利用長枝木黴重構三七中的皂苷成分的製作方法

2023-10-17 19:59:24 3

利用長枝木黴重構三七中的皂苷成分的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種木黴發酵改變三七中單體皂苷含量和組成成分的方法。該方法的操作步驟主要包括：（1）長枝木黴TrichodermalongibrachiatumRifai菌種的製備；（2）三七培養基的製備；（3）發酵培養條件；（4）產物後處理和主要功效成分檢測。使用本發明所提出的木黴發酵三七的方法，直接以三七原藥材作為發酵底物，使三七中皂苷的組成成分和含量發生明顯變化，實現了三七有效成分的重構。
【專利說明】利用長枝木黴重構三七中的皂苷成分
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬微生物【技術領域】，涉及一種木黴發酵改變三七中單體皂苷含量和組成的方法。
【背景技術】
[0003]三七[/--?: no toginseng (Burk.) F.H.Chen]為五加科人參屬植物,主產於雲南，主要活性成分為三七總阜苷OcIaflar no toginseng saponins, PNS)。目前為止，已從三七中分離出70餘種人參皂苷，均屬達瑪烷型四環三萜皂苷。按其皂苷元類型又可細分為兩類:20(S)_原人參二醇型[20 (S) -protopanaxadiol]和20(S)_原人參三醇型[20 (S) -protopanaxatriol]。其中原人參二醇型皂苷包括 Rbl、Rb2、Re、RcU Rh2、Rg3、Rb3、C-K,PPD ;原人參三醇型皂苷包括Rgl、Rg2、Re、Rl、Rhl、Fl、PPT。天然皂苷中含量較高的是Rgl、Rbl、RcU R1、Re、Re ;含量甚微的稀有皂苷為 Rg2、Rg3、Rhl、Rh2、F1、F2、PPD、C_K、PPT。其中人參皂苷Rd的含量較Rgl和Rbl少很多，西洋參含0.1-0.2%，人參含0.2-0.3%，三七含0.5-0.7%。但Rd對心腦血管、神經系統、免疫系統等作用獨特。目前，人參皂苷Rd已完成II期臨床試驗，正在開展III期臨床研究，有可能成為治療腦中風的新型臨床治療藥物，同時，在鎮痛、神經保護作用方面，人參皂苷Rd有比其它單體皂苷更強的活性。人參皂苷Rd在植物中含量少，化學結構複雜，化學合成至今尚未成功，目前僅能從原植物的根、莖、葉中提取，效率低，成本高，嚴重製約了人參皂苷Rd的開發利用
對人參皂苷不同時段體內代謝產物的研究表明:絕大多數天然人參皂苷在胃腸道中吸收較差，人參皂苷在胃液作 用下只發生輕微的水解反應，代謝產物在腸液中酶或菌的作用下，糖苷鍵逐步斷裂，將連在C3、C6、C20位的糖逐步降解成稀有皂苷才真正發揮藥理作用。通過對皂苷活性的研究發現，人參皂苷的抗腫瘤活性與皂苷糖鏈結構的關係為:苷元 > 單糖苷> 二糖苷 > 三糖苷 > 四糖苷。人參皂苷的結構因糖基側鏈的不同，表現出性質和功能的較大差異，不同的人參單體皂苷具有不同的藥理活性。日本學者Hasegawa經過多年研究，總結出了原人參二醇型(Rbl、Rd和Re)皂苷口服後，在大腸中被腸道菌水解成C-K，然後進入血液發揮藥理作用；原人參三醇型(Rgl、Rl和Re)皂苷口服後，在大腸中被腸道菌水解成原人參三醇PPT，然後進入血液，由此得知大量人參皂苷是前藥，真正發揮作用的是它們的代謝產物C-K以及苷元PPT，同時C-K可以進一步降解成PPD。
[0004]但是，這種體內的轉化過程受到多種個體因素的制約，轉化甚微。因此，採用微生物轉化技術在體外有效地改造皂苷的糖鏈結構，重構三七總皂苷單體皂苷的種類和含量具有重要研究意義。
[0005]目前，得到稀有人參皂苷的方法主要有加熱法、酸解法、鹼解法、Smith降解法和酶法。化學法可以使皂苷水解，但它們的水解條件都十分劇烈，不易控制，水解副產物多，且易汙染環境。生物法具有反應選擇性強、反應條件溫和、副產物少、不造成環境汙染、後處理簡單等優點。本發明以三七藥材為主要培養基成分，用三七中分離得到的長枝木黴為菌種進行發酵，獲得原藥材中缺乏的活性成分，優化三七總皂苷中各皂苷的組成和比例，達到改善藥效的目的。[0006]

【發明內容】
[0007]本發明提供了一種利用微生物重構三七活性成分的方法。[0008]該方法的操作步驟如下: (1)菌株為長枝木黴longibrachiatum Rifai,於 2012 年 3 月 5 日鑑定並保存於雲南大學中草藥生物資源研究所云百草實驗室； (2)菌種製備:將長枝木黴接種到PPDA斜面培養基，於23°C恆溫培養4d； (3)三七培養基:精確稱取Ig過60目篩的三七粉於100 mL三角瓶，加入0.2 mL無機鹽:10 %KH2P04 和 5 %MgS04，20 mL 水，自然 pH, 121°C滅菌 30-90 min ； (4)液體發酵培養:將步驟(2)中製備好的菌種接入步驟(3)三七培養基中，於10-30。。，130 r/min 培養 60-120 h ； (5)液體發酵物後處理:將步驟(4)中培養好的液體發酵物抽濾，用10mL純水清洗濾渣，合併濾液，4000 r/min離心30 min，取上清液加入等體積水飽和正丁醇超聲萃取I h，靜置分層後，收集上層正丁醇相60°C旋蒸至乾燥，用5 mL70%甲醇溶解殘渣採用行HPLC法檢測皂苷含量。[0009]本發明的關鍵點在於:利用三七根莖上分離得到的長枝木黴直接發酵三七藥材，使活性成分(皂苷)的種類和含量發生變化，改善和提高了三七藥效。[0010]
【具體實施方式】[0011]以下實施例用於說明本發明，但不是對本發明的限制。[0012]實施例1:不同培養基滅菌時間對發酵後皂苷種類和含量的影響 (1)菌種製備:將長枝木黴接種到PPDA斜面培養基，於23°C恆溫培養4d； (2)三七培養基:精確稱取Ig過60目篩的三七粉於100 mL三角瓶，加入0.2 mL無機鹽:10 %KH2P04 和 5 %MgS04，20 mL 水，自然 pH, 121°C滅菌 30、60、90 min ； (3)液體發酵培養:將步驟(1)中製備好的菌種接入步驟(2)三七培養基中，於20°C，130 r/min 培養 96 h ； (4)液體發酵物後處理:將步驟(3)中培養好的液體發酵物抽濾，用10mL純水清洗濾渣，合併濾液，4000 r/min離心30 min，取上清液加入等體積水飽和正丁醇超聲萃取I h，靜置分層後，收集上層正丁醇相60°C旋蒸至乾燥，用5 mL70%甲醇溶解殘渣，採用HPLC法檢測阜苷含量。其結果見表1。[0013]表1三七培養基121°C滅菌不同時間發酵對皂苷含量的影響
【權利要求】
1.一種木黴發酵改變三七中單體皂苷含量和組成的方法，其特徵在於該方法包括: (1)生產菌株為長枝木黴longibrachiatum Rifai ； (2)菌種製備:將長枝木黴接種到PPDA斜面培養基，於23°C恆溫培養4d； (3)三七培養基:精確稱取Ig過60目篩的三七粉於100 mL三角瓶，加入0.2 mL無機鹽:10 %KH2P04 和 5 %MgS04，20 mL 水，自然 pH, 121°C滅菌 30-90 min ； (4)液體發酵培養:將製備好的菌種接入三七培養基中，於10-30°C, 130 r/min培養60-120 h ； (5)液體發酵物後處理:將液體發酵物抽濾，用10mL純水清洗濾渣，合併濾液，4000r/min離心30 min，取上清液加入等體積水飽和正丁醇超聲萃取I h，靜置分層後，收集上層正丁醇相60°C旋蒸至乾燥，用5 mL70%甲醇溶解殘渣，採用HPLC法檢測皂苷含量。
【文檔編號】C12P33/20GK103627771SQ201210301913
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月23日 優先權日:2012年8月23日
【發明者】虞泓, 葛鋒, 王豔, 趙方允, 曾文波, 陳自宏, 王元兵 申請人:雲南雲百草實驗室有限公司