低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積雪草苷的工藝的製作方法

2023-10-17 22:57:59

專利名稱：低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積雪草苷的工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積雪草苷的 工藝。積雪草Centella asiatica (L. ) UrBan為傘形科植物，植物學家林奈 (Linnaeus, Carolus)於1764年將積雪草歸入天胡荽屬(Hydrocotyle)，並定名為 Hydrocotyleasiatica L.。在1879年，德國人UrBan根據花瓣的排列以及果實的稜數將其 從天胡荽屬中的獨立出來並建立積雪草屬(Centella)，積雪草歸入該屬並更名為Centella asiatica (L)Urb.。積雪草主要分布於南北半球熱帶和亞熱帶地區，主產地為南非、印度、 斯裡蘭卡、馬來西亞、印度尼西亞、澳大利亞、日本等，我國亦產積雪草。積雪草在中國的藥 用歷史已達二千多年之久，民間常用於治療感冒、扁桃腺炎、傳染性肝炎、痢疾、跌打損傷、 疔瘡腫毒、外傷出血等。積雪草現代藥理學研究和應用有了很大發展，表明積雪草可用於治 療抑鬱症、皮膚創傷、胃潰瘍、傳染性肝炎、皮膚病和流行性腦脊髓膜炎等。積雪草的化學成分複雜，主要有三萜類、黃酮類、揮髮油類、多炔烯類等。積 雪草總苷是積雪草提物中主要的藥效成分，主要由積雪草苷(Aisaticoside，CAS No. 16830-15-2)、羥基積雪草苷(Asaiticoside A ；Madecassoside, CAS No. :34540-22_2)和 積雪草苷B (Asaiticoside B，CAS No. : 125265-68-1)等物質組成。其中積雪草苷在醫藥、 化妝品等領域已有廣泛應用，研究表明積雪草苷具有促進傷口癒合，治療疤痕的藥理作用。積雪草苷(a)、羥基積雪草苷(b)與積雪草苷B(C)的結構式如下(R = Glu-Glu-Rha)在工業上，從積雪草中提取的積雪草總苷產品常因積雪草產地或工藝的不同而導 致其中積雪草苷、羥基積雪草苷與積雪草苷B的含量有明顯的變化。有些積雪草總苷中積 雪草苷含量大於20%且羥基積雪草苷/積雪草苷(w/w)小於2，有些則積雪草苷含量低於 20%且羥基積雪草苷/積雪草苷(w/w)大於2。對於上述兩種積雪草總苷中的前者，浙江大學化工系製藥工程研究所綠色製藥工 程研究室的呂秀陽研究員課題組成功開發的採用結晶法從積雪草總苷出發製備積雪草苷
背景技術：
純品的工藝(專利CN2008-10162211)，可以高效地製備得到高純度的積雪草苷產品，具有 高效節能、產品純度高、回收率高等特點。但此工藝應用於後者時，卻存在積雪草苷回收率 偏低、產品純度不高的問題。同時，為了從該工藝過程的結晶餘液中進一步回收殘留的積雪 草苷與羥基積雪草苷，非常有必要尋找一種從低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷 和羥基積雪草苷的工藝。

發明內容
本發明的目的是提供一種低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積 雪草苷的工藝。工藝的步驟如下1)低積雪草苷含量總苷在50 65°C下用甲醇加熱溶解，冷卻結晶得到固形物I 與結晶母液I ；2)固形物I繼續在50 65°C下用甲醇加熱溶解，冷卻結晶得到固形物II與結晶 母液II ；3)固形物II再次在50 65°C下用甲醇加熱溶解，冷卻結晶得到固形物III與結 晶母液III ；4)固形物III經真空乾燥後得到高純度羥基積雪草苷；5)結晶母液I經大孔吸附樹脂純化，富含總苷的收集液濃縮後真空乾燥，得到高 積雪草苷含量總苷；6)高積雪草苷含量總苷用溶劑I溶解、再加入溶劑II結晶得到固形物IV與結晶 母液IV ；7)固形物IV經真空乾燥後得到高純度積雪草苷；8)合併結晶母液II、III、IV經大孔吸附樹脂純化，富含總苷的收集液濃縮後真空 乾燥作為起始原料回至步驟1)。其中步驟6)中溶劑I為甲醇或二甲基甲醯胺，加入量為2. 5 10mL/g積雪草總 苷。步驟6)中溶劑II為丙酮、乙腈、乙醚、乙酸乙酯或水，加入量為溶劑I加入量的0.5 10 倍。步驟 5)、8)中的大孔吸附樹脂型號為 HPD100、HPD200、HPD300、HPD400、HPD500、 HPD600、HPD700、X_5、AB-8 或 D4020。本發明中的低積雪草苷含量總苷是指積雪草苷、羥基積雪草苷、積雪草苷B總含 量大於70%，積雪草苷含量低於20%且羥基積雪草苷/積雪草苷(w/w)大於2的積雪草總 苷。高積雪草苷含量總苷是指積雪草苷、羥基積雪草苷、積雪草苷B總含量大於70%，積雪 草苷含量高於20%且羥基積雪草苷/積雪草苷(w/w)小於2的積雪草總苷。高純度積雪草 苷是指純度大於90%的積雪草苷產品，高純度羥基積雪草苷是指純度大於90%的羥基積 雪草苷產品。冷卻結晶過程在室溫下進行，結晶時間通常在4小時以上。本發明具有過程簡單、生產成本低、汙染少、產品積雪草苷收率和純度高等優點， 適合於工業化生產。


附圖是低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積雪草苷的工藝流程簡圖。
具體實施例方式以下用實施例對本發明的工藝方法作進一步的說明。本發明的保護範圍不受實施 例的限制，本發明的保護範圍由權利要求書決定。積雪草總苷原料由廣西昌洲天然藥業有限公司提供，經檢測其中積雪草苷質量含 量為15. 0 %，羥基積雪草苷含量為33 %，積雪草苷B質量含量佔28 %。實施例中所用的分析條件如下高效液相色譜(HPLC)分析條件AgilentllOO液相色譜分析系統，色譜柱為 Synergi 4 μ Hydro-RP 80Α reversed—phase column(4. 6mmX 250mm,4 μ m, Phenomenex), 流動相甲醇-水(60 40)，流速0.5mL/min，柱溫25°C，紫外檢測波長205nm，積雪草苷標 準對照品購自Sigma公司，羥基積雪草苷標準對照品購自中國藥品生物製品檢定所。本發明中大孔吸附樹脂純化的具體步驟如下1)結晶母液經濃縮後真空乾燥，再用水溶解至1. 5g/L濃度；2)在層析柱中裝入預處理的大孔吸附樹脂，高徑比為3 5 ；3)物料溶液以0. 5 1. 5BV/h的流速流過樹脂柱，至流出液中總皂苷穿透；4)4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇-水混合流動相(乙醇的體積百分比 為30% )以0. 5 2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，洗脫液經HPLC分析後合併得到富含總 苷的收集液。實施例1取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為37. 2g，加入93mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到 固形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為28. lg，加入140. 4mL甲醇(5mL 溶劑I/g積雪草總苷)加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形 物III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為17. 5g，收率80. 6%，純度91. 2%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為40. 5g，用27L水溶解製成總苷水溶液。在 內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD100，樹脂柱高為12cm(高徑比為 3)，樹脂柱的床層體積為150. SmL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液中雪 草總苷穿透，共加入總苷水溶液6. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇-水 混合流動相以0. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分 比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空 乾燥，重量為16. 7g，加入41. SmL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入41. SmL 水(溶劑I加入量的1倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為6. 8g，收率69. 6%，純度91. 4%。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為12g後用水溶解製成總苷水 溶液，用8L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD100，樹脂 柱高為9cm(高徑比為3)，樹脂柱的床層體積為63. 6mL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速過層 析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液2. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以0. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇_水混合流動相 中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析後 合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為8. 3g，作為起始原料回用。實施例2取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入300mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)， 加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量為 27. 6g，加入138mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形 物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為16. 3g，加入40. 7mL甲醇(2. 5mL溶劑 I/g積雪草總苷)加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物III 經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為12. 6g，收率58. 7%，純度92. 5%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為44. 4g，用29. 6L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD200，樹脂柱高為12cm(高徑比 為4)，樹脂柱的床層體積為84. SmL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層析柱，至流出液中雪草 總苷穿透，共加入總苷水溶液3. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇_水混 合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比為 30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複7次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空乾燥， 重量為20. 6g，加入103. 2mL 二甲基甲醯胺(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入51. 6mL 水(溶劑I加入量的0.5倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV;固形物 IV經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為5. 2g，收率53. 3 %，純度90. 8 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為18. 5g後用水溶解製成總苷 水溶液，用12. 3L水溶解，在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD200， 樹脂柱高為12cm(高徑比為3)，樹脂柱的床層體積為150. SmL ；總苷水溶液以lBV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液6. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動 相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複1次，洗脫液經HPLC分析 後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為12. Sg,作為起始原料回 用。實施例3取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入450mL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為18g，加入135mL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固 形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為7. 7g，加入57. 4mL甲醇(7. 5mL溶 劑I/g積雪草總苷)加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物 III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為3. 6g，收率17. 2%，純度93. 9%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為54. 4g，用36. 2L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD300，樹脂柱高為20cm(高徑 比為5)，樹脂柱的床層體積為251. 3mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液 中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液11. 2L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙 醇_水混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮 後真空乾燥，重量為30. 6g，加入229. 3mL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入 917. ImL水(溶劑I加入量的4倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ； 固形物IV經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為5. 1 g，收率52. 3 %，純度90. 3 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為27. 5g後用水溶解製成總苷 水溶液，用18. 3L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD300， 樹脂柱高為15cm(高徑比為5)，樹脂柱的床層體積為106mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液4. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流 動相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分 析後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為19. lg，作為起始原料 回用。實施例4取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入600mL甲醇(IOmL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為8. 4g，加入21mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到 固形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為6. 3g，加入31. 7mL甲醇(5mL溶 劑I/g積雪草總苷)加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物 III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為4g，收率18. 7%，純度93. 9%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為54g，用36L水溶解製成總苷水溶液。在內徑 為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD400，樹脂柱高為20cm(高徑比為5)， 樹脂柱的床層體積為251. 3mL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液中雪草總 苷穿透，共加入總苷水溶液11. 2L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇-水混 合流動相以2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比為 30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空乾燥， 重量為30. 2g，加入302. 5mL 二甲基甲醯胺(IOmL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入605mL 水(溶劑I加入量的2倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為4. 5g，收率45. 5%，純度89. 8%。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為27. 8g後用水溶解製成總苷 水溶液，用18. 5L水溶解，在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD400， 樹脂柱高為12cm(高徑比為3)，樹脂柱的床層體積為150. SmL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流 速過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液6. 7L ；先用4個床層體積的水洗 滌樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流 動相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分 析後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為19. 3g，作為起始原料 回用。實施例5取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量為37. 2g，加入93mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到 固形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為28. lg，加入280. 9mL甲醇(IOmL 溶劑I/g積雪草總苷)加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形 物III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為9. 2g，收率43. 1%，純度93. 1%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為49. 8g，用33. 2L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD500，樹脂柱高為16cm(高徑比 為4)，樹脂柱的床層體積為201. ImL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層析柱，至流出液中雪 草總苷穿透，共加入總苷水溶液8. 9L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇_水 混合流動相以0. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分 比為30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空 乾燥，重量為26g，加入65. ImL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入651. ImL水 (溶劑I加入量的10倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為7. 5g，收率76. 7 %，純度91. 4 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為19. 6g後用水溶解製成總苷 水溶液，用13. IL水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD500， 樹脂柱高為12cm(高徑比為4)，樹脂柱的床層體積為84. SmL ；總苷水溶液以lBV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液3. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以0. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流 動相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分 析後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為13. 6g，作為起始原料 回用。實施例6取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入300mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)， 加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量為 27. 6g，加入138mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形 物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為16. 3g，加入81. 4mL甲醇(5mL溶劑 I/g積雪草總苷)加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物III 經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為10. lg，收率47. 6 %，純度93 %。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為46. 9g，用31. 2L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD600，樹脂柱高為15cm(高徑比 為5)，樹脂柱的床層體積為106mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液中雪 草總苷穿透，共加入總苷水溶液4. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇-水 混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比 為30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複6次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空 乾燥，重量為23. lg，加入115. 3mL 二甲基甲醯胺(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入 922. 2mL水(溶劑I加入量的8倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ； 固形物IV經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為5. 9g，收率60. 9 %，純度90. 8 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為20. Ig後用水溶解製成總苷 水溶液，用13. 4L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD600，樹脂柱高為15cm(高徑比為5)，樹脂柱的床層體積為106mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液4. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動 相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析 後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為14g，作為起始原料回用。實施例7取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入450mL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為18g，加入90mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形 物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為10. 6g，加入26. 6mL甲醇(2. 5mL溶劑 I/g積雪草總苷)加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物III 經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為8. 2g，收率38. 6%，純度93. 3%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為49. Sg,用33. 2L水溶解製成總苷水溶液。在 內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD700，樹脂柱高為12cm(高徑比為 3)，樹脂柱的床層體積為150. SmL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液中雪 草總苷穿透，共加入總苷水溶液6. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇-水 混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分 比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複4次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空 乾燥，重量為26g，加入195. ImL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入390. ImL 水(溶劑I加入量的2倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為4. 9g，收率50. 2 %，純度90. 3 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為23. Ig後用水溶解製成總苷 水溶液，用15. 4L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD700， 樹脂柱高為9cm(高徑比為3)，樹脂柱的床層體積為63. 6mL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液2. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流 動相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複4次，洗脫液經HPLC分 析後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為16g，作為起始原料回 用。實施例8取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入600mL甲醇(IOmL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為8. 4g，加入21mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到 固形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為6. 3g，加入31. 7mL甲醇(5mL溶 劑I/g積雪草總苷)加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物 III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為4g，收率18. 7%，純度93. 9%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為54g，用36L水溶解製成總苷水溶液。在內 徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂X-5，樹脂柱高為16cm(高徑比為4)，樹 脂柱的床層體積為201. ImL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液8. 9L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動 相以2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比為30%。 上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空乾燥，重量 為30. 2g，加入75. 6mL 二甲基甲醯胺(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入37. SmL水 (溶劑I加入量的0. 5倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為6. 6g，收率68. 1 %，純度91. 4 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為25. 6g後用水溶解製成總苷 水溶液，用17. IL水溶解，在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂X-5，樹脂 柱高為16cm(高徑比為4)，樹脂柱的床層體積為201. ImL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層 析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液8. 9L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂 柱，接著用乙醇-水混合流動相以2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中 乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複1次，洗脫液經HPLC分析後合 並得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為17. 8g，作為起始原料回用。實施例9取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為37. 2g，加入372mL甲醇(IOmL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到 固形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為9. 7g，加入24. 2mL甲醇(2. 5mL 溶劑I/g積雪草總苷)加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形 物III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為7. 5g，收率35. 2%，純度93. 4%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為50. 5g，用33. 7L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂AB-8，樹脂柱高為20cm(高徑比 為5)，樹脂柱的床層體積為251. 3mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液 中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液11. 2L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙 醇_水混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積 百分比為30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真 空乾燥，重量為26. 7g，加入133. 7mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入133. 7mL 水(溶劑I加入量的1倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為5. 3g，收率54. 7 %，純度90. 8 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為23. 4g後用水溶解製成總苷 水溶液，用15. 6L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂ABU^i 脂柱高為15cm(高徑比為5)，樹脂柱的床層體積為106mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速過 層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液4. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹 脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相 中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析後 合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為16. 3g，作為起始原料回用。實施例10取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入300mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)， 加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量為27. 6g，加入138mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形 物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為16. 3g，加入81.4mL甲醇(5mL溶劑 I/g積雪草總苷)加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物III 經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為10. lg，收率47. 6 %，純度93 %。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為47. 9g，用31. 9L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂D4020，樹脂柱高為12cm(高徑比為 3)，樹脂柱的床層體積為150. SmL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層析柱，至流出液中雪草 總苷穿透，共加入總苷水溶液6. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇_水混 合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比 為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複4次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空幹 燥，重量為24. Ig,加入180. 4mL 二甲基甲醯胺(7. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入 1082. 5mL水(溶劑I加入量的6倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ； 固形物IV經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為5. 2g，收率53. 6 %，純度90. 3 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為20. 8g後用水溶解製成總苷 水溶液，用13. 9L水溶解，在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂D4020，樹 脂柱高為16cm(高徑比為4)，樹脂柱的床層體積為201. ImL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過 層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液8. 9L ；先用4個床層體積的水洗滌樹 脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動 相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複1次，洗脫液經HPLC分析 後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為14. 4g，作為起始原料回 用。實施例11取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入600mL甲醇(IOmL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為8. 4g，加入21mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到 固形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為6. 3g，加入31. 7mL甲醇(5mL溶 劑I/g積雪草總苷)加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物 III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為4g，收率18. 7%，純度93. 9%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為55g，用36. 7L水溶解製成總苷水溶液。在 內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD100，樹脂柱高為12cm(高徑比為 3)，樹脂柱的床層體積為150. SmL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液中雪 草總苷穿透，共加入總苷水溶液6. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇-水 混合流動相以0. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分 比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複4次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空 乾燥，重量為31. 2g，加入156. 2mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入156. 2mL 水(溶劑I加入量的1倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為5. 3g，收率54. 7%，純度90. 8%。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為26. 9g後用水溶解製成總苷 水溶液，用17. 9L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD100，樹脂柱高為9cm(高徑比為3)，樹脂柱的床層體積為63. 6mL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液2. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以0. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流 動相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複5次，洗脫液經HPLC分 析後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為18. 7g，作為起始原料 回用。實施例12取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入450mL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為18g，加入90mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形 物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為10. 6g，加入26. 6mL甲醇(2. 5mL溶劑 I/g積雪草總苷)加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物III 經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為8. 2g，收率38. 6%，純度93. 3%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為48. 8g，用32. 5L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD200，樹脂柱高為12cm(高徑比 為4)，樹脂柱的床層體積為84. SmL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層析柱，至流出液中雪草 總苷穿透，共加入總苷水溶液3. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇_水混 合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比為 30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複8次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空乾燥， 重量為25g，加入250. ImL 二甲基甲醯胺(IOmL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入125mL 水(溶劑I加入量的0.5倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV;固形物 IV經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為4. 1 g，收率42. 3 %，純度89. 8 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為23. 9g後用水溶解製成總苷 水溶液，用15. 9L水溶解，在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD200， 樹脂柱高為16cm(高徑比為4)，樹脂柱的床層體積為201. ImL ；總苷水溶液以lBV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液8. 9L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動 相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複1次，洗脫液經HPLC分析 後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為16. 6g，作為起始原料回 用。實施例13取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入300mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)， 加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量為 27. 6g，加入207mL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固 形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為11. 7g，加入88mL甲醇(7. 5mL溶劑 I/g積雪草總苷)加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物III 經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為5. 6g，收率26. 3%，純度93. 7%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為51. 4g，用34. 3L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD300，樹脂柱高為20cm(高徑比為5)，樹脂柱的床層體積為251. 3mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液 中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液11. 2L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙 醇-水混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體 積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮 後真空乾燥，重量為27. 6g，加入207. 3mL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入 829mL水(溶劑I加入量的4倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV;固 形物IV經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為5. lg，收率52. 3%，純度90. 3%。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為25. 5g後用水溶解製成總苷 水溶液，用17L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD300，樹 脂柱高為15cm(高徑比為5)，樹脂柱的床層體積為106mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速過 層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液4. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹 脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動 相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分析 後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為17. 7g，作為起始原料回 用。實施例14取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為37. 2g，加入93mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至65°C溶解後冷卻結晶得至Ij 固形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為28. lg，加入140. 4mL甲醇(5mL 溶劑I/g積雪草總苷)加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形 物III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為17. 5g，收率80. 6%，純度91. 2%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為40. 5g，用27L水溶解製成總苷水溶液。在 內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD400，樹脂柱高為20cm(高徑比 為5)，樹脂柱的床層體積為251. 3mL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液 中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液11. 2L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙 醇_水混合流動相以2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積 百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複1次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後 真空乾燥，重量為16. 7g，加入167mL 二甲基甲醯胺(IOmL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加 入334mL水(溶劑I加入量的2倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ； 固形物IV經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為4. 5g，收率45. 5 %，純度89. 8 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為14. 2g後用水溶解製成總苷 水溶液，用9. 5L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD400，樹 脂柱高為9cm(高徑比為3)，樹脂柱的床層體積為63. 6mL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速過 層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液2. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌樹 脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相 中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析後 合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為9. 9g，作為起始原料回用。實施例15
取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入600mL甲醇(IOmL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為8. 4g，加入21mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到 固形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為6. 3g，加入63. 4mL甲醇(IOmL溶 劑I/g積雪草總苷)加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物 III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為2. lg，收率9. 8%，純度94. 1%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為56. 9g，用38L水溶解製成總苷水溶液。在 內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD500，樹脂柱高為16cm(高徑比為 4)，樹脂柱的床層體積為201. ImL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層析柱，至流出液中雪草 總苷穿透，共加入總苷水溶液8. 9L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇_水混 合流動相以0. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比 為30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空幹 燥，重量為33. Ig,加入82. 8mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入828. 3mL水 (溶劑I加入量的10倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為7. 5g，收率76. 7%，純度91. 4%。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為26. 7g後用水溶解製成總苷 水溶液，用17. 8L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD500， 樹脂柱高為12cm(高徑比為4)，樹脂柱的床層體積為84. SmL ；總苷水溶液以lBV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液3. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以0. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流 動相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複4次，洗脫液經HPLC分 析後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為18. 5g，作為起始原料 回用。實施例16取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入450mL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為18g，加入90mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形 物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為10. 6g，加入53. ImL甲醇(5mL溶劑 I/g積雪草總苷)加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物III 經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為6. 6g，收率31. 2%，純度93. 5%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為52. 4g，用34. 9L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD600，樹脂柱高為15cm(高徑比 為5)，樹脂柱的床層體積為106mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液中雪 草總苷穿透，共加入總苷水溶液4. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇-水 混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比 為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複6次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空幹 燥，重量為28. 6g，加入71. 5mL 二甲基甲醯胺(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入 571. 7mL水(溶劑I加入量的8倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ； 固形物IV經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為7. 4g，收率75. 8 %，純度91. 4 %。
合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為22. 2g後用水溶解製成總苷 水溶液，用14. 8L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD600， 樹脂柱高為15cm(高徑比為5)，樹脂柱的床層體積為106mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液4. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動 相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析 後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為15. 4g，作為起始原料回 用。實施例17取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入300mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)， 加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量為 27. 6g，加入138mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形 物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為16. 3g，加入40. 7mL甲醇(2. 5mL溶劑 I/g積雪草總苷)加熱至60°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物III 經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為12. 6g，收率58. 7%，純度92. 5%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為44. 4g，用29. 6L水溶解製成總苷水溶液。在 內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD700，樹脂柱高為12cm(高徑比為 3)，樹脂柱的床層體積為150. SmL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液中雪 草總苷穿透，共加入總苷水溶液6. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇-水 混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分 比為30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空 乾燥，重量為20. 6g，加入154. 8mL甲醇(7. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入309. 6mL 水(溶劑I加入量的2倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為4. 9g，收率50. 2 %，純度90. 3 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為18. 7g後用水溶解製成總苷 水溶液，用12. 5L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂HPD700， 樹脂柱高為9cm(高徑比為3)，樹脂柱的床層體積為63. 6mL ；總苷水溶液以0. 5BV/h的流速 過層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液2. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌 樹脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流 動相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分 析後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為13g，作為起始原料回 用。實施例18取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為37. 2g，加入93mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至65°C溶解後冷卻結晶得至Ij 固形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為28. lg，加入140. 4mL甲醇(5mL 溶劑I/g積雪草總苷)加熱至65°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形 物III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為17. 5g，收率80. 6%，純度91. 2%。
結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為40. 5g，用27L水溶解製成總苷水溶液。在 內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂X-5，樹脂柱高為16cm(高徑比為4)， 樹脂柱的床層體積為201. ImL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層析柱，至流出液中雪草總苷 穿透，共加入總苷水溶液8. 9L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇_水混合流 動相以2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比為30 %。 上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空乾燥，重量為 16. 7g，加入125. 3mL 二甲基甲醯胺(7. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入62. 6mL水 (溶劑I加入量的0. 5倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為4. 6g，收率47. 1 %，純度90. 3 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為14. Ig後用水溶解製成總苷 水溶液，用9. 4L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂X_5，樹脂 柱高為12cm(高徑比為4)，樹脂柱的床層體積為84. SmL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層 析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液3. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂 柱，接著用乙醇_水混合流動相以2BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中 乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複1次，洗脫液經HPLC分析後合 並得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為9. 8g，作為起始原料回用。實施例19取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入300mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)， 加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量為 27. 6g，加入276mL甲醇(IOmL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固 形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為7. 2g，加入17. 9mL甲醇(2. 5mL溶 劑I/g積雪草總苷)加熱至50°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物 III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為5. 5g，收率26. 2%，純度93. 7%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為51. 5g，用34. 3L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂AB-8，樹脂柱高為20cm(高徑比 為5)，樹脂柱的床層體積為251. 3mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速過層析柱，至流出液 中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液11. 2L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙 醇_水混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積 百分比為30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真 空乾燥，重量為27. 7g，加入138. 3mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入138. 3mL 水(溶劑I加入量的1倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ；固形物IV 經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為5. 3g，收率54. 7 %，純度90. 8 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為25. 3g後用水溶解製成總苷 水溶液，用16. 9L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂ABU^i 脂柱高為15cm(高徑比為5)，樹脂柱的床層體積為106mL ；總苷水溶液以1. 5BV/h的流速過 層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液4. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹 脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以lBV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相 中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分析後 合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為17. 6g，作為起始原料回用。
實施例20取60g積雪草總苷原料加入燒杯中，加入150mL甲醇(2. 5mL溶劑I/g積雪草總 苷)，加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I ；固形物I經真空乾燥後重量 為37. 2g，加入186mL甲醇(5mL溶劑I/g積雪草總苷)，加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固 形物II與結晶母液II ；固形物II經真空乾燥後重量為21. 9g，加入109. 7mL甲醇(5mL溶 劑I/g積雪草總苷)加熱至55°C溶解後冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III ；固形物 III經真空乾燥後羥基積雪草苷產品，重量為13. 7g，收率63. 7%，純度92. 3%。結晶母液I經濃縮後真空乾燥，重量為43. 3g，用28. 9L水溶解製成總苷水溶液。 在內徑為4cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂D4020，樹脂柱高為12cm(高徑比為 3)，樹脂柱的床層體積為150. SmL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過層析柱，至流出液中雪草 總苷穿透，共加入總苷水溶液6. 7L ；先用4個床層體積的水洗滌樹脂柱，接著用乙醇_水混 合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動相中乙醇的體積百分比 為30 %。上述大孔吸附樹脂純化過程重複3次，洗脫液經HPLC分析後合併，濃縮後真空幹 燥，重量為19. 5g，加入146. 4mL 二甲基甲醯胺(7. 5mL溶劑I/g積雪草總苷)，溶解後加入 878. 7mL水(溶劑I加入量的6倍)進行結晶，然後經過濾得到固形物IV與結晶母液IV ； 固形物IV經真空乾燥後即為高純度積雪草苷產品，重量為5. 2g，收率53. 6 %，純度90. 3 %。合併結晶母液II、III、IV經濃縮後真空乾燥，重量為17. 3g後用水溶解製成總苷 水溶液，用11. 5L水溶解，在內徑為3cm的層析柱中裝入經預處理的大孔吸附樹脂D4020，樹 脂柱高為12cm(高徑比為4)，樹脂柱的床層體積為84. SmL ；總苷水溶液以lBV/h的流速過 層析柱，至流出液中雪草總苷穿透，共加入總苷水溶液3. 8L ；先用4個床層體積的水洗滌樹 脂柱，接著用乙醇_水混合流動相以1. 5BV/h的流速洗脫積雪草總皂苷，乙醇-水混合流動 相中乙醇的體積百分比為30%。上述大孔吸附樹脂純化過程重複2次，洗脫液經HPLC分析 後合併得到富含總苷的收集液，收集液經濃縮後真空乾燥，重量為12g，作為起始原料回用。
權利要求
一種低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積雪草苷的工藝，其特徵在於，工藝的步驟如下1)低積雪草苷含量總苷在50～65℃下用甲醇加熱溶解，冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I；2)固形物I繼續在50～65℃下用甲醇加熱溶解，冷卻結晶得到固形物II與結晶母液II；3)固形物II再次在50～65℃下用甲醇加熱溶解，冷卻結晶得到固形物III與結晶母液III；4)固形物III經真空乾燥後得到高純度羥基積雪草苷；5)結晶母液I經大孔吸附樹脂純化，富含總苷的收集液濃縮後真空乾燥，得到高積雪草苷含量總苷；6)高積雪草苷含量總苷用溶劑I溶解、再加入溶劑II結晶得到固形物IV與結晶母液IV；7)固形物IV經真空乾燥後得到高純度積雪草苷；8)合併結晶母液II、III、IV經大孔吸附樹脂純化，富含總苷的收集液濃縮後真空乾燥作為起始原料回至步驟1)。
2.根據權利要求1所述的一種低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積 雪草苷的工藝，其特徵在於所述步驟6)中溶劑I為甲醇或二甲基甲醯胺。
3.根據權利要求1所述的一種低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積 雪草苷的工藝，其特徵在於所述步驟6)中溶劑I的加入量為2. 5 10mL/g積雪草總苷。
4.根據權利要求1所述的一種低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積 雪草苷的工藝，其特徵在於所述步驟6)中溶劑II為丙酮、乙腈、乙醚、乙酸乙酯或水。
5.根據權利要求1所述的一種低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積 雪草苷的工藝，其特徵在於所述步驟6)中溶劑II的加入量為溶劑I加入量的0. 5 10倍。
6.根據權利要求1所述的一種低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積 雪草苷的工藝，其特徵在於所述步驟5)、步驟8)中的大孔吸附樹脂型號為HPD100、HPD200、 HPD300、HPD400、HPD500、HPD600、HPD700、X_5、AB-8 或 D4020。
全文摘要
本發明公開了一種低積雪草苷含量總苷出發同時製備積雪草苷和羥基積雪草苷的工藝，工藝步驟如下1)低積雪草苷含量總苷在50～65℃下用甲醇加熱溶解，冷卻結晶得到固形物I與結晶母液I；2)固形物I再在上述條件下重結晶二次、再經真空乾燥後得到高純度羥基積雪草苷；3)結晶母液I經大孔吸附樹脂純化，濃縮、真空乾燥後得到高積雪草苷含量總苷，然後用溶劑I溶解、再加入溶劑II結晶，最後經真空乾燥後得到高純度積雪草苷；4)結晶母液經大孔吸附樹脂純化，富含總苷的收集液濃縮後真空乾燥作為起始原料回用。本發明過程簡單、生產成本低、汙染少、產品收率和純度高，適合於工業化生產。
文檔編號C07J63/00GK101983966SQ201010556169
公開日2011年3月9日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年11月19日
發明者呂秀陽, 鄭興芳 申請人:浙江大學