治療性肽治療和預防癌症的用途的製作方法

2023-10-05 00:33:49 2

專利名稱：治療性肽治療和預防癌症的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及癌症治療法和預防法領域。特別地，本發明涉及抑制、延緩和減低癌症 開始、生長和侵襲的危險的方法。
背景技術：
MUCl (DF3、CD227、上皮唾液蛋白、PEM)是> 300kDa的重度0-糖基化異二聚體蛋 白質，通常大量表達於腺上皮的頂端表面。在大於90%的人乳腺癌和轉移中，頂點的定位 消失，MUCl過表達(大於10倍)並糖基化不足(underglycosylated) (1,2)。除了在白血 病、骨髓瘤和淋巴瘤中高表達，MUCl的失調表達被發現在許多其它類型的腺癌以及癌症中， 包括肺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌(3-5)。在遺傳小鼠模型和細胞系模型中的研究都已 證明MUCl是癌基因。迫使MUCl (人類)在小鼠乳腺過表達的轉基因小鼠模型(MMTV-MUC1) 導致乳腺癌的發展並伴隨乳腺通過凋亡進行完全的哺乳後復原的失敗(6)。將MUCl轉染 到3Y1成纖維細胞引起它們的轉化，將MUCl轉染到結腸癌細胞表明MUCl過表達抑制藥物 誘導的凋亡(7)。MUCl的胞質域含有多種蛋白質相互作用位點，儘管這些相互作用在正常乳腺的極 化上皮細胞中大量地未成形，因為MUCl的結合配偶體被典型地發現在基底外側膜上((8) 和(9、10)中評論的)。在癌症的演進過程中，當細胞極化喪失時，MUCl過表達並與src、 GSK3i3、表皮生長因子受體(EGFR)和β -聯蛋白等功能性相互作用(9、11、12)。MUCl和 這些蛋白之間相互作用的位點已被作圖以獲得MUCl的72個胺基酸胞漿尾內的獨特結 構域(11、13-15)。EGFR和src能在YEKV基序上磷酸化MUC1，並且這種磷酸化導致通過 SAGNGGSSLS結構域MUCl與β -聯蛋白的結合增加(11)。最近的證據表明MUCl與EGFR之 間的相互作用能顯著地調節EGFR生物學並影響EGFR依賴的轉化{Pochampal 1 i，2007#537 ； Pochampalli，2007#527}。酪氨酸激酶的表皮生長因子受體(EGFR)家族在癌症中經常失調，並通常在侵襲 性癌中被擴增和/或過表達[(16)所評述的]。該家族由4個同源的1型酪氨酸激酶受 體(包括EGFR、her2/neu/erbB2、erbB3和erbB4)和多個相關的配體[包括表皮生長因子 (EGF)和轉化生長因子α (TGFa)等]構成。配體誘導的受體同源或異源二聚化導致酪氨 酸激酶活化和胞質域中的酪氨酸殘基的轉磷酸作用。這引起許多種效應物蛋白——包括 Src、PI 3-激酶、She、PLC γ、STATs、Grb2和cbl——的募集，導致增殖、遷移、凋亡的抑制、 分化或內吞受體的降解(17-20)。在過表達MUCl的人乳腺癌細胞系和轉基因小鼠(MMTV-MUC1)中已經確定，MUCl和 EGFR生物化學地相互作用，從而導致在哺乳過程中EGF依賴的p42/44ERK活化的增強(11、 21)。最近，我們的實驗室已證明MUCl表達抑制EGFR的配體介導的泛素化和降解同時增強 其內化和再循環(Pochampalli et al 2007)。為了評價Mucl在轉化中的作用，我們進一步 在Mucl無效的背景上產生了 WAP-TGF α小鼠，其揭示了 Mucl表達對乳腺的TGF α依賴的轉化、促進開始和進展具有主導的影響(Pochampalli et al 2007b)。儘管現在已確定EGFR被MUCl表達有效地調節，在EGFR和MUCl信號傳導中，轉 基因小鼠模型也已牽涉細胞粘著蛋白β-聯蛋白。在WAP-TGFa轉基因模型的研究中， Wntl和Wnt3被發現在大多數侵襲性乳腺腫瘤中被選擇性地活化(22)。Wnt是分泌的糖蛋 白，它結合跨膜捲曲受體，導致信號級聯放大，這使β _聯蛋白降解的機制失活並導致轉化 (23-28)。此外，在MMTV-Wntl轉基因小鼠中，EGFR被發現以腫瘤特異性方式與β-聯蛋白 相互作用並將之磷酸化(Schroeder et al 2002)。這些研究證明β-聯蛋白和EGFR能影 響它們各自的通路來促進轉化。最後，MUCl在聯蛋白依賴的轉化中也被牽涉，表明這 三種蛋白具有協同促進癌症進展的能力。在雜交到Mucl無效背景上的MMTV-Wnt-I轉基因 小鼠中，Mucl的丟失對應腫瘤進展的顯著減少(Schroeder et al，2003)。此外，MUCl和 β-聯蛋白之間的相互作用被發現在來自人轉移性乳腺腫瘤的樣品中高度地增加，表明這 些相互作用是臨床上相關的(Schroeder et al，2003)。這些研究共同證明MUC1、EGFR和β -聯蛋白在轉化過程中相互影響的強大潛力， 包括在轉化和轉移過程中它們顯著的共同上調。MUCl能抑制EGFR的下調並促進EGFR和 β -聯蛋白的轉化能力，並且遺傳上衍生的小鼠模型在EGFR和β -聯蛋白依賴的轉化和轉 移中牽涉MUC1。有趣的是，MUCl上EGFR和β -聯蛋白的相互作用位點串聯地位於MUCl胞 質域上。對於發展在預防和治療癌症中有效的治療，本領域存在持續的需求。 發明概要根據一方面，具有A-B-C或C-B-A結構的融合肽被給予具有鑑定的高癌症危 險的人。癌症開始的概率因此被減小。A是增強附著的大分子跨細胞膜轉運的蛋白轉 導結構域。B是0-5個胺基酸殘基的間隔區。C是6-15個胺基酸殘基的多肽。C包含 PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ ID NO 1)的全部或部分。C 的部分包含 GGSSLS(SEQ IDNO 2)。可 選地，所述6-15個胺基酸殘基的至少一個被保守地替換，這樣無電荷極性胺基酸置換無電 荷極性胺基酸，或非極性胺基酸置換非極性胺基酸殘基，或酸性胺基酸置換酸性胺基酸，或 其中所述6-15個胺基酸殘基的一個用A殘基替換。根據另一個方面，具有A-B-C或C-B-A結構的融合肽和EGFR抑制劑被給予已切除 腫瘤的人。腫瘤復發或轉移的概率因此被減小。A是增強附著的大分子跨細胞膜轉運的蛋 白轉導結構域。B是0-5個胺基酸殘基的間隔區。C是6-15個胺基酸殘基的多肽。C包含 PYEKVSAGNGGSSLS (SEQ ID NO 1)的全部或部分。C 的部分包含 GGSSLS (SEQ ID NO :2)。可 選地，所述6-15個胺基酸殘基的至少一個被保守地替換，這樣無電荷極性胺基酸置換無電 荷極性胺基酸，或非極性胺基酸置換非極性胺基酸殘基，或酸性胺基酸置換酸性胺基酸，或 其中所述6-15個胺基酸殘基的一個用A殘基替換。根據另一個方面，具有A-B-C或C-B-A結構的融合肽被給予結腸或皮膚癌患者。 癌症的侵襲力或生長因此被減小或延緩。A是增強附著的大分子跨細胞膜轉運的蛋白轉 導結構域。B是0-5個胺基酸殘基的間隔區。C是6-15個胺基酸殘基的多肽。C包含 PYEKVSAGNGGSSLS (SEQ ID NO 1)的全部或部分。C 的部分包含 GGSSLS (SEQID NO :2)。可 選地，所述6-15個胺基酸殘基的至少一個被保守地替換，這樣無電荷極性胺基酸置換無電荷極性胺基酸，或非極性胺基酸置換非極性胺基酸殘基，或酸性胺基酸置換酸性胺基酸，或 其中所述6-15個胺基酸殘基的一個用A殘基替換。閱讀說明書後，這些和其它方面對本領域的技術人員來說將是清楚可見的，它們 為本領域提供治療或預防癌症的新方法。附圖簡述

圖1A-1F。MUCl模擬肽(PMIP)能有效地進入細胞，促進EGFR降解並抑制MUCl和 β-聯蛋白的相互作用。圖1Α)人MUCl的胞質胺基酸序列(MUC1CT ； SEQ ID Ν0:15)，其包 含EGFR/src磷酸化位點(下劃線=SEQ ID NO 15，殘基46-49)和β-聯蛋白結合位點(雙 下劃線SEQ ID NO: 15，殘基50-59)。PTD4蛋白轉導結構域(SEQ IDNO 16)允許細胞攝取 PMIP模擬Jj太(人PMIP(hPMIP ;SEQ ID NO :17)和小鼠PMIP(msPMIP ;SEQ ID N0:18)。綠盒子 突出MUCl模擬的胺基酸序列。圖IB)用10 μ M生物素-hPMIP處理BT-20乳腺癌細胞4小 時顯示hPMIP有效的細胞攝取和保留(綠色=生物素-PMIP，藍色=DAPI (細胞核)，400 X 和630X)。圖lC)BT-20乳腺癌細胞用hPMIP(lOyM)或PTD4(10yM)處理18小時。細 胞用EGF(30' EGF, 10ng/ml)處理或不處理(-S，無血清)，產生蛋白裂解物並在SDS-PAGE 上分離。對裂解物就EGFR (1005)和β-肌動蛋白(AC-15)進行免疫印跡(IB)。圖ID-F MDA-MB-468 細胞用 EGF (10ng/ml)以及或者(圖 ID) hPMIP (10 μ M)、(圖 IE) PTD4 (10 μ Μ)或 者(圖1F)PBS處理過夜。細胞被固定，探測MUCl (Texas Red)和β-聯蛋白(FITC)，並在 共聚焦顯微鏡上檢查(400Χ)。使用Image Pro Plus進行共定位(箭頭)分析，並用白色 像素指定。圖2A-2C。PMIP抑制體外乳腺癌細胞的細胞增殖和侵襲。圖2A)BT20細胞在96 孔盤中(IO4細胞/孔)培養並用在RPMI 1640/1 % FBS中的hPMIP (10 μ M)或PTD4 (10 μ Μ) 每天處理，持續6天。處理完成之後，進行MTT測定法來定量細胞數，ρ < 0.0001)。誤 差條代表標準誤差。圖2B)MDA-MB-231和圖2C)BT20細胞系用hPMIP(50 μ Μ)、PTD4(50 μ Μ) 或PBS處理過夜，用Calcein AM標記，允許通過Transwell (8. 0 μ Μ)插入物侵入到I型膠 原凝膠，被侵入的細胞通過螢光測量。(AN0VA，*p < 0. 0001廣ρ < 0. 0001, #p = 0. 007, ##p =0. 007)。誤差條代表標準偏差。圖3A-3E。PMIP顯著地抑制體內腫瘤生長和復發。圖3A)基質膠(Matrigel)中 的MDA-MB-231細胞被注射進scid小鼠的乳腺脂肪墊中，當腫瘤達到IOOmm3時，每天的肽 治療(hPMIP或PTD4，50 μ g/g體重)開始(PTD4和hPMIP η = 8)，並且評價原發腫瘤生長 (*，ρ = 0. 028)。圖3Β)治療結束之後，測量腫瘤發展到IOOOmm3需要的時間量(AN0VA, **， ρ = 0. 03)。圖3C切除之後，觀察小鼠在原發位點或繼髮乳腺的腫瘤再生長(PTD4n = 8和 hPMIP η = 7)。圖3D)基質膠中的MDA-MB-231細胞被注射進scid小鼠的乳腺脂肪墊中， 當腫瘤達到500mm3時，每天的肽治療(hPMIP或PTD4, 50 μ g/g)開始(PTD4n = 4和hPMIP η = 6),並且評價原發腫瘤生長Γ，ρ = 0. 028)。圖3Ε)治療21天之後腫瘤被立即切除，監 測在原發位點的腫瘤再生長和傳播到繼髮乳腺(PTD4n = 4和hPMIP η = 4)。誤差條代表 標準誤差。圖4A-4D。PMIP顯著地減慢MMTV-pyV mT誘導的乳腺腫瘤的進展。圖4A)MMTV_pyV mT轉基因小鼠被注射以FITC-msPMIP(50 μ g/g體重)，四小時之後被處死，使用螢光顯微 鏡顯現各種組織。FITC-msPMIP在小鼠乳腺腫瘤中的定位被顯示(2.5X和8X)。圖4B)
6允許乳腺腫瘤(直徑> 0. 5cm)發展，小鼠每天注射msPMIP (7隻小鼠)或PTD4 (6隻小鼠) (50 μ g/g體重，21天治療，腹膜內(i. p.)注射，IX每天)。在治療結束時，動物被處死，腫 瘤製成的蛋白裂解物用於後來的分析。在治療期間，msPMIP處理小鼠所有腫瘤位點(msPMIP η = 70, PTD4n = 60)的腫瘤總生長顯著低於PTD4小鼠(193.8% 士 77. 7 %對589. 5 % 士283. 6%,*AN0VA ρ = 0. 039)。圖4C)msPMIP處理小鼠的乳腺腫瘤以較PTD4處理腫瘤顯 著低的速率生長(ANOVA p = 0. 0076)。圖4D)msPMIP或PTD4處理轉基因小鼠的腫瘤大小 分布顯示，與27% (70個可能腫瘤位點中的19個)的msPMIP處理腫瘤相比，47% (60個可 能腫瘤位點中的28個)的PTD4處理腫瘤大於100mm3。上面數據的數目是滿足超過總潛在 腫瘤位點的大小標準的腫瘤數目。圖5A-5B。MMTV-pyV mT腫瘤對msPMIP具有差示反應。圖5A)來自圖3中描述的 動物的每個腫瘤位點的單獨的生長(每一條是來自一隻小鼠的乳腺脂肪墊/腫瘤位點)每 天用msPMIP (深灰色)或PTD4(淺灰色)以50 μ g/g體重處理，持續21天。在21天的治 療過程中，每3天觀察腫瘤進展(PTD4，n = 60，PMIP，n = 70)。在4個實例中(*)，msPMIP 處理腫瘤完全消退，然而對照(PTD4)處理腫瘤沒有一個消退。MFP=乳腺脂肪墊。圖5B) 來自msPMIP(l，左2圖)和PTD4(2，右2圖)處理小鼠的腫瘤被切除(3μπι)，接下來被用於 蘇木素_伊紅染色和分裂的caspase-3免疫組織化學術(200X)。圖6A-6B。PMIP與減少的Mucl表達相關聯。圖6A)代表性的MMTV-pyV mTmsPMIP (P)處理小鼠和PTD4小鼠(C)在處死前30分鐘每隻被注射表皮生長因子 (1 μ g/g體重)和肽。處死之後，腫瘤被收集，產生蛋白裂解物。對於磷酸酪氨酸(PY99)、 EGFR (1005), Mucl (CT2)和 β-肌動蛋白(AC-15)的表達，蛋白(50 μ g)通過 SDS-PAGE 分 離、轉移和免疫印跡。圖6B)來自MDA-MD-231異種移植物腫瘤(未用EGF處理；圖2中描 述的)的裂解物被相似地分析以確定EGFR和MUCl蛋白表達的水平。Mucl的相對蛋白水平 通過光密度測定法測量並繪圖(Mucl/β-肌動蛋白，ANOVAZp = 0.014)。分子量被顯示在 右側。IB=免疫印跡。通過印跡的白線表示相同的凝膠和暴露，但是不連續的。發明詳述支持本發明的發現是MUCl模擬肽在系統給藥後選擇性地保留在乳腺腫瘤、結腸 和皮膚中。而且，MUCl模擬肽減少腫瘤開始。此外，MUCl模擬肽能與其它抗EGFR治療結合 用於在輔助的環境中，即手術後。任何蛋白轉導結構域(PTD)能被用在融合蛋白中。這些包括先前已被鑑定 並用於蛋白轉導的任何結構域。參見例如Dietz and Bahr, Molecular and Cellular Neuroscience, 27 (2004) 85-131的廣泛表1，該文獻被清楚地併入本文。某些這樣的結構域 被顯示在SEQ ID NO :3、4、5和6中，但是熟練的技術人員不受限於這些使用。可以使用包 括合成的PTDs在內的其它PTDs。這些結構域促進細胞攝取附著肽。融合蛋白中使用的間隔區是附加的胺基酸殘基，它們被用在融合蛋白中典型地促 進位造或合成。這些可以是相當無害的，並典型地是0至5個殘基長度。連接體可以是單 一的或混合的殘基。殘基可以是隨機的或從其它蛋白獲得的序列或為特定的性質而設計， 例如物理的、化學的或生物的性質。MUCl胞質域肽諸如SEQ ID NO 14增加乳腺癌細胞的侵襲。Schroeder，2003。令 人驚奇的地，這樣的肽的較短部分實際上具有相反的作用。這些肽包括選自SEQ IDNO 1的6至15個連續的胺基酸殘基並包括SEQ IDNO :2顯示的胺基酸序列。來自精確序列的微小 差異可被用於優化活性，諸如通過一個、兩個或三個殘基的替換來進行保守改變或通過用 丙氨酸替換。保守改變互相替換相似的殘基，諸如無電荷極性的替換無電荷極性的、或非極 性的替換非極性的、或酸性的替換酸性的殘基。因此G或S殘基能用G、S、T、C、Y、N和Q替 換。L殘基能用A、V、I、P、F、W和M替換。A、V和P殘基能用A、V、L、I、P、F、W和M殘基替 換。Y或N殘基能用G、S、T、C、Y、N和Q殘基替換。E殘基能用D殘基替換。K殘基能用R 或H殘基替換。任何殘基能用丙氨酸殘基替換，除非這樣的替換被發現破壞侵襲和轉移抑 制活性。這樣替換的肽能被容易地測試，例如使用侵襲測定法、腫瘤生長測定法、腫瘤開始 測定法等。癌細胞，體外或體內，能與本發明的融合肽接觸或供給本發明的融合肽。它們能夠 作為肽被直接提供，或它們能夠通過提供給細胞在細胞中表達並產生融合肽的核酸載體而 被內源性地產生。對於體內給予，能使用任何本領域已知的遞送技術，包括但並不限於直接 的腫瘤內注射、肌肉內注射、血管內注射、皮下注射、腹膜內注射等。體外遞送能，例如，簡單 地通過向培養基補給融合肽而完成。可被治療的癌症和癌細胞包括乳腺、皮膚、結腸、卵巢、前列腺、子宮頸、結腸直腸、 肺、腦、頭和頸、胰腺、腎臟和肝臟癌症和癌細胞。給予後觀察的作用是開始、生長、侵襲和轉 移的減少的程度或延緩的速度。測量這些過程的合適的測定法在實施例中被描述。本領域 已知的其它測定法同樣能被使用。融合肽能被配製或修飾，如本領域已知的。這可包括共價修飾，諸如加帽、PEG化 或與膠束或脂質體結合。這樣的修飾和配製可增加在身體內的穩定性，因此允許較高百分 比的輸入劑量到達靶癌症。融合蛋白還能與其它的治療結合使用，包括但並不限於EGFR抑 製劑。治療可被同時或連續地給予。治療癌症的其它合適的治療包括化學治療藥給藥或輸 注、抗腫瘤抗體、抗受體抗體、輻照治療、放射性標記的藥物和手術。以不同方式起作用的兩 種形式的使用可向患者提供增加的益處。合適的EGFR抑制劑可以是抗體或激酶抑制劑，諸 如帕尼單抗(panitumumab)、西妥昔單抗、吉非替尼和厄洛替尼。對MUCl與β-聯蛋白結合的相似抑制作用能通過將抗體遞送到細胞或癌症患者 而被獲得。抗體可以是任何類型，單克隆的或多克隆的、單鏈或多鏈抗體。抗體可以在宿主 哺乳動物中、在細胞培養物中或在重組的細胞中製備。抗體結合SEQ ID NO :1中含有的表 位。使用根據SEQ ID NO :1的肽作為免疫原，例如，或使用根據發明的融合蛋白作為免疫原 或使用其它融合蛋白作為免疫原，能產生抗體。遞送編碼本發明融合蛋白的核酸的載體可以是任何本領域已知的載體。腺病毒載 體和腺相關載體是已知的和廣泛使用的。非病毒載體也能被使用，諸如納米顆粒、脂質體和 膠束。在一些實施方式中可以使用逆轉錄病毒載體。本領域的技術人員能選擇適合其目的 的載體。相似地，為了培養物中重組製造本發明的融合蛋白，本領域的技術人員能選擇載體 和宿主細胞系統。被鑑定為具有與癌症相關的遺傳基因的人處於增加的發展癌症的危險中。這樣 的人能被治療以減小他們癌症開始的危險。相似地，那些已被暴露於環境危險——諸如原 子彈放射性塵埃、核燃料廢物和其它的汙染物——中的人，處於增加的發展癌症的危險中。 可被突變的基因和它們引起的常染色體顯性疾病包括但並不限於BRCAl 乳腺癌，BRCA2
8乳腺癌，APC 結腸癌HNPCC 結腸癌，CDKN2 黑色素瘤。其它的常染色體顯性遺傳癌症危險 包括基底細胞痣症候群、神經纖維瘤病2型、卡奈症候群、骨軟骨瘤病、多發的、脊索瘤、家 族的、副神經節瘤、家族的、考登症候群、普-傑二氏症候群、具有胼胝形成的食管癌、前列 腺癌、胃癌、家族的、腎癌、家族的、李弗勞明症候群、視網膜母細胞瘤、多發性內分泌瘤病1 型、結節性硬化症、多發性內分泌瘤病2型、希-林二氏病、神經纖維瘤病1型和腎母細胞 瘤。易患癌症的常染色體隱性疾病包括運動失調性毛細血管擴張症、Bloom症候群著色性 幹皮病、維納症候群和Fanconi 『 s貧血。與蛋白轉導結構域(PTD)連接的MUCl模擬肽(MIP)能自由地進入轉化的細胞並 抑制它們的體外侵襲。這些相同的肽能抑制原發的腫瘤生長、腫瘤傳播和切除後腫瘤的復 發，例如，在同位植入的乳腺癌模型中。PMIP模擬肽，諸如SEQ ID NO :17和18，能以組織特 異性保留在循環中倖存並沒有可檢測到的毒性。重要地是，PMIP能顯著地抑制腫瘤生長， 例如，在模擬人乳腺癌的自發小鼠模型中。在機制上，這種腫瘤抑制作用與EGFR和MUCl表 達的降低密切相關。這些數據共同證明，這些基於肽的細胞內藥物顯示作為癌症非毒性治 療的強效性。人MUCl在小鼠乳腺中的過表達促進轉化，在多個轉基因模型中MUCl的喪失能顯 著地延遲腫瘤開始(6、10、12)。這可歸因於致癌性配偶體MUCl的數目已被證明與，即β -聯 蛋白、src和EGFR相互作用[(8)中評論的]。這個模擬肽被設計以阻斷MUC1、β-聯蛋白 和EGFR之間的相互作用，並且我們已證明PMIP處理確實阻斷MUCl與這些蛋白之間的相互 作用。此外，我們觀察到在某些情況下對PMIP處理的反應是MUCl表達喪失，這可能是EGFR 下調的結果。吸引人的是推測在PMIP存在時，MUCl和EGFR被可選地運輸(trafficked)並 進入溶酶體降解途徑，導致它們增強的降解。在CMV啟動子下過表達MUCl的MDA-MB-231 細胞在培養物中只3小時的PMIP處理誘導MUCl過表達的喪失，表明這種作用不是轉錄調 節的(未顯示數據)。一個重要的觀察結果是與PMIP處理相關的毒性的缺乏(沒有重量減輕、痛苦的跡 象或器官衰竭)。儘管這不是使用內源肽的意外不到的結果，但它指出在患者中潛在的低水 平的毒性。我們還檢查了 PMIP在免疫缺陷的MMTV-pyV mT轉基因動物中已激活免疫反應 的概率。使用作為標記物的CD45的蛋白水平檢查白細胞浸潤，我們發現與對照比較，在那 些用PMIP處理的腫瘤中沒有增加((37)；未顯示數據)。此外，通過分組調查蛋白轉導結構 域潛在輔助活性的研究已發現TAT蛋白轉導結構域不是免疫原性的(38)。我們最近已證明MUCl抑制配體依賴的EGFR降解，導致增強的受體穩定性(9)。此 外，我們已證明這種相互作用促進EGFR的致癌性質(10)。這些實驗中使用的小鼠模型先 前也都沒有顯示是依賴EGFR進展的，然而，PMIP在每個模型中是顯著有效的。這表明PMIP 對過表達MUCl的腫瘤可具有寬廣的應用，這包括大多數上皮瘤形成(39)。此外，PMIP可充 當與抗EGFR治療的重要輔助治療[(40)中評論的，該文獻被清楚地併入用於此目的]。我 們的數據表明MUCl誘導內化、改變的運輸和增強的EGFR信號傳導(9)。因此，如果PMIP阻 斷這些相互作用，依賴EGFR表面定位的抗EGFR治療能通過PMIP共遞送被增強。我們已證明癌症，特別是乳腺癌中PTD連接肽基藥物的有效性和MUCl定向靶標的 價值。重要地是，這些數據表明PMIP是在腫瘤進展的所有階段有活性的強效藥抑制開始、 抑制生長、誘導消退和抑制轉移性傳播。
上面的公開內容概括地描述本發明。本文公開的所有參考文獻被清楚地併入作為 參考。通過參考下面的具體實施例，能獲得更完全的理解，本文提供的這些具體實施例只是 為了舉例說明的目的，而並不是要限制本發明的範圍。實施例I-方法 細胞培養。轉移性乳腺癌細胞系MDA-MD-231和BT20從美國組織培養物保 藏中心(American Tissue Culture Collection)獲得。這些細胞系用10%胎牛血清 (Cellgro, Herndon, VA)、1 %青黴素-鏈黴素 _ 穀氨醯胺(Invitrogen, Eugene, OR)和 RPMI 1640 (Cellgro)培養基在37°C、5% CO2的增溼培養箱中培養。侵襲測定。膠原基質(0. 9mg/ml I型大鼠尾膠原(BD Biosciences, Billerica, ΜΑ)、83· 0% (ν/ν)Μ-199 培養基(Life Technologies)和 0. 18% NaHCO3(Fisher,Hampton, NH))被倒入24孔板。在膠原聚合之前，0. 8μπι孔的transwell插入物(Corning Inc.， Corning, NY)被放在基質頂部。使用化學吸引劑(具有lOOng/mL EGF的20 % FBS/ RPMI 1640)，將聚合的膠原再水化。用在無血清的RPMI 1640培養基中的50 μ M肽 處理MDA-MB-231細胞17小時。將細胞加載到transwell插入物上之前，它們用 Calcein-AM(Invitrogen)螢光標記30分鐘，然後用PBS洗滌。細胞然後在50 μ M肽/RPMI 1640無血清培養基中被再懸浮，並被加載到每孔中的插入物上(266，000細胞/孔)。細胞 在37°C、5% CO2的增溼培養箱中被允許侵入到基質中12小時。12小時之後，用40% FBS/ PBS中的0. 25%膠原酶處理膠原基質，並且移去插入物(Calbiochem，San Diego, CA)。使 用Molecular Devices分光光度計(Ex :485，Em :538，截止530)測量已侵入到膠原中的熒 光標記細胞的數目。免疫沉澱和免疫印跡。蛋白如(9)所描述進行處理。光密度測定法。如(9)所描述進行免疫印跡分析。抗體和生長因子。CT2(抗-MUCl胞質尾)從 Neomarkers Inc. (Fremont, CA)購買。抗磷酸化酪氨酸抗體(PY99)和EGFR/erbBl (1005)都從Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)購買。β -肌動蛋白抗體來自 Sigma Chemical Company (St. Louis，M0)。與 HRP 結合的二抗從 Molecular Probes(Invitrogen)獲得,抗倉 鼠HRP結合的抗體從Jackson Labs (West Grover，PA)購買。表皮生長因子(EGF)以IOOng/ μ 1 的濃度儲存在 _20°C (Invitrogen)。免疫螢光。8了20細胞用20(^11 FITC標記的hPMIP處理2小時，並在4%多聚甲 醛/PBS中固定。固定的細胞用0. 02% NaN3/PBS洗3次，並與具有DAPI的SlowfadeGold 抗衰退試劑(Invitrogen)溫育。用螢光DMLB Leica複式顯微鏡使細胞可視化。肽合成。hPMIP(SEQ ID NO 17)、FITC—hPMIP、msPMIP (SEQ ID N0:18)、 FITC-msPMIP和PTD4 多月太(SEQ ID NO 16)通過GenScript (Scotch Plains，NJ)合成並被凍 幹遞送。這些肽以500 μ M的濃度在PBS中再懸浮並以一次性使用的等分試樣儲存在-80°C。人乳腺腫瘤異種移植物。測試免疫減弱的(scid)小鼠(Taconic，Rockville, MD)血清IgG的存在並發現 0. 5cm。只有大於七周齡的小鼠被包括在本研究中，並排 除發生液體囊腫的小鼠。動物被腹膜內注射50 μ g/g體重的msPMIP或PTD4，每天一次，持 續21天。使用測徑器每兩天測量十個乳腺中的每一個，測量結果被用於基於公式a2Xb/2確 定腫瘤體積，a是較小的直徑，b是較大的直徑。處理21天之後，小鼠通過CO2吸入被處死， 組織被切除。在處死之前一至四小時，給幾個msPMIP處理小鼠注射FITC-msPMIP(50y g/g 體重)，用螢光MZFLIII Leica解剖顯微鏡使未受損的組織可視化。異種移植物和轉基因小鼠研究都在亞利桑那大學的Institutional Animal Care andUse Committee 批准的規禾呈下通過Experimental Mouse Shared Services (University ofArizona, Tucson)進行。統計學分析。所有統計數字都在Excel (Microsoft)中進行。實施例2-PMIP被保留在細胞中，減少EGFR磷酸化並抑制MUCl和β -聯蛋白相互作用。MUCl 胞質域由72個胺基酸組成，這裡面存在含有EGFR磷酸化位點(人=YEKVdn^= YEEV)和 β-聯蛋白結合位點(人=SAGNGGS SLS (SEQ ID NO :9)，小鼠=SAGNGSSSLS(SEQ ID NO: 19)，圖1A)的15個胺基酸的結構域(11、29)。我們合成了 15個胺基酸的肽以測定是否它 能以顯性負性方式起作用，阻斷MUCl和EGFR/ β -聯蛋白/src之間的相互作用。為了允許 這個肽進入細胞，我們將它與蛋白轉導結構域[PTD4，圖IA (30)，(31)所評論的]串聯合成。 在體外與結合到MIP肽的FITC標記PTD4 (FITC-hPMIP)脈衝的細胞被發現含有螢光肽，並 且該肽隨著時間推移被保留(圖1B)。因為MUCl和聯蛋白的相互作用在轉移進展過程中增加，我們接下來檢測了在 ΒΤ20細胞系中hPMIP處理對這些相互作用的體外影響(12、32)。實施例3-PMIP抑制侵襲。當這些細胞分別代表高和低MUCl表達模型時，它們被選出(數據 未顯示)。我們發現當與用對照肽(PTD4)或PBS處理的細胞相比，PMIP處理顯著地抑制細 胞通過8.0μΜ濾器侵入到I型膠原基質中的能力(圖IC和D)。為了確定是否hPMIP還 能影響增殖和/或凋亡，我們對人乳腺癌細胞系MDA-MB-231進行了 Armexin V和細胞數目 定量。當細胞在塑料上生長時，hPMIP處理被發現對凋亡或細胞生長沒有可檢測到的影響 (數據未顯示)。實施例4-PMIP在異體移植物乳腺癌模型中抑制腫瘤生長並抑制復發。由於hPMIP在體外 強烈地抑制細胞侵入，我們接下來評價了 hPMIP在體內抑制腫瘤復發和轉移的能力。我 們檢測了是否hPMIP能改變被植入到嚴重的組合免疫缺陷(scid)小鼠乳腺脂肪墊中的 MDA-MB-231乳腺癌細胞的轉移潛力。我們發現用hPMIP處理在對原發腫瘤切除後腫瘤再生 長和播散到繼發性乳腺產生了基本抑制(圖2B和2E)。此外，我們發現hPMIP處理還減慢
11了原發腫瘤的生長(圖2C)。在第一個實驗(圖2A和2B)中，細胞被允許建立大的腫瘤團塊(500mm3)，小鼠用 hPMIP或對照肽(PTD4)注射(i. p. )21天(圖2A)。在處理結束時，原髮乳腺腫瘤被切除， 並跟蹤動物以檢測腫瘤再生長和/或轉移到繼髮乳腺的速度。儘管再生長和繼髮乳腺腫瘤 被發現對於兩處理組數目相同，但對照處理動物的腫瘤體積平均為760mm3，而PMIP處理動 物平均只有73mm3 (圖2B)。注意，小鼠在接下來再生長的10天過程中沒有用藥物處理。我 們還注意到與對照相比，在hPMIP處理動物中腫瘤大小減少，並接下來設計將允許我們測 定是否hPMIP在這個模型中影響腫瘤生長速度的實驗。為了測定hPMIP對原發性腫瘤生長的潛在的影響，我們重複了 MDA-MB-231異種移 植實驗(藥物處理21天)，但在較小腫瘤體積(IOOmm3)時開始治療。我們允許21天藥物 處理之後腫瘤繼續生長並當它們到達800mm3的體積時進行原發性腫瘤的手術切除，這允許 我們也評價在這個實驗中腫瘤的擴散(圖2D)。用hPMIP處理導致與對照處理動物相比腫 瘤大小的顯著減少(圖2C，p = 0. 028)。這對應於hPMIP處理小鼠達到800mm3的切除大小 需要的時間長度的顯著的增加(圖2D，ρ = 0. 03)。儘管處理在切除之前大約20天結束， 但是我們發現hPMIP處理基本上減少了切除之後10天腫瘤再生長和擴散的量(圖2E)。這 些數據共同證明了在高度轉移性乳腺癌模型中，hPMIP處理能抑制腫瘤生長、擴散和復發。實施例5PMIP在自發性乳腺癌中抑制腫瘤生長並誘導消退。儘管異種移植模型已經證明 了 hPMIP處理對建立的細胞系的生長和進展的影響，我們想要測定在更好地重演人乳腺癌 的小鼠模型中msPMIP如何影響腫瘤開始和進展。乳腺癌的MMTV-py V mT轉基因小鼠模型 與人乳腺癌非常相似，都活化多種信號傳導通路，包括AKT、src和shc(33、34)。研究已經 證明產生的乳腺癌在病理上和分子上模擬在人類疾病中觀察到的增生、原位導管癌和腺癌 的全部進展(35、36)。為了測定是否肽能被遞送到這些動物的乳腺和腫瘤，我們注射FITC 標記的msPMIP並分析肽的保留(圖3A)。在注射後一個小時時，FITC被檢測到遍及動物體 腔，包括所有的器官(數據未顯示)。四個小時之後，FITC-msPMIP被發現選擇性地保留在 乳腺腫瘤中以及結腸和皮膚中(圖3A，數據未顯示)。為了測定msPMIP對自發性乳腺癌進展的影響，負荷有直徑> 0. 5cm的乳腺腫瘤 的MMTV-py V mT小鼠用msPMIP或PTD4對照肽處理21天。處理對腫瘤生長具有顯著的影 響，通過21天的處理，msPMIP將總腫瘤生長從 590%顯著地減緩至 194% (ρ = 0. 038 ； 圖3Β)。此外，與在對照(PTD4)處理腫瘤中的60mm3/天相比，msPMIP處理將腫瘤生長速度 顯著地減小到只有25mm7天(ρ = 0. 007 ；圖3C)。注意到用hPMIP(與msPMIP相反)對 MMTV-py V mT小鼠的處理對腫瘤生長沒有影響，這強調PMIP的胺基酸特異性。我們接下來分析出現在本研究中各處的腫瘤的總尺寸。這個分析顯示對照(PTD4) 組中13%的腫瘤在研究結束時生長大於500mm3，在msPMIP處理組中只有的腫瘤達到這 個尺寸(圖3D)。由於這個轉基因模型具有多瘤居中T轉基因的連續表達，該多瘤居中轉基 因在整個本研究驅動腫瘤發生，我們接下來檢測藥物處理對新腫瘤形成的影響。儘管在處 理開始時msPMIP和對照(PTD4)組具有相似數目的、尺寸100_300mm3的腫瘤，但是這個數 目在處理結束時在對照組中增加一倍，而在msPMIP組中保持相同(圖3D)。這些數據表明 msPMIP處理在這個模型中抑制腫瘤開始。為了進一步分析腫瘤開始，我們評價了在藥物處理過程中開始的腫瘤百分比(開始等於腫瘤從Omm3轉變至IOOmm3的百分比)。這個分析 顯示在msPMIP組中，研究過程中腫瘤開始顯著地減少(ρ = 0. 0045 ；圖3E)。儘管從用msPMIP對荷瘤MMTV-pyV mT小鼠的處理中觀察到腫瘤形成和生長非常 顯著的降低，但是本研究中不是所有的腫瘤對處理都有反應(圖4)。每個乳腺的分析顯示， 儘管響應於msPMIP的大多數腫瘤生長速度明顯減慢，但許多腫瘤繼續生長，表明在這個模 型中有隨機的通路活化。重要的是，用msPMIP處理的建立的腫瘤亞組(四個腫瘤)在治療 下完全消退，儘管對照處理的腫瘤沒有一個完全消退(圖4，。實施例6-msPMIP處理導致EGFR和Mucl水平降低。先前地，我們觀察到MUCl表達抑制配 體依賴的EGFR降解，而其它的人顯示SAGNGGSSLS序列促進MUCl/ β -聯蛋白相互作用(9、 11)。為了測定是否msPMIP影響EGF依賴的EGFR降解，我們產生了來自MMTV-pyV mT動物 的腫瘤的蛋白裂解物，在動物處死前30分鐘，給動物注射EGF和肽(標準的21天藥物處理 之後)。我們觀察到與對照處理的動物相比，在msPMIP處理的小鼠中EGFR的表達和相應的 磷酸酪氨酸顯著減少(圖5A)。注意在這個小鼠中，21天msPMIP處理之後沒有剩餘的空白 腫瘤，而我們從對照處理的動物中獲得了 6個大於400mm3的腫瘤。為了測定是否msPMIP阻斷Mucl和β -聯蛋白之間的相互作用，我們通過在腫瘤 裂解物中建立Mucl蛋白表達的水平開始。有趣的是，我們發現msPMIP處理誘導MMTV-pyV mT模型(圖5A禾口 5B)中和MDA-MB-231異種移植物模型(圖5C禾口 5D)中Mucl蛋白表達的 喪失。雖然這種喪失的機制尚未知，但它將一定導致Mucl依賴的致癌信號傳導的喪失。參考文獻弓I用的每篇參考文獻的公開內容被清楚地併入本文。1. 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1權利要求
治療具有鑑定的高癌症危險的人的方法，包括將具有A B C或C B A結構的融合肽給予具有鑑定的高癌症危險的人，藉此癌症開始的概率被減小，其中A是增強附著的大分子跨細胞膜轉運的蛋白轉導結構域；其中B是0 5個胺基酸殘基的間隔區；其中C是6 15個胺基酸殘基的多肽，其中C包含PYEKVSAGNGGSSLS(SEQ IDNO1)的全部或部分，其中所述C的部分包含GGSSLS(SEQ ID NO2)，或其中所述6 15個胺基酸殘基的至少一個被保守地替換，這樣無電荷極性胺基酸置換無電荷極性胺基酸，或非極性胺基酸置換非極性胺基酸殘基，或酸性胺基酸置換酸性胺基酸，或其中所述6 15個胺基酸殘基的一個用A殘基替換。
2.權利要求1所述的方法，其中所述鑑定的高危險歸咎於遺傳素因。
3.權利要求1所述的方法，其中所述鑑定的高危險歸咎於環境暴露。
4.權利要求1所述的方法，其中所述鑑定的高危險歸咎於職業暴露。
5.權利要求1所述的方法，其中所述的人具有歸咎於乳腺癌遺傳素因的高危險。
6.權利要求1所述的方法，其中所述的人具有歸咎於結腸癌遺傳素因的高危險。
7.權利要求1所述的方法，其中所述的人具有歸咎於皮膚癌遺傳素因的高危險。
8.權利要求1所述的方法，其中所述6-15個胺基酸殘基的一個至三個之間被保守地替換。
9.權利要求1所述的方法，其中C是6-15個胺基酸殘基的多肽，其中C包含 PYEKVSAGNGGSSLS (SEQ ID NO :1)的全部或部分，其中所述C的部分包含GGSSLS (SEQ ID NO: 2)。
10.權利要求1所述的方法，其中所述6-15個胺基酸殘基的至少一個被保守地替換，這 樣無電荷極性胺基酸置換無電荷極性胺基酸，或非極性胺基酸置換非極性胺基酸殘基，或 酸性胺基酸置換酸性胺基酸。
11.權利要求1所述的方法，其中所述6-15個胺基酸殘基的一個用A殘基替換。
12.治療切除腫瘤的人的方法，包括將具有A-B-C或C-B-A結構的融合肽和EGFR抑制劑給予切除腫瘤的人，藉此所述腫瘤 復發或轉移的概率被減小，其中A是增強附著的大分子跨細胞膜轉運的蛋白轉導結構域； 其中B是0-5個胺基酸殘基的間隔區；其中C是6-15個胺基酸殘基的多肽，其中C包含PYEKVSAGNGGSSLS (SEQ IDNO 1)的全 部或部分；其中C的部分包括GGSSLS (SEQ ID NO 2),或其中所述6_15個胺基酸殘基的至 少一個被保守地替換，這樣無電荷極性胺基酸置換無電荷極性胺基酸，或非極性胺基酸置 換非極性胺基酸殘基，或酸性胺基酸置換酸性胺基酸，或其中所述6-15個胺基酸殘基的一 個用A殘基替換。
13.權利要求12所述的方法，其中所述6-15個胺基酸殘基的一個至三個之間被保守地替換。
14.權利要求12所述的方法，其中所述EGFR抑制劑是帕尼單抗。
15.權利要求12所述的方法，其中所述EGFR抑制劑是西妥昔單抗。
16.權利要求12所述的方法，其中所述EGFR抑制劑是吉非替尼。
17.權利要求12所述的方法，其中所述EGFR抑制劑是埃羅替尼。
18.權利要求12所述的方法，其中C是6-15個胺基酸殘基的多肽，其中C包含 PYEKVSAGNGGSSLS (SEQ ID NO 1)的全部或部分，其中所述C的部分包含GGSSLS (SEQ ID NO: 2)。
19.權利要求12所述的方法，其中所述6-15個胺基酸殘基的至少一個被保守地替換， 這樣無電荷極性胺基酸置換無電荷極性胺基酸，或非極性胺基酸置換非極性胺基酸殘基， 或酸性胺基酸置換酸性胺基酸。
20.權利要求12所述的方法，其中所述6-15個胺基酸殘基的一個用A殘基替換。
21.治療具有結腸癌或皮膚癌的患者的方法，包括將具有A-B-C或C-B-A結構的融合肽給予結腸癌或皮膚癌患者，藉此所述癌症的侵襲 力被減小或延緩，其中A是增強附著的大分子跨過細胞膜轉運的蛋白轉導結構域；其中B是0-5個胺基酸殘基的間隔區；其中C是6-15個胺基酸殘基的多肽，其中C包含PYEKVSAGNGGSSLS (SEQ IDNO 1)的全 部或部分，並且其中C的部分包含GGSSLS (SEQ ID NO :2)，或其中所述6_15個胺基酸殘基 的至少一個被保守地替換，這樣無電荷極性胺基酸置換無電荷極性胺基酸，或非極性氨基 酸置換非極性胺基酸殘基，或酸性胺基酸置換酸性胺基酸，或其中所述6-15個胺基酸殘基 的一個用A殘基替換。
22.權利要求21所述的方法，其中所述患者患有結腸癌。
23.權利要求21所述的方法，其中所述患者患有皮膚癌。
24.權利要求21所述的方法，其中所述6-15個胺基酸殘基的一個至三個之間被保守地替換。
25.權利要求21所述的方法，其中C是6-15個胺基酸殘基的多肽，其中C包含 PYEKVSAGNGGSSLS (SEQ ID NO 1)的全部或部分，其中所述C的部分包含GGSSLS (SEQ ID NO: 2)。
26.權利要求21所述的方法，其中所述6-15個胺基酸殘基的至少一個被保守地替換， 這樣無電荷極性胺基酸置換無電荷極性胺基酸，或非極性胺基酸置換非極性胺基酸殘基， 或酸性胺基酸置換酸性胺基酸。
27.權利要求21所述的方法，其中所述6-15個胺基酸殘基的一個用A殘基替換。全文摘要
MUCl(DF3、CD227、上皮唾液蛋白、PEM)是＞300kDa的重度O-糖基化的異二聚體蛋白質，通常大量表達於腺上皮的頂端表面。全身給藥後，MUCl模擬肽選擇性地保留在乳腺腫瘤、結腸和皮膚中。而且，MUCl模擬肽減少腫瘤的開始。此外，MUCl模擬肽能與其它抗-EGFR治療結合用於輔助的情況中，即手術後。
文檔編號A61K39/395GK101977623SQ200980109625
公開日2011年2月16日 申請日期2009年2月19日 優先權日2008年2月20日
發明者J·A·施洛德 申請人:亞利桑那生物醫學研究委員會