基於杆狀病毒生產不含汙染性杆狀病毒毒粒的生物藥品的製作方法

2023-09-23 00:49:00

專利名稱：基於杆狀病毒生產不含汙染性杆狀病毒毒粒的生物藥品的製作方法
基於杆狀病毒生產不含汙染性杆狀病毒毒粒的生物藥品本發明涉及利用基於杆狀病毒的系統來生產生物藥品的方法。這些方法有利地允許生產汙染性杆狀病毒毒粒減少或沒有的生物藥品。經過過去的二十年，杆狀病毒-昆蟲細胞技術已變成用於生產重組蛋白的非常常用的真核表達系統，其不僅用於科學目的，而且越來越多地用於人類醫學和獸醫學(Condreay 和 Kost, 2007, van Oers,2006)。具體來說，源自於苜猜銀紋夜蛾(Autographacalifornica)多粒核多角體病毒(AcMNPV)的重組杆狀病毒被廣泛用於在培養的昆蟲細胞中大規模生產異源蛋白。頻繁使用該系統的主要原因是(1)外來蛋白的高表達水平，(2)昆蟲細胞能夠在懸浮培養中生長，因此易於規模放大，(3)在昆蟲細胞中合成的蛋白經過翻譯後加工和修飾；(4)良好建立的病毒載體操作技術，其產生靈活的表達系統，以及5)對人類無致病性，因為杆狀病毒的宿主範圍限於昆蟲和無脊椎動物。重組杆狀病毒載體正被用 來生產用於亞基疫苗目的的個體蛋白，但是也用於含有ー種或多種蛋白的更有序的結構，例如酶複合體、病毒或病毒樣粒子。病毒樣粒子(VLP)是高度組織化的結構，其由病毒來源的結構蛋白自組裝而來。這些穩定和多用的納米粒子具有出色的輔助性質，能夠誘導先天和獲得性免疫應答(Ludwig
&Wagner，2007)。在過去幾年中，利用VLP的結構穩定性和對操作的耐受性，已將其應用於生物技術的其他分支，以攜帶和展示異源分子或用作新納米材料的構築單元。對於免疫治療和預防應用來說，已在杆狀病毒感染的昆蟲細胞中成功生產了許多類型的病毒樣粒子(VLP) (Noad & Roy, 2003, van Oers 等,2006, Ramqvist 等，2007)。第一種商業化實現的用於人類的杆狀病毒VLP技術是最近由GlaxoSmithKline上市的人類乳頭瘤病毒(HPV)疫苗，其預防性對抗HPV毒株16和18。通過重組杆狀病毒載體表達了這些HPV類型的每ー種的LI蛋白，並將得到的VLP組合以產生疫苗Cervarix (Harper等,2006)。目前，正進行巨大的努力以開發源於杆狀病毒的流感病毒樣粒子以及流感亞基疫苗，作為不基於卵和哺乳動物細胞培養的新一代。非複製型流感病毒樣粒子能夠有效引發針對來自於新出現的H5N1流感病毒分離株的蛋白的加寬的、跨進化枝的保護性免疫應答，產生用於人類的可能大流行的流感疫苗候選物，其可以被儲備用於H5N1流感爆發的情況(Bright等，2008)。在昆蟲細胞中生產的流感亞基疫苗已快要獲得FDA批准(Cox和Hollister，2009)。類似策略原則上可應用於針對大流行性流感例如最近爆發的豬流感的疫苗。為了基因治療目的，杆狀病毒-昆蟲細胞技術也被應用於生產感染性腺相關病毒載體(例如Urabe等，2002)和慢病毒載體(Lesch等，2008)。為了生產AAV載體，將昆蟲細胞用三種重組杆狀病毒共同感染，一種產生AAV複製酶(REP)蛋白，ー種帶有用於產生AAV病毒結構蛋白(VP1、VP2、VP3)的cap功能，第三種杆狀病毒包含具有攜帯和轉移轉基因的能力的AAV-ITR載體。最近發表了這種生產方法的改進形式，其基於僅僅使用重組杆狀病毒，其中ー種重組杆狀病毒攜帶AAV的r印和cap功能(Smith等，2009)。產生的AAV載體與在哺乳動物細胞中產生的載體在物理和生物性質上無法區分。AAV-ITR載體的產率達到每個Sf9昆蟲細胞5X IO4個，證實了該系統能夠以簡單方式生產大量AAV載體。目前，使用杆狀病毒來源的AAV載體用於例如脂蛋白脂肪酶缺陷的臨床試驗正在進行之中(AmsterdamMolecular Therapeutics B. V·)。作為生產慢病毒載體的備選的、可放大的方法(Lesch等，2008)，用在昆蟲細胞中產生的四種重組杆狀病毒同時轉導哺乳動物293T細胞，以表達產生安全的慢病毒載體所需的所有元件。哺乳動物細胞培養基中未濃縮的慢病毒滴度平均為2. SXlO6TUmr1,與通過常規的四種質粒轉導方法生產的慢病毒的滴度相當。此外，進行了廣泛嘗試以將慢病毒載體生產方法轉變成更好的、可放大的基於昆蟲細胞的技術。Tjia等，1983，發現BV可以被哺乳動物細胞內化，並且甚至ー些病毒DNA到達細胞核。進ー步的研究顯示，杆狀病毒能夠進入哺乳動物細胞並介導大腸埃希式桿菌(Escherichia coli)氯黴素こ醯轉移酶在勞氏(Rous)肉瘤病毒啟動子下的表達(Carbonell等，1985)。這些發現導致開發了用於哺乳動物細胞的新的基於杆狀病毒的基因遞送載體(Boyce&Bucher, 1996, Hofmann 等，1995, Condreay 和 Kost, 2007, Kaikkonen 等，2008)。目前，有強烈證據表明杆狀病毒來源的基因遞送載體在抗生素選擇後能夠在哺乳動物細胞中介導外來基因的瞬時和穩定表達(Lackner等，2008)。 關於杆狀病毒啟動子在哺乳動物細胞中的轉錄活性，仍然了解得不多。已證實，在哺乳動物細胞中，AcMNPV的反式激活蛋白IEl (Murges等，1997)以及早至晚期(ETL)啟動子(Liu等，2006a，b)有功能。其他未完全探索的領域包括杆狀病毒與哺乳動物免疫系統組分的相互作用。AcMNPV病毒能夠誘導抗病毒的細胞因子生產，其保護細胞免於被水泡性口炎病毒和流感病毒感染(Abe等，2003，Gronowski等，1999)。AcMNPV還被樹突狀細胞和巨噬細胞上的Toll樣受體9識別，並且AcMNPV誘導抗腫瘤的獲得性免疫力(Kitajima &Takaku, 2008)。這些結果表明AcMNPV具有作為誘導先天和獲得性免疫力的有效病毒或腫瘤治療劑的潛力。儘管AcMNPV對小鼠中體液和適應性細胞介導的免疫的組分具有普遍的正效應，但杆狀病毒與人類免疫系統的相互作用可能稍有不同。此外，AcMNPV的免疫輔助性質應該與針對在昆蟲細胞中生產的目標疫苗/生物藥品的免疫應答完全分離開。在將杆狀病毒用於生產供治療目的的疫苗或病毒載體(例如AAV、慢病毒)的情形中，杆狀病毒的這些特點非常不利。因此，應該避免生產的生物藥品被兩種類型的杆狀病毒毒粒——芽生型毒粒(BV)和包埋型毒粒(ODV)汙染。一般來說，重組蛋白可以在昆蟲細胞中作為胞質、膜結合或細胞外分泌型蛋白來生產。後ー種分泌蛋白被培養基中存在的杆狀病毒BV高度「汙染」。在某些生產和純化構造中，將不想要的杆狀病毒毒粒與產生的重組生物藥品分離可能非常困難。例如，已顯示這些BV可能在使用杆狀病毒-昆蟲細胞技術生產的AAV載體的純化過程中引起問題(個人通信，O. Merten, Genethon)。另ー方面,還存在0DV，其在所有常規杆狀病毒-昆蟲細胞表達系統中總是在被感染細胞的核內部形成，即使在因使用所需基因代替多角體蛋白的開放閱讀框而不形成包含體的情況下也是如此。類似地，這些毒粒在純化過程中可以隨著細胞內產生的重組蛋白或VLP共純化。概括來說，重組蛋白以及特別是VLP與杆狀病毒粒子的分離，需要大量努力並以高成本實現。此外，它引起重組蛋白生產效率的降低。因此，開發允許異源蛋白的高表達並在同時消除杆狀病毒BV和ODV產生的改進的杆狀病毒-昆蟲細胞技術是非常需要的，並且是本專利申請的主題。對於在昆蟲細胞中生產的所有種類的生物藥品來說，這樣的不含杆狀病毒毒粒的生產系統將呈現與現有系統相比的顯著改迸。
本發明是基於鑑定有效的基於杆狀病毒-昆蟲細胞的方法，所述方法用於生產杆狀病毒毒粒的量減少或沒有的生物藥品。因此，本發明的ー個目的提供了用於生產生物藥品的方法，所述方法包含(a)用至少ー種杆狀病毒感染生產生物藥品的昆蟲細胞，所述至少一種杆狀病毒包含編碼所述生物藥品的基因組；以及(b)將生產生物藥品的昆蟲細胞維持在使所述生物藥品得以生產的條件下，其中所述至少一種杆狀病毒的每個基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷，或其中所述生產生物藥品的昆蟲細胞包含使杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因失活的表達控制系統。在一個實施方案中，本發明涉及上述方法，其中通過突變，例如通過核苷酸取代、插入或缺失，使所述基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因有缺陷。在另ー個實施方案中，本發明涉及上述方法，其中生產生物藥品的昆蟲細胞是重組昆蟲細胞，其包含表達對杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有特異性的dsRNA的構建物，所述dsRNA任選在誘導型啟動子的控制下表達。在另ー個實施方案中，本發明涉及上述方法，其中所述至少一種杆狀病毒在步驟(a)之前、在表達杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的互補拷貝的杆狀病毒生產細胞中產生。在另ー個實施方案中，本發明涉及上述方法，其中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少一個基因選自vp80、vp39、vpl054和ρ6· 9。在另ー個實施方案中，本發明涉及上述方法，其中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的有缺陷或失活，與來自野生型杆狀病毒載體的極晚期表達相比，不影響來自所述杆狀病毒的極晚期表達。在另ー個實施方案中，本發明涉及上述方法，其中所述至少一種杆狀病毒優選源自於 AcMNPV 或家香(Bombyx mori ) (Bm) NPV0在另ー個實施方案中，本發明涉及上述方法，其中生物藥品是重組蛋白、重組病毒、源於病毒的載體或病毒樣粒子。在另ー個實施方案中，本發明涉及上述方法，其中生物藥品是重組AAV載體。此夕卜，本發明涉及上述方法，其中生物藥品是疫苗。可以使用本發明的方法生產的疫苗的代表性實例包括但不限於流感病毒樣粒子或流感亞基疫苗以及針對人乳頭瘤病毒的疫苗。在另ー個實施方案中，本發明涉及上述方法，其中生物藥品由導入到重組杆狀病毒基因組中並在杆狀病毒啟動子、優選為PlO或多角體蛋白啟動子控制下的至少ー個基因編碼。本發明的另ー個目的提供了杆狀病毒-昆蟲細胞系統在生物藥品生產中的應用，其中所述杆狀病毒-昆蟲細胞系統包含用至少ー種重組杆狀病毒感染的生產生物藥品的昆蟲細胞，其中-所述或每個重組杆狀病毒包含編碼生物藥品或生物藥品的至少ー個組分的重組杆狀病毒基因組，並且-所述重組杆狀病毒基因組中所述杆狀病毒正確裝配所必需的至少ー個基因是有缺陷的，或者生產生物藥品的昆蟲細胞包含使杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少一個基因失活的表達控制系統。本發明的另ー個目的涉及包含杆狀病毒基因組的杆狀病毒質粒，其中所述基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因是有缺陷的，優選其中所述杆狀病毒基因組的vp80、vp39、p6. 9或vpl054有缺陷。在特定情況下，所述杆狀病毒質粒源於AcMNPV並缺少vp80 ORF。本發明的另ー個目的涉及重組AcMNPV杆狀病毒載體，其中所述杆狀病毒的基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因是有缺陷的，優選其中所述杆狀病毒基因組的vp80、vp39、vpl054或ρ6· 9有缺陷。在特定情況下，本發明涉及缺少vp80 ORF的重組AcMNPV杆狀病毒。本發明的另ー個目的是用上面提到的重組AcMNPV杆狀病毒感染的昆蟲細胞。
本發明的另ー個目的涉及昆蟲細胞，其包含表達特異性針對杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因、優選針對vp80、vp39、vpl054和/或p6. 9的dsRNA的構建物，所述構建物優選整合在昆蟲細胞的基因組中。本發明的另ー個目的涉及昆蟲細胞，其包含編碼杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達盒。具體來說，本發明涉及所述昆蟲細胞，其中由表達盒編碼的基因是vp80、vp39、vpl054 和/或 ρ6· 9。本發明的另ー個目的涉及用於生產杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的杆狀病毒的方法，所述方法包含用包含杆狀病毒基因組的杆狀病毒質粒轉染昆蟲細胞的步驟，所述昆蟲細胞包含編碼杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達盒，其中所述基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因是有缺陷的，優選其中所述杆狀病毒的基因組中νρ80、νρ39、ρ6. 9和/或νρ1054有缺陷，其中在所述杆狀病毒質粒中有缺陷的杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因是由包含在所述昆蟲細胞中的表達盒所編碼的基因。本發明涉及利用杆狀病毒系統在昆蟲細胞中生產生物藥品，但是不同時產生汙染性杆狀病毒毒粒。本發明的方法在很大程度上簡化了在昆蟲細胞中生產的生物藥品的下遊處理。因此，本發明涉及利用為了避免產生汙染性杆狀病毒毒粒而設計的杆狀病毒系統來生產生物藥品的方法。本發明的方法包含用編碼所述生物藥品的至少ー種杆狀病毒感染生產生物藥品的昆蟲細胞。杆狀病毒是有包膜的節肢動物DNA病毒，其兩個成員是公知的用於在細胞培養物中生產重組蛋白的表達載體。杆狀病毒具有環狀雙鏈基因組(80-200kbp)，其可以被エ程化以允許將大的基因組內含物遞送至特定細胞。用作載體的病毒一般是苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)多粒核多角體病毒(AcMNPV)或家香(Bombyx mori ) (Bm) NPV(Kato 等，2010)。杆狀病毒常用於感染昆蟲細胞以表達重組蛋白。具體來說，異源基因在昆蟲中的表達可以按照例如 U. S. 4，745，051、Friesen 等(1986)、EP 127，839、EP 155，476、Vlak 等(1988)、Miller 等(1988)、Carbonell 等(1988)、Maeda 等(1985)、Lebacq-Verheyden 等(1988)、Smith 等(1985)、Miyajima 等(1987)和 Martin 等(1988)中的描述來實現。可用於蛋白質生產的許多杆狀病毒毒株和變異體以及相應的許可性昆蟲宿主細胞，描述在Luckow等(1988)、Miller 等(1986)、Maeda 等(1985)和 McKenna (1989)中。
根據本發明，可以使用源於常用於蛋白質和生物藥品的重組表達的杆狀病毒的任何基因組。例如，杆狀病毒基因組可以源自於例如AcMNPV、BmNPV、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera) (HearNPV)或甜菜夜蛾(Spodoptera exigua) MNPV,優選源自於 AcMNPV 或BmNPV0具體來說，杆狀病毒基因組可以源自於AcMNPV克隆C6 (基因組序列=Genbank登記號 NC_001623. I - SEQ ID NO:I)。術語「生物藥品」打算是指使用生物技術生產的醫藥品。就此而言，生物藥品可以對應於重組生產的藥物,例如重組蛋白，尤其是重組激素或用作疫苗的重組蛋白、病毒例如治療性重組AAV或用於基因治療的其他病毒載體，以及病毒樣粒子(或VLP)。這樣的生物藥品打算給藥於需要的對象，用於在所述對象中預防性或治癒性治療疾病狀況，所述對象可以是人類或動物源的。生物藥品可以對應於單鏈蛋白或肽，例如在治療性重組蛋白的情況下，或者可以是複合體結構例如病毒或病毒樣粒子。在後兩種情況下，複合體的組分可以從各攜帶複合體結構的至少ー種組分的幾種重組杆狀病毒來表達，或者從其基因組已通過插入編碼複合 體的所有組分的序列進行了遺傳修飾的單ー杆狀病毒來表達。例如，為了生產重組AAV，可以使用包含三種杆狀病毒的系統編碼AAV Rep蛋白的杆狀病毒，編碼AAV Cap蛋白的杆狀病毒、和編碼在兩個AAV ITR之間包含治療基因的AAV-ITR基因組的杆狀病毒。現在也有包含兩種杆狀病毒的系統，其中編碼AAV Rep蛋白和AAV Cap蛋白的DNA序列由一個杆狀病毒提供。在本發明的優選實施方案中，編碼生物藥品的異源基因被置於杆狀病毒啟動子的控制之下。例如，異源基因被置於多角體蛋白或Pio啟動子或常用於在昆蟲細胞中進行表達的任何其他杆狀病毒啟動子(例如ie_l、p6. 9、gp64或Orchyia pseudotsugataCOp)MNPVie-2啟動子)的控制之下。在本發明的優選實施方案中，杆狀病毒啟動子選自極晩期表達啟動子，例如選自P10和多角體蛋白啟動子，優選在多角體蛋白啟動子的控制之下。在本發明的方法中，在上述方法中利用的重組杆狀病毒的基因組缺乏杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因，或者所述基因的表達被阻止。本發明人已表明，這些基因的缺失或失活導致杆狀病毒的兩種形式，即芽生型毒粒和/或包埋型毒粒的減少或甚至完全不存在。「杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因」是其在生產杆狀病毒的細胞中的缺陷或失活對於從所述細胞生產的BV和ODV的數量有負面影響的基因。這樣的基因可以如本文下面的實施例中所提供的來鑑定。具體來說，人們可以使用特異性針對特定杆狀病毒基因的雙鏈RNA，通過例如檢測杆狀病毒基因組中存在的報告基因在細胞培養物中的表達來評估缺乏所述特定基因對BV和ODV生產的影響，並因此確定杆狀病毒(單感染表型)的擴散或不存在擴散。或者，可以在對BV生產進行取樣時通過培養基中杆狀病毒結構蛋白或基因組序列的存在來檢測杆狀病毒毒粒。這兩種毒粒類型都可以通過電子顯微術來檢測。在本發明的優選實施方案中，杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因選自vp80、 vp39、vpl054和ρ6· 9。更優選，基因選自νρ80和νρ39,所述基因優選為νρ80。本發明提供了杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的失活。為此目的可以利用幾種策略，特別是突變，例如通過在重組杆狀病毒基因組中缺失所選基因；或者通過在打算用杆狀病毒感染的生產生物藥品的昆蟲細胞中提供的表達控制系統降低所選基因的表達。優選，表達控制系統包括通過RNA幹擾來下調由所選基因編碼的蛋白的表達。在本發明的一個實施方案中，在本發明的方法中利用的所述至少一種杆狀病毒的基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷，特別是編碼vp80、vp39、vp 1054和/或ρ6· 9、優選為νρ80和/或νρ39、更優選為νρ80的基因有缺陷。更具體來說，所述基因組源自於AcMNPV，更具體來說源自於AcMNPV克隆C6基因組序列(Genbank登記號NC_001623. I-SEQ ID NO: I)。因此，一方面，本發明提供了如上說明的方法，其中杆狀病毒基因組編碼vp80、vp39、vpl054和/或ρ6· 9、優選νρ80和/或νρ39、更優選νρ80的基因有缺陷的AcMNPV基因組，特別是AcMNPV克隆C6基因組。正如本技術領域中公知並且在Genbank登記號NC 001623. I中指定的，這些基因的位置按照在AcMNPV克隆C6基因組(SPSEQ ID NO: I 中):vp80 為 89564-91639 位；vp39 (互補序列)為 75534-76577 位；vpl054 為45222-46319 位；p6. 9 (互補序列)為 86712-86879 位。應該指出，在生物藥品是包含各自由不同杆狀病毒編碼的各種不同亞基的複合體產物的情況下，所有被利用的重組杆狀病毒的基因組中所選的必需基因有缺陷，以便避免 ー個基因組被另ー個基因組互補。換句話說，當使用幾種杆狀病毒感染同一生產生物藥品的昆蟲細胞時，這些杆狀病毒的每ー種中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的相同基因是有缺陷的。根據本發明，可以通過對基因進行突變以使所述基因有缺陷。杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的突變是導致完全缺乏有功能的必需基因產物的所述基因改變。因此，所述突變可以引起在從杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因所轉錄的mRNA的開放閱讀框中引入ー個或幾個終止密碼子，或者可以相當於杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的全部或部分缺失。杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因，可以通過在野生型基因的全部或部分序列中(例如在Genbank登記號NC_001623. I中提供的源自於AcMNPV的基因組的序列中)利用核苷酸取代、插入或缺失來進行突變。突變可以相當於基因的完全缺失，或所述基因的僅僅一部分缺失。例如，人們可以缺失杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的至少50%、更優選至少60%、更優選至少70%、更優選至少80%、更加優選至少90%。突變的杆狀病毒基因組可以使用本技術領域中公知的標準方法例如位點定向誘變(參見例如 Sambrook 等(1989))和 Lambda red 重組(Datsenko & Wanner, 2000)來產生。具體來說，可以如下面的實施例中所提供的來缺失杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因。概括來說，人們可以利用Suzuki等(2005)描述的突變的IoxP位點，用側翼帶有突變的LoxP位點的報告基因通過重組來全部或部分替換杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因。然後利用使用Cre重組酶的重組來切除報告基因(例如編碼氯黴素こ醯轉移酶的基因I cat))。該實施方案在下面的實施例中進行說明，並對其基因組已通過在AcMNPV基因組中缺失2074-bp的vp80 ORF片段進行修飾的杆狀病毒進行詳細描述。該具體的基因組是本發明的一部分，但是作為本發明的突變杆狀病毒基因組的非限制性實例提供。應該指出，杆狀病毒基因組的重組工程可以弓I起幾個序列例如克隆位點或重組位點(例如用Cre重組酶重組後ー個殘留的LoxP位點)的插入。這是無關緊要的，只要得到的基因組被製造成杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所選基因有缺陷即可。在其中所述至少一種杆狀病毒的基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的這個實施方案中，生產生物藥品的細胞的初始感染所需的重組芽生杆狀病毒粒子的產生，需要利用拯救缺陷基因的特殊細胞，即這些生產杆狀病毒的細胞表達所選基因。換句話說，生產杆狀病毒的細胞表達在杆狀病毒基因組中有缺陷的杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的互補拷貝。例如，可以建立組成型生產杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的產物的Sf9來源的細胞系。該重組細胞系被用於生產杆狀病毒毒種儲用物，而常規昆蟲細胞系如Sf9、Sf21或High-five細胞系可以用產生的杆狀病毒進行感染，用於生物藥品的異源表達。因此，本發明還涉及被修飾以表達杆狀病毒正確裝配所必需的基因的昆蟲細胞，所述基因在用於生產生物藥品的如上說明的杆狀病毒中被突變。這種用於生產在本發明的方法中利用的突變杆狀病毒載體的細胞系，被稱為「生產杆狀病毒的細胞」。當杆狀病毒基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷吋，生產杆狀病毒的昆蟲細胞必須提供並表達所述基因以便互補所述缺陷並產生感染性杆狀病毒。在特定實施方案中，通過用編碼杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因的表達盒進行轉染，對用於生產杆狀病毒的昆蟲細胞進行修飾。在實施方案中，所述表達盒被整合在所述細胞的基因組中。人們也可以使用用至少ー個包含所述表達盒的質粒瞬時轉染的昆蟲細胞。術語「表達盒」是指包含目標基因編碼序列與表達控制序列功能性連接的構建物。這樣的表達盒可以是包含處於在所選昆蟲細胞中有功能的啟動子的控制之下的杆狀病毒毒 粒正確裝配所必需的基因的ORF的質粒，但是不含待互補的杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因和任選的允許所述基因表達的啟動子序列之外的其他杆狀病毒基因組序列(具體來說，表達盒不是杆狀病毒質粒或任何其他杆狀病毒完整基因組)。示例性表達控制序列可以在啟動子、增強子、絕緣子等中選擇。在一個實施方案中，補償基因源自於其中已造成杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷的杆狀病毒的基因組。在另ー個實施方案中，互補基因源自於與用於生產生物藥品的杆狀病毒基因組不同的杆狀病毒物種的基因組。例如，用於生產生物藥品的杆狀病毒可以源自於AcMNPV基因組，而導入到生產杆狀病毒的細胞中的互補基因源自於BmNPV或SeMNPV。更具體來說，杆狀病毒基因組可以被製造成vp80、vp39、vpl054和/或p6. 9有缺陷，並且生產杆狀病毒的細胞可以包含來自於能夠互補這些基因的BmNPV或SeMNPV的基因拷貝(例如如實施例中所提供，在AcMNPV基因組中缺失了p6. 9，而生產杆狀病毒的細胞提供了 SeMNPV p6. 9基因的拯救拷貝)。因此，本發明還提供了用於生產杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的杆狀病毒的方法，所述方法包括用包含杆狀病毒基因組的杆狀病毒質粒來轉染包含編碼杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達盒的昆蟲細胞的步驟，其中所述基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷，優選其中所述杆狀病毒的基因組中vp80或vp39、p6. 9和/或vpl054有缺陷,其中在所述杆狀病毒質粒中有缺陷的杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因，是由在所述昆蟲細胞中包含的表達盒編碼的基因。根據這種方法，在杆狀病毒基因組中有缺陷的基因由在昆蟲細胞中表達的基因來互補。將用杆狀病毒質粒轉染的細胞維持在使杆狀病毒毒粒得以產生的條件下。然後收集這些產生的杆狀病毒毒粒，其包含其中缺少了杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因的基因組，以備它們後續用於感染生產生物藥品的昆蟲細胞，以生產生物藥品。在杆狀病毒的基因組中杆狀病毒毒粒裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的實施方案中，生產生物藥品的昆蟲細胞必須不能互補所述基因的缺陷。否則該缺陷將被生產生物藥品的細胞拯救，並且可能產生BV和ODV。杆狀病毒正確裝配所必需的基因的存在或不存在，可以例如通過用特異性針對所述基因的PCR來檢查所述細胞或通過檢測該基因的蛋白產物(例如通過用特異性針對所述基因產物的抗體進行western印跡分析)來監測。打算用於感染細胞的所利用的杆狀病毒基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因已被造成缺陷，而所述細胞仍表達所述基因的功能產物，這樣的細胞決不能用作生物藥品生產細胞。在本發明的另ー個實施方案中，杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達受到 表達控制系統的控制。術語「表達控制系統」被定義為生產杆狀病毒的昆蟲細胞系統/生產生物藥品的細胞系統的修飾和/或病毒基因組的另一種適應，其引起杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的特異性調控。該系統可以是允許所述必需基因如期啟動或關閉的誘導型表達系統(例如Tet-OruTet-Off、基於蛻皮激素的系統(Dai等，2005)或含有杆狀病毒同源區(hr)的元件例如Aslanidi等，(2009)所描述的hr2系統)、表達RNA幹擾的構建物或它們的組合。在特定實施方案中，杆狀病毒正確裝配所必需的基因的表達通過RNA介導的沉默或RNA幹擾來失活(Salem & Maruniak, 2007,Kanginakudru等，2007)。優選，通過用編碼基因特異性雙鏈RNA (dsRNA)的構建物穩定轉化細胞來沉默杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達，建立了昆蟲細胞來源的細胞系，特別是Sf9來源的細胞系。這種表達dsRNA的細胞系在用攜帯生物藥品的編碼基因的重組杆狀病毒感染後，被用於表達所述生物藥品。在該實施方案中，可以使用常規的Sf9、Sf21或High-Five細胞系(即細胞中不需要基因的互補拷貝)來生產重組杆狀病毒毒種儲用物，因為在這種情況下杆狀病毒基因組包含杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的野生型基因。在本發明的還ー個實施方案中，將杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因置於誘導型啟動子的控制之下，允許在受控條件下表達或阻遏所述基因。在優選實施方案中，在本發明的方法中產生的杆狀病毒毒粒的數量，與原本使用包含杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所有基因的杆狀病毒基因組時由生產生物藥品的細胞所產生的杆狀病毒的數量相比，減少了至少50%。更優選，杆狀病毒毒粒的數量與野生型杆狀病毒基因組相比減少了至少60%、至少70%、至少80%、至少90%，最優選至少95%。如上所討論的，使用在現有技術中用於生產生物藥品的昆蟲細胞/杆狀病毒系統，其特徵為與生物藥品並行地共同產生大量重組杆狀病毒(並且可以超過IO8 pfu/ml),需要仔細開發和優化的下遊處理方案來失活和消除這種杆狀病毒汙染。可以通過增添引起汙染性杆狀病毒的脂質層解體的去汙劑的步驟，例如用於疫苗目的的病毒樣粒子的純化(豬細小病毒-VLP (Maranga等，(2002))或輪狀病毒-VLP (Mellado等，(2008))或不同AAV血清型的純化(Smith et al. 2009)的步驟來進行失活。已經使用了其他有效的分離步驟離心(Wang等，(2000) ；Maranga等，(2002)；Mellado等，(2008))、微過濾(Tellez，(2005))、杆狀病毒蛋白的負消除(例如Mellado等(2008))或正向親和層析(保留/捕獲生物藥品——汙染性蛋白通流，例如通過伴刀豆球蛋白A層析捕獲輪狀病毒的vp7蛋白(Mellado等(2008)),通過固定化的金屬離子親和層析捕獲免疫原性嵌合rVP2H傳染性囊病病毒粒子(Wang等，(2000))或通過使用駱駝抗體的免疫親和層析捕獲不同AAV血清型(Smith等，2009)。具體來說，由於使用高特異性免疫配體，利用免疫親和性允許將待純化的生物藥品(例如特異性AAV)與任何汙染物完全分離開，或者在杆狀病毒系統的情況下，與由於杆狀病毒與生物藥品平行地同時生產所引起的杆狀病毒的大量汙染完全分尚開。這些參考文獻非常清楚地顯示需要這些不同處理步驟來失活和消除殘留的杆狀病毒汙染物，因為沒有這些步驟，生物藥品仍然被各種杆狀病毒蛋白顯著汙染，並且不能用於臨床目的。本發明的方法允許汙染性杆狀病毒毒粒的數量顯著減少或者甚至完全不存在。結果，為了獲得用於臨床目的的生物藥品所必需的純化步驟數量減少(或者如果不產生杆狀病毒毒粒的話，甚至不需純化步驟)。因此，由於通過使用本發明的方法，極大降低了對消除 殘留杆狀病毒毒粒的需要，簡化了生物藥品的生產和純化方案。在仍將使用簡化的純化方案的情況下，專業技術人員可以選擇至少ー種上面指定的方法和方案來獲得純化的生物藥品O優選，所選的必需基因是與原始杆狀病毒載體相比，其失活不影響杆狀病毒極晚期基因表達的基因。在AcMNPV基因組(和其他α-杆狀病毒)中，plO和多角體蛋白啟動子是極晚期表達啟動子，並且應該指出，在杆狀病毒/昆蟲細胞生產系統中，異源基因最通常被插入到這些非常強的啟動子的控制之下，以允許表達非常大量的重組蛋白。因此，不影響極晚期基因表達的杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的失活是優選的。術語「不影響極晚期基因表達」是指下述事實，即來自於按照本發明修飾的杆狀病毒基因組中包含的極晚期杆狀病毒啟動子的重組蛋白表達水平，與從未修飾的基因組獲得的水平相比，為至少70%、更優選高於80%、更優選高於90%。應該提到的是，在本發明的方法中，來自於極晚期杆狀病毒啟動子的生物藥品表達水平甚至可能比使用未修飾載體獲得的水平高100%。在本發明者所測試的基因中，νρ80基因是特別優選的，因為它的缺失不影響極晚期表達，同時它完全阻止了 BV的生產，並導致ODV的前體——細胞內核衣殼的數量顯著降低。可以通過將報告基因例如編碼GFP的基因、特別是egfp或螢光素酶基因置於野生型AcMNPV載體中和必需基因已被失活的突變體AcMNPV基因組中的多角體蛋白或plO啟動子的控制之下，並通過比較來自這兩種基因組的報告基因產物的表達，來評估極晩期表達。優選，當從處於PlO或多角體蛋白基因啟動子控制之下的報告基因測量時，來自帶有突變的杆狀病毒骨架的載體的極晚期表達，為使用野生型AcMNPV載體獲得的表達水平的至少60%，優選高於80%，更優選高於90%。本發明還涉及用於篩選杆狀病毒基因的方法，所述杆狀病毒基因的失活可用於在如上說明的昆蟲細胞-杆狀病毒系統中生產不含汙染性杆狀病毒毒粒的生物藥品，所述方法包含a)提供含有杆狀病毒基因組的細胞的細胞培養物；b)將所述細胞培養物與用於失活所述杆狀病毒基因組的至少ー個被測杆狀病毒基因的手段相接觸，例如與RNA幹擾相接觸；以及c)測試來自所述細胞培養物的毒粒形成，與來自未與所述手段接觸的細胞培養物的毒粒形成進行比較；其中如果被測基因的失活引起杆狀病毒毒粒形成的減少，則所述被測基因被選為可用於生產生物藥品。在特定實施方案中，用於本發明的篩選的方法還包含步驟d):測試來自與所述手段接觸的細胞培養物的極晚期基因表達，與來自未接觸所述手段的細胞培養物的極晚期基因表達進行比較；其中如果被測基因的失活引起杆狀病毒毒粒形成的減少並且如果被測基因不影響來自所述杆狀病毒基因組的極晩期基因表達，則所述被測基因被選為可用於生產生物藥品O本發明還涉及用於篩選杆狀病毒基因的方法，所述杆狀病毒基因的失活可用於在如上說明的昆蟲細胞-杆狀病毒系統中生產不含汙染性杆狀病毒毒粒的生物藥品，所述方法包含-失活杆狀病毒基因組的至少ー個被測基因(例如通過在所述基因組中缺失所述 被測基因)；-如上所說明來評估來自於所述杆狀病毒基因組的杆狀病毒的極晚期基因表達；-確定來自於含有所述杆狀病毒基因組的細胞的杆狀病毒毒粒生產；其中如果基因的失活-引起杆狀病毒毒粒生產的減少，並且-不影響如上說明的來自於所述杆狀病毒基因組的極晩期基因表達，則所述基因被選為可用於生產生物藥品。在用於篩選其失活可用於生產生物藥品的杆狀病毒基因的方法的特定實施方案中，被測基因的失活使用特異性針對所述被測基因的dsRNA來執行。具體來說，候選杆狀病毒基因可以通過用RNA幹擾擊倒其表達以測試其在毒粒形成中的作用來進行鑑定。現在將伴隨下面的實施例對本發明進行說明，所述實施例僅僅被提供為本發明的非限制性示例實施方案。


圖I. dsRNA介導的基因沉默篩選。將昆蟲Sf9細胞在28°C下接種於24孔組織培養板(2X105細胞/孔)中的Iml Sf-900II SFM培養基中。兩小時後，去除培養基，並將細胞在標準條件下用帶有在多角體蛋白啟動子控制下的egfp基因的重組杆狀病毒(AcMNPV-EGFP)感染。(A)使用螢光顯微術確定極晚期基因表達水平。將細胞以moi=iotcid5(i單位/細胞進行感染，並在感染後(P. 1. )1小時用針對vpl054、vp39、vp80、dbp和ec_27的基因特異性dsRNA進行轉染。通過48h p. i.時的EGFP特異性螢光來檢查極晚期基因表達水平。使用特異性針對egfp和cat序列的dsRNA作為RNAi對照。(B)通過基於免疫印跡的測定法測量極晚期基因表達水平。將細胞用AcMNPV-EGFP以MOI=I進行感染，並且也在Ih p. i.時用基因特異性dsRNA進行轉染。在48h p. i.時，使用兔抗EGFP多克隆抗血清來分析極晚期基因表達水平。使用抗vp39和抗α-微管蛋白抗體作為內部対照。(C)在dsRNA處理過的細胞中滴定和檢測產生的芽生型毒粒。在P. i. 36小時收穫芽生型毒粒，並用於終點稀釋測定法以測量感染性毒粒的滴度或用於基於PCR的檢測以檢查病毒粒子的存在。(D) vp39和vp80下調的細胞中包埋型毒粒和杆狀結構的存在。將細胞在p. i. 36小時收穫，裂解，並將細胞裂解液超速離心通過ー層40%的蔗糖溶液(45，OOOrpm，I小吋，Beckman SW55)。將沉澱物重懸浮在去礦質水中，並通過負染色電子顯微術進行分析。標尺條表示lOOnm。圖2. AcMNPV vp80_null杆狀病毒質粒的構建。(A)在大腸桿菌中通過同源重組構建含有AcMNPV vp80開放閱讀框完全缺失的vp80_null杆狀病毒質粒的策略。第一歩，將包含vp80 ORF的2074-bp片段缺失，並用含有側翼帶有修飾的IoxP (LE和RE)位點的氯黴素(cat)抗性基因的序列盒代替。隨後，使用Cre/loxP重組系統從杆狀病毒質粒序列中消除抗生素抗性基因(cat)。p48基因的啟動子序列和he65基因的聚腺苷化信號保持原封未動。在野生型基因座和兩個vp80敲除基因型的PCR分析中，使用由單側箭頭所指示的寡核苷酸對來驗證vp80 ORF的缺失和氯黴素抗性基因盒的正確插入/缺失。它們的名字按照核苷酸序列坐標來命名。用於cat基因盒擴增的引物被命名 為cat-F和cat-R。(B)基於PCR檢測原始 AcMNPV 杆狀病毒質粒(Ac_wt)、Ac-vp80null (+cat)和 Ac_vp80null (-cat)杆狀病毒質粒中vp80基因座中序列修飾的存在或不存在。上圖證實了使用引物對90292/90889和cat-F/cat-R的vp80基因缺失和cat盒插入vp80基因座。下圖顯示了使用89507/91713引物對,對vp80基因座中的正確重組過程的基於PCR的驗證。圖3.使用轉染-感染測定法測定AcMNPV-vp80敲除和修復的杆狀病毒質粒構建物的病毒複製能力。(A)轉座到多角體蛋白基因座中的表達盒的示意圖。製造了 4種修復構建物(由其天然啟動子驅動的vp80，由多角體蛋白啟動子驅動的vp80，N-端帶有FLAG標籤的vp80和C-端帶有FLAG標籤的vp80，後二者都由其天然啟動子表達)。用於轉染測定的杆狀病毒質粒基因組骨架在左側標出。使用野生型AcMNPV (bM0N14272)杆狀病毒質粒作為病毒複製的陽性對照。Ac-gp64null杆狀病毒質粒被用作陰性對照，代表了具有「單細胞感染」表型的原型杆狀病毒質粒。(B)時間過程螢光顯微術，其顯示了用標出的杆狀病毒質粒構建物轉染的Sf9細胞中感染的傳播。在轉染後的指定時間點通過EGFP檢測來檢查病毒感染的進展。在P. t. 120小時時，收集細胞培養上清液以啟動二次感染。(C)二次感染測定。在P. i. 72小時時檢測EGFP以檢測感染的進展。圖4.從轉染時間過程測定法產生的AcMNPV_vp80null修復的杆狀病毒質粒構建物的生長曲線。將Sf9細胞用5. Oyg來自每種修復杆狀病毒質粒的DNA進行轉染。(a)由其天然啟動子驅動的vp80, (b)由多角體蛋白啟動子驅動的vp80, (c)N-端帶有FLAG標籤的vp80和(d)C-端帶有FLAG標籤的vp80，後兩者從vp80啟動子表達。在轉染後指定時間點收穫細胞培養上清液，並通過TCID5tl終點稀釋測定法分析感染性芽生型病毒的生產。通過監測EGFP表達來確定感染力。點表示從三次獨立轉染得到的平均滴度，誤差條表示標準偏差。圖5. AcMNPV-vp80null突變體不能產生任何感染性/非感染性芽生型毒粒。將Sf9 細胞用 20 μ g 杆狀病韋質粒 DNA Ac- Δ vp80 (a)、Ac_wt (b)、Ac-Δ vp80_vp80 (C)、Ac- Δ νρ80-ρΗ-νρ80 (d)、Ac_ Δ vp80-FLAG_vp80 (e)或 Ac-Δ vp80-vp80_FLAG (f)獨立地進行轉染。P.t.5日時，將富含芽生型病毒的細胞培養上清液超速離心，並通過負染色電子顯微術觀察芽生型病毒(A)。標尺條表示200nm。並行地，也將收穫的芽生型毒粒在SDS-PAGE上分離、產生印跡並使用抗VP39抗體進行免疫檢測或用於基於PCR的檢測，以檢測病毒粒子的存在(B)。圖6· vp80基因無效的杆狀病毒質粒突變體形成少量核衣売，並且包埋型毒粒的生產不足。按照材料和方法中的描述將用Ac-Λ Vp80 (A至D)、Ac-AVp80-vp80 (E、F)或Ac-wt (G、H)轉染的Sf9細胞固定、染色、包埋並薄切片。(A)用Ac-vp80null杆狀病毒質粒突變體轉染的Sf9細胞的代表性概觀。(B)Ac-vp80null突變體在病毒發生基質中形成較少數量的核衣殼(C)，並且在被轉染細胞的環區中沒有包埋型毒粒(D)。另ー方面，修復杆狀病毒質粒構建物Ac- Δ vp80-vp80完全再生了病毒發生基質中大量核衣殼的形成(E)，並且在被轉染細胞的環區中正常外觀的包埋型毒粒(F)。用Ac-wt杆狀病毒質粒轉染的細胞的病毒發生基質(G)和環區(H)的代表性圖像。標尺條表示500nm。縮寫Nc，核衣売；匪，核膜；Nu，核；RZ，環區；Mi，線粒體；ODV，包埋型毒粒；VS，病毒發生基質。圖7.使用反式作用vp80基因對Ac_vp80null杆狀病毒質粒突變體進行功能互ネト。將Sf9細胞用pIZ-flag-vp80 (A)或pIZ (B)載體進行轉染，並進行基於博萊黴素(Zeocin)的篩選。轉染後3周，將多克隆博萊黴素抗性細胞群體接種到新的6孔板中，並用Ac-vp80null杆狀病毒質粒突變體進行轉染以檢查互補活性。在p. t. 72h和96h，通過EGFP特異性螢光監測病毒繁殖。在p. t. 120小吋，收集細胞培養上清液，以在未處理的(野生型)Sf9細胞中啟動二次感染(右圖)。在p. i. 72小時時檢測EGFP以指示感染的進展。在p. i. 120小時時檢測EGFP以指示感染的進展。圖8. AcMNPV vp39_null杆狀病毒質粒的構建。(A)在大腸桿菌中通過同源重組構建含有AcMNPV vp39開放閱讀框部分缺失的vp39-null杆狀病毒質粒的策略。第一歩，將vp39 ORF的498-bp的內部片段缺失，並用含有側翼帶有修飾的IoxP (LE和RE)位點的氯黴素(cat)抗性基因的序列盒代替。隨後，使用Cre/loxP重組系統從杆狀病毒質粒序列中消除cat基因。lef-4和cg-30基因的啟動子序列不受影響。箭頭指示在野生型基因座和兩個vp39敲除基因型的PCR分析中用於驗證vp39 ORF的部分缺失和cat基因盒的正確插入/缺失的寡核苷酸對的位置。引物名稱按照核苷酸序列坐標來命名。(B)基於PCR檢測Ac-wt、Ac_vp39null (+cat)和Ac_vp39null (-cat)杆狀病毒質粒的vp39基因座中序列修飾的存在或不存在。圖顯示了使用75834/76420引物對，對vp39基因座中的正確重組過程的基於PCR的驗證。圖9.使用轉染-感染測定法測定AcMNPV-vp39敲除和修復的杆狀病毒質粒構建物的病毒複製能力。(A)基於Tn7轉座到多角體蛋白基因座中的表達盒的示意圖。(I)從多角體蛋白啟動子表達的vp39，(2)都由其天然啟動子驅動的雙基因νρ39和lef_4，(3)都由多角體蛋白啟動子驅動的雙基因vp39和cg-30，以及最後(4)由多角體蛋白啟動子驅動的N-端帶有FLAG標籤的vp39與從其天然以及更上遊的多角體蛋白啟動子表達的cg_300RF的雙基因構建物。用於轉染測定的親本杆狀病毒質粒基因組骨架在左側標出。使用野生型AcMNPV (bM0N14272)杆狀病毒質粒作為病毒複製的陽性對照。(B)時間過程螢光顯微術，其顯示了用標出的杆狀病毒質粒構建物轉染的Sf9細胞中感染的傳播。在轉染後的指定時間通過EGFP檢測來檢查病毒的進展。在p. t. 168小時時，收集細胞培養上清液以啟動二次感染。(C) 二次感染測定法。在p. i. 72小時時進行EGFP檢測以測量感染的進展。圖10. AcMNPV vpl054_null杆狀病毒質粒的構建。(A)在大腸桿菌中通過同源重組構建含有AcMNPV vpl054開放閱讀框缺失的Vpl054_null杆狀病毒質粒的策略。從vpl054ORF的3』 -端起955-bp的序列缺失，並用側翼帶有修飾的IoxP (LE和RE)位點的cat序 列盒代替。同吋，導入了單個點突變，將第一個翻譯密碼子ATG — Met改變成ACG — Thr,以防止翻譯成C-端截短的VP1054蛋白。這也意味著Ief-IO的32號內部AAT密碼子被突變成AAC, 二者都編碼Asn。隨後,使用Cre/loxP重組系統消除cat基因。在杆狀病毒質粒構建物中vpl054/lef-10的啟動子序列不受影響。由於Ief-IO基因的聚腺苷化信號被去除，因此在Ief-10 ORF的3 』 -末端引入了帶有終止密碼子的新的合成poIy-A信號(TAATAAA)。箭頭表示在野生型基因座和兩個vpl054敲除基因型的PCR分析中用於驗證vpl054 ORF的缺失和cat基因盒的正確插入/缺失的寡核苷酸對的位置。(B)基於PCR檢測Ac-wt、Ac_vpl054null (+cat)和Ac_vpl054null (-cat)杆狀病韋質粒的vpl054基因座中序列修飾的存在或不存在。上圖顯示了使用引物對90292/90889和cat-F/cat-R證實vpl054基因的缺失和cat盒插入vpl054基因座中。下圖顯示了使用89507/91713引物對，對vpl054基因座中的正確重組過程的基於PCR的驗證。圖11.使用轉染-感染測定法測定AcMNPV-vpl054敲除和修復的杆狀病毒質粒構建物的病毒複製能力。(A)轉座到多角體蛋白基因座中的表達盒的示意圖。用於轉染測定法的杆狀病毒質粒基因組骨架在左側標出。製造了兩種Ac-Vpl054null衍生構建物第一種構建物只攜帶PlO啟動子控制下的egfp標記基因，第二種構建物攜帶由其天然啟 動子序列指導的egfp標記和交疊的lef-10/vpl054基因座兩者(d)。使用野生型AcMNPV(bM0N14272)杆狀病毒質粒作為病毒複製的陽性對照(a)。Ac_gp64null杆狀病毒質粒被用作陰性對照，代表了具有「單細胞感染」表型的原型杆狀病毒質粒(b)。(B)時間過程螢光顯微術，其顯示了用標出的杆狀病毒質粒構建物轉染的Sf9細胞中感染的傳播。在轉染後的指定時間通過EGFP檢測來檢查病毒感染的進展。在p. t. 120小時時，收集細胞培養上清液以啟動二次感染。(C) 二次感染測定法。在p. i. 72小時時進行EGFP檢測以指示感染的進展。圖12.AcMNPV p6. 9_null杆狀病毒質粒的構建。(A)在大腸桿菌中通過同源重組構建含有AcMNPV vp6. 9開放閱讀框完全缺失的vp6. 9-null杆狀病毒質粒的策略。將vp6. 90RF的164-bp的片段缺失，並用側翼帶有修飾的IoxP (LE和RE)位點的cat抗性基因代替。隨後，使用Cre/loxP重組從杆狀病毒質粒序列中消除cat基因。p6.9基因的啟動子序列保持不受影響，這是因為其序列與p40 ORF交疊。箭頭指示在野生型基因座和兩個vp6. 9敲除基因型的PCR分析中使用的引物對的位置。(B)基於PCR檢測Ac_wt、Ac_vp6. 9null (+cat)和Ac_vp6. 9null (-cat)杆狀病韋質粒的νρ6· 9基因座中序列修飾的存在或不存在。上圖顯示了使用引物對cat-F/cat-R, cat盒在νρ6. 9基因座中的插入。下圖顯示了使用89507/91713引物對，對νρ6. 9基因座中的正確重組過程進行的基於PCR的驗證。圖13.使用轉染-感染測定法測定AcMNPV_vp6. 9敲除和修復的杆狀病毒質粒構建物的病毒複製能力。(A)轉座到多角體蛋白基因座中的表達盒的示意圖。製造了兩種修復構建物(AcMNPV p6. 9和SeMNPV p6. 9基因，二者都由AcMNPV p6. 9啟動子驅動)。用於轉染測定的杆狀病毒質粒基因組骨架在左側標出。使用野生型AcMNPV (bM0N14272)杆狀病毒質粒作為病毒複製的陽性對照。Ac-gp64null杆狀病毒質粒被用作陰性對照，代表了具有「單細胞感染」表型的原型杆狀病毒質粒。(B)時間過程螢光顯微術，其顯示了用標出的杆狀病毒質粒構建物轉染的Sf9細胞中感染的傳播。在轉染後的指定時間通過EGFP檢測來檢查病毒感染的進展。在P. t. 120小時時，收集細胞培養上清液以啟動二次感染。(C)二次感染測定法。在P. i. 72小時時進行EGFP檢測以指示感染的進展。(D) AcMNPV_p6. 9null (a)、用 AcMNPV ρ6· 9 拯救的 AcMNPV-p6. 9null (b)和用 SeMNPV ρ6· 9 拯救的 AcMNPV-p6. 9null(c)構建物與野生型(Ac-wt)杆狀病毒質粒的生長曲線的比較。將Sf9細胞用5. Ομ g來自每種杆狀病毒質粒的DNA進行轉染，在轉染後指定時間點收穫細胞培養上清液，並通過TCID50終點稀釋測定法分析感染性芽生型病毒的產生。通過監測EGFP表達來確定感染性。點表示從三次獨立轉染產生的平均滴度，誤差條表示標準偏差。圖14 :細胞、BV 和 ODV 中 Flag:vp80 的 Western 印跡分析感染的昆蟲細胞中vp80表達的時間過程。將Sf9細胞用Ac-Δ vp80_Flag · vp80修復病毒進行感染，並在指定時間點收穫。從P. i. 12h至72h,通過western印跡分析可以檢測到作為約95kDa條帶的Flag *VP80。此外，從p. i. 48h至72h，積累了 80kDa的第二個Flag ·νΡ80特異性條帶。使用微管蛋白作為內部上樣對照。(A)VP80與BV的核衣殼級分結合。P. i.兩日，通過在蔗糖梯度中等速超離心來純化BV，並通過基於Nonidet-P40的提取分離成核衣殼(Ne)和包膜(Env)級分。在Ne級分中檢測到作為雙帶的Flag ·νΡ80，其分子量 介於在被感染的Sf9細胞中檢測到的兩種變體(80-kDa和95-kDa)之間(上圖)。正確分離成Ne和Env級分通過抗VP39和抗GP64抗體來控制(下圖)。(B) VP80也是ODV-核衣殼的結構組分。將 Sf9 細胞用 Ac-Λ Vp80-Flag ·νρ80 (Μ0Ι=25)和 AcMNPV 毒株 Ε2 (M0I=5)病毒共感染。P. i. 5天,ODV從包涵體釋放,隨後分離成核衣殼(Ne)和包膜(Env)級分。Western印跡分析顯示VP80作為 80kDa的單一條帶存在於DV Ne級分中。正確分級成Ne和Env級分使用抗PIF-I抗血清來控制(下圖)。圖15.通過反式互補對BV生產缺陷的Ac_vp80null杆狀病毒質粒進行功能互補。(A)通過Western分析在轉基因的Sf9衍生細胞系(Sf9_vp80)中檢測FLAG:VP80。使用微管蛋白作為內部上樣對照。(B)在用Ac-Avp80桿狀病毒質粒轉染(i)或感染(ii)的Sf9-vp80細胞中，感染後的時間過程螢光顯微術(EGFP)(a，b)。在p. t. 120小時時，收集細胞培養上清液以在Sf9-vp80 (a)或Sf9 (b)細胞中啟動二次感染(右側的圖)。作為陰性對照，將Ac_AVp80在Sf9細胞中繁殖(C)，使用在Sf9細胞中繁殖的Ac_wt (d)作為陽性對照。(C)感染性BV毒粒的比較性釋放。將Sf9-vp80細胞用Ac-AVp80桿狀病毒質粒轉染，並將Sf9細胞用Ac-AvpSO (陰性對照)或Ac-wt (陽性對照)杆狀病毒質粒進行轉染。在P.t.6日通過終點稀釋法對細胞培養上清液中的BV進行定量。顯示了三次獨立測定的代表性結果，誤差條表示SD。圖16.通過反式互補的複製缺陷型杆狀病毒毒種分析外來基因表達。將Sf9細胞用 Ac-wt、Ac-Avp80_Flag:vp80 或 Ac_Avp80 毒種(M0I=10TCID5Q 單位 / 細胞)感染，所有病毒都從極晚期PlO啟動子表達egfp。(A)在48h p. i.，通過Western印跡分析EGFP、Flag:VP80和GP64的存在。使用肌動蛋白作為內部上樣對照。(B)在72h p. i.時表達EGFP的細胞的顯微照片(上)，以及在P. i 48和72h通過ELISA測量的EGFP的相對量(下)。(C)p. i. 72h時表達EGFP的細胞的顯微照片(上)，以及通過TCID5。滴定來分析BV釋放以測試回復體基因型(下)。顯示了三次獨立測定的結果，並帶有誤差條(SD) (B和C)。圖17.為生產不含汙染性杆狀病毒毒粒的生物藥品設計的新的杆狀病毒-昆蟲細胞技術方法。(A)昆蟲細胞的工程化，以表達必需病毒因子(vp80)來補償病毒中的vp80突變。轉基因Sf9細胞編碼vp800RF和抗性基因，允許基於抗生素篩選轉基因細胞。(B)BV和ODV毒粒生產缺陷的Ac- Δ vp80桿狀病毒質粒的產生。杆狀病毒質粒缺少整個vp80ORF。(C)在工程化Sf-vp80細胞中通過反式互補產生杆狀病毒毒種儲用物。將Sf9-vp80細胞用Ac-Λ vp80桿狀病毒質粒轉染以產生反式互補的病毒後代。在芽生型病毒繁殖後，在Sf9-vp80包裝細胞中生產高滴度病毒儲用物。(D)基於杆狀病毒的重組蛋白表達。將常規Sf9細胞用反式互補的芽生型病毒後代進行感染。從極晚期杆狀病毒啟動子(plO或polh)表達重組蛋白，其允許高水平的表達，同時不產生汙染的杆狀病毒毒粒(BV/0DV)。
實施例實施例I材料與方法昆蟲細胞和病毒將草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf9)細胞在標準條件下維持在 SF900-II無血清培養基(Invitrogen)中。帶有在極晚期多角體蛋白啟動子控制之下轉座到多角體蛋白基因座中的的egfp報告基因的重組杆狀病毒質粒(bacmic)來源的AcMNPV病毒(AcMNPV-EGFP)，根據Plman等(2006)獲得。將病毒在Sf9細胞中進行繁殖，並通過終點稀釋測定法測定其滴度。dsRNA的體外合成用於合成dsRNA的方法與Ramadan等(2007)描述的方法類似，進行了少量修改。所有DNA模板使用具有與T7RNA聚合酶啟動子序列5』-gcttctaatacgactcactataggg_3』同源的25個核苷酸突出部分的引物，通進行PCR擴增。下面指明的引物序列提供在表I中。使用了下列引物來擴增這些基因引物vp39-F和vp39-R用於vp39 ;引物45510和46235用於 vpl054 ;引物 90292 和 90889 用於 vp80 ;引物 ec-27-F 和 ec-27-R 用於 odv_ec27 ;引物dbp-F和dbp-R用於dbp。為了測試RNAi研究的效率，我們使用弓I物gfp-F和gfp-R製造了針對egfp的dsRNA，並且為了獲得陰性對照，我們使用引物cat-F和cat_R製造了用於氯黴素こ醯轉移酶(cat)基因的dsRNA。使用Illustra GFX PCR DNA 和 Gel Band 純化試劑盒(GEHealthcare, Buckinghamshire, UK)純化 PCR 產物，並將其用作模板，使用 T7RiboMAX Express RNAi系統(Promega, Madison, WI, USA),按照製造商的方案進行dsRNA體外合成。簡單來說，使用約I μ g純化的DNA模板，在37°C下進行4小時的RNA合成。在合成後，通過用DNase消化來除去DNA模板。通過在70°C溫育10分鐘，然後緩慢冷卻至室溫( 30min)，使互補的RNA鏈退火。通過RNase A處理(30min，37°C )來降解未退火的(單鏈)RNA分子。最後,將dsRNA用異丙醇沉澱,重懸浮在DEPC處理過的無菌水中至終濃度為0. 5-lmg/ml,並通過瓊脂糖凝膠電泳檢查其純度和完整性。將dsRNA以40 μ I的等份保持在-80°C下。在即將轉染之前，將dsRNA在冰上融化。杆狀病毒感染的昆蟲細胞中的RNAi程序在28°C下，將Sf9細胞接種到24孔組織培養板(2X105細胞/孔)中的ImlSf900-11無血清培養基中。2小時後，除去培養基，並將細胞在標準條件下用重組杆狀病毒AcMNPV-EGFP以IOTCID50單位/細胞的感染複數(Μ0Ι)感染Ih0感染後(p. i. ) I小時，通過基於Cellfectin (Invitrogen)的轉染,在Grace無血清培養基中將dsRNA (20 μ g/孔)導入到細胞中。4h後，將轉染混合物用Sf900-II無血清培養基替換。感染後將細胞在28°C下溫育總共48h,然後通過以IOOOXg離心5分鐘進行收穫,用於Western印跡和電子顯微術分析。但是，在P. i. 36h收穫五分之一的培養基，並用於通過終點稀釋測定法滴定芽生型毒粒或用於病毒DNA的基於PCR的檢測。在所有實驗中，將對應於cat基因的dsRNA作為陰性對照。另ー方面，使用egfp基因特異性dsRNA作為用於RNAi程序的陽性對照。SDS-聚丙烯醯胺電泳和western印跡分析為了進行免疫檢測，將Sf9細胞在pH 6.8的125禮Tris - HC1、2%十二烷基硫酸鈉(SDS)、5%2-巰基乙醇、10%甘油、O. 001%溴酚藍中，在95°C下破碎IOmin。將蛋白在10%SDS-聚丙烯醯胺凝膠中分離,然後通過半乾電印跡轉移到Immobilon-P膜(Millipore)上。將膜在含有2%脫脂奶粉的IXPBS中阻斷30分鐘，然後在室溫下與兔多克隆抗GFP抗血清(Molecular Probes)、兔多克隆抗VP39抗血清或單克隆抗α-微管蛋白抗體(Sigma-Aldrich)溫育I小時，所有抗血清和抗體都在含有O. 2%奶粉的IXPBS中1/2000 稀釋。在IXPBS中洗滌(3Χ IOmin)後，將膜與鹼性磷酸酶偶聯的山羊抗兔IgG或兔抗小鼠IgG抗體(Sigma)的1/4000稀釋液進行溫育。在AP緩衝液(IOOmM Tris-Cl [pH 9. 5]，IOOmM NaCl, 5mM MgCl2)中進行最終洗滌(3X IOmin)後，使用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽硝基四氮唑藍(NBTV5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP) (Bio-Rad)，按照製造商的說明書對印跡進行顯色。病毒基因組DNA的製備及其基於PCR的檢測在p. i.36h收集200微升細胞培養基並用於製備病毒DNA。通過以IOOOXg離心5分鐘，從樣品中除去細胞和細胞碎片。將含有芽生型毒粒的上清液定量轉移到新的無菌管中，並以12000Xg再次離心90分鐘。將沉澱的BV重懸浮在200 μ I含蛋白酶K (540 μ g/ml)的TE緩衝液(IOmM Tris-HCl [pH 7. 5]，ImM EDTA)中，並在55°C下溫育2h。相繼進行苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)和氯仿抽提。通過加入等量異丙醇使DNA沉澱，並將沉澱物用70%こ醇清洗。將DNA沉澱物溶解在15 μ I無菌水中，並將2 μ I最終的DNA溶液應用於使用上面提到的引物對νρ39基因序列進行的基於PCR的檢測。所有PCR反應在25 μ I體積中進行，其中包括2 μ I DNA, 200 μ M dNTP，IOpmol 每種引物，I. 5mM MgCl2 和 I. 5U GoTaq DNA聚合酶(Promega)。擴增條件如下初始變性在94°C進行2min，隨後進行30個循環的變性(94°C下30s)、引物退火(60°C下20s)和引物延伸(72°C下25s)。終結循環是72。。下7min。在所有PCR擴增中包含陰性對照以測試試劑中的汙染物。將等份(3. 0μ I)的PCR產物在I. 2% (w:v)瓊脂糖凝膠中使用IXTAE緩衝液通過電泳進行分析,使用溴化こ錠(0. 5 μ g/ml)進行染色。無抗生素抗性基因的AcMNPV vp80_null杆狀病毒質粒的產生為了確定VP80蛋白在病毒後代產生中是否具有必不可少的作用，我們在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有vp80 ORF缺失的AcMNPV杆狀病毒質粒(源自於bM0N14272(來自Invitrogene))。為此，使用PCR引物vp80-K0_F和vp80_K0-R (參見表1)，從包含側翼帶有突變LoxP位點的cat基因的質粒擴增了側翼帶有突變LoxP位點的cat基因(Suzuki等，2005)。將得到的含有側翼帶有突變LoxP位點的cat基因並且在vp800RF的5』或3』鄰近區含有AcMNPV的 50-bp同源序列的PCR片段用DpnI處理，並進行凝膠純化以消除模板質粒。然後將PCR產物轉化到按照下述方式製備的含有bM0N14272 (Invitrogen)和產Lambda RED重組酶的質粒pKD46的DHlO β大腸桿菌細胞中(Datsenko & Wanner, 2000)。將轉化的DHlO β -bM0N14272/pKD46大腸桿菌細胞，在有卡那黴素(50 μ g/ml)、氨苄青黴素(100μ g/ml)和 L-阿拉伯糖(I. 5mg/ml)的 50_mlLB(2. 0% 蛋白腖，O. 5% 酵母提取物，85. 5mMNaCl，[pH 7. O])培養基中，在30°C下生長至OD6tltl為^ O. 6，然後通過標準程序製造電感受態。將電穿孔的細胞在3ml LB培養基中在37°C下溫育3h，並在含濃度為6. 5 μ g/ml的氯黴素的LB瓊脂上鋪板。在37°C溫育48-h後,將氯黴素抗性菌落在有34 μ g/ml氯黴素的新鮮LB瓊脂培養基上劃線。將板在37°C溫育過夜，挑選對氯黴素有抗性的菌落，以備通過PCR進ー步驗證相關基因型。使用引物90292和90889來證實vp80 ORF的不存在，並利用引物cat-F和cat-R來驗證杆狀病毒質粒中cat盒的存在(詳細序列在表I中)。為了從杆狀病毒質粒骨架上消除引入的抗生素抗性基因(cat)，使用了 Cre/LoxP重組酶系統。將從Jeanine Louwerse (LUMC Leiden,荷蘭)獲得的帶有Cre重組酶的質粒PCRE導入DH10b-bM0N14272-vp80null大腸桿菌細胞，隨後通過添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導CRE表達。簡單來說，將電穿孔的細胞在3ml LB培養基(2. 0%蛋白腖，O. 5%酵母提取物，85. 5mM NaCl, [pH 7. O])中在37°C下溫育3h，並在含50 μ g/ml卡那黴素、100 μ g/ml氨苄青黴素和2mM IPTG的LB瓊脂培養基上鋪板。在24_h溫育後,選擇對卡那黴素和 氨苄青黴素有抗性的菌落，通過PCR進ー步驗證所需基因型。在基於PCR的分析中，使用引物89507和91713 (表I)來驗證cat基因從杆狀病毒質粒骨架上的消除。陽性克隆也通過DNA測序來驗證。為了恢復轉座能力，將編碼轉座酶的輔助質粒pM0N7124 (Invitrogen)再引入到DHlO β -bM0N14272-vp80null大腸桿菌細胞中。最後，將egfp報告基因引入到vp80_null杆狀病毒質粒中以便於觀察它在昆蟲細胞中的行為。簡單來說，使用寡核苷酸gfp-Nhel-F和gfp-Sphl-R (表I)從質粒pEGFP-N3 (Clontech)通過PCR擴增egfp報告基因。使用CloneJET PCR克隆試劑盒(Fermentas)，按照製造商的方案將PCR產物克隆到質粒pjetl. 2/Blunt中。然後使用NheI和SphI將egfp ORF從無錯誤的pjetl. 2-egfp上切下，並亞克隆到Nhel/SphI消化的pFastBacDUAL (Invitrogen)中，以產生質粒pFB-egfp。按照Bac-to-Bac手冊■ (Invitrogen)中所描述的,將含有在極晚期plO啟動子的轉錄控制之下的egfp報告基因的表達盒從pFB-egfp轉座到vp80_null杆狀病毒質粒的多角體蛋白基因座中。在得到的基因組中，完整的vp80 ORF已被移除(參見圖2)。這對應於在SEQ ID NO: I中提供的AcMNPV克隆C6基因組中，從89564至91637位核苷酸的2074bp缺失。修復的vp80_null杆狀病毒質粒的構建為了製備vp80修復供體載體，我們通過移除多角體蛋白啟動子並將其用含有vp80啟動子區和vp800RF的片段代替,對質粒pFB-egfp (上面提到的)進行修飾。首先，使用引物pvp80-StuI-F和vp80-XbaI-R (表1)，從杆狀病毒質粒bM0N14272模板擴增了含有vp80啟動子和ORF序列兩者的2300-bp片段，並克隆到載體pjetl. 2/Blunt (Fermentas)中以形成pjetl. 2-pvp80-vp80o在DNA序列驗證後，通過Stul/Xbal雙消化將vp80盒從pjetl. 2-pvp80-vp80上切下，然後亞克隆到Bstll07I/XbaI消化並凝膠純化的pFB-egfp中，以產生供體質粒pFB-egfp-pvp80-vp80。平行地,構建其中vp800RF由極晚期多角體蛋白啟動子(polh)驅動的供體質粒pFB-egfp-polh-vp80。為此目的，使用引物vp80-SacI_F和vp80-XbaI-R (表I)擴增帶有vp800RF的2105-bp片段，並將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產生pjetl. 2-vp80。在最後步驟中，將vp800RF從pjetl. 2_vp80上切下(Sacl/Xbal)，並亞克隆到Sacl/Xbal消化的pFB-egfp中以產生pFB-egfp-polH_vp80。為了克服與不能獲得抗VP80抗體相關的問題，執行了 VP80的FLAG標籤裝飾(N-和C-端融合)以便於免疫檢測。N-端融合的FLAG-vp80序列通過雙步驟PCR策略、即所謂的融合PCR來產生。首先，使用弓I物pvp80-StuI-F和vp80_FLAG-Rl，從bM0N14272桿狀病毒質粒模板通過PCR擴增含有vp80啟動子和FLAG標籤的259_bp片段。在凝膠純化和DNA定量後，將259-bp片段在使用反向引物vp80-XbaI-R在bM0N14272桿狀病毒質粒模板上進行的第二步PCR擴增中用作正向引物。將最終的PCR產物(2324bp)克隆到載體pJet1. 2/Blunt(Fermentas)中以形成 pjetl. 2-pvp80-FLAG_vp80。DNA 序列驗證後，通過 Stul/Xbal雙消化將FLAG-vp80盒從pjetl. 2-pvp80-FLAG-vp80上切下，然後亞克隆到Bstll07I/XbaI消化並凝膠純化的pFB-egfp中，以產生供體質粒pFB-egfp-pvp80-FLAG_vp80。使用pvp80-StuI-F和vp80-FLAG-R從bM0N14272桿狀病毒質粒模板擴增C-端融合的vp80_FLAG
盒。將2324-bp片段克隆到pjetl. 2/Blunt中，然後以與上述構建物類似的方式轉移到pFB-egfp 中 ο按照Bac-to-Bac方案(Invitrogen),將所有產生的供體質粒的插入片段轉座到vp80-null杆狀病毒質粒中。polh基因座中轉座陽性構建物的篩選通過基於三重PCR的測定法來進行，在所述測定法中使用了 M13正向和反向引物以及慶大黴素抗性基因特異性引物 GenR (表 I)。轉染-感染測定法按照Bac-to-Bac手冊■( Invitrogen),從攜帶有具有插入異源基因的杆狀病毒質粒的2到3個獨立菌落的I. 5-ml過夜細菌培養物製備杆狀病毒質粒DNA，並平行地進行分析。為了進行轉染，通過在Bac-to-Bac (Invitrogen)手冊■中所描述的基於Cellfectin 的轉染方案，在6孔板中使用I μ g每種杆狀病毒質粒DNA製備物來轉染I X IO6個Sf9細胞。在轉染後(P. t. )72h至120h，通過螢光顯微術檢查病毒繁殖。在p. t. 120h吋，將細胞培養基以2000 Xg離心5分鐘以除去細胞碎片，並將該澄清的上清液用於在6孔板中感染I. 5X IO6個Sf9細胞。在p. i.72h時，再次通過螢光顯微術監測病毒感染的傳播。在所有實驗中，使用帶有在PlO啟動子控制之下的egfp報告基因的野生型bM0N14272桿狀病毒質粒作為陽性對照。也帶有在PlO啟動子控制之下的egfp報告基因的bM0N14272-gp64null杆狀病毒質粒用作陰性對照，因為它已失去在細胞間感染移動的能力(Lung等，2002)。細胞培養物中病毒繁殖的時間過程表徵執行了時間過程分析以比較AcMNPV_vp80null病毒和各種修復構建物與野生型AcMNPV杆狀病毒質粒(Ac-wt)相比的芽生型病毒生產，它們都含有egfp。簡單來說，在28°C下，將Sf9細胞接種在6孔組織培養板(I X IO6個細胞/孔)中的Iml無血清Sf900_II培養基中。2小時後，除去培養基，並在Bac-to-Bac手冊'(Invitrogen)中推薦的標準條件下，將細胞用5 μ g杆狀病毒質粒DNA進行轉染。在p. t. 24、48、72、96和120h時收穫細胞培養上清液，並通過終點稀釋測定法分析感染性芽生型病毒的生產，以確定半數組織培養感染劑量(TCID5tlX感染通過監測egfp表達(來自於P 10啟動子)來確定。計算源自於三次獨立轉染的感染滴度的平均值並作圖。透射電子顯微術
將昆蟲Sf9細胞接種在25T三角瓶中(3. 5X106個細胞/瓶)，並用20 μ gAc-Δ νρ80、拯救Ac-Δ νρ80_νρ80或Ac-wt杆狀病毒質粒構建物轉染。p. t. 48h後收穫細胞，並按照以前的描述進行製備，用於透射電子顯微術(van Lent等，1990)。使用PhilipsCMl2電子顯微鏡檢查樣品並照相。芽生型病毒生產測定法將昆蟲Sf9細胞接種到兩個25T三角瓶中(3. 5X106個細胞/瓶)，並用20 μ g Ac- Δ vp80> Ac- Δ νρ80_νρ80、Ac- Δ νρ80_ρΗ_νρ80、Ac- Δ vp80-FLAG_vp80、Ac-Avp80-Vp80-FLAG或Ac-wt杆狀病毒質粒構建物轉染。p.t.5日，收穫富含BV的細胞培養上清液，並超速離心通過ー層10%蔗糖溶液(25，OOOrpm, I. 5小時，Beckman SW32)。將沉澱的芽生型毒粒重新懸浮在無菌去礦質水中並製備，用於負染電子顯微術、SDS-聚丙烯醯胺電泳或基於PCR的檢測(如上所述)。從感染細胞純化ODV和杆狀結構 通過電子顯微術(EM)分析感染/轉染的昆蟲細胞中ODV和杆狀結構的存在。為此，在p. i. 48h收穫昆蟲細胞，將其裂解，並將細胞裂解液超速離心通過40%蔗糖的TE(lmMTris-HCl pH 7. 4，O. ImMEDTA)緩衝液層(45，OOOrpm，I 小時，Beckman SW55)。將沉澱物重懸浮在無菌去礦質水中，並按照以前的描述通過負染色EM進行分析(van Lent等，1990)。Sf9衍生的表達vp80的轉基因細胞系的開發為了開發生產VP80蛋白的細胞系，使用引物vp80-SacI-F和vp80-XbaI_R (表I)擴增帶有vp800RF的2105-bp片段，並將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產生pjetl. 2_vp80。在下一步中，將vp800RF從pjetl. 2_vp80上切下(Sacl/Xbal)並亞克隆到Sacl/Xbal消化的pIZ (Invitrogen)中，以產生pIZ_vp80。將得到的質粒載體pIZ_vp80用Eco57I線性化並進行凝膠純化。將Sf9細胞接種在6孔板中(I X IO6個細胞/孔)，並用10 μ g線性化載體轉染。轉染後24小時後，通過含有Zeocin (300 μ g/ml)的細胞培養基對細胞進行2至3周的篩選，直到在同樣條件下沒有對照Sf9細胞存活。然後將細胞作為未克隆的細胞系進行繁殖。AcMNPV vp39_null杆狀病毒質粒的產生和表徵為了研究vp39基因在病毒後代產生和核衣殼裝配過程中的作用，我們按照與上面對於AcMNPV vp80null杆狀病毒質粒構建物提到的相同的程序，在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有vp39缺失的AcMNPV杆狀病毒質粒(bM0N14272)。因為vp390RF的序列與兩個側翼0RF(cg-30和lef-4)的啟動子序列交疊，因此為了避免cg-30和lef-4表達的失調控，只能缺失vp390RF的內部部分。為了達到這一點，使用PCR引物vp39-K0_和vp39-K0_R(表1)，從包含側翼帶有突變LoxP位點的cat基因的質粒擴增了側翼帶有突變LoxP位點的cat基因。將得到的含有側翼帶有突變LoxP位點的cat基因和與vp390RF的內部區域同源的 50-bp序列的PCR片段用DpnI處理並凝膠純化，以消除模板質粒。然後將PCR產物轉化到按照上面提到的方式製備的含有杆狀病毒質粒bM0N14272 (Invitrogen)和產LambdaRED重組酶的質粒pKD46的 ΗΙΟβ大腸桿菌細胞中(Datsenko & Wanner, 2000)。在最後步驟中，使用引物75834和76420 (表I)，將對卡那黴素有抗性的菌落進行基於PCR的分析，以驗證cat基因從杆狀病毒質粒骨架的插入/消除。陽性克隆通過獲得的PCR產物的DNA測序來進ー步驗證。按照本方案，vp390RF的內部部分(498nt=166aa)被移除,其坐標為圖9中所指示的75894-76391。修復的vp39_null杆狀病毒質粒的構建和分析為了製備vp39修復供體載體，我們通過導入在多角體蛋白啟動子控制之下的vp390RF來修飾質粒pFB-egfp(上面提到的)。起初，使用引物vp39-SacI_F和vp39_XbaI-R(引物序列參見表I)從bM0N14272模板擴增1073-bp的片段，並將其克隆到載體pjetl. 2/Blunt (Fermentas)中以形成pjetl. 2_vp39。在DNA序列驗證後，通過Sacl/Xbal雙消化 將vp390RF從pjetl. 2_vp39上切下，然後亞克隆到Sacl/Xbal消化並凝膠純化的pFB-egfp中，以產生供體質粒pFB-egfp-vp39。在不成功嘗試使用pFB_egfp_vp39拯救AcMNPVvp39null後，製備了ー組新的供體質粒。首先,使用引物vp39_StuI_F和lef-4-XbaI-R從杆狀病毒質粒bM0N14272模板通過PCR產生含有vp39和lef_40RF的2498-bp片段，並克隆到載體 pjetl. 2/Blunt(Fermentas)中以形成 pjetl. 2-vp39_lef-4。在 DNA 序列驗證後，通過Stul/Xbal雙消化將含有vp39和lef-4 ORF的片段從pjetl. 2-vp39-lef-4上切下，然後亞克隆到Stul/Xbal消化並凝膠純化的pFB-egfp中，以產生供體質粒pFB_egfp-vp39_lef-4。平行地，構建了供體質粒pFB-egfp-vp39_cg30，其中vp39和cg_300RF兩者都由極晚期多角體蛋白啟動子驅動，並且cg-300RF也能使用其位於vp39 ORF的3』 -末端內部的天然啟動子。簡單來說，使用引物cg30-XbaI-F和vp39-XbaI-R (上面提到的)擴增帶有vp39和cg-300RF兩者的1868-bp片段，並將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產生 pjet I. 2-vp39-cg30o 將 vp39/cg_30 盒作為 Sacl/Xba 亞克隆到 pFB-egfp 中以產生 pFB-egfp-vp39-cg30。此外，構建了類似的供體載體 pFB-egfp-FLAG-vp39_cg30,其中vp390RF在N-端帶有FLAG標籤。該載體的開發使用相同的策略，只是使用反向引物vp39-FLAG-SacI-R 代替 vp39_XbaI_R 引物來擴增 vp39/cg_30 盒。按照Bac-to-Bac試劑盒的方案(Invitrogen),將所有開發的供體質粒轉座到vp39-null杆狀病毒質粒中，並如上面對vp80修復杆狀病毒質粒所詳述的那樣進行篩選。如上對於vp80構建物所述進行功能分析。AcMNPV vpl054_null杆狀病毒質粒的產生和分析為了證實vpl054基因在病毒後代生產和核衣殼裝配中的必不可少的作用，我們按照與用於vpSOnull杆狀病毒質粒構建物相同的程序並進行了少量修改，在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有vpl054缺失的AcMNPV杆狀病毒質粒(bM0N14272)。因為vpl0540RF與必需的Ief-IOORF交疊，因此我們不能移除整個vpl054 0RF,而是只能移除ORF的955-bp核苷酸的3』-末端部分。為了防止在昆蟲細胞中翻譯C-端截短的VP1054突變體，我們決定將第一個翻譯密碼子ATG — Met突變成ACG — Thr0該單個核苷酸取代也將lef-10 ORF的內部32號密碼子(AAT)改變成AAC，但二者都編碼相同的胺基酸(Asn)。為了實現這一點，我們首先使用引物vpl054-K0-F和vpl054-K0-Rl從杆狀病毒質粒bM0N14272(Invitrogen)擴增了 vpl054 ORF 的 5』 -末端。該 214-bp 的 PCR 產物含有 vpl054 ORF 的ATG起始密碼子的突變，導入了用於lef-10 ORF的合成的終止/poly-A信號序列序列，並具有與cat盒同源的3』-末端序列突出端以便於第二步PCR，以及與vpl054 ORF的5』-末端同源的49-bp序列以在大腸桿菌中介導Lambda RED指導的同源重組。在凝膠純化和DNA定量後，第二步PCR中將214-bp的片段用作正向引物，反向引物為vpl054-K0-R2，以包含側翼帶有突變LoxP位點的cat基因的質粒作為模板。將得到的含有側翼帶有突變LoxP位點的cat基因、vpl054 ORF的突變5』 -末端和與vpl054 ORF的5』或3』鄰近區域同源的 50-bp序列的1230-bp PCR片段，用DpnI進行處理並凝膠純化，以消除模板質粒。該PCR產物與bM0N14272桿狀病毒質粒的重組按照上面對vp80突變體所述來進行。使用引物對cat-F/cat-R、45510/46235、以及45122和46441K，通過PCR來驗證卡那黴素抗性菌落，以檢查cat基因從杆狀病毒質粒骨架的插入/消除。插入位點也通過DNA測序來證實。該方法導致在SEQ ID NO: I所提供的AcMNPV克隆C6基因組中從45365至46319位核苷酸的955bp的缺失。所有引物序列在表I中給出。修復的vpl054_null杆狀病毒質粒構建物的構建為了製備vpl054修復供體載體，我們通過移除多角體蛋白啟動子並將其用含有vpl054啟動子區和vpl0540RF的片段代替，對質粒pFB-egfp (上面提到的)進行了修飾。首先，使用引物vpl054-Rep-F和vpl054-Rep-R從杆狀病毒質粒bM0N14272模板擴增含有vpl054啟動子和ORF序列兩者的1714-bp片段，並將其克隆到載體pjetl. 2/Blunt(Fermentas)中以形成 pjetl. 2-pvpl054_vpl054。在 DNA 序列驗證後，通過 Stul/Xbal 雙 消化將vpl054盒從pjetl. 2-pvpl054-vpl054上切下，然後亞克隆到Bstll07I/XbaI消化並凝膠純化的pFB-egfp中，以產生供體質粒pFB-egfp-pvpl054_vpl054。按照Bac-to-Bac方案(Invitrogen)將開發的供體質粒轉座到vpl054_null杆狀病毒質粒中並進行篩選。如上面對vp80桿狀病毒質粒所詳述的那樣來分析重組杆狀病毒質粒。AcMNPVp6. 9-null杆狀病毒質粒的產生和分析為了證實p6. 9在病毒後代產生中的必不可少的作用，我們在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有P6. 9缺失的AcMNPV杆狀病毒質粒(bM0N14272)。為此，使用PCR引物p6. 9-K0-F和p6. 9-K0-R，從包含側翼帶有突變LoxP位點的氯黴素抗性基因(cat)的質粒擴增了這種側翼帶有突變LoxP位點的cat基因。按照與用於其他突變體相同的程序獲得突變體病毒。對於最終獲得的突變體克隆的基於PCR的分析來說，使用引物對cat-F與cat-R以及86596與86995來檢查cat基因從杆狀病毒質粒骨架上的插入/消除。陽性克隆還通過DNA測序來證實。該方法導致在SEQ ID NO: I中提供的AcMNPV克隆C6基因組中從86716至86879位核苷酸的164bp的缺失。引物序列顯示在表I中。修復的p6. 9-null杆狀病毒質粒的構建和功能分析為了製備 ρ6· 9 修復供體載體，使用了 由 Marcel Westenberg (WageningenUniversity)構建的pFB-GFP-p6. 9載體。為了製造該載體，使用高保真擴展長模板PCR系統(Roche),利用引物 pp6. 9-F 和 pp6. 9-R 從質粒 pAcMP KHill-Perkins & Possee, 1990)擴增AcMNPVp6. 9啟動子序列。將PCR產物作為SalI片段克隆到通過事先將Bstll07I與StuI位點融合以缺失多角體蛋白啟動子的pFastBacl (Invitrogen)中，以獲得pFB 1_ρ6· 9。將來自於pFBl-p6. 9的p6. 9啟動子作為SnaBI/BamHI片段重新克隆到pFastBacDUAL(Invitrogen)的Bstll07I和BamHI位點中，由此缺失了多角體蛋白啟動子。隨後，將egfp報告基因克隆到XmaI位點中plO啟動子的下遊，以獲得pFB_GFP-p6. 9。最後，通過使用高保真擴展長模板PCR系統和分別在5』和3』末端產生EcoRI和NotI的引物(表1)，從AcMNPV杆狀病毒質粒(bM0N14272)或SeMNPV基因組DNA通過PCR擴增了 AcMNPV和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua) (Se) MNPV 的 ρ6· 9 基因。將 PCR 產物克隆到 pFB_GFP_p6. 9 的EcoRI/Notl位點中p6. 9啟動子的下遊。對所有產生的克隆進行測序以驗證併入的p6. 9序列。按照Bac-to-Bac方案(Invitrogen),將這兩種開發的供體質粒的表達盒轉座到p6. 9-null杆狀病毒質粒中。如上對vp80構建物所描述的，通過基於三重PCR的測定法，篩選polh基因座中的轉座陽性構建物。按照對vp80構建物那樣執行分析。結果AcMNPV vp80的沉默不影響杆狀病毒極晚期基因表達我們探索了在用AcMNPV-GFP感染期間，用不同dsRNA感染Sf9細胞的效果。為了引發所選杆狀病毒基因(vpl054、vp39、vp80、dbp和odv_ec27)的dsRNA誘導型沉默,我們使用基於T7RNA聚合酶的體外合成，產生了基因特異性dsRNA。然而，當我們開始這些研究吋，不清楚dsRNA轉染的何種量和時間點對沉默杆狀病毒基因來說最有效。為了確定在杆狀病毒感染的細胞中用於RNAi測定目的的最適dsRNA量，我們首先嘗試用不同量的dsRNA 來沉默egfp報告基因。這些初步測定顯示，使用每個細胞IOOpg dsRNA時獲得了最強有力的RNAi效應(數據未顯示)。同時，還證明了 RNAi處理對感染性芽生型毒粒後代的產生沒有負面影響。我們還嘗試了在兩個不同時間點、即感染前24h或p. i. Ih將dsRNA轉染到細胞中。結果證明，在p. i. Ih執行的轉染與在感染前24h執行的轉染相比，對於在杆狀病毒感染的晩期/極晚期時表達的基因的沉默來說更加有效(數據未顯示)。此外，為了確保擊倒是基因特異性的，將對應於cat基因的dsRNA作為RNAi陰性對照進行轉染。在這種情況下，與未轉染的昆蟲細胞相比，我們能夠觀察到杆狀病毒感染傳播的中度抑制。然而，當昆蟲細胞僅用轉染試劑進行處理時，也觀察到相同的現象。因此，我們可以得出結論，該效應可以通過轉染試劑的存在對細胞生存カ的負面影響(細胞毒性)來解釋。杆狀病毒基因的沉默篩選揭不出，vpl054> vp39、dbp和odv/ec_27的下調也與通過EGFP檢測所測量到的極晚期基因表達的降低或抑制相關(圖IA和1B)。在dbp-和odv/ec-27-靶向細胞中觀察到這種抑制的最高水平。這種效應的原因可以通過在杆狀病毒複製周期中產生的雙順反子和交疊的mRNA轉錄本來解釋。最後，該過程可能還涉及與序列相似性有限的靶的交叉反應。只有用vp80 dsRNA處理的細胞顯示出與未轉染細胞或者特別是cat dsRNA處理的細胞相似的EGFP表達水平。重要的是，在導入egfp特異性dsRNA的昆蟲細胞(陽性RNAi對照)中觀察到非常少的EGFP產生細胞，顯示出高轉染效率。基於我們的RNAi篩選成果，在幹擾杆狀病毒極晚期基因表達的情形中，vp80基因(基因座)似乎是用於基於RNAi的祀向的適合候選物。
vp80的擊倒完全阻止了 BV和正常外觀的ODV的產生為了確定所選的候選基因(vpl054、vp39、vp80、dbp和odv/ec_27)在芽生型毒粒後代的生產中的作用，從dsRNA處理細胞的細胞培養基(36h p. i.)中檢測BV的存在。基於終點稀釋的滴定證實了所有測試的基因對於感染性芽生型病毒後代的產生是必需的(圖1C)。我們不能在vp80-和dbp-靶向細胞中檢測到任何感染性BV。此外，基於PCR的測定表明在vp80-靶向細胞中也不產生缺陷型或非感染性病毒粒子。重要的是指出，結果還顯示，在RNAi對照(egfp-和cat-特異性dsRNA處理的細胞)中，與未轉染細胞相比，感染性BV的生產顯著降低。轉染試劑的細胞毒性再一次成為這種負面效應的推測原因。細胞裂解物的電子顯微術分析顯示，正如預期的，在用dsRNA-vp39處理的細胞中，ODV和杆狀結構的形成被完全抑制(圖1D)。在用dsRNA-vp80處理的昆蟲細胞中，ODV和杆狀結構的產生也顯著降低(圖1D)。然而，在vp80靶向細胞中，我們常常能夠發現畸形表型(尖形)的核衣売。另ー方面，將dsRNA-cat導入昆蟲細胞不引起ODV生產的任何變化。AcMNPV vp80基因對於病毒複製是必需的按圖2中的詳情構建了 AcMNPV缺失病毒。修復構建物被設計成使野生型vp80 ORF或在N-和C-端帶有FLAG-標籤的vp80基因連同其天然或多角體蛋白啟動子區，與plO啟動子下的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖3A)。為了研究vp80基因的功能，將Sf9細胞用敲除或修復杆狀病毒質粒構建物轉染，並通過螢光顯微術監測EGFP表達。當將Ac-vp80null導入到Sf9細胞中時，在p. t. 72h至120h時沒有在細胞培養物中觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null杆狀病毒質粒的表型類似的「單細胞感染」表型(圖3B)。結果表明，Ac-vp80null能夠達到感染的極晚期，正如通過plO啟動子驅動的EGFP表達所證實的。從p. t. 72h至120小時，在用三種修復(從其天然啟動子驅動的vp80，從多角體蛋白啟動子驅動的vp80和從其天然啟動子驅動的N-端帶有FLAG標籤的vp80)構建物轉染的昆蟲細胞單層中，可以看到廣泛分布的EGFP表達，表明這些杆狀病毒質粒能夠產生的感染性芽生型毒粒的水平足以啟動與野生型杆狀病毒質粒類似水平的二次感染(圖 3B)。相反，在用C-端帶有FLAG標籤的vp80修復構建物轉染的昆蟲細胞中，到p. t. 72h時為止，只在最初感染的分離細胞中觀察到EGFP表達，表明這種杆狀病毒質粒構建物在病毒複製方面有缺陷(圖3B)。然而，到p. t. 96h時觀察到小型噬斑的形成，並且到p. t. 120h吋，發展出非常少的正常大小的噬斑。結果顯示C-端帶有flag標籤的突變體在芽生型病毒生產中受到強烈延遲，並顯示未修飾的C-端對於VP80的功能非常重要。在p. t. 5天時，去除細胞培養上清液並將其添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中，然後溫育3天，以檢測從用這些杆狀病毒質粒轉染的細胞產生的病毒引起的感染。正如預期的，用來自使用修復構建物進行轉染的上清液溫育的Sf9細胞，顯示出大量EGFP表達細胞(圖3C)。然而，用來自C-端帶有FLAG標籤的構建物的上清液溫育的細胞，在EGFP陽性細胞的數量上顯示出顯著降低。另ー方面，在用來自於使用vp80敲除進行轉染的上清液溫育的昆蟲細胞中，直到72h時，在所分析的任何時間點都沒有檢測到EGFP表達(圖3C)。此外，為了表徵vp80基因的缺失對AcMNPV感染的準確效果，在kciUAc- Δ vp80> Ac- Δ vp80-vp80Rep> Ac- Δ vp80-polh-vp80Rep> Ac- Δ vp80-FLAG-vp80Rep 和Ac-Δ vp80-vp80-FLAGRep之間比較了病毒在轉染的Sf9細胞中的繁殖。在指明的時間點，分析所有上述杆狀病毒質粒構建物的細胞培養上清液的BV生產(圖4)。正如預期的，修復的 Ac- Δvp80-vp80Rep 、Ac-Δvp80-polh_vp80Rep 、Ac-Δvp80-FLAG_vp80Rep 病毒顯示出與野生型病毒(Ac-wt)的繁殖一致的病毒複製動力學。與Ac-wt病毒或其他修復的病毒相比，由C-端帶有flag標籤的Ac-AVp80-vp80-FLAGR印病毒產生的芽生型毒粒減少到約O. 06%ο這些結果表明，vp80基因對於感染性BV的產生是必需的。已經清楚地證明，vp80ORF的整個序列可以從杆狀病毒質粒骨架上完全缺失，並通過將vp80 ORF導入到基因組的異源位點(多角體蛋白基因座)中充分地拯救。我們還顯示，vp80基因表達可以由異源多角體蛋白啟動子序列來驅動，並對細胞培養物中病毒的複製沒有負面影響。此外，我們觀察到與VP80的C-端相反，N-端允許進行基因修飾(表位標籤標記)。我們注意到當與所有其他拯救或野生型病毒相比吋，C-端帶有FLAG標籤的VP80病毒的動力學被顯著延遲，表明了VP80C-端的功能重要性。BV和ODV兩者的產生需要VP80上面描述的結果表明Ac-vp80null突變體在感染性芽生型病毒的生產上徹底缺陷。然而，還存在著突變體仍能產生非感染性芽生型粒子的可能性。為了調查這種能力，將Sf9細胞用敲除、修復或野生型杆狀病毒質粒構建物進行轉染，並在p. t. 7天對細胞培養基進行超速離心以沉澱芽生型病毒。將形成的沉澱物通過負染色電子顯微術或通過基於Western印跡或PCR的檢測進行分析，以證實芽生型病毒的存在。在來自用Ac-vp80null突變體轉染的細胞的沉澱物中，沒有表現出完整的芽生型病毒、病毒樣粒子或其結構(例如主要衣殼蛋白VP39和病毒基因組序列)(圖5A和5B)。另ー方面，與源自於野生型病毒的芽生型病毒相比，所有被分析的修復構建物產生正常外觀的芽生型病毒(圖5A)。然而，在源自於C-端帶有FLAG標籤的vp80基因修復構建物轉染的細胞的沉澱物中，非常難以發現代表性芽生型毒粒。
為了進一步表徵vp80基因的缺失對杆狀病毒生命周期的影響，使用從杆狀病毒質粒轉染的細胞產生的超薄切片執行了電子顯微術。Ac-Vp80null轉染的細胞典型地發展出杆狀病毒感染的細胞的表型，其具有膨大的核、片段化的宿主染色質、電子緻密的病毒發生基質等(圖6A)。不存在VP80不阻止在病毒發生基質內形成正常外觀的核衣殼(圖6C)。所形成的核衣殼在表型上與由Ac-Vp80null修復或Ac_wt杆狀病毒質粒所產生的核衣殼沒有區別。然而，與用Ac-Vp80null修復或Ac_wt杆狀病毒質粒轉染的細胞相比，裝配的核衣殼的豐度相當低(圖6E和6G)。此外，在Ac-vp80null杆狀病毒質粒轉染的細胞的核質的基質周區室(所謂的環區)中，在包膜之前既不能觀察到包埋型毒粒也不能觀察到核衣殼束(圖6B和6D)。在核衣殼的成熟和/或它們從病毒發生基質的釋放/運輸期間，VP80似乎發揮作用。最後，VP80對高效核衣殼裝配可能多少有些貢獻,這可以用Ac-vp80null轉染的細胞的病毒發生基質中存在的少量核衣殼來解釋。當vp80基因被重新導回到杆狀病毒質粒突變體中時，可以在被轉染細胞的環區中看到大量核衣殼和包埋型毒粒(圖6F)。在Ac-Λ vp80-vp80修復杆狀病毒質粒轉染的細胞中產生的包埋型毒粒的豐度和形態，與由野生型杆狀病毒質粒產生的相似(圖6F和6H)。VP80的功能可以通過反式作用型vp80基因來互補為了證明VP80的功能可以通過反式作用型vp80 ORF來互補，使用轉基因細胞系Sf9_vp80執行了互補測定，該細胞系已用在黃杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)早期杆狀病毒ie-2啟動子控制下表達的vp80基因穩定轉化。在測定中，Sf9和Sf9_vp80細胞兩者都用Ac-vp80nul I杆狀病毒質粒突變體轉染(圖7 )。在p. t. 72h和96h，通過EGFP特異性螢光來監測病毒感染的傳播。在Sf9-vp80細胞中，我們能夠觀察到證實病毒擴散的病毒噬斑。另ー方面，在Sf9細胞中，正如以前在上文描述的，只能看到「單細胞感染」表型。在6天後，收穫細胞培養上清液，並將其用作接種物感染新鮮的Sf9細胞群。5天後，通過螢光顯微術監測EGFP陽性細胞。在接收來自Sf9-vp80細胞的上清液的Sf9細胞中僅觀察到「單細胞感染」表型。正如推測的，在接收來自Sf9細胞的上清液的Sf9細胞中沒有檢測到EGFP信號。這些結果顯示，Ac-vp80null可以通過表達VP80的細胞(Sf9_vp80)來拯救,並且證實了觀察到的互補是由於從宿主細胞系表達的VP80蛋白，而不是來自於從所述細胞系獲取vp80基因。換句話說，該結果與對生產沒有汙染性杆狀病毒毒粒的生物藥品(在我們的模型測定法中為EGFP蛋白)所提出的要求相符。vp39_null杆狀病毒質粒的產生和表徵為了研究AcMNPV vp39基因在病毒感染期間的功能，通過vp39基因的部分缺失構建了 vp39-null AcMNPV杆狀病毒質粒。缺失構建物通過它對氯黴素的抗性來選擇,該抗性表明發生了 vp39基因的位點特異性缺失。在得到的vp39-null AcMNPV杆狀病毒質粒中，vp39基因的內部部分正確地被cat基因代替。隨後，通過Cre/LoxP重組來消除cat (圖8A)。根據AcMNPV克隆C6基因組序列(SEQ ID NO: I )，vp39序列被移除了從75894至76391位核苷酸。使用引物75834和76420，通過PCR驗證了 vp39缺失構建物的結構(圖8B)。當使用野生型AcMNPV杆狀病毒質粒作為模板時擴增到647-bp的DNA片段，而在AcMNPVvp39-null(+cat)模板上能夠擴增到1113-bp的DNA片段(圖8B)。當在PCR分析中使用消除了 cat盒的最終構建物AcMNPV-vp80null (-cat)時,只能檢測到短的183_bp的DNA片段(圖8B)。結果通過DNA測序來證實。
vp390RF的功能作圖指出了 vp39與cg_300RF之間可推測的功能關係修復構建物被設計成使在多角體蛋白啟動子序列控制之下的野生型vp390RF與PlO啟動子控制的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖9A)。為了調查vp39基因的功能，將Sf9細胞用敲除或修復杆狀病毒質粒構建物進行轉染，並通過螢光顯微術監測EGFP表達。當Ac-vp39null被導入Sf9細胞時，從p. t. 72h至168h沒有觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null杆狀病毒質粒的表型類似的「單細胞感染」表型(圖9B)。這些結果表明，Ac-vp39null構建物能夠到達感染的極晚期，正如由plO啟動子驅動的EGFP表達所顯示的。出人意料的是,在用vp39修復(從多角體蛋白啟動子驅動的vp39, Ac- Δ vp39-polh-vp39Rep)構建物轉染的昆蟲細胞單層中，不能觀察到病毒繁埴(圖3B)。為此，我們決定製備三種額外的修復杆狀病毒質粒，其攜帯在其天然啟動子控制之下的vp39和lef-4 ORF兩者。當用這些修復構建物轉染昆蟲細胞時，同樣沒有發生病毒複製(圖9B)，並從p. t. 72h至168h觀察到「單細胞感染」表型。有趣的是，在用帶有vp39 (或帶有FLAG標籤的vp39)和cg-30兩者的修復構建物轉染的昆蟲細胞單層中，我們能夠觀察到極小簇的EGFP陽性細胞(3-5個細胞)(圖9B)。然而，我們沒有看見與野生型載體(Ac_wt)相同的全價病毒複製。在p. t. 7天吋，收集細胞培養上清液並添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中，然後將其溫育3天，以檢測由這裡提到的所有杆狀病毒質粒轉染的細胞產生的病毒所引起的感染(圖9C)。正如預期，用來自Ac-wt轉染的上清液溫育的Sf9細胞顯示出大量表達EGFP的細胞。另一方面，用來自 Ac- Δ vp39_polh_vp39Rep 和 Ac- Δ vp39_vp39-lef_4Rep 構建物的上清液溫育的細胞沒有顯示任何EGFP陽性細胞。然而，在用來自Ac-Avp39-Vp39-cg30R印和Ac-Avp39-FLAG-vp39-Rep的上清液溫育的昆蟲細胞中，檢測到大量表達EGFP的細胞(圖9C)。這些結果表明了 vp39與cg-300RF之間的可能的功能關係是杆狀病毒複製所需要的。因為Vp390RF序列與兩側的ORF (lef-4和cg_30)的啟動子序列交疊，因此我們不能在我們的vp39null杆狀病毒質粒構建物中缺失整個vp390RF。因此也有可能可以表達vp39的C-和/或N-端截短的突變體，其可能作為競爭性抑制劑幹擾正常的VP39蛋白。vpl054-null杆狀病毒質粒的構建和分析
為了研究AcMNPV vpl054基因在病毒感染期間的功能，在大腸桿菌中通過同源重組從AcMNPV杆狀病毒質粒(bM0N14272)中部分缺失vpl054基因，構建了 vpl054_nullAcMNPV杆狀病毒質粒。缺失構建物通過它對氯黴素的抗性來選擇，所述抗性表明發生了vpl054基因的位點特異性缺失。在得到的vpl054-null AcMNPV杆狀病毒質粒中，vpl054基因的955-bp的3'-末端部分準確地被cat基因代替。隨後，使用Cre/LoxP重組系統從杆狀病毒質粒骨架中消除抗生素抗性表達盒(cat)(圖10A)。根據AcMNPV克隆C6基因組序列(SEQ ID NO: 1)，缺失的序列從核苷酸坐標45365至46319被移除。通過PCR證實所有缺失構建物的結構(圖10B)。當vpl054基因存在吋，正如在親代野生型AcMNPV杆狀病毒質粒中那樣，使用引物45510和46235能夠擴增到775_bp的PCR產物，而在AcMNPVvpl054null (+cat)構建物的情況下，當cat基因被導入杆狀病毒質粒序列中時,使用cat_F和cat-R引物擴增只產生596-bp的PCR片段(圖10B)。正確的重組過程也通過使用引物45122和46441進行vpl054基因座的PCR作圖來證實。當使用野生型AcMNPV杆狀病毒質粒作為模板時，擴增到1320-bp的DNA片段，而在AcMNPV vpl054-null (+cat)模板上能夠擴增到1353-bp的DNA片段(圖10B)。當在PCR分析中使用消除了 cat盒的最終構建物AcMNPV-vpl054null(-cat)時，只能檢測到423_bp的DNA片段(圖10B)。陽性克隆通過DNA 測序成功地驗證。AcMNPV vpl054基因是病毒複製所必需的修復構建物被設計成使帶有其天然啟動子區的AcMNPV vpl0540RF與在plO啟動子控制下的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖11A)。因為vpl054啟動子和ORF序列與lef-10 ORF交疊，因此修復構建物也能表達LEF-10。為了調查vpl054基因的功能，將Sf9細胞用vpl054敲除或修復杆狀病毒質粒構建物轉染，並通過螢光顯微術監測EGFP表達。當Ac-vpl054null構建物被導入到Sf9細胞中時，在p. t. 72h至120h時在細胞培養物中沒有觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null杆狀病毒質粒的表型類似的「單細胞感染」表型(圖11B)。結果表明Ac-vpl054null能夠達到感染的極晚期，正如由PlO啟動子驅動的EGFP表達所證實的。換句話說，結果表明，晚期表達因子10、即LEF-10的表達在vpl054-null杆狀病毒質粒突變體中不受影響。從p. t. 72h至120小時，在用修復構建物(Ac-Avp1054-vpl054)轉染的昆蟲細胞單層中可以看到廣布的EGFP表達。結果表明修復杆狀病毒質粒能夠產生感染性芽生型毒粒，其水平足以引起與野生型杆狀病毒質粒類似水平的二次感染(圖11B)。在p.t.6天，取出細胞培養上清液並添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中，然後將其溫育3天，以檢測由這些杆狀病毒質粒轉染的細胞產生的病毒所引起的感染。正如預期，用來自修復構建物轉染的上清液溫育的Sf9細胞顯示出大量表達EGFP的細胞(圖11C)。另ー方面，在與來自用Ac-vpl054null敲除進行的轉染的上清液一起溫育的昆蟲細胞中，在長達72h的所分析的任何時間點沒有檢測到EGFP表達(圖11C)。這些結果表明vpl054基因是感染性BV生產所必需的。已經清楚地證明，vpl054ORF的955-bp的3』-末端序列部分可以從杆狀病毒質粒骨架上完全缺失，並通過將AcMNPVvpl0540RF導入到基因組的異源位點(多角體蛋白基因座)中來充分拯救。此外，結果證明了 vpl054基因的缺失不影響極晚期基因表達，正如由用Ac-vpl054null杆狀病毒質粒突變體轉染的細胞中的EGFP陽性細胞所證實的(圖11B)。p6. 9-null杆狀病毒質粒的產生和表徵
為了研究AcMNPV p6. 9基因在病毒感染期間的功能，在大腸桿菌中通過同源重組從AcMNPV杆狀病毒質粒(bM0N14272)缺失p6. 9基因，構建了 vp6. 9-null AcMNPV杆狀病毒質粒。該缺失構建物通過它對氯黴素的抗性來選擇，所述抗性表明發生了 P6. 9基因的位點特異性缺失。在得到的p6. 9-null AcMNPV杆狀病毒質粒中，p6. 9基因正確地被cat基因代替。隨後，使用Cre/LoxP重組系統從杆狀病毒質粒骨架中消除抗生素抗性盒(cat)(圖12A)。根據AcMNPV克隆C6基因組序列(SEQ ID NO: I)，缺失的序列從翻譯起始密碼子(ATG —Met)至終止密碼子(TAT —Tyr)、即核苷酸坐標86716至86879被移除。p6. 9 orf的終止密碼子沒有被移除，因為其序列與側翼的lef-5 orf的終止密碼子交疊。通過PCR證實所有缺失構建物的結構(圖12B)。當p6. 9基因存在時，正如在親代野生型AcMNPV杆狀病毒質粒中那樣，在AcMNPV p6. 9null(+cat)構建物的情況下，當cat基因被導入杆狀病毒質粒序列中時，使用cat-F和cat-R引物只能擴增596_bp的PCR片段(圖12B)。正確的重組過程也使用引物86596和86995通過p6. 9基因座的PCR作圖來證實。當使用野生型AcMNPV杆狀病毒質粒作為模板時，擴增到400-bp的DNA片段，而在AcMNPV p6. 9-null (+cat)模板上能夠擴增到1220-bp的DNA片段(圖12B)。當在PCR分析中使用消除了 cat盒的最終構建物AcMNPV-p6. 9null (-cat)時，只能檢測到290_bp的短DNA片段(圖12B)。陽性克隆通過DNA測序成功地驗證。AcMNPVp6.9基因是病毒複製所必需的修復構建物被設計成使帶有AcMNPV p6. 9啟動子區的野生型AcMNPV或SeMNPVP6.90RF與plO啟動子控制下的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖13A)。為了調查p6. 9基因的功能，將Sf9細胞用p6. 9敲除或修復杆狀病毒質粒構建物轉染，並通過螢光顯微術監測EGFP表達。當Ac-p6. 9null被導入到Sf9細胞中時，在p. t. 72h至120h在細胞培養物中沒有觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null杆狀病毒質粒的表型類似的「單細胞感染」表型(圖13B)。結果表明Ac-p6. 9null能夠達到感染的極晚期，正如由PlO啟動子驅動的EGFP表達所證實的。從p. t. 72h至120小時，在用兩種修復構建物(Ac-Ap6. 9-Acp6. 9和Ac_Ap6. 9-Sep6. 9)轉染的昆蟲細胞單層中可以看到廣布的EGFP表達。結果表明這兩種修復杆狀病毒質粒能夠產生感染性芽生型毒粒，其水平足以引起與野生型杆狀病毒質粒類似水平的二次感染(圖13B)。在p. t. 6天，取出細胞培養上清液並添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中，然後將其溫育3天，以檢測由這些杆狀病毒質粒轉染的細胞產生的病毒所引起的感染。正如預期，與來自用修復構建物轉染的上清液一起溫育的Sf9細胞顯示出大量表達EGFP的細胞(圖13C)。另ー方面，在與來自用Ac-p6.9null敲除進行轉染的上清液一起溫育的昆蟲細胞中，在長達72h的所分析的任何時間點沒有檢測到EGFP表達(圖13C)。此外，為了表徵p6. 9基因的缺失對AcMNPV感染的準確影響，在Ac-wt、Ac-Ap6. 9、Ac-Ap6. 9-Acp6. 9R印、Ac-Ap6. 9-Sep6. 9Rep之間比較了病毒在被轉染Sf9細胞中的繁殖。在指定時間點，分析了所有上述杆狀病毒質粒構建物的細胞培養上清液的BV生產(圖13D)。正如預期，修復的Ac- Δ p6. 9~Acp6. 9Rep和Ac- Δ ρ6· 9_Sep6. 9Rep病毒顯不出與野生型病毒(Ac-wt)的繁殖相一致的病毒複製動力學。這些結果表明p6. 9基因是感染性BV生產所必需的。已經清楚地證明，p6. 9 ORF的整個序列可以從杆狀病毒質粒骨架上完全缺失，並通過將AcMNPV vp80 ORF導入到基因組的異源位點(多角體蛋白基因座)中來充分拯救。我們還顯示，P6. 9基因可以通過源自於SeMNPV的ρ6· 9 ORF來有效互補(M. Westenberg)。此外，結果證明了 ρ6· 9基因的缺失不影響極晚期基因表達，正如由Ac-p6. 9null杆狀病毒質粒突變體轉染的細胞中的EGFP陽性細胞所證實的(圖15B)。實施例II.本發明人在下面的實施例中對本發明的最佳方式進行了修改。材料與方法無抗生素抗性基因的AcMNPV vp80_null杆狀病毒質粒的產生為了確定VP80蛋白在病毒後代產生中是否具有必不可少的作用，我們在大腸桿菌中通過同源重組構建了帶有vp80 ORF的缺失的AcMNPV杆狀病毒質粒(源自於bM0N14272 (來自Invitrogene))。為此，使用PCR引物vp80-K0_F和vp80_K0-R (參見表1)，從包含側翼帶有突變LoxP位點的cat基因的質粒擴增了側翼帶有突變LoxP位點的cat基因(Suzuki等，2005)。將得到的含有側翼帶有突變LoxP位點的cat基因並且在vp80 ORF的5』或3』鄰近區含有AcMNPV的 50-bp同源序列的PCR片段用DpnI處理，並進行凝膠純化以消除模板質粒。然後將PCR產物轉化到按照下述方式製備的含有bM0N14272 (Invitrogen)和產Lambda RED重組酶的質粒pKD46的DHlO β大腸桿菌細胞中(Datsenko & Wanner, 2000)。將轉化的DHlO β -bM0N14272/pKD46大腸桿菌細胞，在含有卡那黴素(50 μ g/ml)、氨苄青黴素(100 μ g/ml)和L-阿拉伯糖(I. 5mg/ml)的50-ml LB (2. 0%蛋白腖，O. 5%酵母提取物，85. 5mMNaCl, [pH 7. O])培養基中，在30°C下生長至OD6tltl為^ O. 6，然後通過標準程序製成電感受態。將電穿孔的細胞在3ml LB培養基中在37°C下溫育3h，並在含濃度為6. 5yg/ml的氯黴素的LB瓊脂上鋪板。在37°C溫育48_h後，將氯黴素抗性菌落在有34 μ g/ml氯黴素的新鮮LB瓊脂培養基上劃線。將板在37°C溫育過夜，挑選對氯黴素有抗性的菌落，以備通過PCR進ー步驗證相關基因型。使用引物90292和90889來證實vp80 ORF的不存在，並利用引物cat-F和cat-R來驗證杆狀病毒質粒中cat盒的存在(詳細序列在表I中)。為了從杆狀病毒質粒骨架上消除導入的抗生素抗性基因(cat)，使用了 Cre/LoxP重組酶系統。將從Jeanine Louwerse (LUMC Leiden,荷蘭)獲得的攜帶Cre重組酶的質粒pCRE導入DH10b-bM0N14272-vp80null大腸桿菌細胞，隨後通過添加異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導CRE表達。簡單來說，將電穿孔的細胞在3ml LB培養基(2. 0%蛋白腖，O. 5%酵母提取物，85. 5mM NaCl, [pH 7. O])中在37°C下溫育3h，並鋪於含50 μ g/ml卡那黴素、100 μ g/ml氨苄青黴素和2mM IPTG的LB瓊脂培養基上。在24_h溫育後，選擇對卡那黴素和氨苄青黴素有抗性的菌落，以備通過PCR進ー步驗證所需基因型。在基於PCR的分析中，使用引物89507和91713 (表I)來驗證cat基因從杆狀病毒質粒骨架上的消除。陽性克隆也通過DNA測序來驗證。為了恢復轉座能力，將編碼轉座酶的輔助質粒pM0N7124 (Invitrogen)再引入到DHlO β -bM0N14272-vp80null大腸桿菌細胞中。最後，將egfp報告基因弓丨入到vp80_nulI杆狀病毒質粒中以便於觀察它在昆蟲細胞中的行為。簡單來說，使用寡核苷酸gfp-Nhel-F和gfp-Sphl-R (表I)從質粒pEGFP-N3 (Clontech)通過PCR擴增egfp報告基因。使用CloneJET PCR克隆試劑盒(Fermentas)，按照製造商的方案將PCR產物克隆到質粒pjetl. 2/Blunt中。然後，使用NheI和SphI將egfp ORF從無錯誤的pjetl. 2-egfp上切下，並亞克隆到Nhel/SphI消化的pFastBacDUAL (Invitrogen)中，以產生質粒pFB-egfp。按照Bac-to-Bac手冊■( Invitrogen)中所描述的,將含有在極晚期plO啟動子的轉錄控制之下的egfp報告基因的表達盒從pFB-egfp轉座到vp80_null杆狀病毒質粒的多角體蛋白基因座中。在得到的基因組中，完整的vp80 ORF已被移除(參見圖2)。這對應於在SEQ IDNO: I中提供的AcMNPV克隆C6基因組中從89564至91637位核苷酸的2074bp的缺失。修復的vp80_null杆狀病毒質粒的構建為了製備vp80修復供體載體，我們通過移除多角體蛋白啟動子並將其用含有vp80啟動子區和vp80 ORF的片段代替,對質粒pFB-egfp(上面提到的)進行修飾。首先,使用引物pvp80-StuI-F和vp80-XbaI-R (表1)，從杆狀病毒質粒bM0N14272模板擴增了含有vp80啟動子和ORF序列兩者的2300-bp片段，並克隆到載體pjetl. 2/Blunt (Fermentas)中以形成pjetl. 2-pvp80-vp80o在DNA序列驗證後，通過Stul/Xbal雙消化將vp80盒從pjetl. 2-pvp80-vp80上切下，然後亞克隆到Bstll07I/XbaI消化並凝膠純化的pFB-egfp 中，以產生供體質粒pFB-egfp-pvp80-vp80。平行地,構建其中vp80 ORF由極晚期多角體蛋白啟動子(polh)驅動的供體質粒pFB-egfp-polh-vp80。為此目的，使用弓I物vp80-SacI_F和vp80-XbaI-R (表I)擴增帶有vp80 ORF的2105-bp片段，並將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產生pjetl. 2-vp80。在最後步驟中，將vp80 ORF從pjetl. 2_vp80上切下(Sacl/Xbal)，並亞克隆到Sacl/Xbal消化的pFB-egfp中以產生pFB-egfp-polH_vp80。為了克服與不能獲得抗VP80抗體相關的問題，執行了 VP80的FLAG標籤裝飾(N-和C-端融合)以便於免疫檢測。N-端融合的FLAG-vp80序列通過雙步驟PCR策略、即所謂的融合PCR來產生。首先，使用弓I物pvp80-StuI-F和vp80_FLAG-Rl，從bM0N14272桿狀病毒質粒模板通過PCR擴增含有vp80啟動子和FLAG標籤的259_bp片段。在凝膠純化和DNA定量後，將259-bp片段在使用反向引物vp80-XbaI-R在bM0N14272桿狀病毒質粒模板上進行的第二步PCR擴增中用作正向引物。將最終的PCR產物(2324bp)克隆到載體pjetl. 2/Blunt(Fermentas)中以形成 pjetl. 2-pvp80-FLAG_vp80。DNA 序列驗證後，通過 Stul/Xbal雙消化將FLAG-vp80盒從pjetl. 2-pvp80-FLAG-vp80上切下，然後亞克隆到Bstll07I/XbaI消化並凝膠純化的pFB-egfp中，以產生供體質粒pFB-egfp-pvp80-FLAG_vp80。使用pvp80-StuI-F和vp80-FLAG-R從bM0N14272桿狀病毒質粒模板擴增C-端融合的vp80_FLAG盒。將2324-bp片段克隆到pjetl. 2/Blunt中，然後以與前述構建物類似的方式轉移到pFB-egfp 中 ο按照Bac-to-Bac方案(Invitrogen)將所有開發的供體質粒的插入片段轉座到vp80-null杆狀病毒質粒中。polh基因座中轉座陽性構建物的篩選通過基於三重PCR的測定法來進行，在所述測定法中使用了 M13正向和反向引物以及慶大黴素抗性基因特異性引物 GenR (表 I)。轉染-感染測定法按照Bac-to-Bac手冊■(Invitrogen),從攜帶具有插入的異源基因的杆狀病毒質粒的2到3個獨立菌落的I. 5-ml過夜細菌培養物來製備杆狀病毒質粒DNA，並平行地進行分析。為了進行轉染，通過按照Bac-to-Bac (Invitrogen)手冊■中所描述的基於Cellfectin 的轉染方案，在6孔板中使用Iyg姆種杆狀病毒質粒DNA製備物轉染IX IO6個Sf9細胞。在轉染後(p. t. )72h至120h，通過螢光顯微術檢查病毒繁殖。在p. t. 120h吋，將細胞培養基以2000 Xg離心5分鐘以除去細胞碎片，並將該澄清的上清液用於在6孔板中感染I. 5X IO6個Sf9細胞。在p. i.72h時，再次通過螢光顯微術監測病毒感染的傳播。在所有實驗中，使用帶有在PlO啟動子控制之下的egfp報告基因的野生型bMON14272桿狀病毒質粒作為陽性對照。也帶有在plO啟動子控制之下的egfp報告基因的bM0N14272-gp64nulI杆狀病毒質粒用作陰性對照，因為它已失去使感染在細胞間移動的能力(Lung 等，2002)。細胞培養物中病毒繁殖的時間過程表徵執行了時間過程分析以比較AcMNPV_vp80null病毒和各種修復構建物與野生型AcMNPV杆狀病毒質粒(Ac-wt)相比的芽生型病毒生產，它們都含有egfp。簡單來說，在28°C下，將Sf9細胞接種在6孔組織培養板(I X IO6個細胞/孔)中的Iml無血清Sf900_II培養基中。2小時後，除去培養基，並在Bac-to-Bac手冊'(Inv itrogen)中推薦的標準條件下，將細胞用5 μ g杆狀病毒質粒DNA進行轉染。在p. t. 24、48、72、96和120h時收穫細胞培養上清液，並通過終點稀釋測定法分析感染性芽生型病毒的生產，以確定半數組織培養感染劑量(TCID5tlX感染通過監測egfp表達(來自於P 10啟動子)來確定。計算從三次獨立轉染得到的感染滴度的平均值並作圖。透射電子顯微術將昆蟲Sf9細胞接種在25T三角瓶中(3. 5X106個細胞/瓶)，並用20 μ gAc-Δ νρ80、拯救Ac-Δ νρ80_νρ80或Ac-wt杆狀病毒質粒構建物轉染。p. t. 48h後收穫細胞，並按照以前的描述進行製備，用於透射電子顯微術(van Lent等，1990)。使用PhilipsCMl2電子顯微鏡檢查樣品並照相。芽生型病毒生產測定法將昆蟲Sf9細胞接種到兩個25T三角瓶中(3. 5X106個細胞/瓶)，並用
20μ g Ac- Δ vp80> Ac- Δ νρ80_νρ80、Ac- Δ νρ80_ρΗ_νρ80、Ac- Δ vp80-FLAG_vp80、Ac-Avp80-Vp80-FLAG或Ac-wt杆狀病毒質粒構建物轉染。p.t.5日，收穫富含BV的細胞培養上清液，並超速離心通過ー層10%蔗糖溶液(25，OOOrpm，I. 5小時，Beckman SW32)。將沉澱的芽生型毒粒重懸浮在無菌去礦質水中並製備，用於負染電子顯微術、SDS-聚丙烯醯胺電泳或基於PCR的檢測(如上所述)。從被感染細胞純化ODV和杆狀結構通過電子顯微術(EM)分析被感染/轉染的昆蟲細胞中ODV和杆狀結構的存在。為此，在p. i. 48h收穫昆蟲細胞，將其裂解，並將細胞裂解液超速離心通過40%蔗糖的TE(lmMTris-HCl pH 7. 4，0. ImMEDTA)緩衝液層(45，OOOrpm，I 小時，Beckman SW55)。將沉澱物重懸浮在無菌去礦質水中，並按照以前的描述通過負染色EM進行分析(van Lent等，1990)。
BV和ODV毒粒的純化和分級為了生產 BV，將 3. O X IO7 個 Sf9 細胞用 Ac- Δ vp80_Flag · vp80 或對照 Ac_wt 病毒以MOI=I進行感染。p. i. 6天，收集72ml富含BV的培養基並以1，500Xg離心10分鐘。然後將上清液在4°C下以80，OOOXg超速離心(Beckman SW28轉頭)60分鐘。將BV沉澱物重懸浮在350μ1 0. I X TE緩衝液中，並上樣在線性蔗糖梯度(25至56% (w/v))上，並在4°C下以80，000 Xg超速離心(Beckman SW55轉頭)90分鐘。收集形成的BV帶，並在12ml0. IXTE中稀釋。將BV製備物在4°C下以80，OOOXg離心60分鐘。將最終的病毒沉澱物重懸浮在150μ I 0. IXTE中。為了生產 0DV，將 6. OXlO7 個 Sf9 細胞用 Ac-Λ Vp80_Flag · vp80 (M0I=25)和AcMNPV (M0I=5)病毒(毒株 E2，Smith & Summers，1979)共同感染。p. i. 5 天，收穫感染的細胞，並按照以前的描述從病毒包涵體純化ODV (Braunagel等，1994)。將最終的ODV沉澱物重懸浮在 0.5ml O. IXTE (IOmM Tris, ImM EDTA，ρΗ=7· 5)中。按照以前的描述將純化的BV和ODV毒粒分級成包膜和核衣殼級分(Braunagel等，1994)。對最後的級分進行處理，用於SDS-PAGE和針對小鼠單克隆抗Flag抗體(Stratagene )、兔多克隆抗VP39抗血清(由美國堪薩斯州立大學(Kansas StateUniversity)的Lorena Passarelli善意提供)、兔多克隆抗GP64抗血清(由中國武漢病毒研究所的HualinWang和Feifei Yin善意提供(Yin等,2008))或針對經ロ傳染性因子I(PIF-I)的兔多克隆抗血清(由荷蘭Wageningen大學的Ke Peng善意提供(Peng等，2010))的免疫印跡。Sf9衍生的表達vp80的轉基因細胞系的開發為了開發生產VP80蛋白的細胞系，使用引物vp80-SacI_F和Vp80_XbaI-R(表I)擴增帶有vp80 ORF的2105-bp片段，並將其克隆到pjetl. 2/Blunt中以產生pjetl. 2_vp80。在下一步中，將vp80 ORF從pjetl. 2_vp80上切下(Sacl/Xbal)並亞克隆到Sacl/Xbal消化的pIZ (Invitrogen)中，以產生pIZ_vp80。將得到的質粒載體pIZ_vp80用Eco57I線性化並進行凝膠純化。將Sf9細胞接種在6孔板中(I X IO6個細胞/孔)，並用10 μ g線性化載體轉染。轉染後24小時後，通過含有Zeocin (300 μ g/ml)的細胞培養基對細胞進行2至3周的篩選，直到在同樣條件下沒有對照Sf9細胞存活。然後將細胞作為未克隆的細胞系進行繁殖。使用vp80null病毒進行重組蛋白表達為了測量使用Ac_AVp80 (反式互補的)毒種表達重組蛋白的能力，將3. OX IO7個未轉化的Sf9細胞用Ac-wt、Ac-Δ vp80-Flag · vp80 (都在未轉化的細胞系中產生)或Ac-ΔνρδΟ病毒(在Sf9-vp80細胞系中產生)以MOI=IO進行感染(獨立的三次重複測定)。所有這些毒種從杆狀病毒極晚期PlO啟動子表達作為模型異源基因的egfp。在p. i.48h和72h吋，收穫細胞和培養基，並用於Western印跡、酶聯免疫吸附測定(ELISA)或BV滴定(參見上文)。對於Western印跡來說，使用與上述相同的抗體來檢測Flag標籤、EGFP和GP64，以及單克隆小鼠抗肌動蛋白抗體(ImmunO)。為了進行相對定量,將Maxisorp 96孔板(Nunc)用IOOng兔多克隆抗GFP抗體(Molecular Probes)以姆孔ΙΟΟμΙ的體積在4°C包被過夜，隨後如以前所述按照標準ELISA程序進行(Fric等，2008)。按照下述公式計算EGFP生產的百分數(獨立的三次重複測定):EGFP表達的％=(測試吸光度背景吸光度)/ (Ac-wt EGFP72h-背景吸光度)X 100%，其中nh表示感染後的時間點。在對照Ac-wt與實驗Ac-Δ vp80_Flag · vp80和Ac-Δ vp80基因型之間觀察到的差異的統計顯著性，使用Student' s t-檢驗來分析。結果AcMNPV vp80基因對於病毒複製是必需的按照圖2中的詳情構建了 AcMNPV缺失病毒。修復構建物被設計成使野生型vp80ORF或在N-和C-端帶有FLAG-標籤的vp80基因連同其天然或多角體蛋白啟動子區，與處於PlO啟動子下的egfp基因一起被插入到多角體蛋白基因座中(圖3A)。為了研究vp80基因的功能，將Sf9細胞用敲除或修復杆狀病毒質粒構建物轉染，並通過螢光顯微術監測EGFP表達。當將Ac-vp80null導入到Sf9細胞中時，在p. t. 72h至120h時沒有在細胞培養物中觀察到病毒繁殖。我們只能觀察到與Ac-gp64null杆狀病毒質粒的表型類似的「單細胞感染」表型(圖3B)。結果表明，Ac-vp80null能夠達到感染的極晚期，正如通過plO啟動子驅動的EGFP表達所證實的。從p. t. 72h至120小時，可以在用三種修復(從其天然啟動子驅動的vp80,從多角體蛋白啟動子驅動的vp80和從其天然啟動子驅動的N-端帶有FLAG標籤的vp80)構建物轉染的昆蟲細胞單層中看到廣泛分布的EGFP表達，其表明這些杆狀病毒質粒能夠產生充分的感染性芽生型毒粒水平，以與野生型杆狀病毒質粒類似的水平啟動二次感染(圖3B)。相反，在用C-端帶有FLAG標籤的vp80修復構建物轉染的昆蟲細胞中，到p. t. 72h時為止，只在最初感染的分離細胞中觀察到EGFP表達，表明這種杆狀病毒質粒構建物在病毒複製方面有缺陷(圖3B)。然而，到p. t. 96h時觀察到極小噬斑的形成，並且到p.t. 120h時，發展出非常少的正常大小的噬斑。結果顯示C-端帶有flag標籤的突變體在芽生型病毒生產中受到強烈延遲，並顯示未修飾的C-端對於VP80的功能非常重要。在P. t. 5天時，去除細胞培養上清液並將其添加到新鮮鋪板的Sf9細胞中，然後溫育3天，以檢測從用這些杆狀病毒質粒轉染的細胞產生的病毒引起的感染。正如預期的，與來自使用修復構建物轉染的上清液一起溫育的Sf9細胞，顯示出大量EGFP表達細胞(圖3C)。然而，與來自C-端帶有FLAG標籤的構建物的上清液一起溫育的細胞，在EGFP陽性細胞的數量上顯 示出顯著降低。另ー方面，在與來自於使用vp80敲除型轉染的上清液一起溫育的昆蟲細胞中，直到72h時，在所分析的任何時間點沒有檢測到EGFP表達(圖3C)。此外，為了表徵vp80基因的缺失對AcMNPV感染的準確效果，在kciUAc- Δ vp80> Ac- Δ vp80-vp80Rep> Ac- Δ vp80-polh-vp80Rep> Ac- Δ vp80-FLAG-vp80Rep 和Ac-Δ vp80-vp80-FLAGRep之間比較了病毒在轉染的Sf9細胞中的繁殖。在指明的時間點，分析所有上述杆狀病毒質粒構建物的細胞培養上清液的BV生產(圖4)。正如預期的，修復的 Ac- Δvp80-vp80Rep 、Ac-Δvp80-polh_vp80Rep 、Ac-Δvp80-FLAG_vp80Rep 病毒顯示出與野生型病毒(Ac-wt)的繁殖一致的病毒複製動力學。與Ac-wt病毒或其他修復的病毒相比，由C-端帶有flag標籤的Ac-AVp80-vp80-FLAGR印病毒產生的芽生型毒粒減少到約O. 06%ο這些結果表明，vp80基因對於感染性BV的產生是必需的。已經清楚地證明，vp80ORF的整個序列可以從杆狀病毒質粒骨架上完全缺失，並通過將vp80 ORF導入到基因組的異源位點(多角體蛋白基因座)中充分地拯救。我們還顯示，vp80基因表達可以由異源多角體蛋白啟動子序列來驅動，並對病毒在細胞培養物中的複製沒有負面影響。此外，我們觀察到與VP80的C-端相反，N-端允許進行基因修飾(表位標籤標記)。我們注意到當與所有其他拯救或野生型病毒相比吋，C-端帶有FLAG標籤的VP80病毒的動力學被顯著延遲，表明了 VP80C-端的功能重要性。VP80是BV和ODV兩者的產生所需要的上面描述的結果表明，Ac-vp80null突變體在感染性芽生型病毒的生產上徹底缺陷。然而，還存在著突變體仍能產生非感染性芽生型粒子的可能性。為了調查這種能力，將Sf9細胞用敲除、修復或野生型杆狀病毒質粒構建物進行轉染，並在p. t. 7天對細胞培養基進行超速離心以沉澱芽生型病毒。將形成的沉澱物通過負染色電子顯微術或通過基於Western印跡或PCR的檢測進行分析，以證實芽生型病毒的存在。在來自用Ac-vp80null突變體轉染的細胞的沉澱物中，沒有揭示出完整的芽生型病毒、病毒樣粒子或其結構(例如主要衣殼蛋白VP39和病毒基因組序列)(圖5A和5B)。另一方面，與源自於野生型病毒的芽生型病毒相比，所有被分析的修復構建物產生正常外觀的芽生型病毒(圖5A)。然而，在源自於C-端帶有FLAG標籤的vp80基因修復構建物轉染的細胞的沉澱物中，發現代表性芽生型毒粒非常困難。為了進一步表徵vp80基因的缺失對杆狀病毒生命周期的影響，使用從杆狀病毒質粒轉染的細胞產生的超薄切片執行了電子顯微術。Ac-Vp80null轉染的細胞典型地發展出杆狀病毒感染的細胞的表型，其具有膨大的核、片段化的宿主染色質、電子緻密的病毒發生基質等(圖6A)。不存在VP80沒有阻止病毒發生基質內正常外觀的核衣殼的形成(圖6C)。所形成的核衣殼在表型上與由Ac-Vp80null修復或Ac_wt杆狀病毒質粒所產生的核衣殼沒有區別。然而，與用Ac-Vp80null修復或Ac_wt杆狀病毒質粒轉染的細胞相比，裝配的核衣殼的豐度相當低(圖6E和6G)。此外，在Ac-vp80null杆狀病毒質粒轉染的細胞的核質的基質周區室(所謂的環區)中，在包膜之前既不能觀察到包埋型毒粒也不能觀察到核衣殼束(圖6B和6D)。在核衣殼的成熟和/或它們從病毒發生基質的釋放/運輸期間，VP80 似乎發揮作用。最後，VP80對高效核衣殼裝配可能多少有些貢獻,這可以用Ac-vp80null轉染的細胞的病毒發生基質中存在少量核衣殼來解釋。當vp80基因被重新導回到杆狀病毒質粒突變體中時，可以在被轉染細胞的環區中看到大量核衣殼和包埋型毒粒(圖6F)。在Ac-Λ vp80-vp80修復杆狀病毒質粒轉染的細胞中產生的包埋型毒粒的豐度和形態，與由野生型杆狀病毒質粒產生的相似(圖6F和6H)。VP80與BV和ODV兩者的核衣殼結合為了調查VP80與BV製備物的結合，在p. i. 48h收集BV，並將核衣殼和包膜級分分離。在被感染的Sf9細胞中觀察到，Flag · VP80蛋白只在核衣殼級分中作為分子質量在80-kDa與95-kDa之間的雙條帶被檢測到(圖14A，上圖)。使用針對VP39 (只針對核衣殼)和GP64 (只針對包膜)的抗體證實了核衣殼和包膜的正確分離(圖14A，下圖)。為了檢查VP80是否也與ODV結合，將Sf9細胞用Ac- Δ vp80_Flag · vp80和產包涵體(OB)的wt AcMNPV病毒共同感染，以提供POLH蛋白。Western印跡分析顯示VP80與ODV的核衣殼級分結合，並且在這種情況下作為 SOkDa的單一條帶遷移，其對應於在感染的極晚期中產生的80-kDa形式(圖14B，上圖)。使用針對一種ODV包膜蛋白PIF-I的抗血清來控制核衣殼和包膜級分的正確分級(圖14B，下圖)。VP80的功能可以通過遺傳反式互補來拯救為了驗證病毒基因組中的vp80缺失是否能夠被在組成性啟動子控制之下以反式方式提供的vp80 ORF互補，構建了表達帶有Flag標籤的vp80的轉基因細胞系。在這些細胞中,VP80主要作為約95-kDa的蛋白產生,正如通過使用抗Flag抗體進行的Western印跡分析所顯示的(圖15A)。還觀察到了兩條次要條帶,一條為 80-kDa,第二條為 65-kDa。在反式互補測定中，將Sf9_vp80細胞用Ac_AVp80桿狀病毒質粒轉染，並在p. t.96h和120h時通過EGFP特異性螢光監測病毒感染的擴散(圖15Ba_c)。在轉染的Sf9-vp80細胞中觀察到病毒噬斑，證實了病毒在細胞之間傳播。然而，我們注意到發展出的噬斑的數量和大小明顯低於在Ac-wt杆狀病毒質粒轉染的Sf9細胞中觀察到的(圖15d)。作為對照，未轉基因的Sf9細胞當用Ac- Δ vp80桿狀病毒質粒轉染時，僅顯示單細胞感染(圖15Bc)。當使用Ac- Δ νρ80轉染的Sf9_vp80細胞的培養基來感染新鮮接種的未轉基因Sf9細胞時，觀察到「單細胞感染」表型(圖15Bb，右圖)。因此，從反式互補產生的BV粒子能夠進入細胞，但是不能產生新的BV。這也顯示出在Sf9-vp80細胞中，Ac- Δ vp80不能通過從宿主細胞獲取轉基因回復成Ac-wt。正如預計的，在接受來自Ac-Λ VP80轉染的未轉基因Sf9細胞的上清液的Sf9細胞中，沒有檢測到EGFP信號(圖15Bc，右圖)。在p. i. 6天，將從用Ac-Λ VP80桿狀病毒質粒轉染的Sf9-vp80細胞釋放的感染性BV的數量，與用Ac_wt轉 染的Sf9細胞中產生的數量進行了比較。該實驗顯示，目前的反式互補系統與經典的基於Sf9的生產系統相比，產生BV的效率低約25倍(圖15C)。反式互補並且複製缺陷的Ac_vp80null病毒能夠表達高水平重組蛋白為了評估vp80基因缺失對重組蛋白表達水平的影響，執行了實驗室規模的比較性生產測定。在這裡，將Sf9細胞用三種類型的杆狀病毒毒種以MOI=IO平行感染，即(i)Ac-wt> (ii ) Ac- Δ vp80-Flag · vp80 (者都在 Sf9 細胞中產生)和(iii ) Ac-Δ vp80 (在Sf9-vp80細胞中產生)，它們都編碼EGFP。Western印跡圖譜顯示，對於所有三種測試的杆狀病毒基因型來說，EGFP蛋白都以相同水平表達，在此用作對照目的的GP64糖蛋白也是如此(圖16A，上圖)。在p. i. 48和72h時，通過ELISA對被感染細胞裂解物中的EGFP相對量進行定量(圖16B)，並且在三種測試的杆狀病毒基因型之間，EGFP水平沒有顯示出任何統計顯著的差異。因此，結果證實了反式互補的Ac-Λ VP80毒種，儘管在病毒複製方面有缺陷，但與常規的杆狀病毒表達載體一樣能夠生產重組蛋白，只要初始感染複數高得足以感染所有細胞即可。此外，在生產培養期間，沒有檢測到帶有vp80基因的回覆突變病毒基因型，因為在免疫印跡中沒有檢測到重新表達的Flag ·νΡ80蛋白(圖16Α)。理論上說，與反式互補的毒種結合的一定量Flag · VP80蛋白進入昆蟲細胞，但這在感染後的極晚期時間不再檢測到，並可能通過溶酶體或蛋白酶體介導的活性被降解。在同一個實驗中，在源自於用Ac- Δ vp80毒種接種的Sf9細胞的細胞培養上清液中沒有記錄到BV釋放(圖16C)，證實了既沒有發生回復突變病毒的產生，也沒有發生野生型病毒的汙染。總結在本研究中，我們致力於常規的基於杆狀病毒的表達工具的改進，其目的在於從製造的重組蛋白中消除汙染性杆狀病毒後代。這種努力由製藥前景強烈驅動，因為重組杆狀病毒表達的治療藥正越來越多地用於人類醫學和獸醫學。因此，我們的目的是鑑定杆狀病毒基因，對其的靶向引起杆狀病毒毒粒生產的缺陷，但是不影響或僅僅輕微影響極晚期基因的表達。通過這種方式，將為異源基因的高水平表達提供安全保護。圖17中顯示了以vp80基因為實例的新技術的概覽。利用基於杆狀病毒質粒的工程化，本發明人構建了缺少vp80基因的AcMNPV基因組(圖17B)。功能基因組學和電子顯微術分析揭示出vp80缺陷阻止了 BV和ODV兩者的產生。並行地，對Sf9細胞進行工程化來生產VP80，以反式互補Ac-AvpSO敲除的杆狀病毒質粒(圖17A，C)。最後，我們證明了反式互補並且複製缺陷的杆狀病毒毒種能夠產生與常規杆狀病毒載體所產生的相似量的重組蛋白(圖14D)。表I. PCR引物依文本中出現次序的列表。CN 102686732 A 0. S 301/42 矧 S I.C
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權利要求
1.用於生產生物藥品的方法，所述方法包含 (a)用至少ー種杆狀病毒感染生產生物藥品的昆蟲細胞，所述至少一種杆狀病毒包含編碼所述生物藥品的基因組；以及 (b)將生產生物藥品的昆蟲細胞維持在使生物藥品得以生產的條件下， 其中所述至少一種杆狀病毒的基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷，或其中所述生產生物藥品的昆蟲細胞包含使杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因失活的表達控制系統。
2.權利要求I的方法，其中通過核苷酸取代、插入或缺失，使所述基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因有缺陷。
3.權利要求I的方法,其中生產生物藥品的昆蟲細胞是重組昆蟲細胞,所述重組昆蟲細胞包含表達對杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因有特異性的dsRNA的構建物，所述dsRNA任選在誘導型啟動子下表達。
4.權利要求I至3任ー項的方法，其中所述至少一種杆狀病毒在步驟(a)之前，在表達杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的互補拷貝的杆狀病毒生產細胞中產生。
5.權利要求I至4任ー項的方法，其中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因選自 vp80、vp39、vpl054 和 ρ6· 9。
6.權利要求I至5任ー項的方法，其中與來自野生型杆狀病毒的極晚期表達相比，杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因的缺陷或失活不影響來自所述杆狀病毒的極晚期表達。
7.權利要求I至6任ー項的方法，其中所述至少一種杆狀病毒源自於AcMNPV或BmNPV。
8.權利要求I至7任ー項的方法，其中生物藥品是重組蛋白、重組病毒或病毒樣粒子。
9.權利要求8的方法，其中生物藥品是重組AAV。
10.權利要求I至9任ー項的方法，其中生物藥品由導入到重組杆狀病毒基因組中在多角體蛋白或Pio啟動子控制下的至少ー個基因編碼。
11.杆狀病毒-昆蟲細胞系統在生物藥品生產中的應用，其中所述杆狀病毒-昆蟲細胞系統包含用至少ー種重組杆狀病毒感染的生產杆狀病毒的昆蟲細胞，其中 -所述或每種重組杆狀病毒包含編碼生物藥品或生物藥品的至少ー個組分的杆狀病毒基因組，並且 -所述或每種重組杆狀病毒基因組中所述杆狀病毒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷，或者生產杆狀病毒的昆蟲細胞包含使杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的所述至少ー個基因失活的表達控制系統。
12.包含杆狀病毒基因組的杆狀病毒質粒，其中所述基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷，優選其中所述杆狀病毒基因組的vp80、vp39、vp 1054或p6. 9有缺陷。
13.重組杆狀病毒載體，優選為AcMNPV杆狀病毒載體，其中所述杆狀病毒的基因組中杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有缺陷，優選其中所述杆狀病毒基因組的vp80、vp39、vpl054或ρ6· 9有缺陷。
14.昆蟲細胞,其用權利要求13的杆狀病毒載體感染。
15.昆蟲細胞，其包含表達對杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因有特異性、優選針對vp80、vp39、vpl054或ρ6· 9的dsRNA的構建物，所述構建物優選整合在昆蟲細胞的基因組中。
16.昆蟲細胞，其包含編碼杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因的表達盒。
17.權利要求16的昆蟲細胞，其中所述基因是vp80、vp39、vpl054和/或ρ6·9。
18.用於生產杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的至少ー個基因有缺陷的杆狀病毒的方法，所述方法包含用權利要求12的杆狀病毒質粒轉染權利要求16或17的昆蟲細胞的步驟，其中所述杆狀病毒質粒有缺陷的杆狀病毒毒粒正確裝配所必需的基因，是由包含在所述昆蟲細胞中的表達盒所編碼的基因。
19.用於篩選杆狀病毒基因的方法，所述杆狀病毒基因的失活可用於在昆蟲細胞-杆狀病毒系統中生產不帶有汙染性杆狀病毒毒粒的生物藥品，所述方法包含 a)提供含有杆狀病毒基因組的細胞的細胞培養物； b)將所述細胞培養物與用於失活所述杆狀病毒基因組的至少ー個被測杆狀病毒基因的手段、例如與RNA幹擾相接觸；以及 c)測試來自所述細胞培養物的毒粒形成，與未接觸所述手段的細胞培養物的毒粒形成進行比較； 其中如果被測基因的失活引起杆狀病毒毒粒形成的減少，則所述被測基因被選為可用於生產生物藥品。
20.權利要求19的方法，其還包含步驟d)，所述步驟d)測試與所述手段相接觸的細胞培養物的極晚期基因表達，與未接觸所述手段的細胞培養物的極晚期基因表達進行比較； 其中如果被測基因的失活引起杆狀病毒毒粒形成的減少並且如果被測基因不影響所述杆狀病毒基因組的極晩期基因表達，則所述被測基因被選為可用於生產生物藥品。
全文摘要
本發明涉及利用基於杆狀病毒的系統來生產生物藥品的方法。這些方法有利地允許生產汙染性杆狀病毒毒粒的數量減少或沒有的生物藥品。
文檔編號C12N15/866GK102686732SQ201080045629
公開日2012年9月19日 申請日期2010年8月5日 優先權日2009年8月17日
發明者奧託-維海姆·莫騰, 莫尼克·凡奧爾斯, 馬丁·馬爾科 申請人:吉尼松公司