修飾的植酸酶的製作方法

2023-10-05 11:23:29

專利名稱：修飾的植酸酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及修飾的植酸酶。
背景技術：
植物含有大量的植酸鹽作為磷酸鹽的儲藏形式。單胃動物不能從植酸鹽中釋出磷酸鹽，因此需要在飼料中補充磷酸鹽。如今可在動物飼料中補充植酸酶以自植酸鹽中釋出磷酸鹽。
植酸酶一般在製作飼料的過程中被添加至動物飼料中。在動物飼料製備過程的某些階段中，植酸酶會逢及較高溫度及較高溼度。此類條件對於不穩定型化合物(例如酶)的活性有負面影響。源自黑麴黴(Aspergillusniger)的植酸酶，由於其有利性質而常用於飼料用途。例如，該酶具有較寬酸性範圍的最適pH、寬的底物專一性、對植酸有相對的高比活性以及高親和性，即使在低植酸濃度下該酶亦可有效地降解植酸。此外，該酶可從植酸鹽中順利地移除6個磷酸中的5個磷酸，而不會顯著的堆積中間物，其活性和穩定性不需要輔因子加以維持，而且其對飼料成份及金屬離子的抑制並不十分敏感。
然而，黑麴黴的植酸酶的耐熱性較低。因此，需要與黑麴黴植酸酶具有相等的有利性質且在高溫下具有高穩定性及活性的植酸酶。
本發明公開具有有利性質的，例如對高的溫度及溼度具有抗性的修飾的植酸酶。


圖1.黑麴黴活性部位殘基。
圖2.與植酸複合的黑麴黴植酸酶的活性部位殘基IHP-S模型坐標(IHP 550H)。
圖3.植酸酶生產力相對於溫度的圖。

發明內容
本發明中，植酸酶是可催化植酸鹽(肌醇六磷酸鹽)水解為一種或多種下列化合物的酶肌醇五-、四-、三-、二-以及單-磷酸鹽及/或肌醇。一般已知某些植酸酶不能將肌醇單磷酸鹽大量水解成肌醇。植酸酶可為3-植酸酶或6-植酸酶(分別為EC3.1.3.8或EC3.1.3.26)，這是指第一個被水解的酯鍵的位置。
本發明的第一方面涉及修飾的植酸酶多肽。相較於模型植酸酶，依據本發明的多肽被修飾，以致當與模型植酸酶比對時，本發明多肽含有選自如下的修改將存在於模型植酸酶中的胺基酸替代為不同的胺基酸、缺失存在於模型植酸酶中的胺基酸、或插入胺基酸。其中，依據本發明的多肽與模型植酸酶的比對將使得可以在本發明的多肽與模型植酸酶之間獲得最大量的同源(一致)殘基。
本發明優選的實施方案中，該修飾為替代。
修飾的數目可至少為一個，優選至少10個，更優選至少20個，更優選至少30個，更優選至少40個，更優選至少50個，更優選至少70個，更優選至少80個。
在本發明中，諸如「5QS」之類的表示法意指，相關模型植酸酶中位置5的胺基酸用Q或S替代。原本的胺基酸殘基的性質可能取決於所用的模型植酸酶。諸如「Q5S」之類的表示法意指，存在於模型植酸酶中的特定胺基酸殘基(例如Q)經不同胺基酸例如S替代。
優選地與模型植酸酶相比，修飾的植酸酶在至少一個下列位置被修飾5，6，13，19，21，29，31，36，39，43，53，69，78，81，85，87，99，112，113，122，125，126，128，137，147，148，157，160，163，165，169，172，176，178，180，181，182，183，189，194，197，201，203，211，213，215，218，222，223，225，232，233，242，246，247，248，249，250，251，252，254，269，291，296，310，312，315，322，330，342，346，362，365，367，368，372，374，375，382，384，395，414，417，425，428，438，440；或優選在至少一個下列位置被修飾13，19，21，29，31，36，39，43，53，69，78，81，85，87，99，112，113，122，125，126，128，137，147，148，157，160，163，165，169，172，176，178，180，181，182，183，189，194，197，201，203，211，213，215，218，222，223，225，232，233，242，246，247，248，249，250，251，252，254，269，291，296，310，312，315，322，330，342，346，362，365，367，368，372，374，375，382，384，395，414，417，425，428，438，440；或優選在至少一個下列位置被修飾13，19，21，29，36，39，43，53，69，81，85，87，99，112，113，122，125，126，128，137，147，148，157，160，165，169，172，176，178，181，183，189，197，201，203，213，218，222，223，225，232，233，246，247，248，249，250，251，252，291，296，310，312，315，322，330，342，346，362，365，367，368，372，374，375，382，384，395，417，425，438，440。甚至更優選，修飾的植酸酶相較於模型植酸酶在至少一個下列位置上被修飾31，78，163，180，182，194，211，215，242，254，269，414，428，440。
特別地，相較於模型植酸酶，修飾的植酸酶含至少一個下列修飾5QS，6SH，13G，19P，21I，29S，31FY，36D，39A，43D，53V，69S，78EA，81K，85A，87K，99T，112Q，113M，122R，125K，126A，128A，137A，147A，148E，157A，160A，163RG，165N，169A，172V，176I，178P，180AG，181A，182STG，183Y，189H，194VA，197E，201G，203D，211TL，213A，215SA，218A，222A，223H，225P，232E，233D，242SP，246V，247A，248R，249T，250S，251D，252A，254KE，269NQ，291A，296F，310Q，312H，315T，322N，330A，342M，346F，362S，365S，367E，368E，372Y，374A，375S，382A，384A，395K，414PA，417K，425D，428RKE，438N，440AE；或更優選，相較於模型植酸酶至少有一個下列修飾5QS，6SH，13G，19P，21I，29S，31Y，36D，39A，43D，53V，69S，78A，81K，85A，87K，99T，112Q，113M，122R，125K，126A，128A，137A，147A，148E，157A，160A，163G，165N，169A，172V，176I，178P，180G，181A，182G，183Y，189H，194A，197E，201G，203D，211L，213A，215A，218A，222A，223H，225P，232E，233D，242P，246V，247A，248R，249T，250S，251D，252A，254E，269Q，291A，296F，310Q，312H，315T，322N，330A，342M，346F，362S，365S，367E，368E，372Y，374A，375S，382A，384A，395K，414A，417K，425D，428E，438N，440E。
最佳地，相較於模型植酸酶，修飾的植酸酶含有至少一個下列的修飾31Y，78A，163G，180G，182G，194A，211L，215A，242P，254E，269Q，414A，428E，440E。
本發明使用的位置編號依據SEQ ID NO1的位置編號。
本發明中使用的模型植酸酶是可得自麴黴屬絲狀真菌的植酸酶，優選得自黑麴黴的植酸酶，或源自任何此類植酸酶的變異體植酸酶。已知在黑麴黴各菌株內植酸酶顯示低程度的變異，即這些植酸酶的同源性至少為90％。還已知黑麴黴物種包括先前稱作無花果麴黴(Aspergillus ficuum)以及泡盛麴黴(Aspergillus awamori)的物種。最佳的模型植酸酶為可以得自黑麴黴NRRL3135的植酸酶，即如SEQ ID NO1所示植酸酶。
尤其優選的模型植酸酶為含有獨特地存在於黑麴黴植酸酶中的特定胺基酸殘基組合的植酸酶。
尤其優選，模型植酸酶在活性部位含有與黑麴黴植酸酶對應位置上的胺基酸殘基相同的胺基酸。為此，本發明公開了一種方法，藉此可以確定位於黑麴黴植酸酶活性部位中、出現在距結合的植酸鹽某一距離內的殘基。
形成黑麴黴植酸酶的活性部位並在黑麴黴植酸酶降解植酸的過程與催化性質相關的胺基酸殘基可以使用黑麴黴植酸酶3D結構加以確認，該3D結構可來自蛋白質資料庫(PDB)，登錄號1IHP(Kostrewa et al.NatureStructural Biology，1997，4，185)。黑麴黴3D結構不含底物植酸(肌醇六磷酸鹽)。然而，可得到與植酸複合的大腸桿菌植酸酶的3D結構(PDB入口1DKQ，Lim et al.，Nature Structural Biology，2000，7，108)。雖然序列同源性低，但此二種植酸酶顯示出實質上的結構類似性。開始時僅使用在黑麴黴植酸酶(1IHP)和大腸桿菌植酸酶中展示相似疊折模式的那些殘基的α碳原子進行兩種植酸酶的原子坐標疊置。其後，以迭代方法擴大疊置中包括的殘基，直到這種疊置不能再得到改進為止。使用用於疊置的原子的均方根差判斷疊置的品質。於最終疊置中，胺基酸片段1DKQ6-22，46-66，83-106，246-257，268-278，296-313，328-338，346-351，375-381，392-398被疊置於1IHP48-64，104-124，133-156，270-281，293-303，331-348，379-389，397-402，406-412，422-428之上。
疊置後從大腸桿菌植酸酶活性部位取出底物植酸，轉移至黑麴黴植酸酶的對應位點。接著將複合植酸的黑麴黴植酸酶進行能量最小化，允許底物與活性部位殘基位移而使其餘的結構保持固定。用Insight Discover程序(Accelrys，San Diego CA)，使用SGI Octane工作站應用力場CVFF進行能量最小化。產生的複合植酸的黑麴黴植酸酶的模型編碼為IHP-S。計算如下胺基酸殘基的溶劑可接近表面，所述胺基酸殘基至少有一個原子與底物植酸的任何原子的距離在7埃內，結果發現勾劃出一個可以幾近理想地容納植酸的口袋的光滑連續表面。形成此活性部位口袋的殘基的原子坐標示於圖1。此外，IHP-S模型被用於確認底物周圍的不同區域殘基。結果在圖2中給出。
因此，在本發明中，黑麴黴植酸酶的活性部位胺基酸殘基是與在活性部位結合的植酸相距某段距離內的那些殘基。優選相距6埃，更優選7埃。
因此，尤其優選的模型植酸酶含有胺基酸Q27，Y28，R58，H59，R62，P64，T65，S67，K68，Y72，D103，S140，R142，V143，E179，D188，F243，KN277，K278，H282，S337，H338，D339，N340，F380(距離6埃以內)，優選地含有胺基酸Q27，Y28，R58，H59，G60，R62，Y63，P64，T65，DE66，S67，K68，K71，Y72，D103，S140，R142，V143，E179，D188，E196，D239，F243，Q274，KN277，K278，H282，S337，H338，D339，N340，G341，V378，F380(距離7埃以內)。
尤其優選的模型植酸酶還含有存在於黑麴黴植酸酶中的下列胺基酸A35，A46，N130，S141，G167，Q168，D174，T191，E199，E205，L220，T235，D244，1268，H306，G341，K356，A381。
對於本發明而言，未具體指明的位置上具有何種胺基酸殘基並不具關鍵性。這些未具體指明的位置是不在黑麴黴植酸酶活性部位內的位置，而且不是以上額外地指明的黑麴黴胺基酸，也不進行如上所述的特定修飾。使用習知的比對程序比對植酸酶將可揭示在某個位置上會典型地出現哪些胺基酸。任何此類胺基酸均可存在於本發明多肽中此相應的未具體指明位置。
因此，依據本發明的優選多肽是這樣的植酸酶，該酶在活性部位含有與黑麴黴植酸酶相應位置的胺基酸相同的胺基酸殘基，以及額外地指明的黑麴黴胺基酸(即A35，A46，N130，S141，G167，Q168，D174，T191，E199，E205，L220，T235，D244，I268，H306，G341，K356，A381)、而且進一步地含有以上所述的修飾。
依據本發明的尤其優選的多肽為還含有至少一個下列胺基酸殘基的植酸酶31Y，78A，163G，180G，182G，194A，211L，215A，242P，254E，269Q，414A，428E和/或440E。依據本發明的另一尤其優選的多肽含有至少一個下列胺基酸殘基180G，182G，242P和/或440E；或優選地至少180G，182G和/或242P。
具體地，本發明公開了依據SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ IDNO7的修飾的植酸酶多肽。
本發明多肽可包含所有以上給出的修飾。此外，本發明多肽可包含額外的修飾，這些額外修飾在該多肽中涉及的位置為修飾不會影響多肽的摺疊或活性的位置。典型地，該修飾可為保守替代，即非極性的、極性不帶電荷的、極性帶電荷的或芳香族的胺基酸由相同類型的不同胺基酸替代。
在一個具體實施方案中，本發明多肽可包含與SEQ ID NO3、SEQ IDNO5或SEQ ID NO7的序列至少有91，優選至少92，更優選至少93，更優選至少94，更優選至少95，更優選至少96，更優選至少97，更優選至少98或最優選至少99％同源性(相同性)的多肽。
相較於模型植酸酶，依據本發明的多肽經修飾具有提高的熱穩定性及/或改變的比活性及/或改變的對某些底物的專一性及/或改變的酶最適pH及/或改良的顆粒飼料成丸穩定性及/或改良的生物功效，及/或改良的在用於產生修飾的植酸酶的宿主生物體內的表達或運輸等等。
在優選實施方案中，依據本發明的多肽仍保留幾種黑麴黴植酸酶(尤其可以從黑麴黴NRRL 3135獲得的植酸酶)的生化學性質。保留的生化學性質為Km值及/或在約5.5及2.5二個pH值的最適pH及/或比活性及/或在生理溫度下的高活性。
在優選的實施方案中，依據本發明的多肽具有提高的熱穩定性。相較於模型植酸酶，依據本發明的修飾的植酸酶熱穩定性增加，這可以表現為在給定的升高的溫度下更長的生命期及/或改良的重新摺疊/再活化的特徵及/或在更高的溫度下解摺疊的特徵。
出人意外地，依據本發明的多肽在提高熱穩定性後同時有多種黑麴黴植酸酶的有利性質。
對本發明多肽重要的(例如對熱穩定性或活性重要的)胺基酸，並由此可作為替代的潛在對象的胺基酸可依據本領域已知的方法，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變加以確認及修飾。後一技術中在分子的每一個殘基位置引入突變，測試產生的突變分子的生物活性(例如植酸酶活性)以確認對分子活性關鍵的胺基酸殘基。亦可用核磁共振、晶體學或光親合標記或分子建模等技術測定晶體結構，之後分析晶體結構以確定酶底物交互作用位點。
本發明多肽通常通過在適宜宿主生物體中表達編碼多肽的多核苷酸序列來重組製備，但亦可用合成方法製備。
預期使用酵母及真菌宿主細胞可提供翻譯後修飾作用(例如蛋白酶解加工、十四烷基化作用、糖基化作用、截短以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化作用)，這對於賦予重組表達的本發明產物最佳的生物活性可能是必需的。
本發明多肽可以以離開其天然細胞環境的形式提供。因此，其可以實質上被分離或純化(討論如上)、或在非天然含有其的細胞，例如其它真菌物種細胞、動物細胞、酵母或細菌中產生。
本發明多肽可用本領域技術人員習知的任何適當試驗進行分析以測量其相較於本領域已知的模型植酸酶的改進。
第二方面，本發明提供(例如分離及/或純化的)多核苷酸，其包含編碼第一方面的多肽的多核苷酸序列。特別的，本發明提供多核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所示胺基酸序列的多核苷酸序列或包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
第二方面的多核苷酸還包括編碼第一方面的多肽的多核苷酸序列的任何簡併形式。例如，本領域技術人員可使用常規技術依據任何待表達本發明多肽的特定宿主生物體的密碼子使用進行核苷酸替代而不影響本發明多核苷酸編碼的蛋白質序列。
第二方面的多核苷酸序列可為RNA或DNA並包括基因組DNA、合成的DNA或cDNA。優選，多核苷酸為DNA序列。
本發明的多核苷酸可依據本領域已知的方法合成。其可以通過組合依據並沿著本發明多核苷酸的核苷酸序列合成的寡核苷酸而產生。
或者，其可以通過在親本多核苷酸的任何所要位置進行誘變而合成。
例如，本發明多核苷酸可構建自一系列相互具有約20個核苷酸重疊的長度為80個核苷酸的合成寡核苷酸。用具有校對活性的聚合酶進行PCR(典型的10個步驟)，將所有80-mer的寡核苷酸退火併延伸此寡核苷酸。用具有校對活性的聚合酶以及位於所需片段的5′以及3』末端的PCR引物進行進一步的PCR，合成完整的所需片段。將完整的片段克隆入適當的載體並加以測序以檢驗是否得到正確的序列。可視需要，糾正序列錯誤，例如使用來自Stratagene的QuickChange試劑盒，依據製造商的說明進行糾正。
可使用本發明的多核苷酸獲得編碼進一步修飾的多肽的多核苷酸，例如以誘變技術將本發明的多核苷酸加以誘變。可使用定點誘變在一個或多個特定位置改變本發明多核苷酸。可使用基因改組技術(例如參見WO95/22625、WO98/27230、WO98/01581及/或WO00/46344)獲得多核苷酸變異體，其中存在於多核苷酸起始群體的各個成員中的變異位置發生隨機組合，該起始群體包括一種或多種依據本發明的多核苷酸。
本發明亦提供包含本發明多核苷酸的載體，包括克隆載體及表達載體。
其中插入了本發明表達盒或本發明多核苷酸的載體可為任何可方便地使用在重組DNA方法中的載體，載體的選擇經常取決於載體將導入的宿主細胞。因此，載體可是獨立自主複製的載體，即載體以染色體外實體形式存在，其複製與染色體的複製無關，例如通常具有複製起點的質粒、粘粒、病毒或噬菌體載體。或者，載體可以是引入宿主細胞後可整合至宿主細胞基因組中且與其所整合的染色體共同複製的載體。載體可為環狀(例如質粒)或線性(例如表達盒)的多核苷酸。
優選，本發明多核苷酸可插入表達盒。在表達盒中，本發明多核苷酸可操作地連接至能為宿主細胞自編碼序列表達多肽提供條件的調控序列上，即該載體為表達載體。本文術語「可操作地連接」意指並置，其中所描述的組分之間的位置關係使得它們可以以其預期方式起作用。調控序列例如啟動子、增強子或其它的表達調控信號與編碼序列「可操作地連接」，意味著調控序列的位置將允許在與調控序列相容的條件下從編碼序列表達多肽。
用於給定的宿主細胞的表達盒以連續的次序從5′-端至3′-端(相對於編碼第一方面多肽的序列的編碼鏈)包含相互可操作地連接的下列元件能在給定的宿主細胞內指導編碼多肽的DNA序列轉錄的啟動子序列；任選地，能指導從給定的宿主細胞分泌多肽至培養基的信號序列；編碼成熟形式的，優選活性形式的多肽的DNA序列；優選地以及在編碼多肽的DNA序列下遊能終止DNA序列轉錄的轉錄終止區域(終止子)。
除了編碼天然原始的本發明多肽的基因的天然啟動子以外，可使用其它啟動子指導本發明的多肽表達。可基於啟動子在期望宿主中指導本發明多肽表達的效力來選擇啟動子。
可選擇啟動子/增強子和其它表達調節信號，以便和表達盒或載體所設計用於的宿主細胞兼容。優選，啟動子序列源自高度表達的基因。本發明中高度表達的基因指其mRNA佔總細胞mRNA的至少0.01％(w/w)的基因(例如在誘導的條件下)，或基因產物佔總細胞蛋白質至少0.2％(w/w)的基因，或對於具有分泌型基因產物的基因而言分泌量至少為0.05克/升的基因。優選用於衍生啟動子和/或包含在表達盒待整合入的優選預定目標基因座內的優選高度表達基因的實例包括(但非限於)編碼糖酵解酶，例如丙糖-磷酸異構酶(TPI)、甘油醛-磷酸脫氫酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK)、醇脫氫酶(ADH)的基因，以及編碼澱粉酶、葡糖澱粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子以及核糖體蛋白質的基因。適宜的高度表達基因的特定實例包括例如克魯維酵母(kluyveromyces)的LAC4基因、漢遜酵母(Hansenula)以及畢赤酵母(Pichia)的甲醇氧化酶基因(分別地為AOX以及MOX)、黑麴黴(A.niger)以及泡盛麴黴(A.awamori)的葡糖澱粉酶(glaA)基因、米麴黴(A.oryzae)的TAKA-澱粉酶基因、構巢麴黴(A.nidulans)的gpdA基因以及裡氏木黴(T.reesei)的纖維二糖水解酶基因。
為了要在細菌中進行表達，可以使用原核啟動子，尤其可使用適用於大腸桿菌的原核啟動子。強細菌啟動子的實例為α-澱粉酶以及SPo2啟動子，以及細胞外蛋白酶基因的啟動子。
酵母啟動子包括釀酒酵母(S.cerevisiae)的GAL4以及ADH啟動子、粟酒裂殖酵母(S.pombe)的nmt 1以及adh啟動子。強酵母啟動子的實例為可以來自醇脫氫酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶以及丙糖磷酸異構酶基因的啟動子。
應用於真菌表達宿主的強組成型及/或誘導型啟動子的優選實例為可取自真菌基因木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶、亞基9(oliC)、丙糖磷酸異構酶(tpi)、醇脫氫酶(AdhA)、α-澱粉酶(amy)、澱粉葡萄糖苷酶(AG-來自glaA基因)、乙醯胺酶(amdS)以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)的啟動子。
適用於植物細胞的啟動子包括胭脂鹼合酶(nos)、章魚鹼合酶(ocs)、甘露鹼合酶(mas)、核酮糖小亞基(rubico ssu)、組蛋白、稻肌動蛋白、菜豆蛋白、花椰菜花葉病毒(CMV)35S以及19S以及環狀病毒(circovirus)的啟動子。在本領域中可容易獲得所有的這些啟動子。
若要將多肽製備為分泌型蛋白質，則表達盒中編碼成熟多肽形式的多核苷酸序列可操作地連接至編碼信號肽的多核苷酸序列。
優選，該信號序列相對於編碼多肽的多核苷酸序列是天然的(同源的)。本發明的優選實施方案中信號序列得自黑麴黴植酸酶基因，尤其如公開於EP 0 420 358的信號序列。或者，信號序列可相對於編碼多肽的多核苷酸序列為外來的(異源的)，在此情況中，優選信號序列是表達此DNA序列的宿主細胞的內源序列。信號序列可與驅動該信號序列所來自的編碼序列表達的啟動子組合以共同使用，例如組合(黑)麴黴澱粉葡萄糖苷酶(亦稱為(gluco)澱粉酶)啟動子與澱粉葡萄糖苷酶(AG)基因的信號序列(18以及24個胺基酸的版本均可)，信號序列也可與其它啟動子組合。
本發明中亦可使用雜合的信號序列。適宜的用於酵母宿主細胞的信號序列的實例為源自酵母α-因子基因的信號序列。適宜的用於細菌的信號序列來自α-澱粉酶基因(芽孢桿菌)。
在一些案例中，多肽經由分泌路徑時可在一個以上的位置發生信號序列的裂解，此意味著可產生具有可變的N-端的成熟多肽。本發明包括這些具有可變的N-端的多肽。
編碼多肽的多核苷酸序列下遊可為內含一個或多個轉錄終止位點(例如終止子)的3′非翻譯區。終止子的來源並不十分重要。終止子可為例如編碼多肽的多核苷酸序列的天然終止子。然而，優選在酵母宿主細胞中使用酵母終止子以及在絲狀真菌宿主細胞中使用絲狀真菌的終止子。更優選宿主細胞(其中表達編碼多肽的多核苷酸序列)的內源終止子。
載體可含有一個或多個選擇性標記基因，以使得可以從多數的未轉化細胞中選出轉化細胞。
優選的選擇性標記包括(但非限於)那些可彌補宿主細胞缺陷或賦予藥物抗性的標記。其包括例如可用於大多數絲狀真菌以及酵母轉化的通用標記基因，例如乙醯胺酶基因或cDNA(構巢麴黴、米麴黴、或黑麴黴的amdS、niaD、facA基因或cDNA)，或提供抗生素如G418、潮黴素、博來黴素、卡那黴素、腐草黴素或benomyl(benA)抗性的基因，或者，可使用特定選擇標記，例如需要對應的突變宿主株系的營養缺陷型標記例如URA3(來自釀酒酵母或來自其它酵母的類似基因)、pyrG或pyrA(來自構巢麴黴或黑麴黴)、argB(來自構巢麴黴或黑麴黴)或trpC。在優選的實施方案中，在引入表達構建體後自轉化的宿主細胞中刪除選擇標記以便取得不含選擇標記基因的能產生多肽的轉化宿主細胞。
其它標記包括ATP合成酶、亞基9(oliC)、乳清酸核苷-5′-磷酸-脫羧酶(pvrA)、細菌的G418抗性基因(此亦可用於酵母，但非真菌)、抗氨苄青黴素抗性基因(大腸桿菌)、新黴素抗性基因(芽孢桿菌)以及編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大腸桿菌uidA基因。可在體外使用載體，例如用於產生RNA或用於轉染或轉化宿主細胞。
編碼多肽的DNA序列優選作為表達盒的一部份引入適當的宿主。對於用表達盒轉化適當的宿主，可使用本領域技術人員熟知的轉化方法。用於轉化宿主的表達盒可為攜帶可選擇標記的載體的一部份，或表達盒可作為單獨分子與攜帶可選擇標記的載體共同進行共轉化。所述載體可包含一種或多種可選擇的標記基因。
對大多數的絲狀真菌及酵母而言，載體或表達構建體優選整合在宿主細胞基因組中以取得穩定轉化體。然而，對某些酵母而言也可獲得適當的附加型載體，表達構建體可以插入其中獲得穩定及高水平表達。其實例包括分別源自酵母屬及克魯維酵母屬的2μ及pKD1質粒的載體，或內含AMA序列(例如麴黴屬的AMA1)的載體。在表達構建體整合入宿主細胞基因組中時，構建體可使用同源重組整合在預定目標基因座或隨機整合在基因組的基因座中，在前一情況中，優選目標基因座包含高度表達的基因。之前已提供許多高度表達基因的適宜實例。
本發明亦提供包含本發明多核苷酸或本發明載體的宿主細胞。多核苷酸對宿主細胞基因組而言可為異源的。本文術語「異源的」意指非天然存在於宿主細胞基因組中的多核苷酸或非該細胞天然產生的多肽。
適宜的宿主細胞優選為原核微生物例如細菌，或更優選為真核生物體，例如真菌例如酵母或絲狀真菌，或植物細胞。
來自芽孢桿菌屬的細菌為非常適宜的異源宿主，因為其可分泌蛋白質至培養基。其它適宜的細菌宿主來自鏈黴菌屬(streptomyces)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)。
用於表達編碼本發明多肽的DNA序列的優選酵母宿主細胞為酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬、Yarrowia、以及裂殖酵母屬酵母。更優選的酵母宿主細胞選自釀酒酵母、乳酸克魯維酵母(kluyveromyces lactis)(亦稱為馬克斯克魯維酵母乳酸亞種(kluyveromyces marxianus var.lactis))、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、巴斯德畢赤酵母(pichia Pastoris)、Yarrowia lipolytica、及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
最優選絲狀真菌宿主細胞。優選的絲狀真菌宿主細胞選自麴黴屬(Aspergillus)、木黴屬(Trichoderma)、鐮孢屬(Fusarium)、Disporotrichum、青黴屬(Penicillium)、枝頂孢屬(Acremonium)、脈孢菌屬(Neurospora)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、毀絲黴屬(Myceliophtora)、側孢黴屬(Sporotrichum)、梭孢殼屬(Thielavia)、以及Talaromyces。更佳的絲狀真菌宿主細胞為米麴黴(Aspergillus oryzae)、醬油麴黴(Asperigillus sojae)、構巢麴黴，或黑麴黴組的菌種(經Raper和Fennell定義，The GenusAspergillus，The Williams Wilkins Company，Baltimore，pp 293-344，1965)。此類菌種包括(但非限於)黑麴黴、泡盛麴黴、塔賓麴黴(Aspergillustubingensis)、棘孢麴黴(Aspergillus aculeatus)、臭麴黴(Aspergillusfoetidus)、構巢麴黴、日本麴黴(Aspergillus Japonicus)、米麴黴以及無花果麴黴(Asperigillus ficcum)，以及菌種裡氏木黴(Trichoderma reesei)、禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)、產黃青黴(Penicilliumchrysogenum)、Acremonium alabamense、粗糙脈孢黴(Neurospora crassa)、嗜熱毀絲黴(Myceliophtora thermophilum)、嗜纖維素側孢黴(Sporotrichum cellulophilum)、Disporotrichum dimorphosporum以及Thielavia terrestris。
本發明範圍內優選的表達宿主的實例為真菌，例如麴黴屬及木黴屬；細菌，例如芽孢桿菌例如枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌和解澱粉芽孢桿菌，假單胞菌；以及酵母例如克魯維酵母屬，例如乳酸克魯維酵母以及酵母屬，例如釀酒酵母。
依據本發明的宿主細胞還包括植物細胞，因此本發明延及含有一個或多個本發明細胞的轉基因生物體，例如植物以及其部份。因此轉基因的(或遺傳修飾的)植物可以在其基因組中插入(例如穩定地)編碼一個或多個本發明多肽的序列。可使用已知的技術，例如使用根瘤農桿菌的Ti或Ri質粒轉化植物細胞。如此，質粒(或載體)可含有感染植物所必要的序列，並且可使用Ti及/或Ri質粒的衍生物。
或者，可直接侵染植物的一部份，例如葉、根或莖。在此技術中可創傷待感染的植物，例如用刀片切割植物或用針穿刺植物或用磨蝕物磨擦植物。然後在創口接種農桿菌。
然後植物或植物部份可生長在適當的培養基上並發育成成熟的植物。可使用已知技術將轉化細胞再生成遺傳修飾的植物，例如使用抗生素選擇轉化的芽並在內含適當的營養物、植物激素等的培養基上傳代培養該芽。
如此本發明的另一方面提供經轉化或轉染包含本發明的多核苷酸或載體的宿主細胞。較佳地多核苷酸包含在用於複製多核苷酸以及表達多肽的載體中。可選擇與該載體能兼容的細胞，例如原核的(例如細菌)、真菌、酵母或植物細胞。
亦可選擇異源宿主，其中本發明的多肽以實質上不含有與本發明多肽具有類似活性的其它多肽的形式產生。可選擇通常不產生具有類似活性的此類多肽的宿主達成此目的。
若本發明多核苷酸併入重組可複製的載體，則該載體可用於在相容的宿主細胞中複製此多核苷酸。
如此本發明進一步提供產生依據本發明的多核苷酸的方法，其中將依據本發明的多核苷酸引入可複製的載體，將載體引入兼容的宿主細胞，以及在引起載體複製的條件下生長宿主細胞。內含依據本發明的多核苷酸的載體可自宿主細胞回收。適當的宿主細胞包括細菌例如大腸桿菌。
本發明進一步提供製備依據本發明的多肽的方法，其中在允許表達(由載體表達)依據本發明的多肽的條件下培養宿主細胞(例如其轉化或轉染了如上所述的表達載體)以及可選地回收表達的多肽。優選將多肽製備成分泌型蛋白質，在此情況下表達構建體中編碼成熟多肽形式的多核苷酸序列可操作地連接至編碼信號肽的多核苷酸序列上。
依據本發明的重組宿主細胞可用本領域已知的方法培養。對於各啟動子和宿主細胞的組合，可獲得有助於表達本發明多肽的培養條件。達到所要的細胞密度或多肽滴度後，可停止培養，並用習知的方法回收多肽。
發酵培養基可包括習知的培養基，其中含有碳源(例如葡萄糖、麥芽糖、糖蜜)、氮源(例如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、有機氮源，例如酵母提取物、麥芽汁、蛋白腖)、以及其它無機的營養源(例如磷酸鹽、鎂、鉀、鋅、鐵、等)。可選地，可以包括誘導物。
適當培養基的選擇可基於表達宿主及/或基於表達構建體的調控需求而定。該培養基為本領域技術人員習知的。培養基可視需要含有附加成份，從而使轉化的表達宿主比其它可能的汙染微生物更具生長優勢。
發酵可進行0.5-30天。發酵可為分批、連續或補料分批法，適當地溫度介於0至45℃之間，以及pH介於例如2至10之間。優選的發酵條件為溫度介於20至37℃之間及/或pH介於3至9之間。通常基於選擇的表達宿主以及表達的蛋白質選擇適當條件。
發酵後，若必要，可使用離心或過濾自發酵培養液中移除細胞。發酵停止後或去除細胞後，可回收本發明的多肽，視需要用常規方法純化和分離。
方便地，本發明的多肽可與適當的(固態或液體)載體或稀釋劑(包括緩衝液)混合以產生多肽組合物。多肽可與載體結合或混合，例如固定於固態載體上。如此本發明進一步提供含本發明多肽的組合物。這可為適於包裝、運送及/或儲藏的形式，優選此時保留多肽的活性。組合物可為糊、液體、乳液、粉、薄片、顆粒、丸或其它擠出物形式。
組合物可進一步包含額外成分，例如一種或多種(額外的)酶。
一般，多肽可穩定地配製成液體或乾燥形式。一般，產物可配成任選地包括例如穩定緩衝劑及/或防腐劑的組合物。
本發明還涉及包含一種或多種本發明多肽的食品或動物飼料組合物或添加劑。多肽可存在於飼料中，且其濃度不同於天然的濃度。優選的量為0.1至100，例如0.5至50，優選為1至10mg/kg飼料。
本發明亦涉及製備動物飼料組合物的方法，該方法包括將本發明的多肽添加入一種或多種可食用的飼料物質或成分中。多肽可與飼料物質或成分分開單獨地或結合其它飼料添加劑添加入動物飼料組合物中。多肽可為飼料物質或成分的組成部份或之一。
本發明多肽亦可添加入動物飼料中以改良植物組份(例如植酸鹽)的分解，改良動物對植物營養物的利用。有利地，本發明多肽可在體內繼續降解飼料中的植酸鹽。本發明的真菌多肽特別地通常具有較低的最適pH並能在諸如動物胃這樣的酸性環境中釋放重要的營養物。
本發明多肽亦可用於自大豆產生奶替代物(或替代品)的過程中。此類奶替代物可以供應人類及/或動物。
所述組合物可額外地包含(尤其當其配製用於動物飼料時)一種或多種離子載體、氧化劑、表面活性劑、保護瘤胃的胺基酸、酶增強物或可在進食動物的胃腸道內天然產生的酶。當添加至反芻動物或單胃動物(例如家禽或豬)飼料(包括青貯飼料)中時，飼料可包含穀類，例如大麥、小麥、玉米、黑麥或燕麥或穀類副產品，例如麩皮或玉米糠，或其它植物材料，例如大豆以及其它豆類。酶可顯著地改善植物材料的降解，使動物更好地利用植物營養物。結果可提高生長速率及/或飼料轉化。
由於本發明多肽在高度酸性的條件下(例如在動物胃中)仍有活性，故其尤其可用於動物飼料。
外源添加本發明多肽的一個方法為以轉基因植物材料及/或(例如轉基因的)種子的形式加入多肽。如此多肽可經由異源基因表達合成，例如編碼所要酶的基因可克隆入植物表達載體，並由適當的植物表達信號，例如組織-特異性啟動子，例如種子-特異性啟動子加以控制。內含編碼多肽的基因的表達載體可接著轉化入植物細胞，可選擇轉化的細胞以再生成整個植物。可生長及收穫如此得到的轉基因植物，內含異源(對植物而言)多肽的植物部份可直接或經進一步的加工後包括於組合物中。異源多肽可包含於轉基因植物的種子中或可包含於其它植物部份，例如根、莖、葉、木質部、花、樹皮及/或果實中。適當的植物包含穀類植物，例如燕麥、大麥、小麥、玉米以及稻。
以轉基因植物材料形式，例如轉基因種子形式添加多肽可能需要對植物材料加工以便動物可得到多肽，或至少提高其利用率。該加工技術可包括各式各樣機械性(例如磨碎及/或研磨)的技術或熱機械性的處理例如擠壓或延展。
如此本發明亦涉及促進單胃或非反芻型動物的生長及/或飼料轉化的方法，該方法包括用本發明的多肽飼養動物。適當的動物包括農場的單胃及/或非反芻動物，例如豬(或小豬)、家禽(例如雞、火雞)、小牛或犢牛或水產(例如海產類)動物(例如魚類)。
實施方式實施例1構建產生植酸酶的菌株合成具有SEQ ID NO2、SEQ ID NO4及SEQ ID NO6序列的DNA片段。證實DNA序列後，將這些合成的基因片段使用PCR融合至黑麴黴植酸酶信號序列，並克隆在葡糖澱粉酶啟動子的控制下。為此，將存在於國際專利申請WO98/46772所述pGBTOPFYT1表達載體中的phyA基因用如上所述的修飾的植酸酶基因取代，分別產生載體pTHFYT2、pTHFYT4及pTHFYT6。
將表達載體pTHFYT2、pTHFYT4及pTHFYT6引入黑麴黴CBS646.97(描述於WO98/46772)。使用PCR選擇內含pTHFYT2、pTHFYT4或pTHFYT6的轉化株。為了測定這些轉化株是否能分泌活性的植酸酶，將轉化株培養在如Chen(1998，Biotechnol.Technique12，759-761)所述內含植酸鹽的平板上。在此試驗中，若分泌出活性植酸酶，則由於植酸鹽降解，在麴黴菌落的附近可看見暈圈。使用此試驗證實所有表達載體均導致可以分泌活性的植酸酶FYT2、FYT4或FYT6至培養基的轉化體。
將顯示清晰暈圈的轉化株培養於搖瓶中。將所選擇的轉化株及對照菌株的107個孢子接種入搖瓶，瓶中內含20毫升的預培養液，其中每升培養液含30克麥芽糖H2O；5克酵母提取物；10克水解的酪蛋白；1克KH2PO4；0.5克MgSO4·7H2O；0.03克ZnCl2；0.02克CaCl2；0.01克MnSO4·4H2O；0.3克FeSO4·7H2O；3克Tween80；10毫升青黴素(5000IU/毫升)/鏈黴素(5000UG/毫升)；pH5.5。這些培養物在34℃下生長20-24小時。將10毫升的培養物接種至100毫升黑麴黴發酵培養液，每升培養液中含70克麥芽糖糊精；25克水解的酪蛋白；12.5克酵母提取物；1克KH2PO4；2克K2SO4；0.5克MgSO4·7H2O；0.03克ZnCl2；0.02克CaCl2；0.01克MnSO4·4H2O；0.3克FeSO4·7H2O；10毫升青黴素(5000IU/毫升)/鏈黴素(5000UG/毫升)；用4N H2SO4調至pH5.6。這些培養物在34℃下生長約6天。將發酵培養液的樣品離心(10分鐘，5.000rpm，swingingbucket離心機)並收集上清液。
實施例2FYT2、FYT4及FYT6的熱穩定性依據實施例1在搖瓶中生產FYT2、FYT4、FYT6以及野生型無花果麴黴植酸酶(EP 0 420 358)。以適當時間間隔取樣並依據van.Engelen等.(Journal of AOAC International 1994，77760-764)描述的方法測定上清液中植酸酶的活性以追蹤植酸酶的產生。活性用FTU表示，1FTU的酶量在測驗條件下(pH＝5.5，溫度37℃，5mM植酸鈉)每分鐘釋出1μmol的無機正磷酸鹽。測量上清液中酶的熱穩定性。視需要，植酸酶上清液用超濾法進一步濃縮。
用三種不同方法測量熱穩定性。首先，測定植酸酶的T50。T50(℃)為樣品加熱20分鐘後喪失50％活性的溫度。實驗條件壓力測驗在250mMHAc/NaAc/Tween20，pH＝4.0下進行。植酸酶的劑量約0.6FTU/毫升。樣品加熱後立刻在冰上冷卻。接著在250mM HAc/NaAc/Tween20，pH＝4.0中測量殘餘的植酸酶活性。結果如表1。FYT2及FYT4的熱穩定性高約8-9℃。
表1各種植酸酶的熱穩定性

其次，於加熱期間測定植酸酶的活性。改變加熱溫度進行實驗時，得到就生產力而言的酶的最適溫度(Topt)。溫育進行固定的30分鐘時間。底物轉換的量取決於酶的活性與此失活作用。因此優選使用術語生產力而非活性。實驗條件250mM HAc/NaAc/Tween20 pH＝4.0，植酸酶劑量約0.012FTU/毫升。釋出的磷酸鹽可依上述的標準檢測方法測量。結果如圖3所示。FYT2與FYT4在75℃下就催化生產力而言最有效，而野生型對照則已完全喪失其催化活性。雖然在75℃以上活性開始減少，圖3顯示FYT2與FYT4在高達約85℃下仍有催化能力。FYT6的行為介於野生型和FYT2或FYT4之間。
第三，除了經由適當的活性分析測量耐熱性之外，植酸酶的耐熱性亦藉由測定植酸酶三維結構去摺疊的溫度而直接確定。伴隨去摺疊的加熱效應可用差示掃描量熱法(DSC)直接測量。DSC的實驗條件250mMHAc/NaAc pH＝4.0，約5毫克/毫升植酸酶，加熱速率為2.5℃/分鐘。結果如表1所示。可以看出，就維持天然酶結構的溫度而言，修飾的植酸酶FYT2及FYT4比野生型植酸酶高出約9℃。
實施例3FYT2、FYT4及FYT6的顆粒飼料成丸穩定性以二種顆粒飼料成丸模具，及由此以不同溫度設置，測試FYT2、FYT4及FYT6培養物濾液。
所有顆粒由培養過濾物及需要量的玉米澱粉(C-凝膠，來自Cerestar)及水通過混合/揉合製成。參閱表2及3的溼混合物組成。混合及揉合後，混合物用Nica E-220擠壓機壓出並用Fuji Paudal QJ-400G球粒機製成球粒。得到的顆粒用Glatt GPCG 1.1流床乾燥器乾燥。顆粒活性介於2500至3000FTU/克。
表2RDS 05顆粒混合物的組成

表3RDS Al顆粒混合物的組成

在25kg飼科(成分依據表4)中混合250克顆粒，並在臨測試前與225kg的相同配方混合。此25kg飼料用Collete MP90 planetary混合器混合10分鐘。此2.5kg與225kg飼料在1200升Nauta混合器中混合。用混合物的樣品確定顆粒飼料成丸穩定性。在混合器/調料器中由配料螺杆以600kg/小時速度加入此250kg混合物，在此處通過直接蒸汽注入將其加熱至80℃。駐留時間約10-15秒，之後將熱混合物推入成丸擠壓器。測試中使用的模具為5/45mm(寬度/長度；RDS05)或3/65mm(寬度/長度；RDS Al)。小丸離開成丸擠壓器時的溫度為82-83℃(RDS 05)或91-93℃(RDSAl)。將小丸推落至冷卻帶上後，從帶上取樣進行穩定性測試。
表4用於RDS 05以及RDS Al顆粒飼料成丸試驗的家禽飼料的組成

表5熱穩定植酸酶(RDS 05)的成丸產率。熱粉的溫度為80℃。丸溫度約達到82-83℃。產率以成丸前後使用標準植酸酶分析(van.Engelen etal，Journal of AOAC International 1994，77760-764)測量的活性為基礎。

表6熱穩定植酸酶(RDS 01)的成丸產率。熱粉的溫度為80℃。丸溫度約達到92-93℃。產率測定結果如表5所示。

成丸測試顯示在82℃下，相較於野生型，FYT2、FYT4以及FYT6的耐熱性均有類似增加，在92℃下FYT2和FYT4的穩定性高於FYT6。
實施例4植酸酶的生化特性過濾發酵培養液後，從濾液純化植酸酶，接著測定植酸酶比活性。用離子交換層析法或親和層析法或此二方法的組合純化植酸酶。
使用ConA(刀豆球素A)親和基質(HiTrap Con A，AmershamPharmacia Biotech)進行糖基化植酸酶的親和層析。在20mM Tris/0.5MNaCl/1mM MnCl2/1mM CaCl2/pH＝7.4中將植酸酶結合於柱上。在徹底清洗柱子之後用20mM Tris/0.5M NaCl/0.5M甲基-α-呋喃葡萄糖苷/pH＝7.4洗脫植酸酶。用20mM Tris pH＝8.5再生柱子。緩衝液pH用4N HCl調節。
使用陰離子交換劑(Resource Q，Amersham Pharmacia Biotech)進行離子交換層析。使用PD-10凝膠過濾柱去鹽及改變緩衝液。用50mMTris，pH＝7.5平衡柱子。上樣植酸酶樣本後，使用0至1M梯度NaCl在50mM Tris pH＝7.5中洗脫植酸酶。
經E280測量確定純化植酸酶的蛋白質含量，1毫克/毫升植酸酶相當於OD280，1cm＝0.938。1毫克/毫升FYT2、FYT4及FYT6的OD280，1cm分別相當於0.995、0.995及0.963。測定的活性以FTU表示，方法描述於vanEngelen et al.(Journal of AOAC International 1994，77760-764)中。
作為底物濃度的函數測量起始反應速率以確定植酸的Km值。試驗混合物內含1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.025、0.015mM植酸(在250mM NaAc緩衝液pH＝5.5中)。以15％TCA(1∶1)終止酶反應。混合0.6M H2SO4-2％抗壞血酸-0.5％鉬酸銨與終止的反應混合物(1∶1)，混合物在50℃下溫育20分鐘，測量820nm的吸收(Wyss et al.Appl Env Microbiol 1999，65367-373)，因此測定釋出的無機磷酸鹽。結果見表7。
表7植酸酶使用植酸作為底物的催化性質

表7顯示與野生型相比，所進行的修飾並未影響比活性和對植酸的高親和性。
在不同pH值下測量從植酸釋放磷酸鹽的速率，測定植酸酶活性的pH依賴性。原則上除了變化pH外使用標準植酸酶分析試驗。以pH＝5.6下的活性定為100％活性。使用下列緩衝液設定實驗的pH250mM甘氨酸，pH範圍為2.8至3.2；250mM NaAc，pH範圍為3.6至5.6；250mM咪唑，pH範圍為6至7以及250mM Tris，pH範圍為7.5至9。此結果見圖8。
表8植酸酶活性的pH依賴性。活性表示為pH＝5.6下觀察到的最大活性(設定為100％)的百分比。

修飾的植酸酶的活性的pH依賴性與野生型的非常相似。尤其是，野生型植酸酶表現出的二個最適pH，這一性質得以維持。其中一個最適pH約為pH＝2.5，而第二個最適pH約為pH＝5.5。表8顯示野生型黑麴黴植酸酶的此特定特性並未受到FYT2、FYT4及FYT6中的修飾的影響。
在250mM NaAc、pH＝5.5、37℃下，植酸酶降解植酸的進展曲線以時間函數記錄。反應底物濃度為0.2mM植酸，植酸酶的劑量為0.05FTU/毫升。以15％TCA(1∶1)終止酶反應。混合1400微升0.3M H2SO4-1％抗壞血酸-0.27％鉬酸銨與100微升的反應混合物，接著混合物在50℃下溫育20分鐘並測量820nm的吸收，從而測定釋出的無機磷酸鹽。結果見表9。
表9植酸酶降解植酸的進展曲線

結果顯示修飾的植酸酶在自植酸釋出磷酸鹽方面與野生型植酸酶非常相似。一小時後進展曲線到達平臺，約釋出80-85％的磷酸鹽。所有植酸酶到達此平臺的速率相似，顯示野生型植酸酶自植酸釋放磷酸鹽的功效在修飾的植酸酶中不受修飾的影響。
結論結果顯示，相較於野生型植酸酶，FYT2、FYT4及FYT6中的修飾對催化性能不產生影響。結果顯示避免任何展示於圖1中的胺基酸(在底物周圍7埃區域內的殘基)的突變以及進一步地保留所述的額外的黑麴黴胺基酸即可保持野生型黑麴黴植酸酶的功能性質。
實施例5修飾的植酸酶的生物功效液體植酸酶的試驗在顆粒飼料製成後以液體製劑形式將植酸酶加入顆粒飼料，之後將其用於生物功效測驗中以比較新產生的耐熱植酸酶。按加入的植酸酶活性將為100、200或300FTU/kg飼料的劑量應用這些酶進行測驗，其中使用肉用仔雞(5-33天)，餵食以玉米-大豆為基礎的膳食(試驗的前14天餵食一種膳食，後14天餵食一種稍微不同的膳食)。基礎飲食中可吸收的磷含量為2.2克/kg飼料(第5-19天)以及1.7克/kg飼料(第19-33天)。這些數值遠低於估計的動物需求量。對於每種處理，動物飼養於六層的雞籠中，各籠內有14隻動物(雞)。使用Finney(1964Statistical methodin biological assay.Charles Griffin，London.)的方法，基於分析的植酸酶含量(FTU/kg)計算結果。體重結果見表10。
表10。根據分析的植酸酶活性計算在全部實驗期間(5-33天)不同植酸酶(顆粒飼料製成後以液體形式應用的)與野生型(＝100％)相比對體重產生的相對功效。
表10

所有產品的回歸線的斜率顯著地偏離零。從表10可見，除FYT4以外，產品間幾乎沒有差異。餵食此酶的動物的表現雖不如餵食其它植酸酶的動物好，但在統計學上差異不顯著。
顆粒狀植酸酶的試驗在形成顆粒飼料前加入顆粒飼料的顆粒製劑形式的耐熱植酸酶通過測驗進行比較。這意即在丸粒化過程中放入植酸酶。此試驗中丸粒化以大約92℃的高溫進行。因為該目標在於向動物的飼料中加入100、200或300FTU/kg，因此進行制粒前試驗以估計此方法中活性的喪失，並且過劑量提供產品以便達成所述活性。用相似於液體產物試驗的方法進行測驗，使用肉用仔雞(5-33天)餵食玉米大豆為基礎的膳食(全部時期僅用一種膳食)，該膳食中可吸收的磷含量遠低於這些動物的估計需要量(1.9克/kg飼料)。每種處理，動物籠養於六層雞籠，各籠內有14隻雞。體重增量回歸線的相對斜率見表11。
表11根據分析的植酸酶活性計算在全部實驗期間(5-33天)不同植酸酶與野生型(＝100％)相比對體重增量的相對功效(除了野生型以液體製劑於制粒後加入顆粒飼料中外，其它均以顆粒施用)。

此試驗中以植酸酶FYT2最好，其次FYT6、FYT4以及野生型。
實施例6植酸酶FYT2以及FYT6的單一突變製備以下單一突變，對於植酸酶FYT2而言為Y31F，A78E，G163R，G180A，G182S，A194V，L211T，A215S，P242S，E254K，Q269N，A414P，E428R及E440A，以及對於植酸酶FYT6而言為E440A。
在此方面將編碼FYT-2(SEQ ID NO2)或FYT6(SEQ ID NO6)的基因用PCR擴增，其總體積為50μl、使用2.5UPwo聚合酶(Rochediagnostics，GmbH，Mannheim，Germany)、100ng DNA模板、0.5mMdNTP、1xPwo緩衝液、10pmol DSM-1 F以及10pmol DSM-1R，擴增條件為94℃下5分鐘、30x(94℃30秒，60℃1秒，72℃2分鐘)、72℃下5分鐘。將擴增片段克隆入PCR-Blunt-TOPO(Invitrogen lifetechnologies，Carlsbad，CA，USA)載體並使用Stratagene(Stratagene，La Jolla，CA，USA)的QuickChange試劑盒，依據供貨商的建議引入突變。
DSM-1F以及DSM-1R引物的序列如下DSM-1F 5′GGCAGTCCCCGCCTCGAGAAAT3』DSM-1R 5′GTCATCGCGATTAATTAATCTAAGCAAAACACTCCTCCCAGTT3′使用下列引物進行誘變，其中突變的密碼子用粗字體表示。
突變引物對Y31F5』-GGTCAATACTCCCCGTTCTTCTCTCTGGCAGAC-3』5』-GTCTGCCAGAGAGAAGAACGGGGAGTATTGACC-3』A78E5』-TCCGCTCTCATTGAGGAGATCCAGAAGAACGCG-3』5』-CGCGTTCTTCTGGATCTCCTCAATGAGAGCGGA-3』G163R 5』-AAGCTGGCCGATCCTCGTGCCAACCCCGGCCAA-3』5』-TTGGCCGGGGTTGGCACGAGGATCGGCCAGCTT-3』G180A 5』-GTGATCATTCCCGAGGCCGCCGGCTACAACAAC-3』5-GTTGTTGTAGCCGGCGGCCTCGGGAATGATCAC-3』G182S 5』-ATTCCCGAGGGCGCCTCATACAACAACACTCTC-3』5』-GAGAGTGTTGTTGTATGAGGCGCCCTCGGGAAT-3』A194V 5』-CACGGCACCTGCACTGTCTTCGAAGAGAGCGAA-3』5』-TTCGCTCTCTTCGAAGACAGTGCAGGTGCCGTG-3』L211T 5』-GCCAATTTCACCGCCACGTTCGCCCCCGCCATT-3』5』-AATGGCGGGGGCGAACGTGGCGGTGAAATTGGC-3』A215S 5』-GCCCTGTTCGCCCCCTCCATTCGTGCCCGTCGT-3』5』-ACGACGGGCACGAATGGAGGGGGCGAACAGGGC-3』P242S 5』-CTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCGTCGCC-3』5』-GGCGACGGTGTCGAAGGAGCACATGTCCATGAG-3』E254K 5』-ACCTCCGACGCCACCAAGCTGTCCCCCTTCTGT-3』5』-ACAGAAGGGGGACAGCTTGGTGGCGTCGGAGGT-3』Q269N 5』-CATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAG-3』5』-CTGGAGGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTCATG-3』A414P 5』-CCGCTGCATGGGTGTCCGGTTGATAAGTTGGGG-3』5』-CCCCAACTTATCAACCGGACACCCATGCAGCGG-3』E428R 5』-CGGGATGACTTTGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCT-3』5』-AGCAAAGCTCAACCCCCTCACAAAGTCATCCCG-3』
E440A5』-TCCGGGGGTAACTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAG-3』5』-CTAAGCAAAACACTCCGCCCAGTTACCCCCGGA-3』用序列分析檢查產生的植酸酶DNA片段的序列。將植酸酶序列克隆入pGBTOPFYTI以及如描述於實施例1中方法製備培養物上清液。
測定FYT2及FYT6的各種單突變的T50值(參閱實施例2)。此結果見表12。
表12植酸酶突變體的T50值

得到的大多數突變體顯示其T50值與植酸酶FYT2的相當。出人意外地，內含所有單突變的組合的FYT6的T50值遠低於各單突變的T50值。
序列表110巴斯福股份公司120修飾的植酸酶13020720WO1607170PatentIn version 3.12101211444212PRT213黑麴黴(ASPERGILLUS NIGER)成熟植酸酶4001Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln1 5 10 15Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe20 25 30Ser Leu Ala Asn Glu Ser Val Ile Ser Pro Glu Val Pro Ala Gly Cys35 40 45Arg Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro50 55 60Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln65 70 75 80Gln Asn Ala Thr Thr Phe Asp Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr85 90 95Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu100 105 110Leu Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr115 120 125Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile130 135 140Ala Ser Gly Lys Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys145 150 155 160Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser Ser Pro Lys Ile Asp Val Val165 170 175
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221CDS222(1)..(1335)223
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221CDS222(1)..(1335)223
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195 200 205acc gcc acg ttc gcc ccc tcc att cgt gcc cgt ctg gag gcc cac ctg672Thr Ala Thr Phe Ala Pro Ser Ile Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu210 215 220ccc ggt gtg act ctc aca gac gag gac gtg acc tac ctc atg gac atg720Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met225 230 235 240tgc tcc ttc gac acc gtc gcc cgc acc tcc gac gcc acc aag ctg tcc768Cys Ser Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Lys Leu Ser245 250 255ccc ttc tgt gac ctg ttc acc cat gac gaa tgg atc aac tac gac tac816Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr260 265 270ctc cag tcc ttg aaa aag tat tac ggc cat ggt gca ggt aac ccg ctc864Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu275 280 285ggc ccg gcc cag ggc gtc ggc ttc gct aac gag ctc atc gcc cgt ctg912Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu290 295 300acc cac tcg cct gtc cag gat cac acc agt acc aac cac act ttg gac960Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp305 310 315 320tcg aac ccg gct acc ttt ccg ctc aac gcc act ctc tac gcg gac ttt1 008Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe325 330 335tcg cat gac aac ggc atg atc tcc att ttc ttt gct tta ggt ctg tac1056Ser His Asp Asn Gly Met Ile Ser Ile Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr340 345 350aac ggc act aag ccg cta tct acc acg tcc gtg gag tcc atc gag gag1104Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser Ile Glu Glu355 360 365aca gat gga tac tcg gcc tcc tgg acg gtt ccg ttt gct gcc cgt gcc1152Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala370 375 380tac gtc gag atg atg cag tgt cag gcg gag aag gag ccg ctg gtc cgt1200Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg385 390 395 400gtc ttg gtt aat gat cgc gtt gtc ccg ctg cat ggg tgt ccg gtt gat124 8Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp405 410 415aag ttg ggg aga tgt acc cgg gat gac ttt gtg agg ggg ttg agc ttt1296Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe420 425 430gct aga tcc ggg ggt aac tgg gag gag tgt ttt gct tag1335Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala435 440
2107211444212PRT213從SEQID 6產生的蛋白質4 007Ala Ser Arg Asn Gln Ser Ser Cys Asp Thr Val Asp Gly Gly Tyr Gln1 5 10 15Cys Phe Pro Glu Ile Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Phe Phe20 25 30Ser Leu Ala Asp Glu Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys35 40 45Arg Val Thr Phe Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro50 55 60Thr Asp Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln65 70 75 80Lys Asn Ala Thr Ala Phe Lys Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr85 90 95Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Gln100 105 110Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Arg Arg Tyr Lys Ala Leu Ala115 120 125Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile130 135 140Ala Ser Ala Glu Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Ala Lys Leu Ala145 150 155 160Asp Pro Arg Ala Asn Pro Gly Gln Ala Ser Pro Val Ile Asp Val Ile165 170 175Ile Pro Glu Ala Ala Ser Tyr Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Thr Cys180 185 190Thr Val Phe Glu Glu Ser Glu Leu Gly Asp Asp Val Glu Ala Asn Phe195 200 205Thr Ala Thr Phe Ala Pro Ser Ile Arg Ala Arg Leu Glu Ala His Leu210 215 220
Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Thr Tyr Leu Met Asp Met225 230 235 240Cys Ser Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Thr Lys Leu Ser245 250 255Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Asp Glu TrpIle Asn Tyr Asp Tyr260 265270Leu Gln Ser Leu Lys Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu275 280 285Gly Pro Ala Gln Gly Val Gly Phe Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu290 295 300Thr His Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn His Thr Leu Asp305 310 315 320Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Leu Tyr Ala Asp Phe325 330 335Ser His Asp Asn Gly Met Ile Ser Ile Phe Phe Ala Leu Gly Leu Tyr340 345 350Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Thr Thr Ser Val Glu Ser Ile Glu Glu355 360 365Thr Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Thr Val Pro Phe Ala Ala Arg Ala370 375 380Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Lys Glu Pro Leu Val Arg385 390 395 400Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp405 410 415Lys Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Asp Phe Val Arg Gly Leu Ser Phe420 425 430Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Glu Glu Cys Phe Ala435 440
權利要求
1.一種多肽，當與模型植酸酶比對時，其與該模型植酸酶相比較在至少1個下列的位置上經修飾5，6，13，19，21，29，31，36，39，43，53，69，78，81，85，87，99，112，113，122，125，126，128，137，147，148，157，160，163，165，169，172，176，178，180，181，182，183，189，194，197，201，203，211，213，215，218，222，223，225，232，233，242，246，247，248，249，250，251，252，254，269，291，296，310，312，315，322，330，342，346，362，365，367，368，372，374，375，382，384，395，414，417，425，428，438，440。
2.如權利要求1的多肽，其包含至少一個下列的修飾5QS，6SH，13G，19P，21I，29S，31FY，36D，39A，43D，53V，69S，78EA，81K，85A，87K，99T，112Q，113M，122R，125K，126A，128A，137A，147A，148E，157A，160A，163RG，165N，169A，172V，176I，178P，180AG，181A，182STG，183Y，189H，194VA，197E，201G，203D，211TL，213A，215SA，218A，222A，223H，225P，232E，233D，242SP，246V，247A，248R，249T，250S，251D，252A，254KE，269NQ，291A，296F，310Q，312H，315T，322N，330A，342M，346F，362S，365S，367E，368E，372Y，374A，375S，382A，384A，395K，414PA，417K，425D，428RKE，438N，440AE。
3.如權利要求1的多肽，其包含至少一個下列的修飾5QS，6SH，13G，19P，21I，29S，31Y，36D，39A，43D，53V，69S，78A，81K，85A，87K，99T，112Q，113M，122R，125K，126A，128A，137A，147A，148E，157A，160A，163G，165N，169A，172V，176I，178P，180G，181A，182G，183Y，189H，194A，197E，201G，203D，211L，213A，215A，218A，222A，223H，225P，232E，233D，242P，246V，247A，248R，249T，250S，251D，252A，254E，269Q，291A，296F，310Q，312H，315T，322N，330A，342M，346F，362S，365S，367E，368E，372Y，374A，375S，382A，384A，395K，414A，417K，425D，428E，438N，440E。
4.一種多肽，當與模型植酸酶比對時，其與該模型植酸酶相比較在至少1個下列的位置上經修飾31，78，163，180，182，194，211，215，242，254，269，414，428，440。
5.如權利要求1至4中任一項的多肽，其中該模型植酸酶包含下述的胺基酸Q27，Y28，R58，H59，R62，P64，T65，S67，K68，Y72，D103，S140，R142，V143，E179，D188，F243，KN277，K278，H282，S337，H338，D339，N340，F380，A35，A46，N130，S141，G167，Q168，D174，T191，E199，E205，L220，T235，D244，I268，H306，G341，K356，A381。
6.如前述權利要求中任一項的多肽，其中該模型植酸酶包含下述的胺基酸Q27，Y28，R58，H59，G60，R62，Y63，P64，T65，DE66，S67，K68，K71，Y72，D103，S140，R142，V143，E179，D188，E196，D239，F243，G274，KN277，K278，H282，S337，H338，D339，N340，G341，V378，F380，A35，A46，N130，S141，G167，Q168，D174，T191，E199，E205，L220，T235，D244，I268，H306，G341，K356，A381。
7.如前述權利要求中任一項的多肽，其中該多肽含有至少一個下列的突變31Y，78A，163G，180G，182G，194A，211L，215A，242P，254E，269Q，414A，428E，440E。
8.如前述權利要求任一項的多肽，其中該模型植酸酶具有SEQ IDNO1的胺基酸序列。
9.如權利要求1的多肽，其為SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQIN NO7。
10.一種多肽，其與權利要求9的多肽具有至少91％，優選至少92％，更優選至少93％，更優選至少94％，更優選至少95％，更優選至少96％，更優選至少97％，更優選至少98％或最優選至少99％的序列同源性(相同性)。
11.一種多核苷酸，其包含編碼前述權利要求中任一項的多肽的多核苷酸序列。
12.如權利要求11的多核苷酸，其為DNA。
13.如權利要求11的多核苷酸，其包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
14.一種載體，其包含權利要求11至13項中任一項的多核苷酸序列。
15.如權利要求14的載體，其為表達載體，諸如其中編碼多肽的多核苷酸序列可操作地連接至調控序列的表達載體。
16.一種宿主細胞，其以異源蛋白質形式表達權利要求1至10項中任一項的多肽。
17.一種宿主細胞，其經權利要求11至13中任一項的多核苷酸或權利要求14或15的載體轉化。
18.一種製備權利要求1至10中任一項的多肽的方法，該方法包括在允許表達該多肽的條件下培養權利要求16或17的宿主細胞。
19.一種組合物，其包含權利要求1至10中任一項的多肽。
全文摘要
本發明描述修飾的植酸酶。相較於模型植酸酶，這些植酸酶在多個位置經過修飾，從而尤其使得修飾的植酸酶與模型植酸酶相比熱穩定增加。此外，尤其由於修飾後的植酸酶保留著黑麴黴植酸酶的特定胺基酸殘基，所以修飾的植酸酶仍保有黑麴黴植酸酶的有利性質。
文檔編號C12N15/64GK1656217SQ03812470
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月28日 優先權日2002年5月30日
發明者範德爾 J·M·拉恩, S·C·H·J·蒂爾克 申請人:巴斯福股份公司