲桿菌菌株(如Lior5)的疫苗不僅在同一種同內而且也在彎曲桿菌屬的其他種(如大腸彎曲桿菌)，針對異源血清型交叉保護。同樣值得注意的是Lior血清型1，2，4，9和11都處於世界範圍內最流行的疾病相關血清型之中。在該實驗中，它們都被證明了可測得的交叉反應性。表16.20個傳統生長的(BHI-YE)或按照本發明的方法(提高的)生長的彎曲桿菌血清型對非-免疫b或抗-81-176a免疫兔粘液的凝集應答凝集應答c非免疫粘液免疫粘液Lior菌株血清型BHI-YE提高的BHI-YE提高的1341---++1952---±14---+++1705--+++++++81-1765--++++++++66--+++++++81-1166--+++357---+528-++++VC-1678--++++VC-1598--±-889---±24411--±+++55617--+-56318----54419-++-++69921--±++118028--++++198229----91032-++-++207436----HC36-+-+298446----7917172----a抗-81-176粘液從用傳統生長的活空腸彎曲桿菌81-176感染兔得到。b非免疫粘液從未感染兔獲得c凝集應答分為陰性(一)，很弱(±)，至很強(+++)11實施例彎曲桿菌疫苗效力的其他實驗實施例34。採用Baqar(InfectImmun.，633731-3735，1995)報導的小鼠移生模型，確定按本發明的方法生長的福馬林固定的完整空腸彎曲桿菌細胞的保護效力。按照實施例5生長和收穫空腸彎曲桿菌81-176，並如上述用0.075％福馬林滅活。幾組5隻6至8周齡雌性Balb/c鼠被施用三個口服劑量(0.25ml劑量，於不含內毒素的PBS中)，每劑量各自單獨含有105，107或109滅活細菌顆粒，或與25ug大腸桿菌熱不穩定腸毒素組合(LT)。以48小時間隔給予劑量，隨即在15分鐘間隔時給予兩劑0.5ml5％碳酸氫鈉溶液(pH8.5)，以中和胃酸。對照組的動物單獨用PBS接種或與LT佐劑組合接種。大約在施用第三劑量後的28天，接種動物用大約108集落形成單位(CFU)的活的傳統生長的空腸彎曲桿菌81-176經鼻或口服攻擊。在9天時期內，每天監測糞便排出以確定腸移生的持續時間。在無菌PBS內乳化糞便材料，將等份於彎曲桿菌血瓊脂平板上塗平板。平板在微需氧條件(CampylobacterGaspak，BBL)下於35℃溫孵3-5天，使空腸彎曲桿菌生長。移生結果表達為在給定的取樣天，排出彎曲桿菌生物體的動物的百分比。如圖7所示，免疫的和對照的所有鼻攻擊的動物，攻擊後立即(第1天)排出生物體。攻擊後，80％對照組動物保持移生9天。相反，在實驗的9天之內，接種組中排出生物體的動物明顯較少。清除攻擊生物體的程度和時間依賴於施用疫苗的數量。低(105顆粒/劑量)和中疫苗劑量(107顆粒/劑量)給出一個漸進的、不完全的清除速率。佐劑的出現提高了在這些劑量下的保護程度。令人驚訝的，在測試的最高劑量(109顆粒/劑量)，無佐劑的疫苗，與施用帶有LT佐劑的可比劑量時相比，產生了相等的、或略高的保護水平。當口服接種動物，並接著口服攻擊時也獲得了相似的結果(見圖8)。這些結果表明用按照本發明的方法生長的、滅活的彎曲桿菌免疫動物，提供了針對於隨後攻擊的活彎曲桿菌的保護。甚至不與佐劑一起口服施用時，這種免疫仍然是有效的。腹膜內(IP)施用按照本發明的方法生長的(見實施例5)福馬林固定的完整空腸彎曲桿菌細胞的保護效力也得到評價。就這些實驗而言，幾組20隻雌性Balb/c小鼠被施用單一劑量1.3×1010，2.5×109，5.0×108，1.0×108或2.0×107在0.5ml無內毒素PBS中，無佐劑的滅活空腸彎曲桿菌顆粒。14天後，腹膜內輸送一單一致死劑量的活空腸彎曲桿菌81-176(約1.0×1010CFU於無內毒素PBS中)以攻擊動物。每日監測動物死亡，持續4天。如表17所示，一個單一腹膜內5.0×108滅活空腸彎曲桿菌顆粒劑量誘導了足以保護動物免受活的空腸彎曲桿菌攻擊的免疫應答。表17按本發明的方法製備的、V2滅活的、IP輸送的空腸彎曲桿菌提供的保護劑量死亡存活者天12341.3×10100400162.5×1090000205.0×1080000201.0×1081170025.0×107106202PBS對照4320112實施例志賀氏菌的DOC提高的侵襲力，剛果紅結合和免疫交叉反應性實施例35，體外生長的志賀氏菌的侵襲力受培養物生長期的影響。按照實施例28所描述的方法，測定傳統生長的(BHI)，或按照實施例9例舉的本發明的方法(DOC-EL)生長的(其中細胞來自於對數早期培養物)，或按照實施例9但在收穫細胞前讓培養物達到對數晚期(DOC-LL)的弗氏志賀氏菌2457T細胞的侵襲性。結果表明用DOC培養提高了侵襲力，而且最大的提高是在生長的對數早期達到的(見圖9)。按照本發明的方法，用DOC培養也提高其他志賀氏菌的種，宋內氏志賀氏菌，和痢疾志賀氏菌(見圖10)的侵襲力。在板化上皮細胞內，僅當上皮細胞被細菌basolaterally感染時，才能觀察到提高的志賀氏菌的侵襲力。這一發現與體內觀察的侵襲過程一致。比較性研究表明按照本發明的方法生長的志賀氏菌，其侵襲力幾乎是按照Pofe等人(Infect.Immun.，633642-36481995)描述方法製備的志賀氏菌的侵襲力的10倍多。實施例36。按照本發明的方法培養的志賀氏菌也顯示出提高的剛果紅結合。傳統生長的(BHI)或如實施例9所例舉的本發明的方法生長的弗氏志賀氏菌2457T和宋內氏志賀氏菌。被用上面實施例26描述的方法分析其染料結合能力。結果顯示，在DOC中生長，這兩種志賀氏菌的種的剛果紅結合提高了10至20倍(見表18)。表18傳統生長的(BHI)或按照本發明的方法生長的(提高的)弗氏志賀氏菌和宋內氏志賀氏菌的剛果紅結合培養條件菌株BHI提高的弗氏志賀氏菌0.040.44宋內氏志賀氏菌0.020.40志賀氏菌被分為四個種和多個血清型。如實施例28所述，用凝集試驗測試按本發明的方法生長的弗氏志賀氏菌的免疫交叉反應性。實驗採用來自免疫兔的抗血清，以確定培養條件對不同志賀氏菌的種的免疫交叉反應性上的影響。兔用按實施例9的方法生長的、用福馬林固定的弗氏志賀氏菌2457T免疫。針對於傳統生長於BHI培養基的，或按照本發明的方法生長的(如，實施例9)的所有4種志賀氏菌的種，測試了從免疫動物獲得的IgG抗體的凝集活性。凝集實驗的結果表明具有DOC的生長極大地提高了異源弗氏志賀氏菌的凝集活性，和三種異源志賀氏菌對於抗-弗氏志賀氏菌抗體的凝集活性(見圖11)。13實施例志賀氏菌的疫苗效力實施例37。用C.P.Mallett等人(免疫，11190-196，1993)等人建立的小鼠鼻攻擊模型確定了根據本發明的方法生長的、福馬林固定的完整弗氏志賀氏細胞的保護效力。簡言之，弗氏志賀氏菌按照實施例9例舉的方法生長和收穫，並按實施例30的說明用0.075％福馬林滅活。大約107滅活的細菌顆粒被用於接種14-16周齡雌性Balb/c小鼠。滅活的弗氏志賀氏菌懸於無菌的不含內毒素的PBS中，其濃度是108顆粒/ml，35μl該物質被經鼻施用於幾組10隻輕度麻醉動物。以14天為間隔，總共免疫三次。為了檢測佐劑在完整志賀氏細胞疫苗的保護性能力的效力，幾組動物用含有滅活的疫苗和5μg大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT)的懸液免疫。第三次免疫後的14天、動物經鼻攻擊亞致死消瘦劑量(105CFU)的活弗氏志賀氏菌或宋內氏志賀氏菌攻擊之前和攻擊後於1，2，5和7天，將動物稱重，確定平均小組重量。結果見表19。表19滅活的弗氏志賀氏菌保護小鼠免受活的弗氏志賀氏菌或宋內氏志賀氏菌的經鼻攻擊攻擊生物體接種攻擊後體重改變百分比天1天2天5天7弗氏志賀氏菌PBS-8.1-18.2-17.7-18.3疫苗-5.4-2.9-2.5-1.6疫苗+-7.0-2.0-1.51.5佐劑宋內氏志賀氏菌PBS-8.1-17.5-9.3-6.4疫苗-6.7-11.3-6.5-6.0疫苗+-6.4-5.2-1.3-2.1佐劑每組10隻小鼠用含107滅活的按實施例9生長的弗氏志賀氏菌疫苗經鼻免疫3次。用含有滅活的，按本發明的方法生長的弗氏志賀氏菌的疫苗免疫的小鼠，被保護免受活的弗氏志賀氏生物體攻擊。與未接種小鼠，即PBS贗品(sham)對照組相比，這些小鼠較少體重降低，且體重恢復也較快。令人驚訝的，弗氏志賀氏菌疫苗也保護小鼠免受活宋內氏菌攻擊。令人感興趣的是，單獨接受疫苗，沒有LT佐劑的小鼠與接受佐劑化疫苗的動物被一樣有效地保護免受同源弗氏志賀氏菌攻擊。單獨的弗氏志賀氏菌疫苗也提供對於宋內氏志賀氏菌的異源攻擊的保護。然而，含有的LT佐劑極大地提高了由宋內氏志賀氏菌攻擊的保護。這些發現表明含有按本發明的方法製備的滅活的志賀氏菌的疫苗在一承認的志賀氏菌疾病模型中是有效的，且在預防或減弱多種志賀氏菌的感染中不需佐劑。14影響H.PYLORI對於動物細胞粘附的因素實施例38。在甘膽酸鹽或膽汁上生長可以提高H.pylori的粘附。H.pylori菌株NB3-2或G1-4被加入到加了4％小牛血清的BHI肉湯中。接種後，三角瓶充入10％CO2-5％O2-85％N2，37℃振蕩溫孵22h。溫孵後，培養物被110稀釋至一個盛有1升加有4％小牛血清、含有不同濃度牛膽汁(0.025％至0.2％)的BHI培養基的三角瓶中。這些培養物再次用同樣的氣體混合物充滿，於37℃溫孵。在不同的時間，最多可達18h收穫細胞，用實施例28中描述的方法分析其對INT-407細胞的粘附。結果表明用膽汁培養提高了H.pylori對於INT-407細胞的粘附(見圖12和13)。就NB3-2菌株而言，比起非提高的培養物增長2至3倍的峰值粘附，發生於生長後約8h(圖12)。就G1-4菌株而言，比起非提高的培養物增長2至3倍的峰值粘附，發生於在0.2％膽汁中生長12-14小時之間。這些「峰值」時間一般對應於每一菌株的培養物處於對數期生長的階段。15實施例。根據本發明的方法生長的卷旋桿菌的疫苗效力實施例39.用陳等描述的小鼠Helicobacterfelis胃移生模型(柳葉刀，3391120-1121，1992)確定按照本發明的方法生長的、福馬林固定的完整細胞Helicobacterpolyri的保護效力。Helicobacterpolyri菌株G1-4作為種子培養物，於37℃，在10％CO2，90％空氣，在含有4％小牛血清的BHI中生長22h。一小份這種培養物被用於接種10倍體積的、含有0.1％(v/v)牛膽汁的同一培養基。37℃生長12-14小時後，離心收穫細胞，於室溫重懸於1/10初始體積的Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)中。細胞再離心，再重懸於1/100初始體積的HBSS中。向緩衝的細胞懸液中，加入福馬林，使其濃度達0.075％通過室溫下攪拌懸液6h，然後將溶液冷卻至4℃18小時而滅活細胞。在0，7和14天或在0，7和21天，向6-8周齡雌性Balb/c無卷旋桿菌小鼠口服施用3個劑量的這種滅活的完整細胞疫苗來日常地測量保護潛能。評價了與大腸桿菌熱不穩定腸毒素組合的109細菌顆粒/劑的劑量。第三次免疫劑量後的14天，動物用單劑量(107CFU/劑量)活H.felis口服攻擊。攻擊後兩周，處死動物，竇胃節用於分析脲酶活性以確定H.felis的出現。通過於室溫下將竇組織樣品於0.5mlStuart′s脲酶肉湯(Remel)中溫孵4-24小時來確定脲酶活性。發生於此階段內的由澄清至紅色的顏色轉變作為陽性脲酶結果。如表20所示，施用由H.pylori菌株G1-4製備的提高的卷旋桿菌完整細胞疫苗保護動物免受H.felis口服攻擊。表20用含有按本發明的方法生長的，滅活的H.pylori的疫苗保護免受卷旋桿菌感染免疫劑攻擊生物體(10CFU)移生/總數保護百分比實驗1H.pyloribH.felis4/1371PBS+LTH.felis9/90實驗2H.pyloribH.felis2/1587PBS+LTH.felis10/100a.所有的化學劑以7天的間隔，3個口服劑量，和10μgLT(ETEC的熱不穩定毒素)給予b.以0.25ml劑量申1×109CFU的G1-4菌株給予。這些實驗的結果表明了提高的腸細菌特性和體內免疫原性的相關性。本發明的方法產生了能夠誘導保護性的免疫原性應答，因而可以用作疫苗的細菌。16.微生物保藏下列微生物已保藏於美國典型培養物保藏中心，12301ParklawnDrive，Rockville，馬裡蘭州20852，美國，具有如下保藏號微生物保藏號保藏日期HelicobacterPyloriNB3-21995年9月29日HelicobacterPyloriG1-41995年9月29日本發明的方法的其他等價物可以被本領域技術人員輕而易舉地確定，本發明試圖包括這些等價物。以上的公開內容包括本領域技術人員實現權利要求的發明所確實必需的所有信息。因為引用的專利或出版物可能提供其他有用信息，所有引述的資料在此全文引入作為參考。權利要求1.一種產生具有提高的抗原特性的腸細菌的方法，其中腸細菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，Gastrospirillumsp.，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，該方法包括在體外在一些條件的組合之下生長腸細菌的培養物，這些條件包括a)大約0.05％至大約3％膽汁或大約0.025％至大約0.6％一種或多種膽汁酸或其鹽；b)溫度在大約30℃至大約42℃之間；c)在空氣中或在微需氧條件下，其中微需氧條件包括i)大約5％至大約20％CO2和大約80％至大約95％空氣；ii)大約5％至大約20％CO2和大約80％至大約95％N2；或iii)大約5％至大約10％O2和大約10％至大約20％CO2和大約70％至大約85％N2；和d)一種二價陽離子螯合劑，選自0至100μM的BAPTA/AM，0至大約10mM的EGTA，和0至大約100μM的EGTA/AM，生長一段足夠的時間，這樣，培養物處於一個在大約是對數早期，在對數早期和穩定期之間，或在大約是穩定期的生長期。2.權利要求1的方法，其中所述膽汁鹽或酸包括脫氧膽酸鹽或甘膽酸鹽。3.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是彎曲桿菌屬的種。4.權利要求3的方法，其中所述腸細菌是空腸彎曲桿菌或大腸彎曲桿菌。5.權利要求4的方法，其中所述空腸彎曲桿菌是這樣的空腸彎曲桿菌菌株，它選自134，195，170，81-176，6，81-116，35，52，VC-167，88，244，544，699，1180，910，和HC。6.權利要求5的方法，其中所述空腸彎曲桿菌是空腸彎曲桿菌菌株81-176條件組合包括a)大約0.1％膽汁鹽，它是脫氧膽酸鹽或大約0.8％膽汁；b)溫度是大約37℃；c)在大約10％至大約20％CO2和大約80％至大約90％空氣，和培養物生長一段足夠時間，這樣，培養物處於穩定期。7.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是志賀氏菌屬的細菌。8.權利要求7的方法，其中所述腸細菌是志賀氏菌屬的種，選自弗氏，宋內氏，痢疾和鮑地氏志賀氏菌。9.權利要求8的方法，其中所述志賀氏菌是弗氏志賀氏菌或痢疾志賀氏菌。10.權利要求9的方法，其中所述弗氏志賀氏菌是弗氏志賀氏菌2457T，條件的組合包括a)大約0.1％脫氧膽酸鹽或大約0.8％膽汁；b)溫度是大約37℃；c)在空氣中；而且培養物生長一段充分的時間，這樣使培養物處於對數早期。11.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是耶爾森氏菌。12.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是大腸桿菌。13.權利要求12的方法，其中所述大腸桿菌是腸毒性的，腸溶血性的，腸病原性的，或腸侵襲性大腸桿菌菌株。14.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是弧菌。15.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是沙門氏菌。16.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是類桿菌。17.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是梭狀芽胞桿菌。18.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是腸球菌。19.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是克雷白氏菌。20.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是腸桿菌。21.權利要求1的方法，其中所述腸細菌是Gastrospirillumsp。22.一種產生具有提高的抗原特性的腸細菌的方法，其中腸桿菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，Gastrospirillumsp.，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，該方法包括在體外在一些條件的組合之下生長腸細菌的培養物，這些條件包括a)一種二價陽離子螯合劑，選自1.0至25μM的BAPTA/AM，0.5至大約10mM的EGTA，和1.0至大約100μM的EGTA/AM；b)溫度在大約30℃至大約42℃之間；和c)在空氣中或在微需氧條件下，其中微需氧條件包括i)大約5％至大約20％CO2和大約80％至95％空氣；ii)大約5％至大約20％CO2和大約80％至大約95％N2；或iii)大約5％至大約10％O2和大約10％至大約20％CO2和大約70％至大約85％N2；生長一段足夠的時間，這樣，培養物處於一個在大約是對數早期，在對數早期和穩定期之間，或在大約是穩定期的生長期。23.一種具有提高的抗原特性的腸細菌，其中腸細菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，腸桿菌屬，Gastrospirillumsp.，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，它是從在體外，在以下條件組合之下生長的腸細菌培養物中收穫的，條件組合包括a)大約0.05％至大約3％膽汁或大約0.025％至大約0.6％一種或多種膽汁酸或其鹽；b)溫度在大約30℃至大約42℃之間；c)在空氣中或在微需氧條件下，其中微需氧條件包括i)大約5％至大約20％CO2和大約80％至95％空氣；ii)大約5％至大約20％CO2和大約80％至大約95％N2；或iii)大約5％至大約10％O2和大約10％至大約20％CO2和大約70％至大約85％N2；和d)一種二價陽離子螯合劑，選自0至100μM的BAPTA/AM，0至大約10mM的EGTA，和0至大約100μM的EGTA/AM，其中所述腸桿菌培養物處於一個在大約是對數早期，在對數早期和穩定期之間，或在大約是穩定期的生長期。24.權利要求23的腸細菌，其中所述膽汁鹽包括脫氧膽酸鹽或甘膽酸鹽。25.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是彎曲桿菌。26.權利要求25的腸細菌，其中所述彎曲桿菌是空腸彎曲桿菌，大腸彎曲桿菌。27.權利要求26的腸細菌，其中所述空腸彎曲桿菌是這樣的空腸彎曲桿菌菌株，它選自134，195，170，81-176，6，81-116，35，52，VC-167，88，244，544，699，1180，910，和HC。28.權利要求27的腸細菌，其中所述空腸彎曲桿菌菌株是81-176，而且條件組合包括a)大約0.1％脫氧膽酸或大約0.8％膽汁；b)溫度是大約37℃；c)在大約10％至20％CO2和大約80％至大約90％空氣，和腸細菌培養物處於穩定期。29.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是志賀氏菌。30.權利要求29的腸細菌，其中所述志賀氏菌選自弗氏、宋內氏、痢疾、和鮑地氏志賀氏菌。31.權利要求30的腸細菌，其中所述腸細菌是痢疾志賀氏菌。32.權利要求30的腸細菌，其中所述腸細菌是弗氏志賀氏菌。33.權利要求32的腸細菌，其中所述弗氏志賀氏菌是弗氏志賀氏菌2457T，而且條件組合包括a)大約0.1％脫氧膽酸或大約0.8％膽汁；b)溫度是大約37℃，c)在空氣中和培養物處於對數早期。34.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是大腸桿菌。35.權利要求34的腸細菌，其中所述大腸桿菌是腸毒性、腸溶血性、腸致病性、或腸侵襲性大腸桿菌菌株。36.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是弧菌。37.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是沙門氏菌。38.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是類桿菌。39.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是梭狀芽胞桿菌。40.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是腸球菌。41.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是克雷白氏菌。42.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是腸桿菌。43.權利要求23的腸細菌，其中所述腸細菌是Gastrospirillumsp。44.一種產生具有提高的抗原特性的腸細菌的方法，所述腸細菌選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，Gastrospirillumsp.，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌，該其中腸細菌從在體外在一些條件的組合之下生長腸細菌的培養物收穫，這些條件包括a)一種二價陽離子螯合劑，選自1.0至25μM的BAPTA/AM，0.5至大約10mM的EGTA，和1.0至大約100μM的EGTA/AM；b)溫度在大約30℃至大約42℃之間；和c)在空氣中或在微需氧條件下，其中微需氧條件包括i)大約5％至大約20％CO2和大約80％至95％空氣；ii)大約5％至大約20％CO2和大約80％至大約95％N2；或iii)大約5％至大約10％O2和大約10％至大約20％CO2和大約70％至大約85％N2；其中腸細菌培養物處於對數早期和穩定期之間。45.一種包含權利要求23，26，28，29，30，或33-44的腸細菌，或其免疫原性片段或其衍生物的疫苗。46.權利要求45的疫苗，還包含可藥用載體或稀釋劑。47.權利要求45的疫苗，其中所述腸細菌是滅活的。48.權利要求47的疫苗，其中所述腸細菌是經福馬林處理而滅活的。49.權利要求45的疫苗，其中所述疫苗適於黏膜或胃腸外或黏膜和胃腸外施用。50.權利要求45的疫苗，還包含一種佐劑。51.一種用於測試潛在的抗微生物劑的方法包括，將權利要求23，26，28，29，30或33-44的腸細菌與所述化學劑(agent)接觸，當測試所述化學劑對於腸細菌的殺菌或制菌作用。52.一種用於檢測動物體內或由其衍生的生物學樣品中的宿主的抗腸細菌的抗體的方法，包括步驟a)將所述生物學樣品與權利要求23，26，28，29，30或33-44的腸細菌或其片段接觸，和b)篩選與腸細菌或其片段結合的抗體。53.一種用於檢測動物體內或由其衍生的生物學樣品中腸細菌的方法，包括步驟a)將所述樣品與和權利要求23，26，28，29，30或33-44的腸細菌或其片段結合的抗體接觸和b)篩選與腸細菌或其片段結合的抗體。54.一種用於檢測宿主產生抗腸細菌抗體或檢測腸細菌的診斷免疫試驗試劑盒，包括權利要求23，26，28，29，30或33-44的腸細菌或其抗體，和進行所期望的免疫實驗所需要的其他所有必需的試劑盒組分。55.一種用於在動物中產生抗腸細菌抗體的方法，包括用有效量的含有權利要求23，26，28，29，30或33-44的腸細菌的免疫原免疫動物，其中，抗腸細菌抗體結合所述腸細菌或其組分。56.一種在動物中刺激免疫應答的方法，包括向動物施用有效量的含有權利要求23，26，28，29，30或33-44的腸細菌的免疫原，其中所述免疫應答保護，減弱或治癒動物中由選自彎曲桿菌屬，耶爾森氏菌屬，類桿菌屬，克雷白氏桿菌屬，Gastrospirillumsp.，腸桿菌屬，沙門氏菌屬，志賀氏菌屬，氣單胞菌屬，弧菌屬，梭狀芽胞桿菌屬，腸球菌屬，和大腸桿菌的腸細菌引起的感染或疾病。全文摘要公開了用於誘導或提高腸細菌抗原或毒力因子的體外進程的方法。也公開使用抗原性提高的細菌的方法，以及含有腸桿菌的疫苗，具體地，卷旋桿菌提供了其完整的腸細菌或組分。且有其它可用於本發明的腸細菌。圖述了一個典型空腸彎曲桿菌，顯示了空腸彎曲桿菌的表面提取物水解物的單糖的高效液相色譜結果。文檔編號G01N33/569GK1168693SQ95196589公開日1997年12月24日申請日期1995年10月4日優先權日1994年10月5日發明者J·L·佩斯,R·I·沃克,S·M·弗拉申請人:微卡布有限公司