含硫醚橋的肽的細菌表面展示和篩選的製作方法

2023-09-23 07:25:55 6

專利名稱：含硫醚橋的肽的細菌表面展示和篩選的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質工程和篩選治療性相關肽的領域。更具體地，涉及翻譯後修飾的異源性蛋白質的細胞表面展示。在微生物(例如細菌)表面的蛋白質或肽的異源展示是有用的研究手段，並已經與寬範圍的有趣的應用相關聯。將蛋白質或肽功能與編碼的基因相連接能夠從大的組合的文庫中篩選和/或最優化具有期望性質的肽。已經開發了多種展示形式，包括核糖體展示、噬菌體展示、細菌表面展示和酵母展示。噬菌體展示或許是最為熟知的系統。
背景技術：
細胞表面展示的一個最有趣的應用是從大文庫中選擇對感興趣的治療性的靶分子高親合的配體。迄今，只展示過線性肽、二硫鍵連接的環肽和與有機核耦合的肽。這導致了多種有用的肽的鑑定，包括治療有效性(前導)肽。然而，已經認識到這些肽對蛋白質水解的敏感性和不穩定性為其治療應用的主要缺點。轉譯後向肽中引入環狀結構，例如硫醚交聯，可避免這些穩定性問題。然而，目前，仍然難於有效地將這樣的結構引入到合成肽中，尤其是大的肽中。

發明內容
本發明旨在提供允許脫氫胺基酸和或含硫醚肽的細胞表面展示的新型展示系統。為此，構建了獨特的重組核酸構建體，其編碼融合肽，所述融合肽除了包含將被環化的肽序列外，還包含特異性功能元件的組合。驚奇地發現環狀結構易於被表達所述構建體並包含用於抗生素的生物合成和輸出的裝置的宿主細胞，例如乳酸菌(Lactococcus lactis)的表面製造或展示。更具體地，本發明提供了編碼融合肽的分離的核酸序列，所述融合肽從N端到C端至少包含如下元件:(a) N端羊毛硫抗生素前導序列(b)將被翻譯後修飾成含脫氫殘基或硫醚的多肽的感興趣的胺基酸序列(c)親水跨細胞壁結構域(d)分選酶識別基序(e)疏水跨膜結構域(f)C端帶電荷的膜錨定結構域。本發明的其它方面涉及包括所述分離的核酸的表達載體、包括所述表達載體的宿主細胞和包括多個宿主細胞的宿主細胞文庫。本發明還可應用於生產表達含脫氫殘基的肽的宿主細胞(的文庫)。所述特異性核酸構建體允許開發同時用於編碼的肽的轉譯後酶修飾及修飾的(環化)肽的展示的細菌宿主細胞。本領域中已知的其它展示系統如噬菌體展示理論上可適於表達和展示可被化學手段環化 的肽，例如二硫橋肽的鹼輔助脫硫(Galande等，2003Biopolymers71，534-551)。然而，觀察到鹼性環境嚴重地減小了噬菌體的存活率和感染性。相反，本發明允許使用高度有活力的革蘭氏陽性宿主細胞，尤其是乳酸菌，所述宿主細胞可例如在篩選期間抵抗嚴酷環境。此外，通過化學手段的環封閉不是立體和區域特異的；具有形成二硫鍵橋的兩個L-Cys殘基的特定的肽將產生3種非對映的含羊毛硫氨酸的肽的混合物，羊毛硫氨酸的的構型為LL、LD和DL。相反，羊毛硫氨酸酶裝置只產生DL-立體異構體，並且在多個環的情況下，只有一個環模式。此外，不需要進行具有不確定的產率的使成本上升的反應步驟；修飾和展示全部為細菌系統所固有。再進一步，(乳酸)細菌的尺寸足夠大以使用FACS分析來篩選。已經說明羊毛硫抗生素合成酶在膜結合複合物中被組織(Siegers等，1996.J.Biol.Chem.271，12294-12301 ；Kiesau 等，1997.J.Bacteriol.179，1475-1481 ；Sahl 等1998.Annu.Rev.Microbiol.52:41-7)。這個複合物由羊毛硫抗生素轉運體(LanT)、脫水酶(dehydrating enzyme) (LanB,也稱為脫水酶(dehydratase))和環化酶(LanC)組成。在一些羊毛硫抗生素的情況中，由雙官能酶(LanM)進行脫水和環化步驟。在核糖體中合成的前多肽原的N端羊毛硫抗生素的前導序列為羊毛硫抗生素酶的識別序列，開始於脫水酶或同時進行脫水和環化的酶。認為所述前導序列結合到所述羊毛硫抗生素複合體上以使所述前多肽原接近所述羊毛硫抗生素酶。所述酶複合體暗示所述脫水和環化酶需要附著到轉運體上，否則羊毛硫抗生素前多肽原將不經修飾被輸出，或者修飾的肽將在細胞內聚集。在多數情況下，羊毛硫抗生素的轉運完全依賴於專用的羊毛硫抗生素轉運體。顯示乳鏈菌肽轉運體(NisT)的破壞引起完全修飾的乳鏈菌肽前體在細胞內的積累(Qiao等1996.FEMS Microbiol.Lett.144，89-93)。Kuipers等以前證明羊毛硫抗生素轉運體NisT可分泌未修飾的羊毛硫抗生素和前導肽與非羊毛硫抗生素肽的融合體，並且在無環化酶的情況下，脫水酶和羊毛硫抗生素轉運體的結合也是功能性的(2004.J.Biol.Chem.279，22176-22182)。上述六個不同的元件在單個融合蛋白中的具體組合和相對順序在現有技術中未知或不可從現有技術中推導出來。申請人:名下的W02006/062398公開了幾種羊毛硫抗生素前導肽及它們的應用，例如在融合蛋白中生 產將被脫水酶轉譯後脫水的感興趣的肽。根據W02006/062398，所述前導肽和將被修飾的肽前面有非羊毛硫抗生素輸出信號，例如SEC輸出信號。所述輸出信號和前導肽可被細胞錨定序列分離，例如LPTX-分選酶識別基序。W02006/062398沒有公開元件
(c)、(e)和(f)。Moll 等，Antonie van Leeuwenhoe Vol.97, N0.4, 2010, 319 333 頁為非羊毛硫抗生素肽中脫氫胺基酸和羊毛硫氨酸的微生物工程的綜述。通常教導肽中羊毛硫氨酸的微生物工程可允許產生獨特文庫和伴隨的展示系統。沒有提及如何技術上獲得這樣含羊毛硫氨酸的肽的文庫，更沒有提出本發明的涉及展示具有轉譯後引入的環狀結構的肽的獨特的方法。相反，本領域技術人員將選擇更常規的方法，例如含二硫鍵的肽的噬菌體展示，然後化學環閉合。Rink 等(2010) J.0f Pharmac.And Toxic.Methods, Vol.61, N0.2, 210 218 頁涉及通過D胺基酸和環化來穩定多肽藥物。將感興趣的肽直接或通過間隔子遺傳地融合到羊毛硫抗生素前導肽上。未提及轉譯後環化的肽的細胞表面展示。Leenhouts 等(1999) Antonie van Leeuwenhoe, Vol.76, N0.1-4, 367 376 頁公開了幾種將蛋白質錨定到細胞壁的方法，包括LPXTG錨定基序。還教導帶電荷的尾部和疏水結構域可作用為定位所述用於蛋白質裂解的靶定基序的臨時終止子。如在W02006/062398中，結合所述Sec信號序列和SEC介導的輸出討論了所述元件。Leenhouts未提及任何革巴定基序與將被所述羊毛硫抗生素裝置識別的元件的組合。任何類型的羊毛硫抗生素前導序列可被用於實踐本發明，只要其可被至少一種羊毛硫抗生素脫水酶識別，還優選可被可形成羊毛硫氨酸橋的環化酶識別。在一個實施方式中，本發明的多肽中的前導肽具有羊毛硫抗生素前導共有基序，所述前導共有基序可源自已知羊毛硫抗生素前導肽的胺基酸序列比對。羊毛硫抗生素前導肽的胺基酸序列可從公共文庫獲得。例如，申請人名下的W02006/062398的表IA和表IB展示了羊毛硫抗生素前導肽的示例性比對。本領域技術人員能夠從比對的序列得到共有基序，例如用公共或商購的比對軟體，例如Vector NTI的AlignX。AlignX用ClustalW算法同時對蛋白質和核酸序列進行多序列比對。其繪出同源、序列複雜性、系統樹和點矩陣同源圖。AlignX接受標準的、富含特徵的、序列的文本文件，例如GenBank、EMBL和GenP印t文件。在一個實施方式中，使用ClustalW算法表I中的序列推導出所述共有基序。優選前導肽共有基序源自至少5種、更優選至少10種、最優選至少15種已知前導肽序列的比對。然後，用本領域中已知的方法驗證由此獲得的共有基序的前導肽活性，即被羊毛硫抗生素脫水酶識別和絲氨酸或蘇氨酸的脫水。可使用Mald1-TOF MS監控給定的靶序列，例如ITSISRASVA的脫水。

所述前導肽共有序列可包含各種共有序列，例如共有基序X1-D/E-E-V/L-S/T-D/E-X2-E-L-D/E，其中，Xl為任何疏水胺基酸，並且其中X2為任何胺基酸。例如，它包含序列LEEVSEQELD。在另一個實施方式中，前導肽包含共有基序F-D/E/N-L-D/E/N-X3，其中，X3為L、I或V。例如，它包含序列LFDLDL或FNLDV。例如，所述前導序列還可包括共有的包含 ILELQNLD 的 I/L-L/F-D/E/N-L-Q-D/N/A/S/T-L/M-D/E。所述前導肽可由共有序列，例如FNLDV組成，後面是所述共有序列和修飾前肽之間的間隔序列。需要該間隔序列在羊毛硫抗生素修飾酶的催化中心可及的範圍內帶來可修飾的部分(Annechien Plat, LeonD.Kluskens, Anneke Kuipers, Rick Rink, Gert N.Moll (2010))。N 端結構域和間隔子對乳鏈菌肽前導肽的功能來說是充足的(Appl.Environ.Microbiol.77, 604-611)。另一方面，已經報導對於羊毛硫抗生素誘變素(Chen P等，FEMS MicrobiolLett.2001; 195 (2): 139)、P印5 (Neis S 等，FEMS Microbiol Lett.1997; 149 (2): 249)和乳鏈菌肽(Van der Meer 等，(1994) J.Biol.Chem.269，3555-3562.)，一些保守的前導肽殘基對所述羊毛硫抗生素的生物合成是必需的，而其它殘基對最佳生物合成速率來說重要。在優選的實施方式中，核酸序列編碼羊毛硫抗生素的前導肽，例如選自由細菌素J46、乳鏈球菌素481、唾液素B、Macedonin、乳桿菌素AM49、乳桿菌素AFF22、唾液素G32、唾液素9、誘變素I1、Variacin, MukAU MukA2/A3、MukA』、乳鏈球菌素3147A1、葡萄球菌素C55a、Butyri vibriocin0R79> RuminococcinA、BovicinHJ50> Thermophi I in 1277 > 溶細胞素 LL、溶細胞素 LS> Sublancinl68、LichenicidinBeta、NukacinISK-K NukacinKQU-131、唾液素A4、唾液素A5、唾液素A2、唾液素A、唾液素A3、唾液素Al、植物乳桿菌素Wb、HaloduracinA2、乳鏈球菌素3147A2、葡萄球菌素C55b、Gallidermin、葡萄球菌素T、表皮素、乳鏈菌肽Z、乳鏈菌肽Q、乳鏈菌肽F、乳鏈菌肽A、EricinA, EricinS,枯草菌素、乳鏈菌月太 U、Epicidin280、Pep5、EpilancinK7、SffLPK Streptin、LichenicidinAlphaMersacidin、Actagardine、BHT-A2、SmbB> BHT-AK SmbA、植物乳桿菌素 ASMl、植物乳桿菌素ffa> HaloduracinAl、誘變素 1140/111、誘變素1、MichiganinA、肉桂黴素、乳桿菌素 S、AmfS(灰色鏈黴菌(S.griseus) )、SapB> AmfS (除蟲鏈黴菌(S.avermitilis)) RamS2> RamSl、迷宮肽素A1/A3、迷宮肽素A2或允許被期望的羊毛硫抗生素修飾酶識別和修飾的感興趣的下遊定位肽的這些前導肽的任何同系物組成的組中的所述羊毛硫抗生素的前導肽。所述同系物顯示與W02006/062398的表I和表2中展示的前導肽序列的一個，Plat等(2010) Appl.Environ.Microbiol.77，604-611顯示的前導肽序列的一個，或Li等(2010)，美國科學院院幹IJ，107 =10430-5.)提到的前導肽至少70%、優選至少80%、更優選至少90%，像92%、95%或甚至98%的序列一致性。例如，所述前導肽可為仍能夠誘導感興趣的肽的翻譯後修飾的被截的和突變的羊毛硫抗生素前導肽。所述前導不需要具有被例如LanT的羊毛硫抗生素轉運體誘導移位的能力，因為這個功能可被可存在於本發明的多肽中的非羊毛硫抗生素輸出信號接替。在具體的方面，所述前導肽為乳鏈菌肽前導肽或其被截的或突變形式，其中在N端的多達4個胺基酸和/或其中在C端的多達5個胺基酸的任一個突變。所述羊毛硫抗生素前導序列後面為將要被修飾的肽。所述修飾包括脫水，優選跟隨環化。只要相關的酶裝置存在，可由所述宿主細胞自身進行環化。或者，脫水的肽可通過在高PH下脫氫胺基酸與半胱氨酸的反應參與環化。將明確感興趣的肽可為任何期望通過脫水和環化羊毛硫抗生素酶來修飾的肽。典型地，設計感興趣的肽，以便在一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基轉譯後脫水後，所述脫水殘基可被連接至半胱氨酸(通過宿主細胞或體外)，以便形成硫醚環狀結構。同時，在肽中的必需的任何期望位點可引入穩定化的環狀結構。特別感興趣的是具有生物活性的肽，例如用於治療用途的肽，因為一個或多個硫醚環的引入通常提高肽的生物穩定性。此外，可使用環狀結構以肽的改變生物活性，例如，受體結合親和性或酶的特異性。感興趣的肽為，例如激素，酶抑制劑，酶激活劑，受體配體，抑制肽，羊毛硫抗生素蛋白，病毒蛋白，真核蛋白，其突變體(例如特定地設計以允 許在特定位點上的修飾)，其相似、同源或功能性等價片段。這樣的肽的實例為胰高血糖素-(1-29)、腸促胰島素/胃泌激素抑制肽、腸抑素、nesfatin-Ι、血管緊縮素-(1-9)、apelinl2、ACTH-(1-24)、瘦素 22-56、IL-1 α (223-250)、IL-1 β (208-240)、胰高血糖素樣肽1、胰高血糖素樣肽2(1-33)、神經肽S、δ睡眠肽、甘丙肽樣肽、黑色素濃縮激素、小腦肽、神經肽W-23、神經肽W-30、運動升壓素、甘丙肽、CART-(62-76)、皮質抑素17、促黑激素的增效因子、心血管調節肽-β、神經肽Y、心鈉素、腦鈉素、樹眼鏡蛇利鈉肽、c型利鈉肽(32-53)、C型利鈉肽(1-53)、血管鈉、降鈣素、C-原降鈣素、N-原降鈣素、骨鈣素、ρΤΗ(1-38)、ρΤΗ相關蛋白質(1-40)、pr印tin、骨抑素(1-5)、生長激素釋放因子、W3R5腦腸肽1-5、人生長激素(1-43)、KGF受體肽、表皮有絲分裂抑制五肽、BPP金槍魚肌肉、水蛭素(54-65)、緩激肽、尾加壓素I1、血管緊縮素A、腎抑制劑、血管生成素-(118-123)、血小板因子4-(58-70)、內皮縮血管肽1-(11-21)、大內皮縮血管肽-(19-37)、胸腺素￠4(16-38)、心血管調節肽-β、alloferonl、皮質抑素29、促吞噬肽、C-反應性蛋白質-(174-185)、CKS17、pseudin2、抗炎肽1、典型的MSH-四肽、原骨膠原類型1、凝血酶受體結合肽、血小板凝集素-1片段、基板糖蛋白質片段、IFN-α受體識別肽1、天青蛋白質片段、valorphin、痛敏肽、α酪蛋白質90_96、β酪啡肽、α_新內啡肽、筋外啡肽A5、筋外啡肽B5、筋外啡肽C、強啡肽Α、α內啡肽、β內啡肽、hemopressin、甘丙素-(1-19)、生長激素抑制素、腎上腺髓質素、膜聯蛋白質Al、鈴蟾肽、bradikinin增效劑B、bradikinin增效劑C、脫硫的雨娃肽、降I丐素基因相關肽、縮膽囊肽、exendin3、exendin4、acetalin、P物質、促皮質素釋放因子、δ啡肽I1、皮啡肽、水蛭蛋白酶抑制劑C、章魚唾腺精、內嗎啡肽1、內嗎啡肽I1、GMAP16-41、GIP6-30、毒蜥素、血細胞激肽1、援木蛙肽、促黑激素、肛褶蛙肽、抑咽側體神經肽、鈣蛋白酶抑素-(184-210)、kinogen類凝血酶抑制劑、吻素、LL37、黃峰毒素、神經肽E1、蜂毒肽、嗎啡調節肽、α-促黑細胞激素(MSH)、神經內分泌egulatory肽-1/2、神經激肽A/B/C、neurostatin、神經肽FF、神經肽Y、神經降壓素、肥胖抑制素、催產素、orphan GPCR SP9155agonist p518、胰抑素、胰腺多肽、肽T、肽YY、泡蛙肽、PACAP_27、pneumadin、催乳素釋放肽、心血管調節肽-α、娃皮降壓肽、scyliorhinin 1/11、分泌素、P物質、胸腺素ct1、胸腺素β4、胸腺素β 10、trail mimetics、尿皮素I/II/II1、尾加壓素1/11、血管加壓素、PHM-27、VIP、澱粉不溶素、抗纖維蛋白質polymerant、GHRH、IGF-U IGF-2、RELAXIN-1/2/3、胰島素樣肽_3/4/5/6、富組蛋白_5、鹼性抗生胜肽、蛙皮素1、C型利鈉肽、vasonatrin、δ睡眠肽誘導肽、α樹眼睛蛇毒素、鋸鱗蝰素、抵禦素1、尿皮素、小心臟活性肽A和B、ceratotoxinA、小腦肽、北非蠍毒素、芋螺升壓肽G、α -芋螺毒素El、corazonin、亮氨酸腦啡肽、蛋內啡肽、促性腺素釋放素I1、tocinoic acid、促腎上腺皮質激素抑制肽、促腎上腺皮質激素釋放因子、肽XY、腦源性酸性成纖維細胞生長因子、腦源性鹼性成纖維細胞生長因子、人生長激素、生長激素釋放因子、鳥苷素、細胞間粘附分子、HIV抗原肽gpl20、HIV抗原肽I片段(gp41)、HIV抗原肽5、HIV蛋白酶抑制劑、胰島素樣生長因子-1、IGF 1169-84、白細胞介素片段、白細胞介素II片段、白細胞激肽1、白細胞焦激肽、蠕動素、神經肽Y、內啡肽、ras致癌基因相關肽、促紅細胞生成素片段、表皮生長因子、轉化生長因子、白灰制菌素、神經生長因子、筋外啡肽、豹鰨劑、短桿菌酪肽、肥大細胞脫粒肽、腫瘤壞死因子、RGD肽、促胸腺生成素、速激肽、殺菌肽、任何病毒多肽或使用其中存在絲氨酸/蘇氨酸及如果希望，半胱氨酸的半隨機引物獲得的肽。 所述肽也可為羊毛硫抗生素(的上述突變體)，非羊毛硫抗生素(的突變體)，例如 bavaricin MN、腸球菌素 P(enterocin P)、mesentericin Y105、片球菌素PA-1 (Pediocin PA-1)、萬苣苦索 F(lactacin F)、乳球菌素 G(LactococcinG)、植物乳桿菌菌素EF、植物乳桿菌菌素JK、乳球菌素A、乳球菌素972、植物乳桿菌菌素A、curvacin A、divercinV41、腸球菌素 A (enterocin A)、muntcidin、sakacin P> leukocin A、肉食桿菌素(Carnobacteriocin) B2 > c lost icin574> circular in A、小菌素(microcin) J25、乳酸菌素 A或AS48。所述羊毛硫抗生素或細菌素可包含或不包含它們自己的前導肽。當然，如果它除了上面定義的羊毛硫抗生素前導肽外還包含其自身的前導肽，將被脫水酶識別的前導肽和被修飾的殘基之間的距離將變得相對較大。因為這個原因，優選可去除它自身的前導肽，以便在整個多肽構建體中，只存在一個羊毛硫抗生素前導子。在特定情況下，例如，如果自身的前導肽小，例如在circularin A、小菌素J25、乳酸菌素A和AS48的情況，另外的前導序列的存在可能不會消極影響感興趣的肽的修飾。甚至可設想不同的前導肽(例如羊毛硫抗生素前導肽及細菌素前導肽)的存在是有益的，因為這允許不同的修飾酶的識別和修飾。這裡提供的核酸構建體的進一步以將被修飾的編碼的肽序列中的3』的存在為特徵，這是編碼所述跨細胞壁的結構域的序列。這個結構域可跨例如革蘭氏陽性宿主細胞的肽聚糖層，並從而確保修飾的胺基酸序列在宿主細胞的細胞表面展示。非常合適的間隔結構域可衍生自或基於乳酸菌的多域細胞膜蛋白酶的跨細胞壁結構域。典型地，所述間隔子結構域包含相似或甚至相同的胺基酸拉伸物的幾個重複。在一個實施方式中，所述跨細胞壁結構域包含金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白質A(PrtA)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)的 prtH、釀胺鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的 scpA 或無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的csp的跨細胞壁結構域的胺基酸序列，或能夠跨在其上展示它們的宿主細胞的細胞壁的其功能類似物或片段(Siezen，1999，乳酸菌的多域細胞膜蛋白酶，A.van Leeuwenhoek76:139-155)的胺基酸序列。在具體的方面,所述核酸構建體僅包括負責跨細胞壁和膜靶定的葡萄球菌蛋白質A或鏈球菌蛋白質G的編碼區(參考，例如Navarre和Schneewind，1999，革蘭氏陽性細菌的表面蛋白質和它們靶定到細胞壁膜的機制，Microbiol.Molecul.Biol.Rev.，63:174-229)。跨細胞壁結構域後面為分選酶基序。分選酶，即參與將金黃色葡萄球菌的一些表面蛋白質共價連接到肽聚糖上的酶，在表面蛋白質的展示和在該重要的人類病原體的毒性中起重要的作用(Marraffini 等，2006:Microbiol.Mol.Biol.Rev.70:192-221)。共價連接由被稱為「分選酶識別基序」或「分選酶基序」的類別信號決定，該類別信號後面為由約20個胺基酸組成的疏水結構域和正電荷胺基酸尾部組成的疏水域。分選酶基序在本領域中已知，參考(1999)Microbiol Mol Biol Rev63:174 - 229，pmid: 10066836 或US7, 238，489。在許多革蘭氏陽性細菌中已經報導了這個機制。最優的基序可取決於將使用的宿主細胞。圖1C顯示了乳酸乳球菌(A面)和金黃色葡萄球菌N315 (B面)的分選酶基序的共有序列。在一個實施方式中，所述分選酶識別基序包含胺基酸序列LPXTG，其中X可為胺基酸D、E、A、N、Q或K，優選地，其中，所述分選酶識別基序由LPKTG組成。分選酶識別基序後 面為能夠跨宿主細胞雙層脂膜的疏水結構域，可選擇通過間隔子序列連接。跨膜結構域通常具有20至30個胺基酸的長度。優選的殘基包括Ala、Pro、Gly、Phe, Leu、lie、Val、Met。在一個實施方式中，所述跨膜結構域包含序列PAFG、FGFL,LGVIV、VIVVIL、ILMGV 和 / 或 GVLGL。在具體的方面，它包含序列 PAFGFLGVIVVILMGVLGL。所述前導構建體的修飾和輸出在幾個方面高度出人意料:I)這個C端固定化多肽的修飾出人意料。先前沒有通過羊毛硫抗生素酶修飾N端或C端固定化肽的報導。該多肽通過接近於C端的疏水部分錨定到膜上。這意味著C端是不游離的，並且肽被固定。在天然乳鏈菌肽中，有8個位置被脫水，並且安裝了 5個環。因此，肽必須沿酶移動，或酶沿著肽移動。由於膜錨定，肽和修飾酶彼此之間移動可被C端固定所阻礙，所以這個修飾出人意料。由於8個脫水的質量峰完全缺失，這與在10%的情況下只有Ser33免於脫水的8倍脫水的天然乳鏈菌肽形成對比(乳鏈菌肽的翻譯後修飾。NisB參與脫水過程。Karakas Sen A等，Eur J Biochem.1999261:524-32),所以確實發生了阻礙。儘管有這個阻礙，仍出人意料地發生7倍、6倍和5倍的脫水(圖7C)。2)由於多肽的長度，輸出出人意料。在科學文獻中，被羊毛硫抗生素酶修飾的最長的肽為48個胺基酸(通過乳酸乳球菌的含脫氫胺基酸的肽的製備，Rink R等，EnvironMicrobiol.200773:1792 6)。本修飾和輸出的構建體的長度為186至210個胺基酸，幾乎是截至目前報導的最長的羊毛硫抗生素酶修飾的肽的4倍長。3)輸出未被接近於C端的疏水部分阻礙。乳鏈菌肽前導肽為親水性，並且如果存在前導肽酶，那麼會在培養基中發現前導肽，即該前導肽不會保持附著在膜或細胞壁上。這表明乳鏈菌肽轉運體形成水通道。這與其它信號肽例如sec和tat信號肽相反，這些信號肽具有疏水片段，這樣它們保持在膜中。在後面的情況下，需要信號肽酶以將所述轉運的肽或蛋白質釋放到培養基中。通過使用具有與C端接近的疏水序列的構建體，將預期這種將多肽錨定在膜中的疏水序列阻礙了通過羊毛硫抗生素轉運體的轉運。令人意外的是，多肽的輸出完全沒有被疏水膜錨定阻礙，而是通過羊毛硫抗生素轉運系統發生。由於識別LPXTG基序的分選酶位於細胞膜的外面，同樣出人意料的是，多肽顯然為將多肽連接到細胞壁上的分選酶作用的底物。4)完整多肽的輸出出人意料地在羊毛硫抗生素轉運體、接近於C端的疏水部分和帶電荷的C端胺基酸KRKQREE的聯合作用下增強。實施例4中清楚的證明，C端的切斷導致降解。這可能由允許細胞內肽酶降解多肽阻礙其完整轉運的不充分的輸出引起的。編碼蛋白質底物的C端由用於膜靶定的帶電荷的尾部組成。在一個實施方式中，所述帶電荷的膜靶定結構域具有至少4個胺基酸殘基的長度，優選其中至少50%的殘基為帶正電荷的胺基酸、更優選為賴氨酸和/或精氨酸殘基。融合肽包含一種或多種另外的序列基序可以是有益的。例如，可在元件(b)和(C)之間引入至少一個蛋白水解裂解位點，這樣可以在翻譯後修飾及表面展示後可釋放修飾的肽。有效的裂解位點在本領域中已知，並且包括因子Xa蛋白酶識別位點，如胺基酸序列IEGR0另一方面涉及包含根據本發明的核酸構建體的表達載體。優選地，設計載體以用於在革蘭氏陽性宿主細胞中表達所述構建體。例如，該載體包含一個或多個以下元件:可誘導的NisA啟動子、乳鏈菌肽前導肽、乳鏈菌肽和乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的LPXTG細胞壁錨定基序的序列。還包括革蘭氏陽性宿主細胞，所述革蘭氏陽性宿主細胞包含這樣的表達載體並能夠將所述感興趣的多肽翻譯 後修飾為含脫氫殘基或硫醚橋的多肽。所述宿主細胞為，例如乳酸菌，優選地選自包含相關的羊毛硫抗生素生物合成酶和轉運體，例如NisB、C、T或SpaB、C、T 的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、化胺性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、雞葡萄球菌(Staphylococcus gallinarium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、變形鏈球菌(Streptococcus mutans)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)、胚牙乳桿菌(Lactobacillus piantarum)> 魚肉桿菌(Carnobacterium piscicola)、幾腸球菌(Enterococcus faecalis)、變異微球菌(Micrococcus varians)、鏈黴菌0H-4156 (Streptomyces 0H-4156)、肉桂地鏈黴菌(Streptomyces cinnamoneus)、灰藤黃鏈黴菌(Streptomyces griseoluteus)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibriosolvens)、同八丈島鏈輪絲菌(Streptoverticillium hachijoense)、Actinoplanes linguriae、活潑瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、馬其頓鏈球菌(Streptococcus macedonicus)、波比斯鏈球菌(Streptococcus bovis)。特別感興趣的是包含多個根據本發明的宿主細胞的宿主細胞文庫，其中，所述文庫的每種細胞都在其細胞表面展示不同的含脫氫殘基或硫醚橋的多肽。這個文庫非常利於用於篩選新型有用的環肽，如新型環狀親和標籤、例如肽藥物的環狀生物活性肽、受體配體、環狀抑制肽。有利地，文庫的構建包含在包括核苷酸的混合物的寡核苷酸合成中在每個位置整合的簡併密碼子的使用。例如，整套標準胺基酸用NNK或NNS密碼子編碼，其中N為A、T、C或G，並且K=G或T，且S=C或G，因而排除了 TAA或TGA終止密碼子。表達候選親和標籤的宿主細胞可與固定結合配體接觸以選擇高親和度結合序列。因此，還提供了用於識別能夠結合到感興趣的靶實體的含脫氫殘基或硫醚的多肽的方法，所述方法包括步驟:(a)提供上述文庫；(b)從所述文庫選擇至少一種展示能夠結合到感興趣的靶實體的含脫氫殘基或硫醚的多肽的宿主細胞；和(c)識別在所述至少一種選定的宿主細胞上展示的多肽序列。在具體的方面，所述文庫包含多個候選環狀親和標籤序列，例如環狀鏈黴親和素標籤(Strep標籤)的變體。提供了識別能夠結合到生物素的包含硫醚橋的環狀鏈黴親和素標籤(Strep標籤)的方法，所述方法包含步驟:(a)提供包含多個含有根據本發明的表達載體並能夠將感興趣的多肽翻譯後修飾成含硫醚橋的多肽的革蘭氏陽性宿主細胞的文庫，其中，所述多肽包含胺基酸序列Ser/Thr-(Xaa)n-Cys或Cys-(Xaa)n_Ser/Thr,其中Xaa為任何胺基酸，並且η為I至5，優選η為3 ; (b)用固定化鏈黴親和素從所述文庫中選擇至少一種展示鏈黴親和素(Strep標籤)具有親和度的硫醚橋肽的宿主細胞；和(c)識別在所述至少一種選定的宿主細胞上展示的多肽序列。例如，兩輪使用塗布鏈黴親和素的磁珠的磁選(MACS)後，所選擇的細菌可被放在板上(plated)用於分析。宿主細胞也可被用作用於評估羊毛硫抗生素生物合成酶和/或轉運體活性的報告系統，其中，含硫醚橋的肽的有效細胞表面表達僅用作讀出。可通過本領域中已知的方法檢測細胞表面表達，包括抗 體檢測和固定到固體載體上。


MJA:本研究中使用的展示載體的遺傳組織。PnisA，乳鏈菌肽可誘導啟動子；前導子，乳鏈菌肽前導肽；NisA，乳鏈菌肽前體編碼序列；FXa，因子Xa識別位點；Strep-標籤，鏈黴親和素識別序列；3C，人鼻病毒蛋白酶識別序列。乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的細胞壁間隔子和細胞壁錨(cell wall anchor)(胺基酸1789 1912)。(a)N端羊毛硫抗生素前導序列；(b)將被翻譯後修飾成含脫氫殘基或硫醚橋的多肽的感興趣的胺基酸序列；(C)親水跨細胞壁結構域；(d)分選酶識別基序；(e)跨疏水膜的結構域；和(f)C端帶電荷的膜靶定結構域。相應的(多)肽產物被稱作相同的名字，沒有前面的「P」。SIB:截短的PTB5變體的遺傳組織。aa##表示乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的細胞壁錨的胺基酸數目。(a) N端羊毛硫抗生素前導序列；(b)將被翻譯後修飾成含脫氫殘基或硫醚橋的多肽的感興趣的胺基酸序列；(C)親水跨細胞壁結構域；(d)分選酶識別基序；(e)疏水的跨膜結構域；和(f) C端帶電荷的膜錨定結構域。圖1C:LPXTG基序的共有序列。上面:乳酸乳球菌的共有序列；下面:金黃色匍萄球菌N315的共有序列。M2:融合肽構建體的表達。A)考馬斯亮藍染色12%SDS_PAA凝膠和B)用抗乳鏈菌肽前導抗體對乳酸乳球菌NZ9000的細胞提取物的免疫印跡，其中所述細胞提取物具有質粒:1，ρΤΒ5，未誘導;2，pTB5 誘導；3，pTB5/pIL3BTC，未誘導；4，pTB5/pIL3BTC，誘導。:融合肽構建體的細胞表面位置。在乳酸乳球菌NZ9000細胞上進行全細胞ELISA以用於檢測表面展示的乳鏈菌肽前體錨定融合蛋白。允許兔子抗-乳鏈菌肽前導抗體結合到展示TB5的乳酸乳球菌細胞上。加入與山羊抗兔子IgG共軛的鹼性磷酸酶，並通過加入對硝基苯基磷酸鹽產生顏色。白色條，未誘導的細胞；灰色條，誘導的細胞。M4.在細胞表面展示修飾的乳鏈菌肽前體。AB面:對兩個具有或不具有修飾的酶的乳酸乳球菌NZ9000的細胞提取物的SDS-PAA凝膠平行分析。1，ρΤΒ5，未誘導；2，pTB5，誘導；3，pTB5/pIL3BTC，未誘導；4，pTB5/pIL3BTC，誘導；5，乳鏈菌肽前體。A)面:考馬斯亮藍染色12%SDS-PAA凝膠。B)面:用0.lmg/ml的胰蛋白酶覆蓋的對乳鏈菌肽敏感的乳酸乳球菌NZ9000菌株的12%SDS-PAA凝膠。在誘導依賴的考馬斯亮藍染色蛋白條帶的位點的凝膠B的泳道4的亮點證明融合蛋白的乳鏈菌肽前體部分被NisB和NisC修飾。C面):對展示活性乳鏈菌肽的乳酸乳球菌細胞的分析，其中所述乳酸乳球菌細胞具有含胰蛋白酶的對乳鏈菌肽敏感的乳酸乳球菌NZ9000菌株的覆蓋培養物(左面)，或具有用NisP生產的乳酸乳球菌菌株(右面)。NisP特異性切割產生活性乳鏈菌肽的乳鏈菌肽前導子。看作亮點的(圖C中白色圓圈/邊緣)該菌株的生長抑制清楚地證明了 NisB和NisC正確地修飾乳鏈菌肽前體，並至少形成TB5的環A、B和C (圖4C中的TB5表示為N15)。Ml.NisBC修飾的cAng-(l-7)的細胞表面展示。A:用於檢測表面展示的前導血管緊縮素(1-7)融合蛋白的在乳酸乳球菌NZ9000細胞上的全細胞ELISA。允許兔子抗-乳鏈菌肽前導抗體結合到展示TB2的乳酸乳球菌細胞。加入與山羊抗兔子IgG共軛的鹼性磷酸酶，並通過加入對硝基苯基磷酸鹽產生顏色。白色條，未誘導的細胞；灰色條，誘導的細胞。B:考馬斯亮藍染色12%SDS_PAA凝膠，以及用抗環狀血管緊縮素(1_7)抗體對乳酸乳球菌NZ9000的全蛋白提取物的免疫印跡分析，其中所述全蛋白提取物具有質粒:泳道1，pTB2 ;泳道 2，pTB2 和 pIL3BTC。C:硫醚橋血管緊縮素(1-7)錨定融合肽TB3的MALD1-T0F光譜顯示單個脫水。示意性顯示相關的肽片段(STKDFNLDLVSVSKKDSGASPRIEGRDRVSIHCGGGWSHPQFEKEALFQ)。5398.83 的質量峰對應於單個脫水N端TB3片段。D =MALD1-TOf光譜顯示沒有CDAP加到硫醚橋血管緊縮素(1_7)錨定融合肽TB3中。上面兩個圖顯示了對照肽25Da的清楚的質量偏移，這表明有CDAP加入到該肽中。未發現TB3的質量偏移(下面兩個圖)，表明無游離半胱氨酸殘基，並且因此證明了 TB3中硫醚橋的存在。M6:乳鏈菌肽錨定融合肽TBl的MALD1-T0F光譜。A)純化的TBl。B)用胰蛋白酶處理的純化的TB1。C)更詳細的B中的盒狀區域。TBl的乳鏈菌肽部分。脫水的數目表示為-7、-6等。D)用胰蛋白酶處理的乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pNZe3)的上清液。脫水的數目表示為_8、-7等。在圖A和圖B中，示意性顯示了相關肽的片段。Ml:結合肽RND-X3-1的選定的鏈黴親和素的展示pRND-X3-l示於圖1A中。在與生物素共培養或不與生物素共培養的展示RND_X3_1的乳酸乳球菌NZ9000 (pIL3BTC)上進行全細胞ELISA。用以ABTS/H202作為底物溶液的與HRP共軛的鏈黴親和素檢測展示的肽。在多於3次的獨立實驗中重複實驗，差異< 15%。

M8:對加入1-氰基-4- 二甲基氨基吡啶嗡四氟硼酸鹽(CDAP)的鏈黴親和素選擇的硫醚橋肽(參看實施例7)的MALD1-TOF的光譜分析。為了分析，將轉譯終止子插入PRND-X3-1中的肽和錨定序列之間(圖1A)，並將所得質粒稱為pTB9 (圖1A)。終止密碼子前面的N端部分因而編碼融合到可修飾的肽ISNMVCNMKTATCHCSIHVSK的乳鏈菌肽前導肽MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR。將包含具有終止密碼子的編碼該構建體的質粒pTB9和包含PIL3BTC的細胞的生長培養基塗到MALDI靶板上，並通過Maldi TOF分析。具有包含游離半胱氨酸的對照肽的對照實驗顯示對照肽的25Da的清楚的質量偏移，這表示有CDAP加入到對照肽。該實驗顯示產生了 4572.94Da質量的肽，這對應於4倍脫水肽(無N端甲硫氨酸的理論平均質量:4570.346Da)。很可能，在該乳鏈菌肽相關肽中的倒數第二個絲氨酸未脫水，這與在乳鏈菌肽自身中的Ser29情況類似。在CDAP的存在下，沒有發現選定的TB9肽的25Da的質量偏移，表明游離半胱氨酸的缺失，並且因而證明硫醚橋的存在。
具體實施例方式實施例1:用於含硫醚和脫氫殘基的肽在乳酸乳球菌上的細胞表面展示的表達載體I遍:該實施例是關於用於含硫醚的肽在乳酸乳球菌的表面展示的表達載體的構建。所述乳酸乳球菌宿主有機體提供用於在期望的肽及其輸出物中引入硫醚連接的乳鏈菌肽生物合成和輸出裝置。所述肽被轉譯融合到LPXTG細胞壁錨定基序中，例如，乳酸乳球菌PrtP蛋白酶。這個錨定機制需要用於將肽共價錨定到細菌細胞壁的肽聚糖上的分選酶的加工。這樣，肽和編碼的DNA被連接，允許選擇/篩選具有期望性質的翻譯後修飾肽。乳鏈菌肽將用作用於展示系統的開發和驗證的模型肽。材料和方法通過PCR將乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的LPXTG細胞壁錨定基序轉譯融合到pNZE3中的nisA基因上，pNZE3為乳酸乳球菌表達載體pNG8048的衍生物。所述展示載體的相關部分包含可誘導NisA啟動子、乳鏈菌肽前導肽、乳鏈菌肽和乳酸乳球菌PrtP蛋白酶的LPXTG細胞壁錨定基序的 序列(圖2A)。將展示載體電穿孔到乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC)中。後者提供乳鏈菌肽生物合成酶Ni SB、Ni SC和轉運體NisT。通過SDS-PAGE和用抗乳鏈菌肽前導的抗體的免疫印跡(Western blotting)分析乳鏈菌肽錨定蛋白的製備。結裡在NisA啟動子控制下用正確的乳鏈菌肽錨定序列構建乳酸乳球菌展示載體。該展示載體被命名為PTB5。使乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pTB5)細胞在乳鏈菌肽的存在或缺失下生長以允許產生TB5。將等量的細胞用溶菌酶消化並溶解於SDS-PAGE樣品緩衝液中。通過SDS-PAGE分離細胞提取物中的蛋白質，並用考馬斯亮藍染色顯示(圖2，左面)。對來自非誘導和誘導的培養基中的細胞培養物的比較顯示在誘導的培養基中存在約26至28kDa的蛋白質條帶。用抗乳鏈菌肽前導的抗體的免疫印跡分析證明該蛋白質為乳鏈菌肽錨定融合蛋白TB5，如通過強免疫反應信號所看到的那樣(圖2，右面)。觀測到的TB5的分子量不同於理論計算的分子量18kDa。該遷移差異最可能由於肽聚糖片段對TB5的共價附著。在非誘導的培養基中的可測量但不那麼強的免疫反應信號是由於乳鏈菌肽啟動子的少量洩露。總之，當用乳鏈菌肽誘導時，包含構建體的展示載體PTB5的乳酸乳球菌細胞引發TB5的產生。實施例2:抗前導肽的抗體證明附著乳鏈菌肽前體靶定融合蛋白TB5的細胞壁的細胞表面位置。MM:用使用抗乳鏈菌肽前導肽的全細胞ELISA評估在乳酸乳球菌的細胞表面的
TB5的展示
_5] 材料和方法在存在或不存在乳鏈菌肽的情況下培養乳酸乳球菌NZ9000(pTB5)和乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pTB5)細胞以誘導TB5。製備後，通過離心收集生產的細胞後，用pH7.4的磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)洗三次。在室溫下，在攪拌下，將等量的展示TB5的細胞用含
0.5%BSA最終體積為Iml的PBS中的1000倍稀釋的兔子抗乳鏈菌肽前導抗體溶液培養I小時。用PBS洗三次後，通過使用與鹼性磷酸酶共軛的山羊抗兔子IgG(l: 10000)和作為底物的對硝基苯基磷酸鹽(0.5mg/ml)培養來顯示所展示的TB5。在410nm確定吸光率，該吸光率用於測量所展示的TB5的量。結果結果被總結於圖3中，該結果顯示了誘導的乳酸乳球菌NZ9000(pIL3BTC/pTB5)細胞的陽性顏色反應。未誘導的乳酸 乳球菌培養看到較低水平的顏色響應。這證明在乳酸乳球菌的細胞表面可獲得乳鏈菌肽前導子。實施例3:在細胞表面展示前，已經用NisB和NisC細胞內修飾了乳鏈菌肽前體靶定融合蛋白。通過在前導肽裂解後的對重疊細胞的抗菌活性證明通過NisB-和NisC-修飾的乳鏈菌肽前體錨定融合蛋白的修飾。I遍:實施例2顯示TB5的產生導致乳鏈菌肽前體在乳酸乳球菌細胞表面的展示。在這個實施例中，用對乳鏈菌肽敏感的乳酸乳球菌菌株的覆蓋層評估通過NisB和NisC的乳鏈菌肽修飾。對該菌株的生長抑制表明NisB和NisC正確地修飾了 TB5並至少形成了環A、B 和 C。材料和方法用在含0.lmg/ml胰蛋白酶的0.5%頂層瓊脂中的200倍稀釋的乳酸乳球菌MG1363或NZ9000菌株覆蓋具有充分清洗的SDS-PAA凝膠或產生pTB5的乳酸乳球菌NZ9000細胞的菌斑的GM17瓊脂板。需要胰蛋白酶用於裂解產生活性乳鏈菌肽的乳鏈菌肽前導子。瓊脂板在30°C下過夜培養。結果圖4顯示了對來自具有或不具有修飾的酶的乳酸乳球菌NZ9000的細胞提取物的兩個相似的SDS-PAA凝膠分析。考馬斯亮藍染色凝膠(圖4A)顯示在誘導培養基中產生TB5，與修飾的酶的存在無關。只有TB5/BTC抑制了菌株的生長，表現為覆蓋層中的空帶(亮點)(圖4B)。這表明NisB和NisC正確地修飾產生活性乳鏈菌肽的TB5。在全細胞上的重疊分析獲得相似的結果(圖4C)。在包含修飾和(en)轉運酶的產生TB5的乳酸乳球菌細胞中發現活性乳鏈菌肽。由於乳鏈菌肽前導子只能接觸來自外部的胰蛋白酶，因此在乳酸乳球菌細胞表面展示活性乳鏈菌肽。此外，用NisP對乳鏈菌肽前導子特異性裂解導致了生長抑制，這暗示固定化乳鏈菌肽仍然為抗菌活性。總之，由於在SDS-PAA凝膠的覆蓋層中和全細胞中用乳鏈菌肽敏感菌株觀測到了活性的乳鏈菌肽，因此NisB和NisC正確地修飾了乳鏈菌肽錨定融合蛋白TB5。因此，TB5的錨定部分提供了用於將TB5共價附著到肽聚糖層的信號，從而在乳酸乳球菌細胞表面展示活性乳鏈菌肽。實施例4 =NisB和NisC修飾肽的穩定展示需要完整的膜錨定MM:釋放截短的乳鏈菌肽前體錨定構建體以促進質譜分析。通186 個胺基酸的完整蛋白質:MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶IGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGALPKTGETTERPAFGFLGVIVVILMGVLGLKRKQREE參照圖1B製備4個截短的變體:pTB5-trl帶電荷膜尾部(KRKQREE)的直接上遊(immediatelyupstream)MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶IGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGALPKTGETTERPAFGFLGVIVVILMGVLGL179胺基酸pTB5~tr2LPKTG序列的直接上遊MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶IGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGA150胺基酸pTB5~tr3MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAP⑶I105胺基酸pTB5~tr4MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGT85胺基酸

表達了截短的乳鏈菌肽前體錨定TB5變體。通過TCA沉澱來沉澱在上清液中的肽並在SDS PAGE上分析所述肽。MS-殺菌活性對於截短的變體2、3和4，上清液似乎對指示菌株MG1363的生長有影響。這表明肽被修飾和釋放。關於這些變體還存在一些自體誘導。沒有發現與截短的變體I相關的生長抑制。該變體包括跨膜的膜部分，並且可能至少在很大程度上保持與細胞相關。在SDS PAA凝膠上，觀察到一個與所有截短的變體相同遷移的條帶。這個肽的帶似乎以乳鏈菌肽的分子量遷移。如在考馬斯亮藍染色的SDS-PAA凝膠中顯示的一樣，在TCA沉澱的上清液中，觀察到單個肽的條帶。疊加分析證明該肽抑制了指示菌株的生長。當截短的肽更短時，產生更多的該乳鏈菌肽條帶(數據未顯示)。
TB5的錨定部分穩定了 TB5乳鏈菌肽前體錨定融合蛋白。缺少該部分時，出現降解，並且釋放活性的乳鏈菌肽。實施例5:環狀血管緊縮素類似物的表面展示MM:證明血管緊縮素(1-7)的表面展示和修飾。用全細胞ELISA評估表面展示。用抗環狀血管緊縮素(1-7)的特異性抗體證明血管緊縮素(1-7)的修飾，其中將鑰孔蟲戚血藍蛋白質(KLH)作為載體蛋白質。材料和方法將血管緊縮素(1-7)的編碼序列(DRVSHIC)轉譯融合到乳鏈菌肽前導肽序列中，用因子Xa識別序列(IEGR)隔開。這產生了血管緊縮素(1-7)表面展示載體pTB2(圖1A)。在具有或不具有TB2的誘導下培養具有pTB2的乳酸乳球菌NZ9000和NZ9000 (pIL3BTC)細胞。收集來自這些生產培養基的細胞，用PBS清洗，並最終在PBS中再次懸浮直至0D_ 20至30。如實施例2中所說明的那樣進行全細胞ELISA。此外，通過SDS-PAGE和抗環狀血管緊縮素(1_7)抗體免疫印跡分析前導肽血管緊縮素(1-7)錨定蛋白的生產。MS來自誘導培養基的細胞對修飾的TB2及未修飾的TB2都產生陽性顏色反應(圖5A)。這證明前導肽可由外部接近，並且因此在乳酸乳球菌的細胞表面展示血管緊縮素(1-7)。 對來自展示TB2的乳酸乳球菌細胞的細胞提取物的SDS-PAGE分析清楚地顯示蛋白質條帶遷移至大約24.9kDa的標記條帶。用抗環狀血管緊縮素(1-7)抗體的免疫印跡識別該蛋白質條帶為TB2 (圖5B)。用KLH作為載體蛋白質，在小鼠中用純化的環狀血管緊縮素(1-7)培養所使用的環狀血管緊縮素(1-7)抗體。在標準的ELISA中，該抗體對環狀血管緊縮素(1-7)的特異性是其線狀等價物的至少IO4倍。因此，抗環狀血管緊縮素(1-7)抗體特異性識別修飾的血管緊縮素(1-7)。免疫印跡清楚地顯示了抗環狀血管緊縮素(1-7)抗體對修飾的TB2的免疫反應信號(圖5B，泳道2)，而對於未修飾的TB2未發現信號(圖5B，泳道I)。這表明展示的血管緊縮素(1-7)被NisB和NisC修飾。Maldi TOF分析顯示展示的血管緊縮素(1-7)為脫水的(圖5C)和環化的(圖OT)。實施例6:修飾的TB I的質譜分析MM:通過MALD1-T0F分析證明TBl內乳鏈菌肽的修飾材料和方法構建乳酸乳球菌表面展示載體以促進純化和分析。質粒pTBl編碼人鼻病毒3C蛋白酶識別序列(PreScission蛋白酶，GE Healthcare),以便從乳酸乳球菌細胞表面的釋放編碼前導肽的N端部分、乳鏈菌肽和Str印標籤II。為了純化的目的加入Str印標籤II序列。在冰上用16%的三氯乙酸提取展示TBl的乳酸乳球菌NZ9000細胞30分鐘。用Iml的丙酮洗細胞兩次，在高速真空中乾燥，並在pH8.0下在0.25ml的IOmM Tris-HCl,ImM EDTA、lmg溶菌酶和0.1mg變溶菌素中再懸浮。在37°C進行細胞壁消化I小時。離心收集細胞，用PBS洗兩次。將細胞在Iml的PreScission蛋白酶裂解緩衝液(50mMTris-HCl,pH7.0, 150mM NaCl, ImM EDTA, ImM DTT)中用 40UPreScission 蛋白酶(GEHealthcare)再懸浮,並在攪拌下於4°C培養24至48小時。用蛋白酶消化後,收集上清液,並根據生產商的操作指南用Strep-tactin離心柱純化試劑盒(IBA，GmbH)純化TBl肽的str印標籤的N端部分。用10%TCA沉澱洗出液中的肽，並將其溶於水中。在線性模型中用Voyager DE PRO基質輔助雷射解析電離飛行時間(MALD1-T0F)質譜記錄質譜。益果通過MALD1-T0F分析純化的TBl的N端部分(圖6)。圖6A中的光譜顯示在7975Da附近的質量峰，這相應於在圖中示意性指出的全長N端TBl部分。當用胰蛋白酶處理樣品時，該峰消失，而在3389Da附近出現質量峰(圖6B)。後一個質量峰對應於TBl的乳鏈菌肽部分。由於該片段免受胰蛋白酶的消化，該片段出現的事實已經證明乳鏈菌肽的修飾。圖6C顯示對來自TBl的乳鏈菌肽質量峰的更詳細分析。在TBl乳鏈菌肽光譜中清楚地出現至少7倍和6倍的脫水峰。與分泌的乳鏈菌肽相比，缺少了 8倍的脫水峰(圖6D)。益論:這些數據證明TBl內的乳鏈菌肽被修飾並包含至少7個脫水。實施例7:目標:通過展示和篩選選擇鏈黴親和素結合肽材料和方法

為證明展示和篩選的原理的證據，以從包含ISXXXCNMKTATCHCSIHVSK的文庫中選擇鏈黴親和素結合肽為目的進行實驗，其中，X為任何胺基酸。將絲氨酸和半胱氨酸放在三個隨機的胺基酸兩側，這樣允許酶催化的絲氨酸脫水及環化酶催化將產生的脫氫丙氨酸與半胱氨酸耦合。在文庫構建中使用NNS密碼子允許所有可能的胺基酸位於絲氨酸和半胱氨酸之間的每個位點上，產生理論上8000個變體的蛋白質多樣性的文庫。估計的文庫大小為約11000獨立的克隆。編碼該乳酸乳球菌硫醚肽展示文庫的構建體被稱為PRND-X3 (圖W。我們篩選文庫中的鏈黴親和素結合體(binder)。兩輪使用塗布鏈黴親和素的磁珠的磁選(MACS)後,將選定的細菌放在板上用於分析。益果對選定的克隆的專門分析產生一個單一的序列:S-MNV-C(pRND-X3-1)，已知其為二硫橋基序而非硫醚環化基序。在所分析的選定的肽中序列變異的缺失可能是由於與對鏈黴親和素結合的需要相結合的硫醚橋所施加的構象限制。展示這種含MNV的多肽的乳酸乳球菌細胞在全細胞ELISA中產生陽性顏色反應，從而提供與鏈黴親和素的結合。此外，在生物素的存在下無結合，證明對生物素結合位點的特異性(圖7)。用Maldi TOF的分析揭示CDAP沒有添加到含MNV的肽中，這排出了未修飾的半胱氨酸的存在，從而證明存在硫醚橋(圖8)。因此，從乳酸乳球菌硫醚肽展示文庫可以容易地選擇對鏈黴親和素具有親和性的硫醚橋肽。結論:可從細胞表面展示的硫醚橋肽的乳酸乳球菌文庫中成功地篩選特異性配體。
權利要求
1.一種編碼融合肽的分離的核酸構建體，所述融合肽從N端到C端至少包含以下序列元件: (a)N端羊毛硫抗生素前導序列； (b)將被翻譯後修飾成含脫氫殘基或硫醚橋的多肽的感興趣的胺基酸序列； (C)親水跨細胞壁結構域； (d)分選酶識別基序； (e)疏水跨I吳結構域；和 (f)C端帶電荷的膜錨定結構域。
2.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述羊毛硫抗生素前導序列為乳鏈菌肽前導序列。
3.根據權利要求1或2所述的核酸構建體，其中，所述跨細胞壁結構域衍生自乳酸菌的多域細胞膜蛋白酶的跨細胞壁結構域。
4.根據權利要求3所述的核酸構建體，其中，所述跨細胞壁結構域包含瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)的 prtH、乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的 prtP、化胺性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的 scpA或無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的csp的跨細胞壁結構域的胺基酸序列或它們的功能類似物或片段。
5.根據前述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中，所述分選酶識別基序包含胺基酸序列LPXTG，其中X可為胺基酸D、E、A、N、Q或K，優選地，其中所述分選酶識別基序由LPKTG組成。
6.根據前述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中，所述疏水跨膜結構域具有20至30個胺基酸的長度。
7.根據前述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中，所述帶電荷的膜錨定結構域具有至少四個胺基酸殘基的長度，優選地，其中，至少50%的所述殘基為帶正電荷胺基酸，更優選賴氨酸和/或精氨酸殘基。
8.根據前述任一項權利要求所述的核酸構建體，其中，所述蛋白質物質在元件(a)和(b)之間和/或元件(b)和(c)之間進一步包含至少一個蛋白水解裂解位點。
9.根據權利要求8所述的核酸構建體，在元件(a)和(b)之間包含因子Xa蛋白酶識別位點，優選胺基酸序列IEGR。
10.根據權利要求8或9所述的核酸構建體，在元件(b)和(c)之間包含人鼻病毒3C蛋白酶識別位點，優選胺基酸序列EALFQGP。
11.根據前述任一項 權利要求所述的核酸構建體，其中，所述感興趣的胺基酸序列為治療相關的肽，優選地選自由激素、酶抑制劑、酶活化劑、受體配體、抑制肽、羊毛硫抗生素蛋白和病毒蛋白組成的組中。
12.—種表達載體，包含根據權利要求1至11的任一項所述的核酸。
13.—種革蘭氏陽性宿主細胞，包含根據權利要求12所述的表達載體，並能夠將所述感興趣的多肽翻譯後修飾為含脫氫殘基或硫醚橋的多肽。
14.根據權利要求13所述的宿主細胞，為乳酸菌，優選地選自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、化胺性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、雞葡萄球菌(Staphylococcus gallinarium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、變形鏈球菌(Streptococcus mutans)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)、胚牙乳桿菌(Lactobacillus piantarum)Λ 魚肉桿菌(Carnobacterium piscicola)、類腸球菌(Enterococcus faecalis)、變異微球菌(Micrococcus varians)、鏈黴菌OH-4156 (Streptomyces 0H-4156)、肉桂地鏈黴菌(Streptomyces cinnamoneus)、灰藤黃鏈黴菌(Streptomyces griseoluteus)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio f ibriosolvens)、同八丈島鏈輪絲菌(Streptoverticillium hachijoense)、Actinoplanes linguriae、活潑瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、馬其頓鏈球菌(Streptococcus macedonicus)、波比斯鏈球菌(Streptococcus bovis)。
15.—種宿主細胞文庫，包含多個根據權利要求13或14所述的宿主細胞，其中，所述文庫的每個成員在它的細胞表面展示不同的含脫氫殘基或硫醚橋的多肽。
16.—種鑑定能夠結合到感興趣的靶實體上的含脫氫殘基或硫醚的多肽的方法，所述方法包含步驟: (a)提供根據權利要求15的文庫； (b)從所述文庫選擇展示能夠結合到所述感興趣的靶實體上的含脫氫殘基或硫醚橋的多肽的至少一種宿主細胞；和 (c)識別在至少一種選擇的所述宿主細胞上展示的所述多肽序列。
17.根據權利要求13或14的宿主細胞作為用於評估羊毛硫抗生素生物合成酶和/或轉運活性的報告系統的 用途。
全文摘要
本發明涉及翻譯後修飾的異源性蛋白的細菌細胞表面展示。提供了分離的編碼蛋白質物質的核酸構建體，所述蛋白質物質從N端至C端包含至少(a)N端羊毛硫抗生素前導序列；(b)將被翻譯後修飾成含脫氫殘基或硫醚橋的多肽的感興趣的胺基酸序列；(c)親水跨細胞壁結構域；(d)分選酶識別基序；(e)疏水跨膜結構域；和(f)C端帶電荷的膜錨定結構域。還提供了表達所述構建體的革蘭氏陽性宿主細胞及宿主細胞的文庫。
文檔編號C12N15/62GK103080318SQ201180042020
公開日2013年5月1日 申請日期2011年7月6日 優先權日2010年7月6日
發明者芝貝·博斯姆 申請人:蘭提歐派普有限公司