抗牙周病菌組合物、含該抗牙周病菌組合物的抗牙周病用食品飲料及口腔用清潔劑的製作方法
2023-10-05 11:09:44 4
專利名稱：抗牙周病菌組合物、含該抗牙周病菌組合物的抗牙周病用食品飲料及口腔用清潔劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有可可豆粗料(cacao mass)中所含的可可組分(cocoa fraction)作為有效成分的抗牙周病菌組合物、含該抗牙周病菌組合物的抗牙周病用食品飲料以及口腔用清潔劑。
背景技術：
牙周炎和牙槽膿溢等牙周病是成人牙齒脫落的主要原因，日本厚生勞動省也從1988年開始致力於牙周病的預防，但其發病率仍逐年上升。例如，35～64歲的日本人約80％被懷疑患有齦炎(牙周病初期)和牙周炎(牙周病後期)，而25～34歲的年輕一代齦炎達到60％左右，進展到牙周炎的患者據說也在10％以上。
此外，根據美國牙周病學會的調查，已查明與健康人相比，牙周病患者發生心肌梗塞的危險約高2.8倍，而在女性，早產的危險約為7.5倍。而且據說易引起肺炎、哮喘、咽炎等呼吸道疾病，血糖的控制變得困難，結果會使糖尿病惡化。
牙周病的主要原因是蓄積在牙周袋的牙垢中的細菌。健康人的牙周袋中通常革蘭氏陽性菌佔有大部分，而隨著牙周病的進展，牙齦卟啉單胞菌(擬桿菌)、具核梭桿菌、伴放線放線桿菌等革蘭氏陰性菌增加。而且從重症成年牙周病人的病灶部位可檢出高比例的革蘭氏陰性菌，特別是牙齦卟啉單胞菌，很多病例患者血清中對該菌的抗體滴度也上升。如果給動物接種牙齦卟啉單胞菌，則會使牙周的炎症惡化，從這些結果可暗示，牙齦卟啉單胞菌對牙周疾病的形成和進展起著重要作用，確實可看作是牙周病的病原菌(牙周病菌)。
作為牙周病症狀的改善方法，可列舉依靠抗炎作用的牙周炎預防或治療，但這些是對症療法，而依靠抗菌作用的預防或治療是最根本的方法。
因此，為改善牙周病的症狀，重要的是抑制牙周袋中牙齦卟啉單胞菌等陰性菌的生長，開發並上市配合有對這些菌有效的各種抗菌物質的牙膏和漱口劑等。
例如，日本專利特開平3-218320號公報(專利文獻1)揭示了抗牙周病及口臭的預防藥，它以茶葉水乃至熱水提取物或乙醇等親水性有機溶劑提取物作為有效成分。
日本專利特開平4-77424號公報(專利文獻2)揭示了抗牙周病藥物，該藥物的特徵是，對牙周病病原菌牙齦擬桿菌(Bacteroides gingivalis)有特異性的生長抑制作用，且對牙齦擬桿菌產生的膠原酶有抑制作用，作為有效成分，其中含有沒食子酸、(+)-兒茶酸、(+)-棓兒茶酸、(-)-表兒茶素、(-)-表棓兒茶酸(epigallocatechin)、(-)-表兒茶素棓酸酯、(-)-表棓兒茶素棓酸酯及它們的二聚體、三聚體等由茶(Cameria sinensis)提取的兒茶酸類。
日本專利特開平6-56687號公報(專利文獻3)揭示了牙垢除去劑及牙石沈著防止劑，它將茶葉水乃至熱水提取物或乙醇等親水性有機溶劑提取物作為有效成分。
日本專利特開平7-238028號公報(專利文獻4)揭示了牙垢形成抑制劑，該製劑的特徵是，含有從用鹼性物質進行過鹼處理的可可豆粗料或由該可可豆粗料榨油得到的可可粉以極性溶劑提取的提取物或其分解物。
日本專利特開平8-81380號公報(專利文獻5)揭示了抗牙周病藥物，它以重均分子量800～10000、聚合度3～30的多酚作為有效成分。
如上述專利文獻1～3、5所揭示的，目前提出了多種以茶的提取物作為有效成分的抗牙周病藥物等，但關於可可豆粗料中所含有的可可組分或其提取物對牙周病菌有抗菌效果尚無報導。例如，上述專利文獻4記載了用鹼性物質進行過鹼處理的可可豆粗料或該可可豆粗料榨油得到的可可粉的提取物或其分解物能抑制作為齲齒原因菌的變異鏈球菌引起的葡聚糖附著沈積於牙齒(牙垢形成)，而對其抗牙周病菌的抗菌效果絲毫沒有記載。
而以前配有抗菌物質的牙膏和漱口劑等，未能得到充分的殺菌效果的情況很多。另一方面，雖然例如四環素等抗生素具有優良的抗菌活性，但由於出現耐藥菌以及副作用等問題，其使用存在限制。此外，抗生素不僅對牙周病菌，對於非病原性的口腔內固有細菌的生長也有抑制作用，所以也存在對口腔內固有菌群的平衡產生不良影響的問題。
所以，牙周病的治療是牙料醫學中極困難的問題之一，至今牙周病尚無有效的預防策略，今後，在老齡化的進程中，牙周疾病的預防將成為重要的問題。
因此，本發明的目的是提供安全而無副作用、對口腔內非病原性的固有細菌的生長不產生影響、而對牙周病菌具有優良的殺菌效果的抗牙周病菌組合物、抗牙周病用食品飲料及口腔用清潔劑。
發明的揭示本發明者為達到上述目的而深入研究後發現，可可能抑制牙齦卟啉單胞菌等牙周病菌的生長，具有優良的抗牙周病菌活性，基於這一事實終於完成了本發明。
即，本發明1是提供抗牙周病菌組合物，該組合物的特徵是，含有可可豆粗料中所含的可可組分作為有效成分。
上述本發明1因為將自古作為巧克力和可可的原料而攝取的可可組分作為有效成分，所以安全而不用擔心副作用，可提供具有優良滅菌效果的抗牙周病菌組合物。而且，可可組分是營養良好的原材料，對螺桿菌也有殺菌效果等(參照日本專利第3110020號公報)，預期同時有營養補充效果和保健作用。
本發明2是提供抗牙周病菌組合物，該組合物的特徵是，含有可可豆粗料中所含的可可組分的熱水提取物作為有效成分。
上述本發明2可提供具有更優良的滅菌效果的抗牙周病菌組合物。而且，可可組分的熱水提取物不含有不溶性成分，因此容易配合用於食品飲料等中。
本發明3是提供抗牙周病菌組合物，該組合物的特徵是，含有來自可可豆粗料中所含的可可組分的多酚作為有效成分。
本發明4是提供抗牙周病菌組合物，該組合物的特徵是，含有來自可可豆粗料中所含的可可組分的游離脂肪酸類作為有效成分。
本發明5是提供抗牙周病菌組合物，該組合物的特徵是，含有來自可可豆粗料中所含的可可組分的多酚及來自可可組分的游離脂肪酸類作為有效成分。
由上述本發明3、4和5提供的抗牙周病菌組合物在具有優良的殺菌效果的同時，使用也方便。
本發明6是提供抗牙周病菌組合物，在上述本發明4或5中，上述游離脂肪酸類含有選自棕櫚酸、硬脂酸、油酸及亞油酸的至少1種。
本發明7是提供抗牙周病菌組合物，在上述本發明1～6的任一項中，上述可可組分為可可及/或可可豆粗料。
本發明8是提供抗牙周病菌組合物，在上述本發明1～7的任一項中，該組合物不會抑制口腔內非病原性固有細菌的生長，對牙周病菌具有抗菌作用。
本發明9是提供抗牙周病菌組合物，在上述本發明1～8的任一項中，上述牙周病菌是屬於卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬或放線桿菌屬的任一屬的菌。
本發明的抗牙周病菌組合物不會抑制口腔內非病原性固有細菌的生長，但能高效率地殺滅從牙周病患者的病灶部位高比例地檢出的牙周病菌。
本發明10是提供抗牙周病用食品飲料，該食品飲料的特徵是，含有上述本發明1～9中任一項所述的上述抗牙周病菌組合物。
本發明11是提供口腔用清潔劑，該清潔劑的特徵是，含有上述本發明1～8中任一項所述的上述抗牙周病菌組合物。
本發明10和11通過含有以來自可可組分的成分為有效成分的抗牙周病菌組合物，可提供能安全、簡便地預防牙周病的抗牙周病用食品飲料和口腔用清潔劑。
附圖的簡單說明
圖1是表示在加有可可全成分的熱水懸浮液的培養基中培養作為牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖2是表示在加有可可全成分的熱水懸浮液的培養基中培養作為牙周病菌的具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum ATCC22586)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖3是表示在加有可可全成分的熱水懸浮液的培養基中培養作為牙周病菌的中間普雷沃氏菌(Prevotella intermedia ATCC25611)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖4是表示在加有可可全成分的熱水懸浮液的培養基中培養作為牙周病菌的伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans ATCC33844)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖5是表示在加有可可組分的熱水提取溶液的培養基中培養作為牙周病菌的變黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens ATCC33563)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖6是表示在加有可可組分的熱水提取溶液的培養基中培養作為牙周病菌的具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum ATCC22586)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖7是表示在加有可可組分的熱水提取溶液的培養基中培養作為非病原性的口腔內固有細菌的咽峽炎鏈球菌(Streptococcus anginosus ATCC333977)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖8是表示在加有可可組分的熱水提取溶液的培養基中培養作為非病原性的口腔內固有細菌的唾液鏈球菌(Streptococcus salivalius ATCC7075)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖9是表示在加有可可組分的熱水提取溶液的培養基中培養作為非病原性的口腔內固有細菌的鏈球菌(Streptococcus sanguinis ATCC10556)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖10是表示在加有可可全成分的熱水懸浮液的培養基中培養作為牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖11是表示在加有可可溶液或從可可溶液提取的多酚部分(50％甲醇提取部分)的培養基中培養作為牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis ATCC33277)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖12是表示在加有上述50％甲醇提取部分的水溶性部分(PVPP處理前部分)或從該組分吸附除去了多酚的部分(PVPP處理後部分)的培養基中，培養作為牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖13是表示在加有上述50％甲醇提取部分(來自可可的多酚)或茶兒茶酸的培養基中培養作為牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalisATCC33277)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖14是表示在加有由可可溶液提取的游離脂肪酸部分(己烷-甲醇提取部分)的培養基中培養作為牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalisATCC33277)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖15是表示在加有可可組分的熱水提取溶液或「FFA組分」的培養基中培養牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)時的活菌數隨時間變化的圖。
圖16是表示在加有可可組分的熱水提取溶液或「FFA組分」的培養基中培養變黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens ATCC33563)時的活菌數隨時間變化的圖。
實施發明的最佳方式本發明中，可可組分是指可可豆粗料除去可可油以後的成分，主要含有蛋白質、糖類、食物纖維(水溶性難消化的多糖類、半纖維素、纖維素、木素等)、磷脂、無機物(磷、鎂、鈣、鐵、鋅、銅、鉀、鈉等)、維生素A、維生素B族、維生素C、維生素E(各種生育酚等)、煙酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、多酚類(丹寧、表兒茶素、兒茶酸、櫟精等)、無水咖啡因、可可鹼、各種游離脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸等)等。
上述可可組分具體來講較好的是使用可可豆粗料榨去可可油所得的可可(可可粉)或者可可豆粗料本身。
可可組分的熱水提取物是上述可可組分用熱水提取所得的可可組分的水溶性部分，含有可可組分所含的上述有機酸類、游離脂肪酸類、維生素、多酚類等水溶性成分。對可可組分的熱水提取物的配製方法沒有特別限制，例如，可在可可粉或可可豆粗料中加適量(通常為可可組分質量的5～100倍量)水、較好是熱水，使其均勻分散，在壓熱器等中加熱處理(通常為40～130℃，1～30分鐘)後，用過濾、離心分離等手段除去不溶性部分而得提取液，可使用提取液本身，必要時也可濃縮然後乾燥後再使用。
來自可可組分的多酚例如可如下配製，即，將可可或可可豆粗料懸浮於水中，然後加等量己烷均勻混合，分離成己烷層和水層後，回收水層，加入與回收的水層等量的50％(v/v)甲醇水溶液，充分混合，回收上清液，除去甲醇就可得到多酚。
來自可可組分的游離脂肪酸類是指上述可可組分所含的各種游離脂肪酸，具體可列舉棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚油酸、肉豆蔻酸、月桂酸等。本發明中較好的是使用含上述各種游離脂肪酸的混合物，更好的是使用含選自棕櫚酸，硬脂酸、油酸和亞油酸的至少1種以上的混合物。對該混合物中的各游離脂肪酸的比例沒有特別限制，較好是根據上述可可組分中所含的全部游離脂肪酸中的各游離脂肪酸的比例決定。具體來說較好的是使用全部游離脂肪酸中各游離酸脂肪酸的比例為棕櫚酸10～50質量％、硬脂酸10～50質量％、油酸10～70質量％、亞油酸1～50質量％、亞麻酸1～10質量％、棕櫚油酸1～10質量％、肉豆蔻酸1～10質量％、月桂酸1～10質量％的混合物。
含上述各游離脂肪酸的混合物可經上述熱水提取、醇提取、己烷提取、丙酮提取等方法，提取上述可可組分所含的各種游離脂肪酸而得到。例如，上述可可組分的熱水提取物中含有上述比例的各游離脂肪酸，可使用該熱水提取物本身，必要時也可從該熱水提取物進一步精製游離脂肪酸類再使用。此外，也可根據上述可可組分中所含的全部游離脂肪酸中各游離脂肪的比例，按規定比例配合各游離脂肪酸而調製。
本發明的抗牙周病菌組合物含有可可組分、可可組分的熱水提取物，來自可可組分的多酚及/或來自可可組分的游離脂肪酸類作為有效成分，可直接將以上調製的可可組分、可可組分的熱水提取物、來自可可組分的多酚及/或來自可可組分的游離脂肪酸類用作抗牙周病菌組合物。而且，必要時可含有著色劑、防腐劑、香精、調味劑、甜味劑、蛋白質(乳蛋白、大豆蛋白等)、維生素類、礦物質類、糖類(糊精等)、有抗牙周病活性的乳酸菌和生藥等。其中從營養學角度出發，較好是含有乳蛋白和維生素類。
本發明的抗牙周病菌組合物在用可可組分作有效成分時，較好是含該可可組分0.01～50質量％，更好是含0.01～10質量％。
在用可可組分的熱水提取物作有效成分時，按固形物折算，較好是含該熱水提取物0.001～20質量％，更好是含0.1～10質量％。
在用來自可可組分的多酚作有效成分時，較好是含該多酚0.0001～10質量％，更好是含0.001～1質量％。
在用來自可可組分的游離脂肪酸類作有效成分時，較好是含該游離脂肪酸類0.0001～1質量％，更好是含0.001～0.2質量％。
在並用來自可可組分的多酚和游離脂肪酸類作有效成分時，較好是含該多酚0.0001～10質量％、含該游離脂肪酸類0.0001～1質量％，更好是含該多酚0.01～1質量％、含該游離脂肪酸類0.001～0.2質量％。
本發明的抗牙周病菌組合物的有效劑量，對成人每天折算成可可組分(可可豆粗料)為1g以上，更好為10g以上。折算成可可組分的熱水提取物(固形物)為0.1～10g，更好為1～10g。折算成來自可可組分的多酚為0.01～1g，更好為0.1～1g。折算成來自可可組分的游離脂肪酸類為0.01～1g，更好為0.1～1g。
本發明的抗牙周病菌組合物如下列實施例所示，對非病原性的口腔內固有細菌的生長無抑制作用，但可高效率地殺滅從牙周病患者的病灶部位高比例地檢出的屬於卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬或放線桿菌的牙周病菌。因此不必擔心對口腔內固有菌群的平衡有不良影響。
屬於卟啉單胞菌屬的牙周病菌，可列舉牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)、不解糖卟啉單胞菌(Porphyromonas asaccharolytca)、牙髓卟啉單胞菌(Porphyromonas endodontalis)等。屬於普雷沃氏菌屬的牙周病菌，可列舉中間普雷沃氏菌(Prerotella intermedia)、變黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens)、產黑素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)等。屬於梭桿菌屬的牙周病菌，可列舉具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)、舟形梭桿菌AA(Fusobacterium naviforme)等。屬於放線桿菌屬的牙周病菌，可列舉伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)等。
另一方面，作為非病原性的口腔內固有細菌，可舉出咽峽炎鏈球菌(Streptococcus anginosus)、唾液鏈球菌(Streptococcus salivalius)、Streptococcussanguinis等。
對本發明的抗牙周病菌組合物的劑型無特別限制，可舉出片劑、丸劑、散劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑等，可配合使用方式進行選擇。
作為固體製劑化的載體，可使用例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、澱粉、高嶺土、結晶纖維素、矽酸等賦形劑，葡萄糖液、澱粉液、明膠溶液、羧甲纖維素、羥丙纖維素等粘合劑，羧甲纖維素鈉、低取代度羧丙纖維素等崩解劑，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯類等表面活性劑，硬脂酸鹽等潤滑劑等。另外，為片劑時可根據需要製成糖衣片、膜包衣片。
為製成溶液劑、乳劑、懸浮劑等形式，可使用稀釋劑例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、多氧化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸類等通常的助溶劑、緩衝劑等，但從與可可組分的熱水提取物的物性平衡的角度考慮，使用丙二醇特別好。
本發明的抗牙周病菌組合物可添加到食品飲料中，例如巧克力、可可飲料等各種飲料(也包括果凍飲料)、口香糖、糖果(硬糖、軟糖)、片狀糕點、各種微波爐食品等。
食品和飲料中的抗牙周病菌組合物的添加量可根據上述有效劑量適當設定，折算成可可組分(可可豆粗料)較好為0.01～50質量％，更好為5～30質量％。折算成可可組分的熱水提取物(固形物)較好為0.1～20質量％，更好是0.2～10質量％。折算成來自可可組分的多酚較好為0.001～5質量％，更好是0.1～3質量％。折算成來自可可組分的游離脂肪酸類較好為0.01～1質量％，更好為0.05～0.5質量％。
本發明的抗牙周病菌組合物可添加到例如牙膏、漱口劑等口腔用清潔劑中。口腔用清潔劑中的抗牙周病菌組合物的添加量也可根據上述有效劑量適當設定，折算成可可組分較好為0.01～10質量％，更好為0.1～5質量％。折算成可可組分的熱水提取物(固形物)較好為0.001～3質量％，更好為0.01～2質量％。折算成來自可可組分的多酚較好為0.0001～10質量％，更好為0.001～1質量％。折算成來自可可組分的游離脂肪酸類較好為0.001～1質量％，更好為0.01～0.5質量％。
實施例以下列舉實施例更詳細地說明本發明。
實施例1可可粉對牙周病菌的抗菌效果的探討將可可粉(商品名「森永純可可」，森永制果株式會社制)懸浮於蒸餾水，使其濃度為30％(w/v)或10％(w/v)，在壓熱器中於121℃處理15分鐘。將這些溶液用作可可全成分的熱水懸浮液，用以下方法進行抗菌活性的測定。
在腦心浸液(BHI，Brain Heart Infusion)培養基(Difco公司制)中添加5％(w/v)酵母提取物(Difco公司制)和0.05％(w/v)的L-半胱氨酸(Sigma公司制)而配製的液體培養基中，分別添加上述可可全成分的熱水懸浮液10％(v/v)，調製培養基，對照培養基系加蒸餾水代替可可全成分的熱水懸浮液所得的BHI培養基。
將作為牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis ATCC33277)或具核梭桿菌(Fusobacterum nucleatum ATCC22486)或中間普雷沃氏菌(Prevotella intermedia ATCC25611)或伴放線放線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans ATCC33844)懸浮於各培養基中，使之達到105CFU/ml左右，在厭氧條件下於37℃進行培養。
培養開始後1、3、6小時，分別自培養液取樣，牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)、中間普雷沃氏菌(ATCC25611)在含有氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊脂平板培養基中，具核梭桿菌(ATCC22486)、伴放線放線桿菌(ATCC33844)在BHI瓊脂平板培養基中，分別接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數。
然後求出1ml培養液中的活菌數，求出對最初的活菌數的比例(％CFU)。圖1顯示牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)的結果，圖2顯示具核梭桿菌(ATCC22486)的結果，圖3顯示中間普雷沃氏菌(ATCC25611)的結果，圖4顯示伴放線放線桿菌(ATCC33844)的結果。
如圖1所示，可知30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的熱水懸浮液添加10％(v/v)的任一場合，隨著培養時間的推移，牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)的活菌數大幅度減少。
如圖2所示，可知30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的熱水懸浮液添加10％(v/v)的任一場合，隨著培養時間的推移，具核梭桿菌(ATCC22486)的活菌數大幅度減少。
如圖3所示，可知30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的熱水懸浮液添加10％(v/v)的任一場合，隨著培養時間的推移，中間普雷沃氏菌(ATCC25611)的活菌數減少，雖然其減少的程度不及牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)和具核梭桿菌(ATCC22486)。
如圖4所示，可知30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的熱水懸浮液添加10％(v/v)的任一場合，隨著培養時間的推移，伴放線放線桿菌(ATCC33844)的活菌數減少，雖然其減少的程度和中間普雷沃氏菌(ATC25611)同樣，不及牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)和具核梭桿菌(ATCC22486)。
由以上結果可知，可可全成分的熱水懸浮液對作為牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)、具核梭桿菌(ATCC22486)、中間普雷沃氏菌(ATCC25611)、伴放線放線桿菌(ATCC33844)具有優良的抗菌活性。
實施例2可可粉熱水提取物對牙周病菌的抗菌效果的探討將可可粉(商品名「森永純可可」，森永制果株式會社制)懸浮於蒸餾水，使其濃度為10％(w/v)，在壓熱器中於121℃處理15分鐘。然後於室溫離心15分鐘(×1000g)，回收上清液。用該上清液作為可可組分的熱水提取溶液(固體成分2～3質量％)，按以下方法進行抗牙周病菌活性的測定。
在BHI培養基(Difco公司制)中添加上述可可組分的熱水提取溶液1％(v/v)或10％(v/v)，調製培養基，對照培養基系加蒸餾水代替可可組分的熱水提取溶液所得的BHI培養基。
將作為牙周病菌的變黑普雷沃氏菌(ATCC33563)或具核梭桿菌(ATCC22586)懸浮於各培養基中，使之達到106～107CFU/ml，在厭氧條件下於37℃進行培養。培養開始後1、3、6小時分別自培養液取樣，在含有氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊脂平板中，接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數。然後求出1ml培養液中的活菌數，得出對最初的活菌數的比例(％CFU)。圖5顯示變黑普雷沃氏菌(ATCC33563)的結果，圖6顯示具核梭桿菌(ATCC22586)的結果。
如圖5所示，可知可可組分的熱水提取溶液添加10％(v/v)的場合，隨著培養時間的推移，變黑普雷沃氏菌(ATCC33563)的活菌數大幅度減少。
如圖6所示，可知可可組分的熱水提取溶液添加1％(v/v)或10％(v/v)的任一場合，隨著培養時間的推移，具核梭桿菌(ATCC22586)的活菌數大幅度減少。
由以上結果可知，可可組分的熱水提取液對作為牙周病菌的變黑普雷沃氏菌(ATCC33563)、具核梭桿菌(ATCC22586)具有優良的抗菌活性。
實施例3可可粉對非病原性口腔內固有細菌的影響的探討和實施例1同樣配製添加有實施例l調製的30％(w/v)可可全成分的熱水懸浮液10％(v/v)的BHI培養基，對照培養基系加蒸餾水代替可可全成分的熱水懸浮液所得的BHI培養基。
將作為非病原性口腔內固有細菌的咽峽炎鏈球菌(ATCC333977)、唾液鏈球菌(ATCC7075)、Streptococcus sanguinis(ATCC10556)懸浮於該培養基中，使之達到約105CFU/ml，在厭氧條件下於37℃進行培養。培養開始後4小時，分別自培養液取樣，在BHI瓊脂平板培養基中分別接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數。然後求出1ml培養液中的活菌數，求出對最初的活菌數的比例(％CFU)。圖7顯示咽峽炎球菌(ATCC33977)的結果，圖8顯示唾液鏈球菌的結果，圖9顯示Streptococcus sanguinis(ATCC10556)的結果。
如圖7所示，可知30％(w/v)的可可全成分的熱水懸浮液添加10％(v/v)的場合，隨著培養時間的推移，咽峽炎鏈球菌(ATCC33977)的活菌數未見減少。
如圖8所示，可知30％(w/v)的可可全成分的熱水懸浮液添加10％(v/v)的場合，隨著培養時間的推移，唾液鏈球菌(ATCC7075)的活菌數未見減少。
如圖9所示，可知30％(w/v)的可可全成分的熱水懸浮液添加10％(v/v)的場合，隨著培養時間的推移，Streptococcus sanguinis(ATCC10556)的活菌數未見減少。
由以上結果可知，可可全成分的熱水懸浮液對作為非病原性的口腔內因有細菌的咽峽炎鏈球菌(ATCC33977)、唾液鏈球菌(ATCC7075)、Streptococcussanguinis(ATCC10556)完全不顯示抗菌活性。
實施例4短時間內可可粉的抗牙周病菌效果的探討和實施例1同樣配製添加有實施例1調製的30％(w/v)可可全成分的熱水懸浮液10％(v/v)的BHI培養基，對照培養基系加水代替可可全成分的熱水懸浮液所得的BHI培養基。
將牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)懸浮於各培養基中，使之達到約105CFU/ml，在厭氧條件下於37℃培養。培養開始後5、10、15、20、30、40、50、60分鐘，分別自培養液取樣，在含有氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊酯平板培養基中分別接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數，然後求出1ml培養液中的活菌數，得出對最初的活菌數的比例(％CFU)。實驗進行2次。其結果以圖10表示。
如圖10所示，可知30％(w/v)可可全成分的熱水懸浮液添加10％(v/v)的場合，牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)在培養10分鐘後的活菌數幾乎不變，但培養15發鍾後活菌數大幅度減少，培養30分鐘後未能檢出活菌。
由以上結果可知，可可全成分的熱水懸浮液對作為牙周病菌的牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)在短時間便能發揮優良的抗菌活性。因而提示即使通常的飲用也可預期對牙周病菌具有充分的抗菌活性。
實施例5可可粉對牙周病菌的臨床分離株的抗菌效果的探討和實施例1同樣配製添加有實施例1調製的30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的熱水懸浮液10％(v/v)的BHI培養基，對照培養基系加水代替可可全成分的熱水懸浮液所得的BHI培養基。
從在鶴見大學附屬醫院接受治療的牙周病患者的病灶用吸水尖(紙尖)採集牙周病菌群，從其中選擇在含氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊脂平板培養基上形成黑色集落的菌株，通過採用PCR法的鑑定(A.Ashimoto，C.Chen，I.Bakker，J.Slots，.Oral Microbiology Immunology.1996 Aug；11(4)266-73)分離出表1所示的5株牙齦卟啉單胞菌臨床分離株(Porphyromonas gingivalis 113H，Porphyromonas gingivalis 823D，Porphyromonas gingivalis 1113C，Porphyromonas gingivalis 1113D，Porphyromonas gingivalis 1433F)。
表1
將各臨床分離株懸浮於上述各培養基中，使之達到約105CFU/ml，在厭氧條件下於37℃培養。培養開始後1、3、6小時，分別自培養液取樣，在含有氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊脂平板培養基中分別接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數。然後求出1ml培養液中的活菌數，得出對最初的活菌數的比例(％CFU)。
其結果是，30％(w/v)或10％(w/v)可可全成分的熱水懸浮液添加10％(v/v)的任一場合中，所有的牙齦卟啉單胞菌的臨床分離株，隨著培養時間的推移，與牙齦卟啉單胞菌典型株(ATCC33277)同樣，活菌數大幅度減少。
由此結果可確認可可粉對牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果的實用性。
實施例6可可粉中的抗菌成分的鑑定-1將可可粉(商品名「Red Cocoa」，森永制果株式會社制)懸浮於蒸餾水，使其濃度為10％(w/v)。以下稱此溶液為「可可溶液」。
在上述可可溶液中加入等量已烷，分離脂肪成分。在除去脂肪成分的殘餘水溶性部分中加入等量的100％甲醇，振蕩10分鐘，離心分離，分出上清液。在該沉澱中加入50％甲醇，振蕩10分鐘，離心分離，分出上清液。該操作重複2次，蒸發所收集的上清，使甲醇完全蒸發後，將其懸浮於蒸餾水，使之相當於10％(w/v)可可粉。該部分以下稱為「50％甲醇提取部分」。據認為這一部分含有可可中的多酚類。
配製上述10％(w/v)可可溶液、上述相當於10％(w/v)可可粉的50％甲醇提取部分的懸浮液添加10％(w/v)而成的BHI培養基。作為對照培養基，配製加水代替可可溶液的BHI培養基。
將牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)懸浮於各培養基，使之達到約105CFU/ml，在厭氧條件下，於37℃進行培養。培養開始後1、3、6小時，分別自培養液取樣，在含有氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊脂平板培養基中分別接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數。然後求出1ml培養液中的活菌數，得出對最初的活菌數的比例(％CFU)。其結果於圖11表示。
如圖11所示，可知10％(w/v)可可溶液、相當於10％(w/v)可可粉的50％甲醇提取部分添加10％(v/v)的任一場合，隨著培養時間的推移，牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)的活菌數大幅度減少。
由以上結果可以認為，可可的抗菌主成分為多酚的可能性很高，所以用吸附多酚類等具有酚基的物質的樹脂PVPP進行了以下實驗。
將用上述方法所得的50％甲醇提取部分離心分離，分離回收水溶性的上清液。將它稱為「PVPP處理前部分」。在此部分中加PVPP，其量為1g/上清液10ml，於37℃振蕩30分鐘，離心分離，將上清液和PVPP分離，回收上清液。將它稱為「PVPP處理後部分」。
配製上述PVPP處理前部分或PVPP處理後部分添加10％(w/v)的BHI培養基，作為對照培養基，配製加水代替PVPP處理前部分的BHI培養基。
將牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)懸浮於各培養基，使之達到約105CFU/ml，在厭氧條件下，於37℃進行培養。培養開始後1、3、6小時，分別自培養液取樣，在含有氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊脂平板培養基中分別接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數。然後求出1ml培養液中的活菌數，得出對最初的活菌數的比例(％CFU)。其結果於圖12表示。
如圖12所示，可知PVPP處理前部分添加10％(v/v)的場合，牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)的活菌數大幅度減少，而除去多酚的PVPP處理後部分添加10％(v/v)的場合，活菌數並未大幅度減少。這與各部分的多酚濃度測定結果也是一致的。由以上結果確認，可可的抗菌主成分是被PVPP吸附的多酚類。
實施例7來自可可的多酚與茶兒茶酸的抗菌效果的比較將含表棓兒茶酸等來自茶的多酚(商品名「Sunphenon」，太陽化學株式會社制)懸浮於蒸餾水，使其濃度為0.05％(w/v)，在壓熱器中於121℃處理15分鐘。該溶液以下稱為「茶兒茶酸溶液」。
測定上述茶兒茶酸溶液以及實施例6的「50％甲醇提取部分」的多酚濃度。調整「50％甲醇提取部分」至相當於1.25％(w/v)可可粉使之與「茶兒茶酸溶液」所含的多酚量(0.313mg/ml)具有相同濃度。
配製分別添加「茶兒茶酸溶液」和經調整的「50％甲醇提取部分」10％(w/v)的BHI培養基。
將牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)懸浮於上述各培養基，使之達到約106CFU/ml，在厭氧條件下於37℃培養。培養開始後1、3、6小時，分別自培養液取樣，在含有氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊脂平板培養基中分別接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數。然後求出1ml培養液中的活菌數，得出對最初的活菌數的比例(％CFU)。其結果於圖13表示。
如圖13所示，添加相當於1.25(w/v)可可粉的「50％甲醇提取部分」10％的場合，培養1小時後牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)的活菌未被檢出，而添加茶兒茶酸溶液10％的場合，減少至0.3％CFU左右。其後隨著培養時間延長，兩樣本活菌數均大幅度減少。
由以上結果提示在比較同量的茶兒茶酸和來自可可的多酚的抗菌效果時，來自可可的多酚具有更高的比活性。
實施例8可可粉中的抗菌成分的鑑定-2用2N鹽酸將10％(w/v)可可溶液的pH調整為2。經此操作，已成鹽而溶於可可溶液中的水分的游離脂肪酸全部轉入油分中。
在上述可可溶液中加等量己烷，於室溫振蕩10分鐘後，離心分離，分出己烷部分。攪拌和離心分離的操作重複3次，蒸發所收集的己烷部分，將己烷完全蒸發後，懸浮於蒸餾水使之相當於10％(w/v)可可粉。再用8N氫氧化鈉使pH恢復原狀。在該部分中加4倍量的100％甲醇，加熱至65℃，同時振蕩15分鐘，然後離心分離，將油層和水層分離。攪拌和離心分離的操作重複2次，蒸發收集的水層，將甲醇完全蒸發後，懸浮於蒸餾水使之相當於10％(w/v)可可粉。以下該部分稱為「已烷-甲醇提取部分」。一般認為這一部分中含有可可中的游離脂肪酸。
配製添加有上述相當於10％(w/v)可可粉的己烷-甲醇提取部分懸浮液10％(w/v)的BHI培養基，作為對照培養基，配製加水代替己烷-甲醇提取部分懸浮液的BHI培養基。
將牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)懸浮於各培養基，使之達到約105CFU/ml，在厭氧條件下，於37℃進行培養。培養開始後1、3、6小時，分別自培養液取樣，在含有氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊脂平板培養基中分別接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數。然後求出1ml培養液中的活菌數，得出對最初的活菌數的比例(％CFU)。其結果於圖14表示。
如圖14所示，可知添加相當於10％(w/v)可可粉的己烷-甲醇提取部分10％(v/v)的場合，隨著培養時間的推移，牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)的活菌數減少。由以上結果可認為可可所含的游離脂肪酸也具有抗菌效果。
實施例9和實施例2同樣，配製可可組分的熱水提取溶液添加10％(v/v)的BHI培養基，作為對照培養基，配製加蒸餾水代替可可組分的熱水提取溶液的BHI培養基。
然後，按表2所示比例配製在精製水中添加游離脂肪酸的游離脂肪酸組合物(以下稱「FFA comp.」)，在BHI培養基中添加FFA comp.10％(v/v)，配製培養基。該FFA comp.是根據質譜等分析所得的純可可中的游離脂肪酸組成、在精製水中添加它的4種主要的游離脂肪酸、人工地再現可可組分中的游離脂肪酸組成的組合物，它和上述可可組分的熱水提取溶液含有等量的各游離脂肪酸。
表2
將牙周病菌(牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)或變黑普雷沃氏菌(ATCC33563))懸浮於這些培養基，使之達到106～107CFU/ml，在厭氧條件下，於37℃進行培養。培養開始後1、3、6小時，分別自培養液取樣，在含有氯高鐵血紅素2-甲萘醌的布魯氏菌血液瓊脂平板培養基中分別接種一定量的分步稀釋的培養液進行培養，對出現的集落進行計數。然後求出1ml培養液中的活菌數，得出對最初的活菌數的比例(％CFU)。圖15表示牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)的結果，圖16表示變黑普雷沃氏菌的結果。
如圖15所示，可知在可可組分的熱水提取溶液添加10％(v/v)的場合，隨著培養時間的推移，牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)的活菌數大幅度減少。此外，在添加FFA comp.的場合，隨著培養時間的推移活菌數也大幅度減少。
如圖16所示，可知可可組分的熱水提取溶液添加10％(v/v)的場合，和圖5所示結果同樣，隨著培養時間的推移，變黑普雷沃氏菌(ATCC33563)的活菌數也減少。此外，可知添加FFA comp.的場合，和對照組相比活菌數減少。
由以上結果可知，可可組分的熱水提取物以及來自可可組分的游離脂肪酸類的有效濃度雖然隨牙周病菌的種類而異，但對於牙齦卟啉單胞菌(ATCC33277)、變黑普雷沃氏菌(ATCC33563)，具核梭桿菌(ATCC22586)均有優良的抗菌活性。
實施例10根據以下表3的配比，製造含有本發明的抗牙周病菌組合物的巧克力。
表3
實施例11根據以下表4的配比，製造含有本發明的抗牙周病菌組合物的口香糖。
表4
實施例12根據以下表5的配比，製造含有本發明的抗牙周病菌組合物的糖果。
表5
實施例13根據以下表6的配比，製造含有本發明的抗牙周病菌組合物的運動飲料。
表6
實施例14根據以下表7的配比，製造含有本發明的抗牙周病菌組合物的蜂王膠飲料。
表7
實施例15根據以下表8的配比，製造含有本發明的抗牙周病菌組合物的微波爐烹調袋裝小豆粥。
表8
實施例16根據以下表9的配比，製造含有本發明的抗牙周病菌組合物的片劑。
表9
實施例17根據以下表10的配比，製造含有本發明的抗牙周病菌組合物的漱口劑。
表10
實施例18根據以下表11的配比，製造含有本發明的抗牙周病菌組合物的牙膏。
表11
工業上利用的可能性如上所述，本發明由於含有可可豆粗料中所含的可可組分、該可可組分的熱水提取物、來自該可可組分的多酚及/或來自該可可組分的游離脂肪酸作為有效成分，所以可提供不會有副作用的安全且具有優良的殺菌效果的抗牙周病菌組合物。該抗牙周病菌組合物在短時間內對可自牙病患者的病灶部位高比例地檢出的屬於卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬或放線桿菌屬的牙周病菌顯示優良的抗菌活性，預期通過抑制這些細菌的增殖對牙周炎和齦炎等牙周病具有預防、治療效果，且不會抑制非病原性的口腔內固有細菌的生長，可改善口腔內固有菌群的平衡。
因此，通過在食品飲料和口腔用清潔劑等中包含該抗牙周病菌組合物，可以提供能安全、方便地預防牙周病的抗牙周病用食品飲料以及口腔用清潔劑。
權利要求
1.抗牙周病菌組合物，其特徵在於，含有可可豆粗料中所含的可可組分作為有效成分。
2.抗牙周病菌組合物，其特徵在於，含有可可豆粗料中所含的可可組分的熱水提取物作為有效成分。
3.抗牙周病菌組合物，其特徵在於，含有來自可可豆粗料中所含的可可組分的多酚作為有效成分。
4.抗牙周病菌組合物，其特徵在於，含有來自可可豆粗料中所含的可可組分的游離脂肪酸類作為有效成分。
5.抗牙周病菌組合物，其特徵在於，含有來自可可豆粗料中所含的可可組分的多酚及來自可可組分的游離脂肪酸類作為有效成分。
6.如權利要求4或5所述的抗牙周病菌組合物，其特徵還在於，上述游離脂肪酸類含有選自棕櫚酸、硬脂酸、油酸及亞油酸的至少1種。
7.如權利要求1～6中任一項所述的抗牙周病菌組合物，其特徵還在於，上述可可組分為可可及/或可可豆粗料。
8.如權利要求1～7中任一項所述的抗牙周病菌組合物，其特徵還在於，該組合物不會抑制口腔內非病原性固有細菌的生長，對牙周病菌具有抗菌作用。
9.如權利要求1～8中任一項所述的抗牙周病菌組合物，其特徵還在於，上述牙周病菌是屬於卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬或放線桿菌屬的任一屬的菌。
10.抗牙周病用食品飲料，其特徵在於，含有權利要求1～9中任一項所述的抗牙周病菌組合物。
11.口腔用清潔劑，其特徵在於，含有權利要求1～9中任一項所述的抗牙周病菌組合物。
全文摘要
本發明提供安全無副作用、對口腔內非病原性固有菌群的生長無影響但對牙周病菌有優良的殺菌效果的抗牙周病菌組合物、抗牙周病用食品飲料以及口腔用清潔劑。該抗牙周病菌組合物中作為有效成分含有可可豆粗料中所含的可可組分、該可可組分的熱水提取物、來自該可可組分的多酚或來自該可可組分的游離脂肪酸類，可以將該抗牙周病菌組合物配合用於食品飲料或口腔用清潔劑。上述可可組分較好是可可及/或可可豆粗料。上述游離脂肪酸類較好的是含有選自棕櫚酸、硬脂酸、油酸及亞油酸的至少1種以上。
文檔編號A23G1/42GK1655807SQ0381195
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月27日 優先權日2002年5月27日
發明者西村榮作, 平尾千波, 大島朋子, 佐藤進, 稻垣宏之, 龜井優德, 加藤正俊, 橋爪秀一, 前田伸子 申請人:森永制果株式會社