製備用於藥用的白介素的製作方法
2023-10-17 23:11:34 4
專利名稱：製備用於藥用的白介素的製作方法
技術領域：
本發明屬於製備和配製用於藥用的白介素-2的領域。
背景技術：
白介素-2(IL-2)是一種細胞因子，其促進體內T細胞的生長和分化，還增強CD8+T細胞和天然殺傷細胞的細胞毒性。對患者給藥以劑量依賴型方式產生多種免疫學效應，包括細胞免疫活化，伴隨著深度的淋巴細胞增多、嗜曙紅細胞增多、血小板減少，和產生細胞因子，包括TNF、IL-1和γ幹擾素。IL-2的更多細節可以在其「GeneCard」中發現，登錄號為GC04M123831。
在一些國家中IL-2已經被批准用於人類藥用。所推薦的國際非產權的名稱為ALDESLEUKIN(阿德斯白細胞素)，並且製劑由Chiron Corporation以商標名PROLEUKINTM上市。美國FDA已經批准PROLEUKINTMIL-2用於治療患有轉移性腎細胞癌(轉移性RCC)或者轉移性黑素瘤的治療。
如在其美國處方信息中陳述的，PROLEUKINTM作為生物活性的、非共價結合的微聚集體存在，該微聚集體的平均大小為27個重組IL-2分子。PROLEUKINTM以單用小瓶中的無菌、白色到灰白色的凍幹餅提供，其用於靜脈內(IV)施用。當用1.2ml無菌注射用水重構時，每毫升含有1800萬IU(1.1mg)PROLEUKINTMIL-2，50mg甘露糖醇，和0.18mg十二烷基磺酸鈉(SDS)，用約0.17mg磷酸二氫鈉和0.89mg磷酸氫二鈉緩衝到pH7.5。然而，這些成分的簡單混合不能得到與PROLEUKINTM產物中發現的IL-2的相同的微聚集體形式。
PROLEUKINTM產物中IL-2的微聚集體對於體內功效是重要的。非聚集(游離單體的)IL-2的藥物動力學和藥效學性質與小顆粒聚集的IL-2的那些性質極其不同，這兩種形式具有不同的治療指數太小的聚集體被身體清除太快；太大的聚集體可能不溶和活性較小。因此小顆粒聚集是PROLEUKINTM產品的關鍵特徵。
生物活性PROLEUKINTM微聚集體形成的方法以前未向公眾提供，儘管現有技術中已經描述了製備藥物IL-2製劑的許多方法[例如，見參考文獻1-30]。參考文獻9具體目的是公開PROLEUKINTM的生產方法，包括表達、回收、純化、製劑和完工的細節，但是該公開在一些方面是不完全的。
知道怎樣實現與PROLEUKINTM產品中發現的IL-2具有相同的活性小顆粒聚集形式將對於想要製備與PROLEUKINTM相似的IL-2產品的任何人都是有用的。因此本發明的目的是提供如在PROLEUKINTM產品中發現的微聚集體形式的IL-2，和提供這些小顆粒聚集的IL-2的製備方法。本發明的另一目的是提供用以補充參考文獻9的公開內容的製備IL-2的方法。
發明內容
PROLEUKINTM產物製備的方法包括下面的關鍵步驟(i)從細胞培養物純化表達的IL-2；(ii)用SDS去汙劑溶解IL-2；(iii)將IL-2還原成單體形式；(iv)純化、氧化和沉澱IL-2；(v)用高水平SDS去汙劑再溶解IL-2；(vi)純化以除去寡聚體IL-2；(vii)滲濾以降低SDS去汙劑水平(而不完全除去)到最佳範圍以得到適宜的小顆粒聚集的IL-2製備物；(viii)用甘露糖醇和緩衝劑配製；和(ix)凍幹和包裝。
該方法的步驟(i)、(iv)、(vi)、(viii)和(ix)在參考文獻9中公開，但是步驟(ii)、(iii)、(v)和(vii)沒有公開，儘管公開了在步驟(vi)之前用未指明的去汙劑再溶解IL-2。此外，參考文獻9提出在步驟(vi)中純化後將SDS加入IL-2，此時它實際上已經被除去。
在這9個步驟中，微聚集體形成的最關鍵的步驟是(v)和(vii)。下遊步驟(viii)或者(ix)中任何一個都對小顆粒聚集沒有任何重要影響，步驟(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(vi)中的純化方法也幾乎沒有影響。然而，一旦SDS加入步驟(v)，IL-2就被溶解，步驟(vii)中SDS水平的隨後降低導致形成最終PROLEUKINTM產品中存在的微聚集體。必須加入足夠SDS以將沉澱的IL-2再溶解成基本上單體的可溶形式，然後必須將SDS除去(但不是完全除去)以得到所希望的微聚集體。
因此本發明提供了製備藥用的白介素-2的方法，該方法包括下列步驟(a)向含有白介素-2的組合物加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，以得到SDS終濃度為每mg IL-2至少500μg SDS；(b)從組合物除去一些但不是所有SDS以得到含有每mg白介素-295-250μg SDS的組合物。該加入SDS然後部分除去的方法為IL-2和SDS分子密切相互作用以形成如PROLEUKINTM產品中發現的IL-2和SDS的微聚集體提供了最佳條件並且，對於給定IL-2/SDS比例，通過SDS和IL-2的簡單混合產生不同的產物。
SDS所加入的白介素-2通常具有分子內二硫鍵。
從該方法產生的水性組合物可以凍幹後分發，可以用水性載體最終重構該凍乾物質後施用於患者。重構後，該組合物優選具有小於1.1cm2/g的比濁度(τ)和/或含有平均流體動力學直徑為8nm到20nm的SDS/IL-2聚集體。因此，本發明可以還包括凍幹該組合物，然後任選地，用水性介質重構該組合物的步驟。該組合物還可以在凍幹步驟之前具有這些τ和/或流體力學特性。
本發明提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的組合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體的形式存在，其中通過本發明的方法可以得到該聚集體。這些組合物適於如PROLEUKINTM產品所示的藥用。
本發明還提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的組合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體的形式存在，其中該組合物具有小於1.1cm2/g的比濁度(τ)。這些組合物適於如PROLEUKINTM產品所示的藥用。
本發明還提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的組合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體的形式存在，其中這些聚集體具有8nm到20nm的平均流體動力學直徑。這些組合物適合於藥用，如PROLEUKINTM產品所示。
本發明還提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的組合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體的形式存在，其中每個聚集體的白介素-2的平均數為10到50。這些組合物適於如PROLEUKINTM產品所示的藥用。
本發明提供了含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的凍幹組合物，其中該組合物可以重構得到水性溶液，該溶液中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體形式存在，該水性溶液具有小於1.1cm2/g的比濁度(τ)。此外，或者而且，考察τ，該聚集體具有8nm到20nm的平均流體動力學直徑。這些組合物適於藥用，如PROLEUKINTM產品所示。
本發明提供了製備含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的凍幹組合物的方法，其中(i)該凍幹的組合物可以重構得到水性組合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體的形式存在，該水性組合物具有小於1.1cm2/g的比濁度(τ)；和(ii)該方法包括步驟(a)向含有白介素-2的組合物加入十二烷基硫酸鈉，其中加入足夠十二烷基硫酸鈉以得到單體的、溶解的白介素-2，(b)將十二烷基硫酸鈉的濃度降低到白介素-2與十二烷基硫酸鈉形成聚集體的水平，和(c)凍幹該組合物。
本發明提供了製備含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的凍幹組合物的方法，其中(i)該凍幹的組合物可以重構得到水性組合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以具有8nm到20nm的平均流體動力學直徑的聚集體的形式存在；和(ii)該方法包括步驟(a)向含有白介素-2的組合物加入十二烷基硫酸鈉，其中加入足夠的十二烷基硫酸鈉以得到單體的、溶解的白介素-2，(b)將十二烷基硫酸鈉的濃度降低到白介素-2與十二烷基硫酸鈉形成聚集體的水平，和(c)凍幹該組合物。
本發明還提供了製備含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的凍幹組合物的方法，其中(i)該凍幹的組合物可以重構得到水性組合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體的形式存在，並且該水性組合物具有小於1.1cm2/g的比濁度(τ)；和(ii)該方法包括步驟(a)將十二烷基硫酸鈉與白介素-2混合得到混合物，其中十二烷基硫酸鈉以第一種濃度存在，(b)從該混合物除去十二烷基硫酸鈉使其濃度減小到第二種濃度，和(c)凍幹該組合物，由此提供所述組合物。所述第二種濃度低於第一種濃度。第一種濃度將通常為至少500μg SDS/mg混合物中IL-2，第二種濃度將為95-250μg SDS/mg IL-2。
本發明還提供了製備含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的凍幹組合物的方法，其中(i)該凍幹的組合物可以重構得到水性組合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以具有8nm到20nm的平均流體動力學直徑的聚集體的形式存在；和(ii)該方法包括步驟(a)將十二烷基硫酸鈉與白介素-2混合得到混合物，其中十二烷基硫酸鈉以第一種濃度存在，(b)從該混合物除去十二烷基硫酸鈉使其濃度減小到第二種濃度，和(c)凍幹該組合物，由此提供所述組合物。所述第二種濃度低於第一種濃度。第一種濃度將通常為至少500μg SDS/mg混合物中IL-2，第二種濃度將通常為95-250μg SDS/mg IL-2。
本發明還提供了製備含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉(SDS)的凍幹組合物的方法，其中(i)該凍幹的組合物可以重構得到水性組合物，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體的形式存在，該水性組合物的比濁度(τ)小於1.1cm2/g，其中SDS的濃度為「x」μg SDS/mg IL-2，其中x為95到250；和(ii)該方法包括以下步驟(a)將SDS與白介素-2混合得到混合物，其中SDS的濃度至少為「x」的4倍，(b)從該混合物除去一些但不是所有SDS，以得到其中SDS濃度為「x」的組合物，和(c)凍幹該組合物。所述濃度優選至少為「x」的5倍，更優選至少為8倍、10倍、15倍、或甚至20倍。
本發明還提供了製備含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉(SDS)的凍幹組合物的方法，其中(i)組合物中的白介素-2和SDS以聚集體的形式存在，其中該聚集體具有8nm到20nm的平均流體動力學直徑，其中SDS的濃度為「x」μg SDS/mg IL-2，其中x為95到250；和(ii)該方法包括以下步驟(a)將SDS與白介素-2混合得到混合物，其中SDS的濃度至少為「x」的4倍，(b)從該混合物除去一些但不是所有SDS，以得到其中SDS濃度為「x」的組合物，和(c)凍幹該組合物。所述濃度優選至少為「x」的5倍，更優選至少為8倍、10倍、15倍、或甚至20倍。
當本發明的方法包括將SDS濃度減小到95-250μg SDS/mgIL-2時，可以在某些實施方案中將濃度減小到95μg/mg(例如50到95μg/mg)以下，然後將該濃度再次增加到95-250μg/mg範圍。可以在重構凍乾物質期間方便地進行該增加到95-250μg/mg範圍，例如，該方法可以包括除去SDS到＜95μg/mg，然後凍幹，然後用水性SDS溶液重構使得SDS濃度在95-250μg/mg範圍內。
去汙劑本發明的方法包括使用十二烷基硫酸鈉(SDS)，其也稱作月桂基硫酸鈉。該陰離子去汙劑的分子式為CH3(CH2)11OSO3-Na+，其CAS號為151-21-3，EC號為205-788-1。
SDS是用於溶解蛋白質的標準試劑，如果在SDS加入前IL-2以沉澱形式存在，那麼SDS用於本發明的方法的步驟(a)中的該目的。以含有沉澱的IL-2的組合物開始，將加入足夠SDS以確保基本上所有沉澱的IL-2都可溶(除了沉澱中任何共價連接的IL-2多聚體之外，即使存在SDS，所述多聚體也將主要保持沉澱)。當SDS以高於約500μg/mg存在時，IL-2在1mg/ml的濃度下基本上不存在微聚集體，因此通常加入SDS以得到SDS終濃度為至少500μg SDS/mg IL-2(例如，至少500，至少600，至少700，至少800，至少900，至少1000，至少1200，至少1400，至少1600，至少1800，至少2000μg SDS/mg IL-2)。優選使用約910μg SDS/mg IL-2。
樣品中SDS的起始濃度將通常是已知的，因為SDS不天然存在於細胞中，並且已經監視細胞來源的物質的處理期間加入的SDS的量。然而，對於SDS的濃度未知的情況，可以使用常規測定技術，對所述物質作為一個整體或者對該物質的樣品實施SDS濃度的測量。例如參考文獻31公開用於分離和測定表面活性劑(包括SDS)的毛細管電泳方法；參考文獻32公開使用電極-較少壓電石英晶體測定0.2-100μM範圍內十二烷基硫酸鹽的單滴方法；參考文獻33比較方便地確定水性溶液中SDS的三種方法，即使用離子-選擇性電極或者濁度通過溴化十六烷基三甲基銨滴定以測量終點，或者在溴化十四烷基三甲基銨的存在下測量濁度；參考文獻34公開了測定SDS的方法，該方法是基於SDS與螢光染料，如溴化乙錠的的相互作用。測量SDS水平的優選測定方法是基於與吖啶黃反應的分光光度測定法，如在35的實施例和參考文獻中更詳細描述的。
作為測量相對於IL-2質量的SDS含量的備選方法，可以相對於IL-2活性測量SDS含量。基於1.1mg IL-2中18×106IU IL-2活性(如在PROLEUKINTM中發現)，100μg SDS/mg IL-2相當於6.111μg SDS/MIUIL-2。
本發明的方法和產物中除了使用SDS中外，還可以使用月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉(SLS)或者月桂基硫酸銨(ALS)。還可以使用SLS、ALS和/或SDS的混合物。然而，在本發明的優選實施方案中，使用SDS。除去去汙劑在SDS加入IL-2組合物後，本發明的方法包括除去一些(但不是所有)SDS，從而，提供IL-2和SDS的微聚集體形式。
通過多種技術可以除去SDS。離子交換層析可以除去帶負電荷的SDS，還可以使用凝膠過濾。然而，更優選地，通過滲濾除去SDS。在滲濾中，溶劑和/或微溶質(例如，鹽)可以通過不同的溶劑和/或微溶質代替。通常，除去和代替可以以相同速度發生，溶液的體積由此可以基本上保持恆定，從而總體效果是將最初的溶劑/微溶質用新的溶劑/微溶質代替。
針對無SDS的緩衝液的滲濾是除去SDS的優選方法，例如，針對10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)除去SDS。
SDS去除持續到組合物含有95μg到250μg SDS/mg白介素-2，例如，118-210μg/mg、135-180μg/mg、或約160μg/mg。在該範圍內IL-2的藥物動力學性質基本上穩定，SDS的水平不會過高而產生相關毒性。然而，隨著SDS濃度降低到約95μg/mg以下，微聚集體的大小顯著升高(
圖1)，從95μg/mg時平均～60個IL-2分子/個微聚集體到75μg/mg時平均～180。
加入SDS然後不完全除去SDS導致在PROLEUKINTM產品中發現的生物活性IL-2微聚集體。以PROLEUKINTM產品中發現的濃度簡單混合SDS和IL-2不產生微聚集體。參考文獻36描述了這樣的研究，其中像PROLEUKINTM產品，將SDS加入含有1.1mg IL-2的IL-2製劑。發現在去汙劑濃度為0.02％-0.05％時SDS沉澱IL-2。相比之下，在根據本發明的SDS除去期間，在這些SDS濃度下IL-2不沉澱—甚至當SDS從1200μg/mg(基於1.1mg IL-2約0.1％SDS)降低到70μg(＜0.01％)，也沒有見到IL-2沉澱。
在SDS除去期間，可以如上述確定SDS濃度。當該除去方法經標準化並且是可以再現時，在SDS除去期間監視SDS水平可能不是必要的，因為該方法每次實施時，通常可以預期相同的結果(儘管可以實施最終證實性測量)。然而，當除去方法是可變的，或者由於其他原因需要定時監視時，可以實施SDS水平的定時或者連續測量直到達到所希望的最終濃度。
其他處理步驟如上面提到的，形成IL-2/SDS微聚集體的關鍵處理步驟是(a)加入然後(b)隨後除去SDS。儘管這兩個步驟得到適於用作藥物中活性成分形式的IL-2，但是僅這兩個步驟不適於製備最終藥物組合物，並且需要其他步驟。這些步驟可以在步驟(a)和(b)之前，步驟(a)和(b)之後，和/或步驟(a)和(b)之間發生。
製備藥用的IL-2的方法中第一步將通常是表達蛋白質。這將通常包括使用含有編碼目標IL-2基因的宿主細胞，如細菌宿主細胞、酵母宿主細胞或者哺乳動物宿主細胞。然而，作為重組途徑的備選方案，還可以活化或者上調宿主細胞基因組中內源IL-2基因的表達(例如，通過啟動子活化)，或者從天然來源(例如，從血液)純化激素。
在重組大腸桿菌中表達IL-2是得到IL-2的優選途徑，其中IL-2形成內含體。適宜的大腸桿菌根據布達佩斯條約在1984年保藏在ATCC，保藏號為39452和39626。
從多種細胞型培養、收穫、破壞，或者提取IL-2的方法是本領域中公知的，例如，見參考文獻19-30和37-41。
表達後，或者當以表達的物質開始時，將使用IL-2純化的最初步驟。如果IL-2存在於細胞中，那麼純化步驟將包括細胞破壞(例如，通過滲透休克、勻漿、超聲處理，等等)以便釋放所述蛋白質；如果IL-2已經存在於溶液中(例如，其在表達後分泌)，那麼不需要破壞。還可以實施活細胞的失活，以及離心。在最初純化步驟結束時，IL-2將通常為沉澱的形式，尤其如果從內含體純化，但是將從細胞碎片分離以得到富含IL-2的漿料用於隨後處理。
製備純化的IL-2後，或者當以沉澱的物質開始時，可以溶解IL-2以便將其與其他宿主蛋白質等分離。通過加入去汙劑如SDS，優選終濃度為4到4.5％，可以實現溶解。這可以方便地通過加入5％SDS溶液實現。
溶解後，或者以溶解的物質開始時，可以還原IL-2以便斷裂該蛋白質中的任何二硫鍵，尤其斷裂任何分子間二硫鍵。因此通過分子間二硫鍵形成的任何共價IL-2聚集體被轉化成單體形式。用於還原二硫鍵的常用還原劑包括β-巰基乙醇和二硫蘇糖醇(DTT)。將通常保持去汙劑的存在以便確保IL-2溶解度。
還原後，或者用起始物質開始時，然後可以將IL-2再氧化以得到具有分子內二硫鍵的單體IL-2。
再氧化後，或者用再氧化的物質開始時，然後可以進一步純化IL-2以便除去試劑，如氧化劑，以除去內毒素，除去宿主細胞DNA和/或蛋白質，除去IL-2同工型或者構象異構體(例如，IL-2的氧化形式)，等等。使用反相HPLC可以方便地實現該純化。
RP-HPLC純化後，或者用可溶的RP-HPLC純化的物質開始時，例如，通過加入0.8N氫氧化鈉可以沉澱IL-2。除了沉澱IL-2，這還允許該蛋白質與RP-HPLC期間所用的任何有機溶劑分離。通過離心可以方便地收集沉澱的物質。
表達、純化、溶解、還原、氧化、RP-HPLC和沉澱(如上文描述)後所得物質適於根據本發明的再溶解和滲濾，儘管通過其他純化途徑製備的IL-2也可以使用。然而，通常，SDS加入本發明方法的步驟(a)之前，IL-2將為沉澱的形式。溶解和滲濾的IL-2在溶解前將具有分子內二硫鍵。
如上文提到，即使存在SDS，共價連接的IL-2多聚體也保持沉澱。由於這些多聚體比SDS-溶解的IL-2蛋白質大得多(因為它們是不可解離的)，所以它們可以在步驟(a)和(b)之間(即，加入SDS後但是滲濾前)通過凝膠過濾方便地除去。應該在整個凝膠過濾期間保持SDS的存在以便防止IL-2沉澱。
滲濾除去SDS和形成微聚集體後，可以將IL-2溶液進行下面步驟之一或多個稀釋得到所希望的最終劑量；滅菌，通常通過無菌過濾，例如，通過0.22μm濾器；藥物配製(見下文)；凍幹；包裝；等等。
微聚集體通過本發明的方法實施的SDS溶解和滲濾的結果是形成SDS和IL-2的生物活性微聚集體，如PROLEUKINTM產品中所看到的。
還沒有確定SDS/IL-2微聚集體的精確分子結構，但是認為它們是微團或者類似微團的結構。在～160μg/mg的SDS濃度下，常見的微團含有～30個IL-2分子和～150個SDS分子。微聚集體中SDS和IL-2非共價相互作用，IL-2的疏水尾部(殘基121-133)可以與SDS的烷基主鏈相互作用以形成微團。一些SDS可以在溶液中保持游離。
通過光散射可以檢測微聚集體，該技術還可以測量這些微聚集體的大小(見下文)。SDS濃度和平均微聚集體大小之間的關係(如通過常規光散射測量)已經按經驗評估，如圖1中所示。
隨著SDS除去的進行，達到一種濃度，在該濃度下微聚集體的大小開始指數地增加(見圖1)。根據本發明，除去SDS直到其濃度為95μg到250μg/mg IL-2。在該範圍內，比濁度(τ)為～0.05到～1.00cm2/g，其暗示著平均小於50個IL-2分子/個微聚集體。在160μg SDS/mg IL-2時，比濁度(τ)為約0.48(約27個IL-2分子)。
技術人員將理解根據本發明的SDS/IL-2的給定組合物將很少(如果有的話)含有單一種類的微聚集體。相反，光散射測量揭示微聚集體具有分布內的多種大小，並且測量可以揭示平均大小。因此，當組合物含有所陳述的平均大小的微聚集體時，將通常有一些更小的微聚集體和一些更大的微聚集體。
本發明的優選的組合物包括SDS/IL-2微聚集體，從而該組合物的比濁度(τ)為0.3到0.6，例如，0.4到0.5，或者約0.45。這些組合物尤其應用於凍幹後重構的組合物，凍幹和重構前τ的值可以更低(圖14)。
本發明的優選組合物包括流體動力學直徑為11nm到13nm的SDS/IL-2微聚集體。
本發明的優選微聚集體含有10到50個IL-2分子，例如，20到35個，優選約27個。
在優選組合物中，基本上所有IL-2以微聚集體的形式存在。組合物可以基本上沒有單體IL-2。
比濁度(τ)
因為本發明的SDS/IL-2微聚集體受到優勢條件的影響，所以諸如大小排阻層析和分析性離心的技術不能用於評估它們的大小。而經典(或者靜態)光散射(CLS)可以用於通過測量它們的濁度檢測和分析微聚集體。可以使用動態光散射(DLS)。可以在特定儀器上測量，或者在螢光計上實施測量，螢光計的激發和發射單色儀設定在相同波長(例如，從氙燈467nm，或者從氬燈488nm，兩者都遠離分析物吸收的波長)和/或使用適宜的濾光器(例如，黃色濾光器)，從而螢光計作為90°CLS光度計。
當測量光散射時，標準光譜參數為「瑞利比」(RΘ)。當在相對於入射光90°(即當Θ＝90°時)測量散射光時，已知瑞利比為R90[例如，見參考文獻42]，90°散射用作濁度測量。
可以相對於光學級甲苯歸一化濁度測量值(90°時的散射強度)，即，標準甲苯樣品的濁度測量值除以甲苯的R90。通過以這種方法歸一化，可以確定散射光強度的絕對值。
對於本發明的IL-2微聚集體，可以在467nm或488nm，25℃下測量濁度。評估濁度前，可以離心或過濾組合物以除去大顆粒(例如，沉澱的蛋白質)，否則其將扭曲數據。離心時，本發明的IL-2組合物優選在上清液中保留至少97％(例如，≥98％，≥99％或更多)總IL-2。
可以如下將SDS/IL 2混合物的濁度測量值轉化成絕對比濁度(τ)值=Tt-0.98TiTi3.210-2C]]>其中Ti為IL-2組合物的濁度強度，Tt為甲苯對照的濁度強度，C為IL-2組合物中IL-2的濃度。
當Ti和Tt以cm-1測量並且C以g/ml(即，g/cm3)測量時，τ的單位為cm2/g。這是評估本發明的IL-2組合物的濁度的優選測量值。
本發明的組合物可以具有小於1.1cm2/g，但是優選大於0.1cm2/g的比濁度(τ)。優選的組合物具有小於0.7cm2/g的τ。本發明組合物的τ優選為0.3-0.6cm2/g。
動態光散射如參考文獻43中，尤其第10章中描述的，可以用動態光散射(DLS)確定溶液中顆粒的流體動力學直徑(或半徑)。本發明的SDS/IL-2聚集體可以通過動態光散射(DLS)檢測。使用DLS，優選的聚集體的平均流體動力學直徑為8nm到20nm，優選10nm到15nm，更優選11nm到13nm，最優選約12nm。如圖17中所示，聚集體將具有在該平均值周圍分布的直徑。
實踐中，通過DLS可以檢測到某些更大的顆粒(例如，圖17中的54nm峰值)，但是上面所指的流體動力學直徑為主要DLS峰的流體動力學直徑，其將通常代表DLS光譜中按數目計至少90％(例如，至少95％，至少97％，至少99％，至少99.5％或以上)。從而，通過DLS檢測的顆粒的按數目即至少90％將具有所指定的數目平均。
緩慢改變的組分，如灰塵顆粒或者混合現象的存在可以使DLS數據的解釋變得複雜。為了避免這些複雜，用於DLS測量的本發明的IL-2組合物優選沒有直徑大於約1μm的顆粒(例如，沒有灰塵)，並且這可以通過使用適宜的濾器，例如，0.22μm濾器來實現。還應該在DLS測量前充分混合該組合物。如果DLS測量揭示組合物中緩慢改變的組分，結果將被被拒絕並且應該對新樣品實施測量。
白介素-2IL-2是熟知的蛋白質，本發明的方法和產物可以使用IL-2的任何適宜的形式。IL-2將通常為人IL-2，或者將是在人體中保持生物活性的IL-2衍生物。
IL-2在人體中天然翻譯為前體蛋白質(例如，GenBank中登錄號為NP 000577.2的153-mer)。前體經切割(例如，NP 000577.2中Ser-20後)得到具有N-末端丙氨酸的成熟產物(SEQ ID NO4)。
當在大腸桿菌中表達時，通常將天然信號肽用單一N-末端甲硫氨酸殘基替換(例如，SEQ ID NOS3和4)。當表達時，該甲硫氨酸被無幹預地切割，留下丙氨酸的天然人N-末端殘基(例如，SEQ ID NO3轉化成SEQID NO1)。
PROLEUKINTM中IL-2缺少天然Ala-1殘基。通常N-末端丙氨酸的缺乏指PROLEUKINTM中IL-2通常稱作IL-2的「去丙氨醯-1」形式。IL-2的去丙氨醯-1形式優選用於本發明。
PROLEUKINTM中IL-2也經設計具有兩個內部半胱氨酸殘基，而不是天然的三個殘基。這將半胱氨酸殘基的可能配對數(從而分子內二硫鍵)從三個減少到一個[46]，並改善了蛋白質再摺疊的結果和保存穩定性。絲氨酸殘基代替天然Cys-125殘基[44]指PROLEUKINTM中IL-2正式稱為IL-2的「絲氨酸-125」形式。IL-2的絲氨酸-125形式優選用於本發明。大腸桿菌中表達的人IL-2的Ser-125形式的三維晶體結構可以在結構資料庫中以登錄號『3INK』得到。
可以進行IL-2胺基酸序列內的其他替換，尤其其中替換是保守的那些替換，即在側鏈相關的胺基酸家族內發生的那些替換。可以將胺基酸分成四個家族(1)酸性—天冬氨酸、穀氨酸；(2)鹼性—賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性—丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不帶電極性—甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸有時歸類為芳香胺基酸家族。例如，可以合理地預測分別用異亮氨酸或纈氨酸替換亮氨酸、用穀氨酸替換天冬氨酸、用絲氨酸替換蘇氨酸，或者用結構上相關的胺基酸對胺基酸的保守替換將不會對生物產生很大影響。技術人員基於天然變異、蛋白質活性形式的比對等等將容易確定可以耐受改變的IL-2的區域，例如，通過標準86/504可以實現所替換的蛋白質的生物活性。
關於通過殘基替換、缺失或插入可以改變的IL-2蛋白質區域的指導可以在本領域中(例如，結構/功能關係和/或結合研究)中發現，如參考文獻45-52等等。參考文獻53公開了多種IL-2突變體，包括Asn-26-Gln；Trp-121-Phe；Arg-120後所有殘基的缺失；及其Met-1形式。參考文獻44公開了具有Cys-125缺失或替換，有或者沒有N-末端Ala的IL-2。參考文獻54公開了殘基的替換或缺失，所述殘基包括2、3、4、5、6、104和125號殘基。Met-104容易受到氧化，因此該殘基的突變(例如，用Glu、Val、Ala等替換)可以提高穩定性[55]。參考文獻56公開了在Asp-20(用His或Ile)、在Asn-88(用Arg、Gly、或Ile)、和/或在Gln-126(用Leu或Glu)處的IL-2替換，已經報導所述替換的IL-2具有更小的毒性和對高親和力IL-2受體的選擇性。參考文獻57公開了替換Arg-38-Ala和Phe-42-Lys，它們為了減小毒性以在免疫治療期間使用。參考文獻58公開了天然Xaa1-Asp-Xaa2三肽序列的突變，其中Xaa1為Leu、Ile、Gly或Val，Xaa2為Val、Leu或Ser以便減小血管滲漏。參考文獻59公開了具有與IL-的前30個殘基融合的N-末端甲硫氨酸、任選具有Asp-20-Lys替換的肽，其據說保持類似IL-2的活性。
其他公知的替換包括T7A、T7D、T7R、KSL、K9A、K9D、K9R、K9S、K9V、K9W、T10K、T10N、Q11A、Q11R、Q11T、E15A、H16D、H16E、L19D、L19E、D20E、I24L、K32A、K32W、N33E、P34E、P34R、P34S、P34T、P34V、K35D、K351、K35L、K35M、K35N、K35P、K35Q、K35T、L36A、L36D、L36E、L36F、L36G、L36H、L361、L36K、L36M、L36N、L36P、L36R、L36S、L36W、L36Y、R38D、R38G、R38N、R38P、R38S、L40D、L40G、L40N、L40S、T41E、T41G、F42A、F42E、F42R、F42T、F42V、K43H、F44K、M461、E61K、E61M、E61R、E62T、E62Y、K64D、K64E、K64G、K64L、K64Q、K64R、P65D、P65E、P65F、P65G、P65H、P651、P65K、P65L、P65N、P65Q、P65R、P65S、P65T、P65V、P65W、P65Y、L66A、L66F、E67A、L72G、L72N、L72T、F78S、F78W、H79F、H79M、H79N、H79P、H79Q、H79S、H79V、L80E、L80F、L80G、L80K、L80N、L80R、L80T、L80V、L80W、L80Y、R81E、R81K、R81L、R81M、R81N、R81P、R81T、D84R、S87T、N88D、N88H、N88T、V91A、V91D、V91E、V91F、V91G、V91N、V91Q、V91W、L94A、L94I、L94T、L94V、L94Y、E95D、E95G、E95M、T102S、T102V、M104G、E106K、Y107H、Y107K、Y107L、Y107Q、Y107R、Y107T、E116G、N119Q、T123S、T123C、Q126I、和Q126V。
IL-2的生物活性變體將通常具有與參比IL-2多肽分子，如上面討論的天然人IL-2的胺基酸具有至少約70％(例如，≥80％、≥90％、≥95％、≥98％、≥99％)胺基酸序列同一性。變體可以例如，相差少至1到15個胺基酸殘基，少至1到10個殘基，如6-10個，或少至5個，少至4、3、2或甚至僅1個胺基酸殘基。
已經報導了IL-2的C-末端延伸[60]。用於本發明的IL-2優選不具有任何這種C-末端延伸。
可以使用的IL-2的其他形式包括非人序列。例如，IL-2可以來自獼猴(Mucucu mulatto；GenBanK登錄號P51498)；橄欖狒狒(Papio unubis；GenBank Q865Y1)；黑色白眉猴(Cercocebus torquatus atys；P46649)；吃蟹的獼猴(Macaca fascicularis；Q29615)；普通長臂猿(Hylobates lar；ICGI2)；普通松樹猴(Saimiri sciureus；Q8MKH2)；奶牛(Bos taurus；P05016或NP-851340；成熟序列由GenBank登錄號NP-851340的殘基24-158代表)；水牛(Bubalus bubalis；Q95KP3)；馬(Equus caballus；P37997)；山羊(Caprahircus；P36835)；綿羊(Ovis aries；P19114)；豬(Sus scrofu；P26891)；赤鹿(Cervus elaphus；P51747)；狗(Canis familiaris；Q29416)；貓(Felis catus；407885)；兔(Oryctolagus cuniculus；077620)；虎鯨(Orcinus orca；097513)；北部海象(Miroungu angustirostris；062641)；家鼠(Mus musculus；NP-032392)；西部野生小鼠(Mus spretus；408867)；挪威大鼠(Rattusnorvegicus；P17108)；蒙古沙土鼠(Meriones unguiculatus；Q08081)。也可以使用這些Genbank條目中公開的任一種變體形式。這些Genbank條目通常公開前體序列，其如上面關於人序列描述的，經處理(例如通過切割前20個胺基酸)得到最終生物活性形式。
人IL-2的脫-丙氨醯-1，絲氨酸-125形式尤其優選用於本發明。IL-2的最優選形式具有圖2中所示132-mer胺基酸序列(SEQ ID NO1)，如在PROLEUKINTM中發現的。組合物優選沒有不具有N-末端Ala的IL-2。使用圖4所示的核酸序列(SEQ ID NO2)，切割所翻譯的N-末端甲硫氨酸後，可以表達圖2蛋白質。
PROLEUKINTM產物中的IL-2未被糖基化，這是由於大腸桿菌表達宿主的原因。未被糖基化的IL-2優選用於本發明。
檢測組合物中IL-2的存在和其定量方法是本領域中公知。使用抗-IL-2抗體的免疫學檢測(例如，ELISA)是最常用的檢測方法，這些方法也可以定量使用。其他定量方法包括胺基酸分析、使用規章批准的蛋白質標準的Lowry蛋白質測定法、HPLC測定法和內在紫外吸收測量。
IL-2的標準定量測量是國際單位(IU)，其不是基於蛋白質質量而是基於生物學測定法中的活性。根據標準86/504，1IU是導致建立的IL-2依賴的細胞系[61]CTLL-2的最大增殖的50％的IL-2的量。使用平行線分析通過比較製備物與可得到的標準(例如，WHO IL-2標準安瓿，其重構後含有100IU/ml)的劑量反應曲線，或者通過計算機軟體，如ALLFIT程序[62，63]可以實現其他製備物中IL-2活性的定量。實踐中，當生產經標準化後，藥物重量和IUs之間的轉換是可能的。例如，對於PROLEUKINTM產品，該轉換為1.1mg IL-2等於18×106IU。
通過將活性除以存在的IL-2的質量可以將活性轉換成比活(即，每單位質量IL-2的活性，例如，IU/mg)。本發明的優選組合物具有16到17MIU/mg的比活。
藥物組合物本發明的方法得到IL-2/SDS微聚集體，其適於人體中的藥用，因此本發明提供了含有本發明的IL-2/SDS微聚集體的藥物組合物。然而，不是簡單地使用直接從滲濾得到的微聚集體，它們在施用於患者前通常經配製。
例如，可以稀釋微聚集體以便得到標準濃度，同時保持IL-2/SDS比例。通常稀釋得到IL-2濃度為約1.1mg/ml。
微聚集體(例如，稀釋後)可以與穩定劑混合，尤其如果它們將被凍幹時。加入糖(例如，蔗糖、海藻糖)通常在凍幹期間得到穩定性，優選的穩定劑是甘露糖醇。可以加入該糖醇得到終濃度為40到50(例如，約45.5)mg/mg IL-2(對於1.1mg IL-2可以加入50mg)。也可以加入人血清白蛋白(優選重組的)作為穩定劑。還可以用糖的混合物，例如，蔗糖和甘露糖醇、海藻糖和甘露糖醇，等等。
可以向微聚集體組合物加入緩衝液，例如，Tris緩衝液、組氨酸緩衝液、甘氨酸緩衝液或者優選地，磷酸鹽緩衝液(例如，含有磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉)。優選加入緩衝液得到7.2到7.8的pH，尤其約7.5的pH。
可以將含有微聚集體的組合物滅菌，優選通過過濾除菌，例如，通過0.22μm濾器。在這之前可以為使用具有更大孔的濾器過濾。
含有微聚集體的水性組合物可以直接包裝到準備注射的注射器中。它們也可以包裝到準備吸入的霧化器中。
含有微聚集體的水性組合物可以在分發前凍幹。水性或凍幹的物質可以包裝到容器(例如，小瓶)中，其然後可以密封。凍幹通常在小瓶中發生，凍幹後密封。相當於22×106IU的IL-2的凍乾物質可以在單個小瓶中作為單位劑量包裝，用於在約1.1ml的最終水性體積中重構，以得到約18×106IU/ml。其部分量(例如，1/2、1/3、1/4、1/5、1/8)也可以作為單位劑量包裝。具體地，可以使用約9×106IU、約4.5×106IU、和約14×106IU的單位劑量。
對於凍幹後重構，可以使用無菌注射用水。還可以用含有人血清白蛋白(優選重組的)的水性組合物重構凍幹餅。優選重構成約1.0ml到1.2ml的水性體積(即，可以將IL-2稀釋成與凍幹前相同的濃度)。然後該重構的物質可以無菌稀釋成更大液體體積以靜脈輸注到例如約50ml D5W溶液(5％右旋糖注射)。在D5W稀釋期間比濁度保持基本上恆定，直到IL-2濃度降低到約0.1mg/ml以下。稀釋可以在多種容器，例如，玻璃瓶、塑料(例如，聚氯乙烯)袋等中發生。應該避免將最終IL-2濃度稀釋到30-70μg/ml範圍之外。應該避免導致微聚集體改變的條件，例如，用抑菌注射用水或者用0.9％氯化鈉注射液重構。
從而第一種優選的藥物組合物為水性組合物，其pH約7.5，含有1.1mg/ml IL-2，0.18mg SDS，50mg/ml甘露糖醇和磷酸鹽緩衝液，其中IL-2和SDS形成微聚集體，其中每個聚集體IL-2分子的平均數為10到50。這些組合物可以從凍幹的物質重構。
第二種優選的藥物組合物為將第一種優選的藥物組合物稀釋到D5W溶液的產物。
優選組合物不含防腐劑，不含抗生素，不含除IL-2之外的蛋白質(包括不含HSA)，即這些物質是檢測不到的。
藥物方法和應用本發明提供了治療患者的方法，其包括對所述患者施用本發明的藥物組合物。患者優選為人，可以為兒童(例如，學走路的兒童或者嬰兒)、青少年或者成年人，但是將通常為成年人。
本發明還提供了用作藥物的本發明的SDS/IL-2微聚集體。
本發明還提供了本發明的微聚集體在製備用於治療患者的藥物中的應用。
這些應用、方法和藥物優選用於治療癌症，尤其實體瘤，如腎細胞癌或黑素瘤，該癌症可以是轉移性的。所述應用、方法和藥物還可用於治療接受組織或者器官移植，或者將要接受組織或者器官移植的患者。所述應用、方法和藥物還可以用於治療感染HIV，包括患有或未患有AIDS的那些患者。
因此，用本發明治療的患者將已經診斷為癌症。然而，不應根據本發明治療的患者可以包括(1)對IL-2或者藥物組合物的任何其他組分超敏的患者；(2)ECOG(Eastern Cooperative Oncology Group)性能狀態≥2的患者；(3)同時存在ECOG＞1的性能狀態和一個以上器官具有轉移性疾病部位和最初診斷為原發性腫瘤和患者經評估需要IL-2治療的日期之間＜24個月的患者；(4)具有嚴重心臟病的重要病史或當前證據的患者；(5)證明需要抗生素治療的活性感染的患者；(6)靜息期間PaO2＜60mm Hg的患者；(7)預先存在的嚴重主要器官功能異常的患者；和(8)具有中樞神經系統轉移或者抽搐病症的患者，排除腦轉移成功治療的患者。
檢查治療性IL-2治療的功效的方法是本領域中公知的。
靜脈大丸劑給藥或輸注後人中IL-2的血清半衰期曲線可以描述為雙指數的。對於大丸劑，Tα為8分鐘，Tβ為88分鐘；對於輸注，Tα為15分鐘，Tβ為96分鐘。所觀察到的血清水平與IL-2劑量成比例。
在上面標題為「藥物組合物」的章節中給出了適宜藥物的特性。這些組合物將通常直接施用於患者。直接遞送可以通過腸胃外注射(例如，靜脈內、皮下、腹膜內、肌內、或者施用於組織的胞間隙)，或者通過經直腸、口、陰道、局部、透皮、鼻內、經眼、耳、肺或者其他黏膜施用。然而，通常，通過靜脈注射(例如，連續輸注或者大丸劑)或者通過皮下注射(例如，連續輸注或大丸劑)施用IL-2。
IL-2給藥通常按患者的身體大小調節，所述身體大小是通過體重(kg)或者體表面積測量(BSA；以m2測量，通過患者的身高和體重的組合測量或者估計)。儘管在體重和BSA給藥之間沒有精確轉換，但是存在良好的近似對於一般體重和身高(每個50百分位數)，25000IU/kg＝1MIU/m2。
治療可以是單劑量方案或者多劑量方案。可以通過大丸劑或者輸注施用劑量。IL-2的通常的治療方案是以連續輸注施用18×106IU/m2/24-小時，共5天，接著不接受IL-22-6天，然後如前以連續輸注靜脈內施用IL-2另外5天，然後3周不接受IL-2。這是IL-2的單一「誘導循環」。第一循環的3周靜息期後，可以開始第二次誘導周期。可以對應答治療或者疾病穩定的患者以4周間隔進行長達4個維持循環。然而，如果患者不能耐受該劑量方案，將減小劑量或者施用中斷直到毒性緩和。IL-2的另一種治療方案是通過靜脈內大丸劑每8小時施用6×105IU/kg，在5天內施用14劑，9天靜息期後給予第二次治療。
優選施用包括靜脈內輸注以治療轉移性腎細胞癌；靜脈內輸注以治療轉移性黑素瘤；皮下大丸劑以治療轉移性腎細胞癌；皮下輸注以治療轉移性腎細胞癌；通過吸入經肺施用以治療患有肺轉移的轉移性腎細胞癌。
聯合治療本發明的IL-2微聚集體可以用作藥物的活性成分。這些藥物可以自身使用以治療患者，或者它們可以與其他活性成分組合使用。通常，IL-2在施用前不與其他活性成分混合；相反，IL-2和其他活性成分將作為組合方案中獨立的藥物施用。聯合治療尤其適於治療癌症，包括惡性和轉移性癌。
從而，本發明提供了(a)本發明的IL-2微聚集體，和(b)第二種藥劑，其用於同時單獨或者順序給藥。
本發明還提供了藥物製劑或者系統，其含有(a)第一種藥劑，其含有本發明的IL-2微聚集體；和(b)第二種藥劑，其中所述第一種和第二種試劑混合或者為單獨的組合物，例如，用於單獨或者順序給藥。
本發明還提供了試劑盒，其含有(a)第一種藥劑，其含有本發明的IL-2微聚集體；和(b)第二種藥劑。
本發明還提供了(a)本發明的IL-2微聚集體和(b)第二種藥劑在製備組合藥物中的應用。
本發明還提供了本發明的IL-2微聚集體在製備藥物中的應用，其中該藥物用於施用於已經用第二種藥劑預先治療的患者。類似地，本發明提供了第二種藥劑在製備藥物中的應用，其中該藥物用於施用於已經用本發明的IL-2微聚集體預先治療的患者。預處理可以是最近的(例如，施用所述藥物前24小時)，中等的(例如，之前超過24小時，但是不長於4周)，更遠(例如，之前至少4周)，或者非常遠(例如，之前至少6個月)，這些時間期限指最近的治療前劑量。通過在預先治療中施用的藥劑的治療可能難以治療該患者。
本發明還提供了本發明的IL-2在製備藥物中的應用，其中該藥物與第二種藥劑共同施用。類似地，本發明提供了第二種藥劑在製備藥物中的應用，其中該藥物與本發明的IL-2微聚集體共同施用。兩種試劑優選相互在4小時以內施用。
優選地，第二種藥物藥劑選自下表，其還包括所述聯合治療可用於治療的疾病的細節(和適宜時，該聯合治療可以怎樣施用的基本細節)。
當第二種試劑為抗體時，其優選為單克隆抗體，更優選人源化或者人抗體。通常通過例如皮下或靜脈內注射施用抗體。抗體可以偶聯其他活性試劑，例如，tiuxetan、奧佐米星、放射性核素、131I等，尤其用於癌症治療。
通常，第二種試劑可以是提供ADCC(依賴抗體的細胞毒性)的任何抗體。基於IL-2的聯合治療與介導ADCC以治療癌症的抗體一起使用比與通過抑制血管形成或者通過改變細胞信號轉導治療癌症的試劑一起使用更有效。
定義術語「包含」包括「包括」以及「組成」，例如，「包含」X的組合物可以僅由X組成或者可以包括額外的事物，例如X+Y。
術語「約」與數值x相關時指例如，x+10％。必要時，術語「約」可以省略。
詞語「基本上」不排除「完全地」，例如，「基本上不含」Y的組合物可以完全不含Y。必要時，詞語「基本上」可以從本發明的定義省略。
用Smith-Waterman同源性搜索算法，使用親和缺口搜索，用缺口打開罰分12，缺口延長罰分2，BLOSUM矩陣62百分數序列同一性可以確定序列同一性百分數。Smith-Waterman同源性搜索算法在參考文獻64中教導。
附圖簡述圖1顯示了滲濾期間隨著SDS的除去比濁度(τ)的增加。
圖2和3顯示了PROLEUKINTM產品中IL-2的胺基酸序列(SEQ IDNO1)。該序列(i)缺少SEQ ID NO3的N-末端甲硫氨酸，(ii)缺少如在SEQ ID NO4中看到的天然成熟人IL-2的N-末端的丙氨酸殘基，和(iii)具有在SEQ ID NO4中看到的Cys-125殘基處的絲氨酸替換。
圖4顯示了編碼圖2序列的核苷酸序列(SEQ ID NO2，其包括起始和終止密碼子，並且在N-末端甲硫氨酸切割前表達為SEQ ID NO3)。左邊的編號表示從IL-2基因的(+)DNA鏈的5』末端計數每一行中第一個鹼基的編號。胺基酸序列下的數字指出從天然人IL-2的N-末端計數的殘基數。箭頭指出相對於人IL-2的核苷酸差異(即，SEQ ID NO2和5之間的差異)。
圖5顯示了用於藥物動力學試驗的7種樣品的比濁度(τ，cm2/g)，使用不同的SDS濃度(μg SDS/mg IL-2)，圖6顯示通過7種樣品的離心可以沉澱的總IL-2的比例。
圖7顯示了7種樣品的6種的血漿生物活性。圖8比較了160μg/mg和25μg/mg樣品，圖9是圖7和8的綜合。X軸顯示注射後時間(小時)；Y軸顯示血漿生物活性(ng/ml)。
圖10顯示滲濾期間針對SDS濃度(mg/μg)的τ(cm2/g)，圖11將τ轉化成MW(kDa)。
圖12顯示滲濾期間SDS濃度的下降。
圖13將圖10的濁度結果疊加在圖12的SDS除去曲線上。
圖14顯示了凍幹對τ(cm2/g)的影響。正方形顯示凍幹前值，圓形顯示凍幹後值。X軸顯示樣品的SDS濃度(μg/mg)。
圖15顯示用血清稀釋之前和之後IL-2微聚集體的生物活性，和與單體IL-2的比較。
圖16和17顯示IL-2的微聚集體的動態光散射光譜。圖16是溶液組分的質量分布，圖17是數字分布。
實施本發明的方式1.IL-2微聚集體的製備用含有圖4核苷酸序列的質粒轉化的大腸桿菌培養在標準條件下，從而具有圖2序列的IL-2蛋白質得到表達。培養後，IL-2主要為內含體的形式。
IL-2的初級回收包括濃縮、細胞破碎、滲濾、失活、再破碎和蔗糖懸浮。用正交流動濾器實施收穫細胞的濃縮以便將工作體積降低到約1/5。通過勻漿破壞細胞以方便分離IL-2內含體。通過滲濾除去發酵培養基鹽，並通過加入乙醇殺死滲濾溶液中的宿主細菌。乙醇處理後，通過勻漿破壞細胞。加入蔗糖得到更高密度的混合物，以便允許離心期間IL-2內含體與細胞碎片分離。通過離心收集IL-2顆粒糊狀物，等分試樣並在-70℃或更低溫度下保存，直到進一步處理。
將IL-2顆粒糊狀物用SDS溶解並用二硫蘇糖醇(DTT)還原以便得到沒有任何二硫鍵的可溶性IL-2的單體形式。實施該加工步驟以增加下一個步驟中層析的IL-2的產率。
通過包括大小排阻層析(SEC)、氧化、濃縮、RP-HPLC、沉澱和離心步驟的方法純化IL-2的單體可溶形式。實施SEC的第一個層析步驟以將IL-2與宿主蛋白質和核酸分離。收集並合併含有IL-2的級分。氧化IL-2以便得到分子內二硫鍵。用超濾實施IL-2溶液的濃縮以便減小工作體積。實施第二個層析步驟製備性RP-HPLC以便將IL-2與細菌內毒素、核酸和宿主蛋白質分離，和除去IL-2同工型，包括氧化的形式。收集並合併含有IL-2的級分。通過加入氫氧化鈉(NaOH)沉澱IL-2並通過離心收集。實施該步驟以除去用於RP-HPLC純化中的溶劑。該階段的所述物質稱作「HPLC糊狀物」。
然後通過加入0.05MNa2HPO4+1％SDS的溶液再溶解HPLC糊狀物。當SDS加到足夠濃度時，該組合物主要含有單體溶解了的IL-2，但是純化期間可以形成少量寡聚體化IL-2(即寡聚體形式的共價交聯的IL-2分子)。通過凝膠過濾除去這些寡聚體，該凝膠過濾也從前面的步驟除去了任何殘留的有機溶劑。
由於SDS對細胞有毒，所以將其從溶解的IL-2除去。將該溶液針對10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)滲濾，直到SDS水平達到約160μg/mg IL-2。IL-2和SDS的微聚集體開始在約500-600μg/mg時形成，當SDS的水平進一步減小到目標160μg/mg水平時，微聚集體的大小逐漸增加(圖1)。該SDS除去對於微聚集體的形成是關鍵的，SDS除去是配製前IL-2的純化方法的最後步驟。
2.用於藥用的IL-2微聚集體的製劑將含有微聚集體的滲濾SDS/IL-2混合物通過將其在280nm的吸光度除以IL-2消光係數(0.79)來檢驗蛋白質濃度(mg/ml)。還測量滲濾的IL-2溶液的體積(ml)。通過將滲濾的IL-2溶液的體積乘以蛋白質濃度計算IL-2蛋白質的總量(mg)。通過將蛋白質的總mg乘以因數0.909計算製劑的最終工作體積(ml)。該因數考慮過濾期間IL-2損失。
為了穩定凍幹期間IL-2，加入1/4體積的20％甘露糖醇溶液以得到5％的最終甘露糖醇濃度(即50mg/ml)。將10mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)也加到最終工作體積。加入甘露糖醇和緩衝液後，通過測量280nm處的吸光度確定配製的溶液中IL-2濃度。
配製後的最終結果為pH7.5時的本體溶液，其含有終濃度1.1±0.05mg/ml的IL-2；0.18mg/ml SDS；50mg/ml甘露糖醇；0.17mg/ml磷酸二氫鈉；和0.89mg/ml磷酸氫二鈉。
將配製的IL-2本體溶液過濾除菌到無菌集液罐中。將物質從該罐轉移到無菌小瓶中。每隻小瓶裝入1.2ml本體溶液。然後將小瓶置於凍幹機中凍幹。然後使用塞子，並且塞子密封。然後標記並包裝小瓶。
3.SDS濃度對濁度的影響達到SDS的優選濃度範圍前，通過上述方法製備IL-2，只是為了研究濁度在滲濾期間的多個點除去大樣品(～300mg IL-2)，以便確定SDS對IL-2聚集的影響。
圖12顯示起始物質的滲濾期間SDS濃度。濃度在對數軸上直線下降。在下面的SDS濃度(μg/mg IL-2)下除去樣品1195、536、351、217、173、137、123、104和72。
IL-2純度在每種樣品中相同(SDS-PAGE測量為100％，HPLC測量為≥98.5％)。在488nm測量濁度並基於樣品中IL-2濃度將其轉化成如上述的絕對比濁度。結果在圖10中顯示，圖13將濁度結果疊加在圖12的SDS除去曲線上。
在約300μg/mg以下，濁度逐漸增加，在約95μg/mg時增加變得非常急劇。
通過下面的公式可以將τ值轉換成推理的分子量MW=1078.1+2]]>對凍幹前樣品的轉換結果在圖11中顯示。這些和其他數據表明在約600μg/mg以上看到相應於單體IL-2的MW，當SDS低於約300μg/mg時MW開始顯著增加，當SDS降低到約100μg/mg以下時該增加變得非常急劇。
基於單體IL-2的MW(天然IL-2為15.3kDa)，可以將聚集體的分子量轉換成每個聚集體IL-2單體的推導數。
4.凍幹和比濁度在用以除去SDS的滲濾期間，在下面的SDS濃度下除去15ml樣品1155；840；585；400；190；和155μg/mg IL-2。在配製之前和之後確定這些樣品的濁度(即，加入甘露糖醇、磷酸鹽緩衝液、凍幹和重構之後)。在兩種情況中，濁度測量在通過0.2μm濾器過濾之前以便除去任何大聚集體。
圖14顯示了凍幹對這些樣品的τ(對數尺度)的影響。該圖表明凍幹不破壞微聚集體，但是其可以通常稍微增加比濁度(即，聚集體大小增加)，而不影響對SDS濃度的依賴。在優選的SDS範圍內該影響通常是微小的。
5.動態光散射使用160μg/mg的SDS濃度如上描述的測量IL-2微聚集體，並將其通過DLS分析。結果在圖16和17中顯示。圖16顯示了通過溶液組分的質量分布的DLS結果，圖17顯示了通過數目分布的DLS結果。
在圖16中，主峰的平均流體動力學直徑為12.7nm，代表總質量的90.22％。還有平均直徑55.6nm的下遊峰，代表質量的0.98％。在圖17中，主峰的平均流體動力學直徑為11.7nm，代表總數目的99.99％。還有平均直徑53.7nm的下遊峰，代表剩餘的0.01％顆粒。
6.比較微聚集體與單體IL-2在多種試驗中比較微聚集體IL-2與單體IL-2。如上描述的製備IL-2微聚集體。為了比較，以單體形式製備IL-2，其中吐溫80用作去汙劑代替SDS。該去汙劑不與IL-2形成微聚集體，但是該去汙劑溶解IL-2並得到生物活性單體產物。
IL-2的兩種形式都證實是有生物活性的。聚集的IL-2具有約20MIU/mg的活性。當用血清體外稀釋時，活性稍微下降。在兩種情況中，活性稍微高於單體IL-2的活性(圖15)。從而本發明的IL-2微聚集體能夠解離而得到生物活性產物，並且生物活性等價於沒有聚集的的IL-2的。
以SDS-微聚集體形式或者單體形式靜脈內施用放射標記的IL-2後比較該放射標記的IL-2的體內分布。微聚集體形式優先在肺、肝和腎中分布，而單體產物幾乎100％在腎中分布。因此，微聚集體對體內分布具有影響。
還在腫瘤轉移模型中比較了微聚集體和單體IL-2。將B16F10腫瘤細胞靜脈內注射到小鼠的尾部，14天後，檢查肺中腫瘤。所治療的動物從第3-10天每天接受IL-2。第14天時肺轉移的中位數如下
因此IL-2的微聚集體形式在腫瘤模型中比單體形式更有效，這是因為使用低得多的劑量的IL-2可以預防腫瘤。然而，因為IL-2自身可以是有毒的，數據不能直接比較，例如，10mg/kg IL-2微聚集體可以殺死約1/2試驗群體。從而最有意義的比較是在最高的非致死劑量，即在7.5mg/kg劑量下。在該等毒(equitoxic)劑量下，用微聚集體看到的轉移中位數為4.5(範圍1-18)，相比用單體IL-2的為16(範圍4-57)，差異是統計學上顯著的。該差異代表IL-2微聚集體形式的3到5倍更好的治療指數。
使用B16人工轉移模型的其他研究揭示終產物中SDS的水平似乎不影響功效。例如，含有160μg/mg SDS的組合物與含有181μg/mg SDS的組合物性能相同。因此，SDS在95-250μg/mg範圍內時，抗腫瘤活性保持最佳，同時避免的SDS相關的毒性。
7.SDS終濃度的藥物動力學效果如上文所示，IL-2/SDS混合物的濁度隨著滲濾期間SDS水平降低而增加。在藥物動力學試驗中，在160μg/mg的典型目標直到下降到25μg/mg時，滲濾仍然保持良好。在滲濾過程的多個階段1090μg/mg；200μg/mg；160μg/mg；125μg/mg；95μg/mg；65μg/mg；和25μg/mg時採集樣品。
可看到除了最稀(25μg/mg)的樣品之外的所有樣品都是澄清的，圖5顯示了7種樣品的比濁度(τ)。最低濃度下τ的下降反映了在25μg/mg下蛋白質沉澱的顯著增加，該沉澱是眼睛可見的。圖6顯示了通過7種樣品中離心可以沉澱的總IL-2的比例，在最低SDS濃度下看到顯著增加，而較高的濃度基本上是恆定的。該沉澱的物質沉澱出來並且不導致混濁，解釋了圖5中的低τ值。
與不同的濁度和沉澱相比，對於7種樣品生物活性(IU)基本上是恆定的(約19IU/mg)。
為了研究藥物動力學，基於人劑量的比速增長外推，除了最稀的樣品外的所有樣品都作為大丸劑以0.2mg IL-2/kg體重注射到大鼠的尾靜脈(每種SDS劑量一式三份，總共18隻大鼠)。注射後1、3、5、7.5、10、15、20、25、30、45和60分鐘時採集血樣，並分析IL-2生物活性。圖7顯示了這些樣品的血漿生物活性(ng/ml)。0.5小時到1小時之間，頂線為160μg/mg劑量(■)，最低線為65μg/mg(△)，儘管所有線都非常相似。
在第二個研究中，將來自第一個實驗具有最高線(160μg/mg)的樣品與最稀釋的樣品(25μg/mg)比較。該第二個研究中160μg/mg樣品的藥物動力學參數與第一個研究的那些參數匹配。而圖7中的線相互都具有相似形狀，然而，最稀釋的樣品給出非常不同的結果(圖8)。從這些曲線計算的清除率差異達～30倍160μg/mg劑量為12.7ml/min/kg，25μg/mg劑量為362ml/min/kg。
當比較來自兩個實驗的結果時，最稀釋的樣品與其他6種樣品明顯不同(圖9)。
因此，IL-2的聚集體狀態對其體內藥物動力學具有明顯影響。
8.游離SDS上面的實驗測量SDS/IL-2混合物中的總SDS濃度。進行實驗以觀察總SDS中有多少與IL-2結合，和有多少在溶液中保持游離。
如所教導的將PROLEUKINTM產品的小瓶重構並通過以3000轉/分鐘兩次離心，每次30分鐘通過Centricon 10膜(10kDa截留值)超濾。檢測起始樣品和濾液的SDS和IL-2水平。通過吖啶橙[35]測量SDS。簡言之，該測定法包括採集0.5ml樣品；加入0.1ml 1.75M NaHSO4溶液；加入0.1ml 1％(w/v)吖啶橙溶液；加入1.5ml甲苯；密封；渦旋3分鐘；分離有機相和水相(例如，通過環境溫度下以3000轉/分鐘離心5分鐘)；在499nm下測量上層有機層的吸光度。可以在測定前將樣品稀釋(例如，用純水)以使它們在標準曲線的範圍內，例如，如果標準曲線是基於高達25μg/mg的已知SDS濃度，那麼應該稀釋樣品以使其SDS濃度在該範圍內。分光光度法步驟的空白應該是不含有SDS的標準，其已經以與試驗樣品相同的方式進行處理。
結果表明通過超濾膜完全保留IL-2(在濾液中檢測不到)，而約35％SDS能夠穿過該膜。
應當理解僅通過舉例的方式描述了本發明，可以在不背離本發明的精神和範圍下對細節作出修改。
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1.一種製備用於藥用的白介素-2的方法，該方法包括以下步驟(a)向含有白介素-2的組合物中加入十二烷基硫酸鈉(SDS)，以獲得每mg IL-2至少500μg SDS的SDS終濃度；(b)降低SDS濃度，從所述組合物中除去一些但不是所有SDS以獲得含有每mg白介素-2 95-250μg SDS的組合物。
2.權利要求1的方法，其中步驟(a)中的SDS終濃度為至少900μg/mg。
3.權利要求1或權利要求2的方法，其中步驟(b)的產品具有135-180μg/mg的SDS濃度。
4.一種製備含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的組合物的方法，其中(i)所述組合物中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體形式存在；和(ii)該方法包括以下步驟(a)向含有白介素-2的組合物中加入十二烷基硫酸鈉，其中加入足夠的十二烷基硫酸鈉以得到單體的、溶解了的白介素-2，和(b)將十二烷基硫酸鈉的濃度降低到白介素-2與十二烷基硫酸鈉形成聚集體的水平，以致於該組合物在凍幹和重構後具有小於1.1cm2/g的比濁度(τ)。
5.權利要求4的方法，其中所述聚集體具有8nm到20nm之間的平均流體動力學直徑。
6.前面任一項權利要求的方法，其中通過滲濾降低SDS濃度。
7.前面任一項權利要求的方法，其包括在步驟(a)和(b)之間的凝膠過濾步驟以便除去任何沉澱的IL-2共價多聚體。
8.前面任一項權利要求的方法，其還包括步驟加入甘露糖醇。
9.前面任一項權利要求的方法，其還包括步驟凍幹。
10.一種含有白介素-2與十二烷基硫酸鈉的組合物，其中白介素-2與十二烷基硫酸鈉以聚集體形式存在，並且其中通過前面任一項權利要求的方法可以得到該聚集體。
11.一種含有白介素-2與十二烷基硫酸鈉的組合物，其中白介素-2與十二烷基硫酸鈉以聚集體形式存在，並且其中該組合物具有一個或多個下列特性(i)該組合物具有小於1.1cm2/g的比濁度(τ)；(ii)該組合物含有平均流體動力學直徑為8nm到20nm之間的SDS/IL-2聚集體；和/或(iii)該組合物含有95-250μg SDS/mg白介素-2。
12.一種含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的凍幹組合物，其中該組合物可以用水性介質重構得到權利要求11的組合物。
13.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中所述組合物的比濁度小於0.7cm2/g。
14.權利要求13的方法或組合物，其中所述組合物的比濁度為0.3cm2/g到0.6cm2/g。
15.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中所述組合物含有流體動力學直徑為11nm到13nm的SDS/IL-2微聚集體。
16.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中所述組合物包括濃度為40到50mg甘露糖醇/mg IL-2的甘露糖醇。
17.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中IL-2為人IL-2。
18.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中IL-2為脫丙氨醯-1IL-2。
19.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中IL-2為絲氨酸-125IL-2。
20.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中IL-2為脫-丙氨醯-1，絲氨酸-125人IL-2。
21.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中IL-2具有胺基酸序列SEQ ID NO1。
22.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中IL-2為非糖基化的。
23.前面權利要求任一項的方法或組合物，其中IL-2是在重組原核宿主中表達後純化的。
24.權利要求10到23中任一項的組合物，其中IL-2濃度為約1.1mg/ml。
25.一種凍幹的藥物組合物，其當用1.2ml無菌注射用水重構時，每毫升含有1.1mg非糖基化脫-丙氨醯-1，絲氨酸-125人IL-2；50mg甘露糖醇；0.18mg十二烷基硫酸鈉(SDS)；0.17mg磷酸二氫鈉；和0.89mg磷酸氫二鈉至pH 7.5，其中IL-2和SDS為聚集體形式使得所述重構的組合物具有小於1.1cm2/g的比濁度(τ)。
26.一種通過用1.2ml無菌注射用水重構權利要求25的凍幹組合物可以得到的水性藥物組合物。
27.權利要求10到26中任一項的組合物，和第二種藥劑，它們用於同時分開或者順序給藥。
28.含有(a)權利要求10到26中任一項的組合物；和(b)第二種藥劑的試劑盒。
29.權利要求10到26中任一項的組合物，其用於醫藥。
30.(a)白介素-2和(b)十二烷基硫酸鈉的微聚集體在製備施用於患者的藥物中的應用，其中所述微聚集體具有8nm到20nm的平均流體動力學直徑。
31.含有白介素-2和十二烷基硫酸鈉的組合物在製備施用於患者的藥物中的應用，其中白介素-2和十二烷基硫酸鈉以聚集體形式存在，並且其中該組合物具有一種或多種下列特性(i)該組合物具有小於1.1cm2/g的比濁度(τ)；(ii)該組合物含有平均流體動力學直徑為8nm到20nm之間的SDS/IL-2聚集體；和/或(iii)該組合物含有95-250μg SDS/mg白介素-2。
32.權利要求30或權利要求31的應用，其中所述藥物用於治療癌症。
33.權利要求32的應用，其中癌症為腎細胞癌。
34.權利要求32的應用，其中癌症為黑素瘤。
35.權利要求30到34中任一項的應用，其中患者已經用第二二種藥劑預先治療。
36.權利要求30到34中任一項的應用，其中所述藥物與第二二種藥劑共同施用。
37.第二種藥劑在製備施用於患者的組合藥物中的應用，其中患者已經用權利要求10到26中任一項的組合物預先治療。
38.第二種藥劑在製備施用於患者的組合藥物中的應用，其中該藥物與權利要求10到26中任一項的組合物共同施用。
39.(a)白介素-2和十二烷基硫酸鈉的微聚集體，和(b)第二種藥劑在製備組合藥物中的應用，其中所述微聚集體具有8nm到20nm的平均流體動力學直徑。
40.權利要求27的組合物，權利要求28的試劑盒，或者權利要求35到39中任一項的應用，其中所述第二種藥劑為單克隆抗體。
41.權利要求27的組合物，權利要求28的試劑盒，或者權利要求35到39中任一項的應用，其中所述第二種藥劑為提供ADCC的抗體。
42.權利要求27的組合物，權利要求28的試劑盒，或者權利要求35到39中任一項的應用，其中所述第二種藥劑選自由下列各項組成的組抗-CD20抗體；抗-CD40抗體；抗-Her2抗體；抗-EGFR抗體；抗-VEGF抗體；抗-CD52抗體；抗-CD33抗體；H2受體激動劑；卡介苗；沙利度胺；Lenalidomide；蛋白酶體抑制劑；環磷醯胺、長春新鹼和潑尼松的組合；環磷醯胺、羥基多柔比星、長春新鹼和潑尼松的組合；細胞因子；α幹擾素；γ幹擾素；5-氟尿嘧啶；抗-逆轉錄病毒化合物；酪氨酸激酶抑制劑；和脫氧氮雜胞苷。
43.權利要求42的組合物、試劑盒或者應用，其中所述H2受體激動劑為組胺或者組胺的藥學上可接受的鹽，如二鹽酸組胺。
全文摘要
一種製備用於藥用的阿德斯白細胞素的方法，其包括以下步驟(a)向含有阿德斯白細胞素的組合物中加入SDS，以獲得高SDS終濃度；(b)降低SDS水平以得到低SDS濃度的組合物。加入然後部分除去SDS得到了適於藥用的阿德斯白細胞素和SDS的微聚集體。
文檔編號C07K14/54GK1799625SQ20051011365
公開日2006年7月12日 申請日期2005年10月13日 優先權日2004年12月14日
發明者馬寧德·奧拉 申請人:凱榮公司