新型線蟲蛋白質及其在生產抗蠕蟲藥和疫苗中的應用的製作方法
2023-10-05 02:21:29
專利名稱：：新型線蟲蛋白質及其在生產抗蠕蟲藥和疫苗中的應用的製作方法新型線蟲類蛋白質及其在生產抗蠕蟲藥和疫苗中的應用發明領域本發明涉及用於鑑定新型抗蠕蟲藥的篩選，特別涉及抗血矛線蟲屬蠕蟲的藥劑，以及用作針對蠕蟲如血矛線蟲屬(haemonchus)蠕蟲的疫苗或免疫原性藥劑的蛋白服的製備。
背景技術：
：蠕蟲寄生蟲引起寬範圍的家畜動物的疾病和感染，當它們導致疾病和感染時，其導致生產力喪失並且甚至導致動物死亡，因此有相當大的經濟重要性。食血(bloodfeeding)線蟲類血矛線蟲屬感染反芻動物的胃腸道內層。它在世界範圍內具有非常值得考慮的經濟重要性，具有從家畜動物的體重增加的減少、生產力喪失和缺乳到死亡範圍內的影響。貧血是感染的基本特徵。當大量幼蟲感染綿羊時，在綿羊仍然看起來是健康的時候可能突然發生死亡。這稱為"急性潛伏期病"，此時用糞便檢查看不到卵。包括較少量蠕蟲的慢性感染可能引起水腫(下頜水腫)，缺鐵性貧血症，進展性虛弱，毛髮斷裂(woolbreaks),和死亡。四階段幼蟲和成蟲都刺穿胃壁中的血管，並且以所釋放的血液為生。因此，宿主利用營養來替換失去的血液成分，而不是用於生長和毛髮生產。一種相關的線蟲胃線蟲屬(Ostertagia)具有相似的作用。疾病血矛線蟲病(haemonchosis)和奧斯特塔格線蟲病(ostertagiasis)特徵在於浪費，所述浪費部分是由於與嚴重感染相關的食慾缺乏引起。相關的攝取血液的線蟲，鉤蟲感染反芻動物、狗、貓、其它食肉動物、和人。超過7億人感染了鉤蟲，特別是美洲鉤蟲(Necatoramericanus)，每年有700-900,000新病例，和50-60,000例由這些寄生蟲的災害引起的死亡。蠕蟲寄生蟲的控制目前主要依賴與牧場管理結合的抗蠕蟲藥的使用。然而，這樣的技術具有許多缺點…-頻繁的藥物施用和牧場管理通常不切實際，並且耐藥性蠕蟲品系變得愈加普遍。從血矛線蟲屬獲得的包含蛋白雙聯體H110D的提取物在注射給綿羊時提供抗血矛線蟲病的保護。該雙聯體H110D在血矛線蟲屬蠕蟲的腸內腔表面上發現。H110D的製備和應用已經在WO-A-88/00835中進行了描述。在WO-A-89/00163中，在寄生蟲線蟲蛇形毛圓線蟲(Trichostrongyluscolubriformis)幼蟲中描述了這樣一種蛋白，該蛋白在十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上具有41Kd的分子量。該蛋白從勻槳的蛇形毛圓線蟲(T.colubriformis)三階段幼蟲中提取。己經克隆了關於該蛋白的基因。在捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)中發現了一種非常相似的DNA序列，儘管尚未報導血矛線蟲屬蠕蟲基因的體內表達。該文獻還報導了使用由重組生物體表達的抗原在綿羊中針對捻轉血矛線蟲的接種試驗的結果。在這些試驗中，報告了在糞便中減少的卵數量，總體上平均減少40%的卵數量。在接種後63天宰殺時，發現接種組綿羊含有比對照組平均少52%的蠕蟲。EP0434909公開了具有抗凝活性的蛋白，其可以有效用作疫苗。在WO9402169和WO9526402中公開了其它潛在有效用作疫苗候選物的蛋白。然而，對鑑定新的抗蠕蟲藥和/或開發針對這樣的寄生蟲的新型疫苗存在緊急需求。本發明的目的之一是提供用於開發新抗蠕蟲藥的肽或蛋白。提供用於在反芻動物中提高免疫反應的肽或蛋白也是本發明的目的之一。發明概述本發明部分是基於本發明人鑑定和表徵了一種在捻轉血矛線蟲中表達的新型蛋白。本發明人己經鑑定了多種與所述蛋白相關的生理和酶活性，開創了將所述蛋白用作治療蠕蟲且特別是血矛線蟲屬蠕蟲感染的藥物靶標和疫苗候選物的可能性。如在下文更詳細地描述地，本發明人已經在變性條件下鑑定了蛋白的表觀分子量，約55KDa。基因組和蛋白質組研究表明，它包含來自捻轉血矛線蟲(Hco"toWw)的2種高度同源的蛋白。所述蛋白表現出與秀麗隱杆線蟲(C.中的脯氨醯羧肽酶樣蛋白的同源性，並且包括2個絲氨酸羧肽酶S28型結構域。對該蛋白的生理學和酶學研究表明所述蛋白具有顯著的二肽基肽酶IV(DPPIV)活性和弱DPPII活性，並且能夠延遲血纖蛋白凝塊形成。因此，在本發明第一方面，提供用於鑑定抗蠕蟲藥的篩選測定方法，所述測定方法包括使某種藥劑與蠕蟲蛋白接觸的步驟，所述蠕蟲蛋白特徵為表現出二肽基肽酶IV活性，並且導致血液凝固時間的增加，從而檢測所述藥劑是否能夠調節所述蛋白的所述活性或血液凝固作用。便利地，所述蛋白包括圖2a所示的序列，或如圖2c和2d所示的編碼所述蛋白的核苷酸序列，或基本與其同源或功能等價。也可以使用所述蛋白的片段，只要所述片段表現出所述DPPIV活性和任選地所述增加的血液凝固時間作用。應該理解，術語"調節活性"涉及藥劑提高或降低由所述酶表現出的DPPIV和任選地所述血液凝固活性的能力。理想地，所述藥劑將能夠抑制或降低所述酶的DPPIV活性，並且任選地抑制或降低所述酶增加血液凝固時間的能力。根據第一方面，所述酶可以通過重組方法提供，如在下文更詳細所述，或簡單地從寄生蟲本身純化。所述酶可以從寄生蟲的食血L4或成蟲階段分離。在能夠測定藥劑對所述酶的DPPIV活性的作用方面，在本領域中許多DPPIV活性測定方法是已知的。一種這樣的測定是由普洛麥格(普洛麥格集團(PromegaGroup),美國)提供的DPPIV-GbTM蛋白酶測定方法，其使用促發光的(proluminescent)DPPIV底物，即Gly-Pro-氨基螢光素，其在由DPPIV酶裂解該底物且隨後由螢光素酶作用後產生"輝光(glow)-型"發光信號。另一種DPPIV測定方法使用羅丹明llO-綴合的甘氨酸-脯氨酸，其在裂解時(通過羅丹明110)以異硫氰酸螢光素(FITC)波長發光。另一種DPPIV測定方法使用生色底物，如對-硝基苯胺(pNA)，其在從其二肽上裂解時導致在405nm吸光度的增加。一種這樣的試劑盒由美國PA的BIOMOL國際(BIOMOLInternational,PA,USA)提供。因此，應該理解，在本領域中存在多種已知的DPPIV測定方法，並且應該理解本發明不限於任何具體的DPPIV測定方法。典型地，待檢測的藥劑可以是，例如，小的化學個體，對所述蛋白特異性的抗體，設計靶向所述蛋白肽的表達的RNAi分子，肽模擬物等，可以與分離的酶接觸，並且然後測量所述酶的DPPIV活性。通過與在不加入所述藥劑的條件下所述酶的DPPIV活性水平進行比較，可能檢測所述藥劑是否具有對所述酶的DPPIV活性的任何調節作用。自然地，一旦已經鑑定某種藥劑對所述酶具有作用，則所述藥劑可以施用給活的蠕蟲，如捻轉血矛線蟲，以檢測其對該生物體的作用。然後，可以將所述藥劑施用給感染了所述蠕蟲的宿主動物，以檢測所述藥劑對所述寄生蟲在其存在於宿主生物體內時的作用，並且確保所述藥劑對所述被感染的宿主動物無害。因此，理想地，按照本發明鑑定的抗蠕蟲藥是對寄生蟲特異的，並且基本不影響可能存在於宿主動物中的DPPIV蛋白的DPPIV活性。在本領域中，已經存在多種已知的DPPIV抑制劑，諸如DiprotinA和B,vildagliptin,Sitagliptin,二甲雙胍,Saxagliptin和MK-0431纈氨酸pyrrolidide,異亮氨酸thiazolidide,FE99901(Ferring製藥(FerringPharmaceuticals)),NVP-DPP728(Novartis)，LAF237(Norvartis),SYR322(Syrrx，公司)，SYR619(Syrrx，公司)，並且這些中的任一種或全部可以表現出本發明所述的抑制酶的活性。事實上，本發明人已經表明，例如，DiprotinA部分抑制本發明所述的所述酶的DPPIV型活性。因此，在另一個方面中，提供了DPPIV抑制劑在製備治療蠕蟲感染特別是捻轉血矛線蟲感染的藥物中的應用。還提供了治療被蠕蟲感染的動物如反芻動物的方法，所述方法包括對所述動物施用DPPIV抑制劑的步驟。不希望受到理論限制，考慮了任何這樣的DPPIV抑制劑，通過調節本發明所述的所述酶的活性，可以消除蠕蟲的生育力、破壞、抑制或殺死蠕蟲，由此治療被感染的動物宿主。除了DPPIV活性之外，本發明人還觀察到本發明所述的酶具有增加血液凝固時間的活性。因此，在本發明的另一個實施方案中，篩選步驟可以用來鑑定抑制所述酶增加凝固時間的能力的藥劑。同樣不希望受到理論限制，考慮了任何這樣的藥劑可以引起由蠕蟲攝取的血液食物在該蠕蟲內凝固，如以前一樣導致蠕蟲生物體的破壞或死亡。許多用於檢測血液凝固時間的測定方法是已知的，包括，例如，"凝血因子II時間"和"激活的部分促凝血酶原激酶時間"檢測。這些檢測測量在將特定的激活性化學劑添加到血液樣品中後血液凝固所花費的時間。因此，通過進行在存在和不存在藥物候選物的條件下包括本發明所述的蛋白的檢測，可以告知所述藥物候選物是否能夠調節受所述蛋白影響的血液凝固時間。使用血液成分而不是全血的相似檢測是可能的。實例包括血纖蛋白凝固時間或血纖蛋白凝塊重聚集檢測。通常地，凝塊形成通過使用光度測定方法檢測，因為凝塊表現出與包括檢測介質的非凝塊不同的光學特性。在本發明的另一個方面中，還提供這樣的核酸分子，其包括一種或多種核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼蠕蟲絲氨酸羧肽酶或其酶促反應性部分或抗原性部分，其基本上對應於圖2a所示的預測的胺基酸序列的全部或部分；或如圖2c或2d所示能夠編碼所述酶或其部分的核苷酸序列；或編碼蠕蟲絲氨酸羧肽酶的序列，其與所述序列的任一個基本同源或可以與所述序列的任一個雜交。因此，本發明的核酸可以是單鏈或雙鏈DNA，cDNA或RNA。在一種物種內不同蠕蟲品系之間，在蠕蟲生命周期的不同階段之間(例如，在幼蟲和成蟲階段之間)，在不同地理起源的相似品系之間，並且還在同一種蠕蟲內部，可能發生在羧肽酶-編碼核苷酸序列中的改變。所述變化包含在本發明的範圍內。當用於本文時，"基本上同源"包括具有約60%或更多，例如75%,80%,90%或95%或更多的序列同一性的那些序列，以及還包括功能-等價等位基因變體和通過一個或多個鹼基取代、添加、倒位和/或刪除進行修飾的相關序列。"功能等價"意指編碼具有羧肽酶活性的多肽的核酸序列，所述多肽是相似酶促活性的，即，其能夠催化相同的生化或生理反應(例如，表現出DPPIV活性和/或增加血液凝固時間的能力)，或是相似免疫反應性的，即，其產生針對蠕蟲的宿主保護性抗體。在本發明範圍內還包括與圖2c或2d中所示的序列雜交的核酸分子，或如上述定義的任何基本同源或功能等價序列。當用於本文時，"雜交"定義在中等或高度嚴格性例如2xSSC,65°C(其中SSC=0.15MNaCl,0.015M檸檬酸鈉，pH7.2)下結合的那些序列。產生這樣的衍生物相關序列的方法，例如，通過位點定向誘變，隨機誘變，或酶裂解和/或連接核酸，在本領域內是公知的，確定這樣修飾的核酸是否與所述序列具有顯著同源性的方法，例如通過雜交或核酸測序，在本領域內也是公知的。因此，提供本發明所述的核酸分子能夠大量獲得重組羧肽酶、或其酶性或免疫原性片段，由此允許進行上述篩選測定方法和/或開發抗-蠕蟲疫苗和/或用作抗凝血劑。因此，在本發明另一方面中，提供包括一種或多種核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼用於藥物篩選測定方法的一種或多種多肽和/或用於產生抗蠕蟲寄生蟲的保護性抗體的一種或多種多肽，其序列結合來自圖2a所示的羧肽酶-編碼序列的一個或多個酶性或抗原性區域。'本發明還擴展至合成的多肽，所述合成的多肽包括組成羧肽酶或其酶性或抗原性部分的一個或多個胺基酸序列，其基本上對應於圖2a所述的胺基酸序列的全部或部分，或其功能等價變體。所述酶的酶性部分應該理解為比全長蛋白序列短，但是能夠表現出至少一種蛋白生化或抗原性特性，諸如其DPPIV或血液凝固時間活性中的提高。當在本文中引用時，術語"抗體"包括完整的抗體，其包括IgG,IgM和IgA同種型的那些，以及其任何抗原結合片段(g卩，"抗原-結合部分")或單鏈。"抗體"是指一種糖蛋白，其包括中間通過二硫鍵連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈，或其抗原結合部分。每條重鏈包括重鏈可變區(在本文簡寫為VH)和重鏈恆定區。IgG重鏈恆定區包括4個結構域即CH1,鉸鏈，Ch2和CH3。每條輕鏈包括輕鏈可變區(在本文簡寫為VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括1個結構域即C^。Vh和Vt區可以進一步細分為高可變性區域，其稱為互補性決定區(CDR)，散布更保守的稱為構架區(FR)的區域。每個Vh和VL由3個CDRs和4個FRs組成，其以下列順序從氨基端到羧基端排列FR1,CDR1，FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可以調節免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述因子包括免疫系統的各種細胞(例如，效應器細胞)和經典補體系統的第一成分(Clq)。當用於本文時，術語抗體的"抗原-結合部分"(或簡稱為"抗體部分")是指抗體的保留特異性結合本發明的蛋白或蛋白片段能力的一個或多個片段。已經表明，抗體的抗原-結合功能可以由全長抗體的片段執行。包含在術語抗體的"抗原-結合部分"的結合片段的實例包括(i)Fab片段，其為由VL,VH,Cl和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab，)2片段，其為包括通過鉸鏈區二硫鍵連接的2個Fab片段的二價片段;(iii)Fd片段，其由VH和CH1結構域組成;(iv)Fv片段，其由抗體一條臂的Vl和Vh結構域組成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)自然(Nature)^1:544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補性決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的兩個結構域Vl和Vh由獨立的基因編碼，但是它們可以使用重組方法通過合成的連接體結合，所述連接體能使它們形成單條蛋白鏈，其中Vl和Vh區配対形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如，Bird等.(1988)科學(Science)242:423-426;和Huston等.(1988)美國國家科學院學報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)^1:5879-5883)，或它們可以通過其它方法如使用二硫鍵或通過二聚化基序結合。這樣的單鏈抗體也意欲包含在術語抗體的"抗原-結合部分"內。這些抗體片段使用本領域技術人員已知的常規技術獲得，並且所述片段以與完整抗體相同的方式篩選用途。其它已知的抗體片段包括納米抗體，與其相關的技術授權給比利時的Ablynx。本發明還包括與本文描述的抗體和抗體片段基本同源的變體和等價物。這些可以包含，例如，保守取代，即，由相似胺基酸取代一個或多個胺基酸。例如，保守取代是指用在同一大組內的另一種胺基酸取代一種胺基酸，例如，用另一種酸性胺基酸取代一個酸性胺基酸，用另一個鹼性胺基酸取代一個鹼性胺基酸，或用另一個中性胺基酸取代一個中性胺基酸。保守胺基酸取代所指的內容在本領域中是公知的。當用於本文時，"特異性結合"是指抗體與預先確定的抗原結合。典型地，抗體以1(^M或更小的解離常數(Kd)結合，並且以這樣的KD結合預先確定的抗原，所述KD比與除所述預先確定的抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(例如，BSA，酪蛋白)結合的Ko小至少兩倍。本發明還擴展至在人或非人動物中刺激針對蠕蟲寄生蟲的免疫反應的疫苗組合物，所述組合物包括至少一種上述合成的多肽，以及藥用載體。當用於本文時，術語"多肽"包括全長蛋白、和較短的肽序列二者。本發明還涉及對本文鑑定的蛋白特異的抗體。所述抗體可以以治療意義用於結合所述蛋白並且幹擾其活性。所述抗體可以是單克隆的或多克隆的，並且可以依據本領域技術人員公知的技術製備。與多肽胺基酸序列相關的"功能等價物"，如上文所用，定義與上述多肽序列相關的或由上述多肽序列衍生而來的多肽，其中所述胺基酸序列已經通過單個或多個胺基酸取代、添加、倒位或刪除而進行修飾，並且定義其中胺基酸己被化學修飾的序列，所述化學修飾包括糖基化或去糖基化，但是其仍然保留保護性抗原性(免疫原性)活性。所述功能等價物變體可以作為天然生物學變化存在，或可以使用已知技術製備，例如，功能等價的重組多肽可以使用下列己知技術製備位點定向誘變、隨機誘變、或酶促裂解和/或胺基酸的連接。本發明所述的合成多肽可以代表保護性抗原性序列。當用於本文時，術語"保護性抗原"定義能夠產生宿主-保護性(免疫原性)免疫反應的那些抗原，所述宿主-保護性(免疫原性)免疫反應即是這樣的宿主反應，其引起產生消除寄生蟲的生育力、破壞、抑制或殺死寄生蟲的免疫效應器分子、抗體或細胞，並且由此"保護"宿主免受臨床或亞臨床疾病以及生產力喪失。這樣的保護性免疫反應可以通常由產生這樣的抗體而證明，所述抗體能夠抑制寄生蟲的代謝功能，導致發育障礙、卵生產缺乏和/或死亡。本發明該方面所述的合成多肽可以通過在宿主細胞中表達而製備，所述宿主細胞包含重組DNA分子或包含含有所述重組DNA分子的重組DNA克隆媒介物或載體，所述重組DNA分子包括上文廣泛描述的核苷酸序列，該核苷酸序列與表達控制序列可操作性的連接。備選地，可以通過直接注射本發明所述的裸DNA分子到宿主細胞中而表達所述多肽。這樣表達的合成多肽可以是一種融合多肽，其包括表現出本發明所述的羧肽酶的全長或部分的生化/生理學免疫原活性的部分，和由與其融合的重組分子的DNA編碼的另一種多肽。例如，可以理想地產生這樣的融合蛋白，其包括與蛋白如(3-半乳糖苷酶、磷酸酶、穀胱甘肽-S-轉移酶、脲酶、B型肝炎核心抗原(Francis等，1989)等偶聯的本發明所述的合成的羧肽酶或其它多肽。大部分融合蛋白通過重組基因表達形成，在所述重組基因中，兩個編碼序列協調地符合閱讀框連接在一起。備選地，多肽可以通過化學方法在體外連接。本發明包括羧肽酶-編碼核酸分子的所有這樣的融合或雜交衍生物以及它們各自的胺基酸序列。這樣適當重組的DNA和多肽表達技術，例如，記述在Sambrook等，1989中。備選地，所述合成多肽可以通過化學方法產生，諸如公知的Merrifield固相合成法。本發明的其它方面包括上述核酸分子或合成的肽或多肽用於製備在哺乳動物中特別是反芻哺乳動物中刺激免疫反應的疫苗組合物的應用。備選地認為，本發明還提供在哺乳動物中特別是反芻動物中刺激針對蠕蟲寄生蟲感染的免疫反應的方法，所述方法包括給所述動物施用疫苗組合物，所述疫苗組合物包括一種或多種由上文定義的核苷酸序列編碼的多肽。疫苗組合物可以依據本發明通過疫苗製備領域公知的方法製備。傳統的疫苗製劑可以在存在一種或多種藥用載體或稀釋劑的條件下包括一種或多種本發明所述的合成多肽，以及，在適當情形中，一種或多種合適的佐劑，例如，氫氧化鋁、皂苷、QuilA、或其更純化的形式，胞壁醯二肽、礦物油、或Novasomes。適當的載體包括液體介質，如適合用作賦形劑將所述肽或多肽引入到哺乳動物中的鹽溶液。可以包括其它成分如防腐劑。備選的疫苗製劑可以包括病毒或宿主細胞，例如，微生物(例如，痘苗病毒、腺病毒、噬菌體沙門氏菌(Salmonella))，其在其中插入了本發明所述的核酸分子(例如，DNA分子)，以刺激針對由所插入的核酸分子編碼的多肽的免疫反應。疫苗組合物的施用可以通過任何常規途徑實施，例如，口服或腸胃外，諸如通過肌內注射，任選地以這樣的時間間隔，但不限於其進行，例如，以7-28天的時間間隔注射兩次。如上文所述，本發明所述的羧肽酶-編碼序列的表達可以使用一些己知技術和表達系統實現，包括在原核細胞中如在大腸桿菌(E.COli)中表達，和在真核細胞中如酵母或(of)杆狀病毒-昆蟲細胞系統中表達，或在轉化的哺乳動物細胞以及在轉基因動物和植物中表達。特別有利地，所述核苷酸序列可以使用轉基因線蟲系統進行表達，諸如用於線蟲隱杆線蟲(Caenorhabditis)的系統，例如，在Fire，(1986);Fire等，(1989);Spieth等,(1988);Han等，(1990)中所述。本發明的另一個方面提供製備上述合成多肽的方法，所述方法包括在表達所述多肽的條件下，培養上述含有核酸分子的真核細胞或原核細胞，並且回收這樣產生的所述多肽。因此，本發明的其它方面包括包含本發明所述的核苷酸序列的克隆和表達載體。所述表達載體包括與本發明的核酸分子閱讀框匹配連接的適當的控制序列，諸如例如翻譯(例如起始和終止密碼子)和轉錄控制元件(例如，啟動子-操縱子區、核糖體結合位點、終止序列)。本發明所述的載體可以包括本領域公知和記錄的技術所述的質粒和病毒(包括噬菌體和真核病毒)，並且可以在多種不同表達系統中表達，所述表達系統也是本領域公知和記錄的。適當的病毒載體包括，如上文所述，杆狀病毒以及腺病毒和痘苗病毒。本領域記述了多種其它病毒載體。許多技術是已知的，並且可以用來將所述載體引入到原核細胞或真核細胞中進行表達，或引入到生殖細胞系或體細胞中以形成轉基因動物。在文獻中充分描述了適當的轉化或轉染技術。上文定義的包含本發明所述的核酸分子的轉化的或轉染的真核或原核宿主細胞或轉基因生物體形成本發明的另一個方面。一般地真核表達系統，特別是線蟲表達系統，具有這樣的優點，可以發生翻譯後加工，且特別是發生糖基化…-在轉基因線蟲系統的情形中，可以預測與在天然蛋白中發現的相對應的糖基化。哺乳動物細胞表達系統也具有許多優點。哺乳動物宿主細胞提供天然形式的良好重現和抗原的保護性表位，原因在於真核表達系統將產生大腸桿菌缺少的更相似的糖基化模式，二硫鍵和其它翻譯後修飾，大腸桿菌可以產生需要重摺疊的不溶蛋白並且具有極差的天然形式重現。另外，哺乳動物糖基化不可能誘導分散(distractfrom)抗蛋白保護反應的免疫反應。對於人和家畜動物的保護，因此，優選使用人或動物成纖維細胞或骨髓瘤細胞系，如HeLa，——一種人細胞系;BHK-幼倉鼠腎細胞；VERO，即一種猴子腎細胞系；FR3T3，即費希爾速率成纖維細胞(Fisherratefibroblast);NIH3T3，即一種小鼠成纖維細胞系；C1271,即一種小鼠乳腺瘤細胞系；CV-1，即非洲綠猴腎成纖維細胞；3T6，即小鼠胚胎成纖維細胞；L細胞，即一種小鼠細胞系；CHO，即中國倉鼠卵巢細胞系；NSONSI,Sp2和其它小鼠骨髓瘤細胞系和大鼠骨髓瘤細胞系如YB2/0和Y3。適用於不同種類的哺乳動物細胞系的載體在本領域內是公知的。通常，這些包括與編碼所述抗原或其片段的核苷酸序列可操作性連接的啟動子和/或增強子。適當的啟動子包括SV40早期或晚期啟動子，例如，PSVL載體，巨細胞病毒(CMV)啟動子，小鼠金屬硫蛋白I啟動子和小鼠乳腺瘤病毒長的末端重複序列。所述載體優選地包括適合的標記，如關於二氫葉酸還原酶或穀氨醯胺合酶的基因。這些類型的載體記述在WO86/05807,WO87/04462,WO89/01036和WO89/10404中。對宿主細胞的轉染可以使用標準技術實施，例如，使用磷酸鈣、DEAE葡聚糖、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物、原生質體融合、脂質體、直接的顯微注射、基因轟擊(genecannon)或電穿孔。優選後一種技術，並且使用電穿孔轉染哺乳動物細胞系的方法由Andreason等，1980描述。一般地，線性DNA比環形DNA更容易引入。發明詳述現在，將通過實施例和參考附圖的形式進一步描述本發明，所述附圖顯示.-圖1絲氨酸羧肽酶富集的蛋白級分在還原條件下的SDS-PAGE圖譜。挑取約55kDa的明顯條帶(條帶A和B)，並且通過胰蛋白酶消化、肽質量指紋分析和LC-MS/MS分析進行分析；圖2(A)捻轉血矛線蟲絲氨酸羧肽酶樣蛋白Hc-PCPl和Hc-PCP2的預測胺基酸序列。兩種蛋白中的N端信號序列的裂解位點用箭頭標記。推定的糖基化位點用*標記。兩種蛋白均包含用[]標記的兩個絲氨酸羧肽酶S28型結構域。(B)捻轉血矛線蟲PCP，S的圖示，所述捻轉血矛線蟲PCP，s包含信號肽(SP)和兩個羧肽酶S28型結構域。(C)預測的He-PCP1核苷酸序列。(D)預測的Hc-PCPS核苷酸序列。圖3通過RT-PCR顯示的//c-;7c/7/和//c-pcj^的轉錄。泳道是使用來自出鞘的L3、L4、11日齡和22日齡成蟲寄生蟲的靶RNA的獨立的RT-PCR反應。將關於細胞質超氧化物歧化酶(5^D^的RT-PCR用作對照，檢驗RNA純化的均勻性。圖4二肽基肽酶活性測定。(A)在pH7.5絲氨酸羧肽酶對DPPIV和DPPII特異性底物的劑量依賴性降解。(B)在不同pH溫育的絲氨酸羧肽酶對DPPIV特異性底物的活性。(C)檢測兩種DPPIV特異性抑制劑對絲氨酸羧肽酶DPPIV型活性的作用。圖5添加絲氨酸羧肽酶(PCP，s)對血纖蛋白重聚集的抑制。(A)對照血纖蛋白單體的重聚集與用不同濃度絲氨酸羧肽酶溫育的血纖蛋白單體重聚集的比較。(B)分析DiprotinA對血纖蛋白重聚集抑制的影響。所有結果表示為在350nm測量的散射光的變化，其是對重聚集的血纖蛋白單體量的測量。圖6絲氨酸羧肽酶對血纖蛋白(x-鏈的蛋白水解性降解和DiprotinA對該活性的部分抑制。(A)血纖蛋白溶液在用絲氨酸羧肽酶溫育之前(泳道1)和溫育15秒之後(泳道2)的10。/。還原SDS-PAGE。(B)對照血纖蛋白溶液(泳道l)、用絲氨酸羧肽酶溫育15秒的血纖蛋白(泳道2)和用絲氨酸羧肽酶和DiprotinA溫育15秒的血纖蛋白(泳道3)的10%還原SDS-PAGE凝膠。圖7oc-鏈的消化產物和Y-鏈協同泳動和質譜分析，表明消化從C端起始。下劃線字體表示a-鏈區域，其中陽性擊中(hits)用胰蛋白酶消化的片段獲得。注意在C端沒有獲得擊中，這表明該區域己被羧肽酶活性去除。材料和方法縱遂鎌麥膽節通過打開和清洗來自感染的綿羊的皺胃而收集成蟲捻轉血矛線蟲。將蠕蟲在PBS中勻漿，然後以3000rpm離心5分鐘。收集上清，並且將沉澱物再在PBS中勻漿，然後以3000rpm離心。合併上清，並且以10000g離心10分鐘。沉澱物用PBS洗滌1次，並將合併的上清以35000rpm離心90分鐘。將含有絲氨酸羧肽酶的沉澱物重懸在lmlPBS中，並且在分析前保存在-80。C。微敏欲微譜分叛在還原條件下在10%SDS-PAGE凝膠上分析絲氨酸羧肽酶富集的蛋白提取物。蛋白成分通過考馬斯亮藍染色顯現。從凝膠上切下蛋白條帶，並用於質譜分析。簡言之，使用胰蛋白酶在凝膠中消化蛋白條帶，然後純化，並且通過MALDI-TOF質譜分析。必要時，剩餘物質用於LC-MS/MS分析。Mascot搜尋引擎用來分析質譜和LC-MS/MS數據，並且鑑定所述蛋白。cD順遊分蓐艦虔從11日齡捻轉血矛線蟲cDNA文庫分離絲氨酸羧肽酶的全長cDNA序列(從此處開始命名為//c-pq/和Z/c-;cp2)。基於EST簇HCC00232(7/c少c;^j和HCC00298(Hc-pc;9"的共有序列，設計特異性引物，以分離每種cDNA的5'和3'末端。引物序列顯示在表1中。基因特異性引物與T3cDNA文庫載體引物組合使用。將PCR產物克隆在pGEM-T(普洛麥格(Promega))中並測序。使用DNAstar軟體(DNAstar公司)進行序列分析和比對。生激/,息學使用可在Nembase網址(www.nematodes.org/nematodeESTs/nembase.html)獲得的Partigene生物信息學途徑(Parkinson箏2004)分析捻轉血矛線蟲和其他線蟲的EST數據(在www.nema.cap.ed.ac.uk/nematodeESTs/nembase.html上獲得)。使用DNAstar軟體(DNAstar公司)進行進一步的序列和推定胺基酸序列分析。資料庫搜索在NCBI月艮務器(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)上進行。使用信號P-(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)禾口NetNGlyc-程序(www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlvc)分析胺基酸序列的信號肽和糖基化位點。及綠麟凝遊潛使用反轉錄酶偶聯的PCR(RT-PCR)來確定//c-pc^7和//c-;x^的階段-特異性轉錄。使用總RNA分離試劑(高級生物技術有限公司(AdvancedBiotechnologiesLtd.)),按照Hashmi等(2002)所述，從出鞘的L3、L4和成蟲寄生蟲提取總RNA。RT-PCRs使用Superscript—步RT-PCR系統(Invitrogen)進行。用於檢測//c-pc;7或(of)說-;x^轉錄物的特異性引物顯示在表1中。在35個擴增周期後，在P/。瓊脂糖凝膠上分離RT-PCR產物。關於細胞質超氧化物歧化酶基因(SODc)的RT-PCR用來控制RNA純化的均勻性，所述細胞質超氧化物歧化酶基因是一種在所有生命周期階段表達的基因。二嚴基農線/孺定使用一組分別具有對DPPI,II，III和IV的特異性的底物的初始篩選表明存在強DPPIV活性和非常輕微的DPPII活性。然後，分別使用生色底物H-Ala-Pro-對硝基苯胺(pNitroanilide)和H-Lys-Ala-對硝基苯胺(Bachem)測量DPPIV和DPPII活性。兩種底物的儲液it甲醇中製備(濃度為1M)。將不同體積的絲氨酸羧肽酶製備物(2-6nl)與底物(終濃度lmM)混合在100(ilpH3-8範圍內的緩衝液中(pH3-5:0.1M醋酸鈉緩衝液，pH6-7:0.1M磷酸緩衝液，pH8:0.1MTris緩衝液)。將樣品在37°C溫育45分鐘，然後轉移到微量滴定板。在405nm處測量光密度。每次實驗一式兩份地進行。DPPIV抑制劑DiprotinA和DiprotinB對酶活性的作用通過向上述反應混合物中加入不同濃度的抑制劑(10piM，100(iM,500和lmM)而確定。廚節/鄉/羞覆雄定通過加入lW凝血酶儲液(IOmg/ml)並且在37。C溫育15分鐘，來凝固牛血纖蛋白溶液(濃度15mg/ml)。收集血纖蛋白凝塊，並且重懸在8ml1MNaBr/0.05醋酸鈉緩衝液pH5.3中。隨後將這種血纖蛋白單體溶液濃縮至750pl，並且在使用前保存在4。C。通過將5^il血纖蛋白單體溶液與95plPBS混合而實施血纖蛋白溶液的重聚集/凝固。通過在分光光度計中測量在350nm處的90。角散射光來監測重聚集。結果表示為在10分鐘期間散射光的變化。在進行分光光度計測量分析前，通過將5pl血纖蛋白單體溶液與不同濃度的絲氨酸羧肽酶在37。C溫育30分鐘，而測定絲氨酸羧肽酶對血纖蛋白重聚集的作用。DPPIV抑制劑DiprotinA的作用通過向上述反應混合物中加入0.4pl的0.5M抑制劑儲液而確定。i,歪雄顏定將25嗎按上述製備的血纖蛋白單體與不同濃度的絲氨酸羧肽酶混合，並且在37。C溫育15秒-30分鐘範圍內的不同長度的時間。隨後，在還原條件下在10%SDS-PAGE凝膠上分析樣品，並且通過考馬斯亮藍染色顯現。DiprotinA抑制劑的作用通過向上述反應混合物中加入終濃度為O.lM的抑制劑而進行研究。結果錄麼微麟赦絲氨酸羧肽酶富集的級分的蛋白圖譜顯示在圖l中。它包括約55kDa的明顯的條帶(圖l中的箭頭)。從考馬斯亮藍染色的凝膠上挑取該條帶，並且通過胰蛋白酶消化、肽質量指紋分析和LC-MS/MS分析進行分析。然後，針對捻轉血矛線蟲EST數據篩選該結果。55kDa條帶的LC-MS/MS分析導致3種肽序歹i」，其顯示與簇HCC00232和HCC00298的100。/。匹配(表2)。簇HCC00232和HCC00298分別包含421和37個單個EST序列。簇HCC00232的共有序列為2579bp長。使用與T3載體引物組合的基因特異性引物通過PCR方法從cDNA文庫分離在5'端的另一個884bp。這形成編碼122kDa蛋白的全長克隆序列。簇HCC00298具有3037bp的共有序列。與在3'端的另一個562bp—起，它編碼129kDa的蛋白，所述3，端的另一個562bp以與上述相同的方法分離。兩種蛋白均表現出與秀麗隱杆線蟲中的脯氨醯羧肽酶樣蛋白(PCP-2acc.NP—501599和PCP-3acc.NP501598.1)的同源性。在捻轉血矛線蟲和秀麗隱杆線蟲蛋白之間共有的同一性在約38%變化。這兩種捻轉血矛線蟲蛋白從此處開始命名為Hc-PCPl(簇HCC00232)和Hc-PCP2(簇HCC00298)。Hc-PCPl和Hc-PCP2的序列比對顯示在圖3版A中。這兩種蛋白在胺基酸序列上彼此表現出64%的同一性，並且都包含信號肽和多個推定的糖基化位點(在圖3版A中標記)。Hc-PCPl和Hc-PCP2都包括兩個絲氨酸羧肽酶S28型結構域(pfam05577)，其以串聯重複排列(圖3版B)。這種特徵似乎是線蟲特有的，只有秀麗隱杆線蟲PCP's表現出相似的結構。每個S28結構域編碼51kDa絲氨酸羧肽酶，其近似匹配SDS-PAGE凝膠上條帶B的尺寸。因此，可能是兩個串聯結構的PCP's被翻譯後加工到4種獨立的絲氨酸羧肽酶中。i/dA》銀錄漠式在關於出鞘的L3、L4、11日齡和22日齡寄生蟲的總RNA樣品的RT-PCR中，使用/fc-/cp/和/7c-pcp2特異性引物。RT-PCRs的結果顯示在圖3中。這兩種基因的轉錄物從L4階段開始存在。使用關於細胞質超氧化物歧化酶基因(SODc)(acc，Z69621)的反轉錄酶偶聯的PCR來控制RNA純化的均勻性。二屋基廁緒絲二肽基肽酶活性測定的結果顯示在圖4中。在pH7.5，絲氨酸羧肽酶以劑量依賴性方式水解DPPIV特異性底物。發現非常輕微的針對DPPII特異性底物的活性(版A)。在pH6檢測到針對DPPIV的最大活性(圖4版B)。特異性抑制劑對DPPIV活性的作用顯示在圖4版C中。DiprotinA以劑量依賴性方式部分抑制DPPIV型活性。使用DiprotinB抑制劑沒有觀察到任何作用。踏節蘇窗/定血纖蛋白重聚集測定的結果顯示在圖5版A中。向血纖蛋白單體溶液中加入絲氨酸羧肽酶以劑量依賴性方式顯著抑制重聚集，其通過在10分鐘期間內散射光的變化而測量。通過加入DPPIV抑制劑DiprotinA，部分逆轉這種作用(圖5版B)。血纖蛋白單體溶液在還原條件下在10%SDS-PAGE凝膠上的級分顯示在圖6版A中。其形成約63kDa,56kDa和47kDa的3條蛋白條帶，這些分別是a-鏈、p-鏈和Y-鏈。加入絲氨酸羧肽酶在37°C溫育15秒後導致cx-鏈非常快速的蛋白水解降解(圖6版A)。加入DiprotinA抑制劑部分逆轉這種作用(圖6版B)。a-鏈的消化產物與？鏈協同泳動和質譜分析，(圖7)表明消化從C末端開始。紅色字體表示其中使用胰蛋白酶消化片段獲得陽性擊中的a-鏈區域。注意，針對C端沒有獲得擊中，這表明該區域已被羧肽酶活性去除。表l:用於RT-PCR和RACE實驗的PCR引物序列捻轉血矛線蟲EST簇(基因名稱)引物序列HCC00232(〃c隱拜"FRT-PCR5，aagcaggttcagccttttcaRRT-PCR5，cttgcccattgttcgttttt5'RACE5'cataatgacgcacgatogacHCC00298(〃c-pcp2JF-RT-PCR5'cgctgacctgtgteaagtgtRRT-PCR5'aagtagccggettcgtattg3'RACE5'ageategccgetttcaat表2:55kDa條帶LC-MS/MS分析的肽序列。tableseeoriginaldocumentpage21權利要求1.一種用於鑑定抗蠕蟲藥的篩選測定方法，所述測定方法包括使藥劑與蠕蟲蛋白或其片段接觸的步驟，所述蛋白或其片段特徵在於表現出二肽基肽酶IV活性並且導致血液凝固時間的增加，從而檢測所述藥劑是否能夠調節所述蛋白的所述活性或血液凝固作用。2.權利要求1的篩選測定方法，其中所述蛋白或其片段包括圖2a所示的序列。3.權利要求1的篩選測定方法，其中所述蛋白或其片段由圖2c或2d所示的序列編碼。4.前述權利要求任一項的測定方法，其中所述藥劑抑制或減小所述蛋白或其片段的DPPIV活性和/或所述蛋白或其片段增加血液凝固時間的能力。5.前述權利要求任一項的篩選測定方法，其中所述蛋白或其片段通過重組方式提供或從蠕蟲本身純化而來。6.前述權利要求任一項的測定方法，其中所述蛋白或其片段從蠕蟲的食血L4或成蟲階段分離。7.前述權利要求任一項的測定方法，其中所述待檢測的藥劑選自由下列各項組成的組(i)小化學個體；(ii)對所述蛋白特異性的抗體；(iii)設計靶向所述蛋白的表達的RNAi分子；和(iv)肽模擬物等。8.前述權利要求任一項的測定方法，其中可以將所述藥劑施用給活的蠕蟲，諸如捻轉血矛線蟲(ifoemtwc/zwco"tor/to)，或施用給感染了所述蠕蟲的宿主動物。9.前述權利要求任一項的測定方法，其中鑑定的抗蠕蟲藥對寄生蟲特異，並且基本上不影響宿主DPPIV蛋白的DPPIV活性。10.DPPIV抑制劑在製備用於治療蠕蟲感染、特別是捻轉血矛線蟲感染的藥物中的應用。11.權利要求10的應用，其中所述抑制劑選自由下列各項組成的組(i)DiprotinA禾口B;(ii)vildagliptin;(iii)Sitagliptin;(iv)二甲雙胍；(v)Saxagliptin;(vi)MK-0431纈氨酸pyrrolidide;(vii)異亮氨酸thiazolidide;(viii)FE99901;(ix)NVP陽DPP728;(x)LAF237;(xi)SYR322;和(xii)SYR619。12.治療感染了蠕蟲的動物如反芻動物的方法，所述方法包括給所述動物施用DPPIV抑制劑的步驟。13.包括一種或多種核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼蠕蟲絲氨酸羧肽酶和/或其酶反應性和/或抗原性部分。14.權利要求13的核酸分子，其中所述一種或多種核苷酸序列包括圖2c或2d所示的序列，或編碼具有與圖2a所示的胺基酸序列的全部或部分基本上相對應的序列的酶。15.包括一種或多種核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼與蠕蟲絲氨酸羧肽酶基本同源的酶，或其可以與權利要求13或14的任一種序列雜交。16.包括一種或多種編碼一種或多種多肽的核苷酸序列的核酸分子，所述核酸分子用於藥物篩選測定方法和/或用於產生抗蠕蟲寄生蟲的保護性抗體，所述核酸分子的序列結合圖2a所示的羧肽酶-編碼序列的一個或多個酶的和/或抗原性區域。17.—種合成多肽，其包括一種或多種胺基酸序列或其功能等價變體，所述胺基酸序列組成羧肽酶或其酶的和/或抗原性部分，與圖2a所示的胺基酸序列的全部或部分基本相對應。18.權利要求17的合成肽，其中所述肽提供保護性抗原性序列。19.一種融合多肽，其包括表現出蠕蟲絲氨酸羧肽酶的全部或部分的生化/生理免疫原性活性的部分，和另一種多肽。20.製備權利要求17-19的合成多肽或融合多肽的方法，所述方法包括下列步驟(a)培養包含權利要求13-16所述的核酸分子的細胞；(b)在所述核酸表達的條件下維持所述細胞；和(c)回收這樣產生的多肽。21.在人或非人動物中刺激針對蠕蟲寄生蟲的免疫反應的疫苗組合物，所述疫苗組合物包括至少一種權利要求17-19的合成多肽或融合多肽，以及藥用載體。22.—種疫苗製劑，其包括病毒或宿主細胞，所述病毒或宿主細胞中插入了一種或多種權利要求13-16的核酸分子，用於刺激針對由所述一種或多種插入的核酸分子編碼的多肽的免疫反應。23.—種抗體，其對權利要求17-19的蛋白是特異性的。24.權利要求13-19所述的核酸分子、或合成的或融合的肽/多肽的應用，其用於製備在哺乳動物中特別是反芻哺乳動物中刺激免疫反應的疫苗組合物。25.—種在哺乳動物中、特別是反芻動物中刺激針對蠕蟲寄生蟲感染的免疫反應的方法，所述方法包括給所述動物施用疫苗組合物，所述疫苗組合物包括由權利要求13-16的核苷酸序列編碼的一種或多種多肽。26.權利要求13-16所述的核酸分子、或合成的或融合的肽/多肽的應用，其用於製備用作抗凝血劑的藥物。27.—種在哺乳動物中防止和/或延遲血液凝固的方法，所述方法包括給所述動物施用權利要求13-19所述的核酸分子、或合成的或融合的肽/多肽。全文摘要本發明涉及用於鑑定新型抗蠕蟲藥的篩選，特別涉及抗血矛線蟲屬蠕蟲藥劑，以及用作針對蠕蟲如血矛線蟲屬蠕蟲的疫苗或免疫原性藥劑的蛋白/肽的製備。文檔編號A61K38/48GK101563103SQ200780041427公開日2009年10月21日申請日期2007年9月13日優先權日2006年9月13日發明者彼得·布魯諾·吉爾德霍夫,戴維·派屈克·諾克斯申請人:莫登研究院