黑麴黴菌株及其應用的製作方法
2023-10-04 19:29:19
專利名稱：黑麴黴菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株黑麴黴菌株及其應用，特別涉及一種黑麴黴菌株及其製備酶制 劑中的應用。
背景技術：
酶製劑作為一種安全高效的生物催化劑可以提高畜禽和水產動物的生產性能； 通過消除飼料中的抗營養因子，酶製劑能夠提高飼料原料特別是非常規飼料原料的 利用率，開發新的飼料資源，對緩解飼料資源短缺具有巨大的作用；同時，酶製劑 通過提高營養物質特別是氮和磷的消化利用，可以有效的減少由於飼料中某些營養 成分大量排放造成的養殖業環境汙染。因此，飼料酶製劑一直是近年來國內外動物 營養研究的熱點之一，也是生物技術在飼料工業和養殖業應用最活躍的領域。
因為每一種酶都具有專一性，所以在飼料工業中一般不單獨添加某一種酶制 劑，而是添加複合酶製劑。在發達國家，大多通過單一酶復配的方法製備複合酶制 劑，存在成本高、酶系不全，難以滿足複雜的飼料成分的需要。我國研究和應用較 多的是對單一菌株進行固態發酵來生產複合酶。固態發酵的底物基本上都是農副產 品(主要是麥麩、豆粕等)，廉價易得，底物的誘導效應使得發酵產生的酶系具有 很好的針對性，其在飼料中的實際應用效果往往優於液態發酵生產的酶；發酵所需 要的設備簡單、生產耗能低；後處理簡單，發酵產物無需提取等複雜的後處理即可 直接作為飼料添加劑使用。
發明內容
本發明的目的在於提供一種黑麴黴菌株及其應用。 本發明的黑麴黴菌株，為黑麴黴菌株(A^wg/〃^m'gw) A46。 上述黑麴黴菌株(^^"///ws "/ge" A46，己於2009年06月01日保藏於中國
微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市
朝陽區大屯路)，保藏號為CGMCCM. 3084。
該菌株在察氏培養基上生長迅速，25'C培養7天直徑達40-50毫米，菌落蔓延
迅速，初為白色，後變成淡黃色、淺棕色直至黑褐色厚絨狀，邊緣圓形、整齊；菌
落正面有大量的分生孢子，褐黑色，無滲出液；菌落背面無色或中央略帶黃褐色。本發明提供的黑麴黴菌株的應用是黑麴黴菌株(v4s; ^g^Ms m'ger) A46 CGMCC W2.3084在製備複合酶中的應用，特別是在製備動物飼餵用複合酶中的應用。所述 複合酶中包括木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、澱粉酶和e-甘露聚糖酶。
所述製備複合酶的方法是將黑麴黴菌株A46 CGMCC JVs. 3084進行固體發酵得 到含複合酶的產物。所述製備複合酶的方法是將黑麴黴菌株A46 CGMCC Ns. 3084 的孢子懸浮液接種於固體發酵培養基上於28-32"、 85%相對溼度條件下培養3-4 天，將獲得的發酵產物在40-45"C鼓風乾燥，粉碎，得到發酵產物飼用複合酶。
所述固體發酵培養基含有麥麩75%、玉米芯粉10%、豆粕粉10%、 (NH4) 2S043%、 KH2P04 2%，培養基含水量為50%;所述百分含量為質量百分含量。
所述黑麴黴菌株A46 CGMCC W. 3084的孢子懸浮液的獲得方法為
1) 將黑麴黴菌株A46 CGMCC W2. 3084接種至察氏培養基(蔗糖3.0%、 NaNO30.3%、 K2HPO40.1%、 MgS04'7H20 0.05%、 KC1 0.05%、 FeSO40.001%、瓊脂 2.0%，自然pH，經12rC滅菌30min，所述百分含量(％)為質量百分含量)或馬 鈴薯葡萄糖培養基培養基(PDA)上，28-3(TC培養4天獲得一級種子；
2) 將一級種子接種至三角瓶固體培養基(培養基含有麥麩75%、玉米芯粉10%、 豆粕粉10%、 (NH4) 2S 043%、 KH2P042%，培養基含水量為50%;所述百分含量為質量 百分含量)，28-3(TC培養3-4天至形成大量黑褐色孢子，加入無菌水浸泡、充分振 蕩製成黑麴黴菌株A46 CGMCC >f2. 3084孢子懸浮液。
本發明還提供一種動物飼餵用複合酶製劑，其活性成分為黑麴黴菌株A46 CGMCC N2. 3084的發酵產物。
本發明的黑麴黴菌株A46 CGMCC Ws. 3084可以同時高產木聚糖酶、纖維素酶、 果膠酶、澱粉酶、P-甘露聚糖酶等，從而形成一種針對飼料原料的多酶複合體系， 即可生產飼用複合酶)，且該複合酶中的各種酶活最適pH在4 6之間，適應動 物胃腸道的需要。這種飼用複合酶可以廣泛應用在畜禽飼料中，能夠降低抗營養因 子，提高消化率，具有良好的經濟效益，同時也有利於保護生態環境，推動畜牧業 的健康發展。
本發明黑麴黴菌株A46 CGMCC 3084可採用固體發酵生產高效廉價的飼用 複合酶製劑，該流程中涉及一級種子培養、二級種子培養、固態發酵及簡單的後處 理。所用固態發酵培養基原料來源廣泛成本低，工藝簡單；具有生產成本低、產品 酶系全且活力高的特點。本發明菌株是黑麴黴誘變篩選得到，黑麴黴為國家衛生部和FDA公布的食品 安全菌株，不存在安全性問題，因此，本發明黑麴黴菌株A46CGMCCW.3084用 於製備飼用複合酶安全可靠。
具體實施例方式
下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。 下述實施例中，所述百分含量如無特殊說明，均為質量百分含量。 實施例l、高產詞用複合酶的黑麴黴菌株A46菌株的獲得及其功能驗證 一、高產詞用複合酶的黑麴黴菌株A46菌株的獲得
1、 菌株誘變
將黑麴黴菌株(^y/7erg/〃^mgw) CGMCC 3.316 (購自中國微生物菌種保藏 管委理員會普通微生物中心)接種於馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)斜面上，28"C培 養3 4天至孢子成熟，將長好的孢子用適量無菌生理鹽水洗下，移入加有玻璃珠 的三角瓶中，28t:搖床振蕩4 5h，以打散孢子並使之活化。用四層無菌擦鏡紙過 濾除去菌絲片段，將孢子濾液用適量的生理鹽水稀釋，用血球計數板鏡檢查孢子濃 度，用生理鹽水調節孢子濃度為106 107個/1111，得到最終誘變用的孢子懸液。取 10ml孢子懸液加入直徑9cm的培養皿中，用黑紙覆蓋。
調節紫外燈與培養皿距離20cm，開啟紫外燈(20W)預熱30min。預熱完成後 向培養皿中加入磁力攪拌子，開始攪拌的同時打開培養皿蓋，紫外燈照射30sec後 停止照射，在紅光燈下將誘變處理的孢子懸液收集到50ml誘導培養基中，培養基 盛放在黑紙包裹的250ml三角瓶中。28°C、 170rpm震蕩培養。每間隔4 5h，用四 層無菌擦鏡紙過濾去除已萌發的菌絲，然後繼續培養。如此反覆3 4次之後將濾 液離心收集孢子，用少量生理鹽水重懸，塗布於含有PDA培養基平板上，28t:避 光培養3 4天。
用無菌牙籤挑取在平板上長勢良好的菌落，接種到PDA斜面上，分別給每個 菌株編號，置28"C培養3 4天，4"C保存備用。
2、 誘變菌株篩選
將以上獲得的變異菌株進行三角瓶產酶發酵試驗，測定產酶能力，以木聚糖酶 產量為主要檢測指標。培養基配比(乾物質計算)麥麩75%(質量含量)、玉米芯 粉10%(質量含量)、豆粕粉10%(質量含量)、(NH4) 28043%(質量含量)、KH2P04
52%(質量含量)，培養基含水量50%(質量含量)，自然pH。培養基分裝在250ml三角 瓶中，裝料量30g/瓶。在12rC滅菌30min，冷卻後接種斜面菌種孢子液lmL，充 分混合均勻，於28"C培養4天。
發酵結束後，將培養物置於培養皿中4(TC鼓風條件下烘乾5-6小時，粉碎，取 0.5克溶於20mL水中，室溫140rpm震蕩1小時，4t冰箱靜置3小時，4層紗布過 濾，濾液4。C 5000rpm離心IO分鐘，所得上清即為粗酶液，用於酶活力測定。測定 酶活力包括木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、P-甘露聚糖酶，以木聚糖酶 產量為主要檢測指標進行篩選，獲得高產黑麴黴(A^wg///Mm'ger)菌株，將其命 名為A46。
酶活測定方法為
1) 酶活力定義
木聚糖酶活力在4(TC和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為20mg/ml的木聚糖 溶液中水解釋放lpmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。
纖維素酶活力在4(TC和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為10mg/ml的羧甲基 纖維素鈉溶液中水解釋放lpmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。
果膠酶活力在4(TC和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為10mg/ml的果膠溶液 中水解釋放llimol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。
澱粉酶活力在40"C和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為20mg/ml的可溶性澱 粉溶液中水解釋放lpmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。
(3-甘露聚糖酶活力在4(TC和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的刺槐 豆膠溶液中水解釋放相當於lpmol甘露糖的還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位 (U)。
2) 酶活力測定方法
取0.5克步驟2獲得的發酵產物飼用複合酶溶於20mL水中，室溫140rpm震蕩 1小時，4'C冰箱靜置3小時，4層紗布過濾，濾液4°C 5000rpm離心10分鐘，所得
上清即為飼用複合酶粗酶液。測定酶活時用蒸餾水進行粗酶液適當稀釋。取四支具 塞試管，分別在三支(三個重複)中加入O. lml稀釋的飼用複合酶液粗酶液，第四 支試管中加入0. lml經煮沸5min的滅活酶液作為對照，與用pH5. 5的0. 2mo1/1乙 酸-乙酸鈉緩衝液配製的底物(具體底物和底物濃度見步驟1)所述的各種酶活力定 義)一起於40。C水浴中預熱5min;在各試管中加入0. lml底物，4(TC精確反應30min，
6反應完成後在四支試管中加入0.6ralDNS試劑，搖勻，煮沸10min滅活顯色，迅速 冷卻到室溫，用水定容到5.0ml，在550nm波長下測定吸光度。調整飼用複合酶粗 酶液的稀釋倍數(用蒸餾水稀釋)，使測定的吸光度數值在標準曲線測定範圍之內。
上述黑麴黴(^^erg/〃M A46菌株，己於2009年06月01日保藏於中國
微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市 朝陽區大屯路)，保藏號為CGMCC処.3084。
3、黑麴黴菌株A46的培養學特性
將黑麴黴菌株A46接種到察氏培養基(蔗糖3.0%、 NaNO30.3%、 K2HPO40.1%、 MgS04'7H20 0.05%、 KC1 0.05%、 FeSO40.001o/o、瓊月旨2.0%，經121。C滅菌30min，
"%"表示質量百分含量)上觀察其培養學特性，結果表明黑麴黴菌株A46菌落在 察氏培養基上生長迅速，25'C培養7天直徑達40-50毫米，菌落蔓延迅速，初為白 色，後變成淡黃色、淺棕色直至黑褐色厚絨狀，邊緣圓形、整齊；菌落正面有大量 的分生孢子，褐黑色，無滲出液；菌落背面無色或中央略帶黃褐色。
二、 黑麴黴A46菌株的產酶特性
按照上述步驟2 "酶活力測定方法"進行發酵產物酶活力測定，該菌種一次發 酵可同時產生木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、P-甘露聚糖酶等多種酶， 並且所產酶活性較高。
以木聚糖酶活力為研究對象，檢測了該酶活的適宜反應條件，其適宜反用溫度 範圍為40-55°C，最適反應溫度為5(TC，低於35^或高於6(TC酶活力迅速下降； 適宜作用pH為3.5-5.5，最適反應pH為4-4.5。綜合以上情況，木聚糖酶的適宜 反應溫度40-55°C，適宜反應pH範圍pH3.5-5.5，與動物消化道環境基本吻合，適 合作為詞料添加劑使用。
三、 黑麴黴A46菌株在製備飼用複合酶中的應用及其效果驗證 1、固體發酵黑麴黴A46菌株製備飼用複合酶
將黑麴黴A46菌株以麥麩為主要原料發酵生產木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、
澱粉酶、(3-甘露聚糖酶等詞用複合酶的固體發酵方法為
1) 一級種子的獲得從原始PDA斜面保存黑麴黴A46菌株菌種接種至察氏培 養基(蔗糖3.0%、 NaNO30.3%、 K2HPO40.1%、 MgS04'7H20 0.05%、 KC10.05%、 FeSO40.001%、瓊月旨2.0%，經121。C滅菌30min， "％"表示質量百分含量)上，28-3(TC培養4天獲得一級種子；
2) 二級種子的獲得上述獲得的一級種子接種至250mL三角瓶固體培養基(培 養基含有麥麩75%、玉米芯粉10%、豆粕粉10%、 (NHJ 2S043%、 KH2P042%，培養基含水量 為50%;所述百分含量為質量百分含量)，28-3(TC培養3-4天至形成大量黑褐色孢子， 加入無菌水浸泡、充分振蕩製成孢子懸浮液，用於生產接種；
3) 固體發酵發酵培養基為麥麩75%、玉米芯粉10%、豆粕粉10%、 (NH4) 2S043%、 KH2P042%，加水100%，自然pH， 12KC滅菌40-60min，冷卻後接入 0.1%-0.2%的孢子懸浮液(按重量比計算)，於28-30°C、 85%相對溼度條件下培養 3-4天；
4) 後處理將以上3)獲得的固體發酵物在40-45。C鼓風乾燥，粉碎，得到發 酵產物飼用複合酶。
2、黑麴黴A46產飼用複合酶活力測定
1) 酶活力定義
木聚糖酶活力在4(TC和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為20mg/ml的木聚糖 溶液中水解釋放lpmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。
纖維素酶活力在4(TC和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為10mg/ml的羧甲基 纖維素鈉溶液中水解釋放lpmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。
果膠酶活力在40'C和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為10mg/ml的果膠溶液 中水解釋放l)Limol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。
澱粉酶活力在4(TC和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為20mg/ml的可溶性澱 粉溶液中水解釋放lnmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。
P-甘露聚糖酶活力在4(TC和pH5.5條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的刺槐 豆膠溶液中水解釋放相當於ljiimol甘露糖的還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位 (U)。
2) 酶活力測定方法
取0.5克步驟1的步驟4)獲得的發酵產物飼用複合酶溶於20mL水中，室溫 140rpm震蕩l小時，4"C冰箱靜置3小時，4層紗布過濾，濾液4°C 5000rpm離心 IO分鐘，所得上清即為飼用複合酶粗酶液。測定酶活時用蒸餾水進行粗酶液適當稀 釋。取四支具塞試管，分別在三支(三個重複)中加入O. lml稀釋的飼用複合酶粗 酶液，第四支試管中加入O. lml經煮沸5min的滅活酶液作為對照，與用PH5. 5的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩衝液配製的底物(具體底物和底物濃度見步驟l)所述的 各種酶活力定義) 一起於4(TC水浴中預熱5min;在各試管中加入0. lml底物，40°C 精確反應30min，反應完成後在四支試管中加入0.6mlDNS試劑，搖勻，煮沸lOrnin 滅活顯色，迅速冷卻到室溫，用水定容到5.0ml，在550nm波長下測定吸光度。調 整飼用複合酶粗酶液的稀釋倍數(用蒸餾水稀釋)，使測定的吸光度數值在標準曲 線測定範圍之內。 (3)酶活力測定結果 採用本發明所提供的黑麴黴A46菌株進行固體發酵獲得的飼用複合酶含有多 種酶活力，在以上測試條件下，每克步驟l獲得的飼用複合酶(千重)中木聚糖酶 活力可達4473U、纖維素酶活力達到2703U、果膠酶活力達到268U、澱粉酶活力達 到516U、 e-甘露聚糖酶活力達到887U。
權利要求
1、黑麴黴(Aspergillus niger)A46 CGMCC №.3084。
2、 黑麴黴A46CGMCCW2. 3084在製備複合酶中的應用。
3、 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述複合酶為飼用複合酶。
4、 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述複合酶中包括木聚糖酶、纖 維素酶、果膠酶、澱粉酶和P-甘露聚糖酶。
5、 根據權利要求2-4中任意一項所述的應用，其特徵在於所述製備複合酶的 方法是將黑麴黴A46 CGMCC W. 3084進行固體發酵得到含複合酶的產物。
6、 根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述製備複合酶的方法是將黑曲 黴菌株A46 CGMCC Na. 3084的孢子懸浮液接種於固體發酵培養基上於28-32°C、 85% 相對溼度條件下培養3-4天，將獲得的發酵產物在40-45i:鼓風乾燥，粉碎，得到發 酵產物飼用複合酶。
7、 根據權利要求5所示的應用，其特徵在於所述固體發酵培養基含有麥麩75%、 玉米芯粉10%、豆粕粉10%、 (NH4) 2S043%、 K,2%，含水量為50%，所述百分含量 為質量百分含量。
8、 一種動物飼餵用複合酶製劑，其活性成分為黑麴黴A46 CGMCC JSf2. 3084的發 酵產物。
全文摘要
本發明公開了一種黑麴黴菌株及其應用。具體該黑麴黴菌株，為黑麴黴A46CGMCC №.3084。該菌株可以同時高產木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、β-甘露聚糖酶等，可生產動物飼餵用複合酶，該複合酶中的各種酶活最適pH在4～6之間，適應動物胃腸道的需要。這種飼用複合酶可以廣泛應用在畜禽飼料中，能夠降低抗營養因子，提高消化率，具有良好的經濟效益，同時也有利於保護生態環境，推動畜牧業的健康發展。
文檔編號C12N1/14GK101591619SQ20091008856
公開日2009年12月2日 申請日期2009年7月3日 優先權日2009年7月3日
發明者丁宏標, 宇 喬, 張鐵濤, 王海燕, 高秀華 申請人:中國農業科學院飼料研究所