植物莖尖轉化方法及其專用工具的製作方法

2023-10-04 17:50:29

專利名稱：植物莖尖轉化方法及其專用工具的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種植物莖尖轉化方法及其專用工具。
背景技術：
植物遺傳轉化方法就是通過特定的方式將外源基因導入到受體細胞內，使之發生定向的、永久的遺傳變異。目前，人們已經建立了多種轉化系統。對大多數遺傳轉化系統而言，遺傳轉化方法是遺傳轉化系統的關鍵環節，決定著轉化的成敗及效率。用於植物的轉化方法有許多農桿菌介導法，基因槍法，電擊法、PEG法等。農桿菌介導法和基因槍法已成為目前用於遺傳轉化的主要方法。過去認為受農桿菌宿主範圍限制，農桿菌介導的遺傳轉化僅限於雙子葉植物。最早報導的採用農桿菌介導法轉化成功的植物單子葉植物是石刁柏，之後相繼在水稻、玉米、 大麥、甘蔗等重要作物中獲得了農桿菌介導的轉基因植株，並有充足的分子和遺傳證據。雖然大多數單子葉植物不是農桿菌的天然宿主，但隨著對農桿菌轉化植物細胞原理的深入認識，通過添加外源信號物質如乙醯丁香酮(AQ等也可以實現農桿菌對單子葉植物的轉化。 由於農桿菌轉化利用天然的整合系統實現DNA的轉移，該法具有轉基因拷貝數低、遺傳穩定、成本低廉等優點使農桿菌成為大多數遺傳轉化的首選方法。植物受體的選擇是遺傳轉化系統的另一重要因素。目前農桿菌轉化的植物受體主要包括幼胚及其胚性愈傷組織、葉盤、子葉、子葉節、下胚軸等外植體。這些受體都需要經過脫分化過程形成愈傷組織，然後經過再分化再生植株。組織培養和遺傳轉化能否成功在很大程度上取決於受體基因型，絕大多數具有重要經濟價值的基因型難以利用，植株再生頻率很低，並且組織培養過程中易發生體細胞無性系變異。因此，選擇合適的外植體作為農桿菌轉化的受體，建立不受基因型限制的遺傳轉化體系仍是目前研究的重點之一。近年來，利用離體莖尖分生組織直接再生系統進行的轉基因研究工作逐漸增多， 並取得重要進展。1988年，McCabe等用基因槍轉化大豆離體莖尖獲得了轉基因植株。1991 年Gould等用玉米離體莖尖與農桿菌共培養獲得了轉化植株及子代。Zapata等(1999)和 Mtyavathi等^00 分別用農桿菌介導法轉化棉花離體莖尖都獲得了轉基因植株。離體莖尖分生組織不需要脫分化過程，莖尖轉化後直接再生植株，這使轉化周期大大縮短，並一定程度上打破了基因型限制，因此顯示出良好的應用前景。農桿菌介導的小麥遺傳轉化是一道難題。據統計，在2002年前獲得小麥轉基因植株的報導中，基因槍法佔90%左右，其他方法僅佔10%。1997年，Cheng等利用農桿菌介導法轉化小麥成功，標誌著小麥遺傳轉化的另一個裡程碑。由於小麥離體培養受基因型的影響大、多數品種植株再生頻率低、對農桿菌感染不敏感、組織培養過程中易發生體細胞無性系變異等原因，使得通過農桿菌介導的遺傳轉化進展慢，批量獲得轉基因小麥植株仍受基因型限制很大，以致小麥基因工程研究遠落後於其它主要農作物。另外，小麥的基因組有1. 7 X 1010bp,是水稻基因組的40倍，是玉米基因組的6倍，是擬南芥基因組的100倍，巨大的基因組導致轉基因植株的分子鑑定難度大，特別是Southern雜交分析，影響了轉基因小麥的後代研究。影響小麥遺傳轉化的因素如小麥基因型、外植體類型、浸染及共培養時間、農桿菌菌株與篩選劑等近年來都得到了廣泛研究，但轉化效率明顯低於其它主要農作物的。鹽角草(Salicornia europaea)是屬於藜科的一種肉質化真鹽生植物，廣泛分布在沿海和內陸鹽湖附近，能夠積累高到乾重50%的NaCl，被認為是世界上最耐鹽的一種高等植物。鹽角草具有發展為蔬菜、油料作物及飼料作物的潛力。建立高效穩定的鹽角草遺傳轉化體系對於挖掘研究其抗逆基因功能及其自身的形狀改良具有重要意義。31^等Q006) 以成熟胚為外植體誘導愈傷組織並實現了植株再生，建立了鹽角草的體外再生體系。然而該體系的愈傷誘導率和植株再生率很低，很難用於批量遺傳轉化。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。本發明提供的培育轉基因植物的方法，包括如下步驟1)刺傷目的植物的莖尖生長點，得到處理後目的植物；2)用含有目的DNA的重組農桿菌菌液侵染步驟1)得到的所述處理後目的植物，得到浸染後幼苗；3)培養步驟2)得到的浸染後幼苗，得到含有所述目的DNA的轉基因植物。步驟1)中，所述刺傷採用下述的金屬刷；步驟2)中，所述含有目的DNA的重組農桿菌菌液按照如下方法製備A)將所述目的DNA通過重組載體導入根癌農桿菌得到重組農桿菌；B)將步驟A得到的所述重組農桿菌重懸於如下所述培養基，得到的菌液即為含有目的DNA的重組農桿菌菌液；所述重組載體為含有bar基因的pCAMBIA3300-ubinOS ；或將所述目的DNA插入表達載體pCAMBIA3300-ubinos中，得到表達目的DNA的重組載體。所述目的DNA為kVPl或&VP2 ；所述SeVPl的核苷酸序列為序列表中的序列2 ；所述SeVP2的核苷酸序列為序列表中的序列3。所述bar的核苷酸序列為序列表中的序列4。步驟2)中，所述侵染在大氣壓力為0.05MPa下進行；所述侵染的時間為 15-20min，所述侵染的時間具體為20min。步驟1)中，所述目的植物為所述目的植物的種子萌發1-7天得到的植物；步驟幻中，所述培養依次為共培養和繼續培養；所述共培養的溫度為20°C -22°C ；所述共培養的時間為2天_4天，所述共培養為黑暗培養；所述共培養的培養基為MS培養基；所述繼續培養為a)或b)a)所述繼續培養的溫度為日溫25-30°C，夜溫18_20°C，所述繼續培養的相對溼度為60-80%，所述繼續培養的光照條件為1 光照/8h黑暗；所述繼續培養的時間為20-30 天；b)所述繼續培養的溫度為日溫22-28°C，夜溫15_21°C，所述繼續培養的光照條件為自然光照；所述繼續培養的時間為10-15天。步驟1)中，所述目的植物為所述目的植物的種子萌發1、2、3或7天得到的植物；步驟3)中，所述共培養的溫度為20°C或22°C ；所述共培養的時間為3天，所述繼續培養為a)或b)a)所述繼續培養的溫度為日溫25°C，夜溫18°C，所述繼續培養的相對溼度為 60%，所述繼續培養的時間為21天；b)所述繼續培養的溫度為日溫22C，夜溫16°C ；所述繼續培養的時間為10天。所述目的植物具體所述目的植物的種子萌發1、2、3或7天得到的植物。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為小麥，所述雙子葉植物為鹽角草。本發明的第二個目的是提供一種用於刺傷所述目的植物莖尖生長點的金屬刷。本發明提供的金屬刷，包括金屬纖維束和套設在所述金屬纖維束外側的套筒，所述金屬纖維束的一端設於所述套筒外，所述金屬纖維束的另一端位於套筒內。所述金屬纖維束的直徑為(0. 3-0. 8)釐米，所述金屬纖維束的直徑具體為0. 5釐米；所述金屬纖維束具體由若干條直徑為20-25微米的金屬纖維組成；所述金屬纖維束尤其具體由若干條直徑為20微米或25微米的金屬纖維組成；所述設於所述套筒外的金屬纖維束的長度為(0. 2-0. 5)釐米，所述設於所述套筒外的金屬纖維束的長度具體為0. 5釐米。所述金屬纖維束和所述套筒固定連接，所述金屬纖維束通過線與萬能膠與所述套筒固定連接。本發明的第三個目的是提供一種用於配製所述重組農桿菌菌液的培養基。本發明提供的培養基，按照如下方法製備將乙醯丁香酮、SilwetL-77和1/2MS液體培養基混合，得到培養基，所述乙醯丁香酮在所述培養基中的濃度為150μΜ-250μΜ ；所述SilwetL-77在所述培養基中的濃度為0. 005% -0. 015% (體積百分含量)。所述乙醯丁香酮在所述培養基中的濃度為200 μ M ；所述SilwetL-77在所述培養基中的濃度為0.01% (體積百分含量)。本發明的實驗證明，分別以單子葉植物小麥和雙子葉植物鹽角草幼苗的莖尖分生組織為農桿菌轉化受體，通過對莖尖損傷工具的改造、對幼苗苗齡的研究，及輔助真空滲透處理和助滲劑使用等措施，建立了一套高效快速的植物轉化體系，提高了莖尖轉化效率；該轉化體系的優勢在於操作簡單、周期短，不需要組織培養和植株再生過程，從而克服了普遍存在的基因型依賴性及體細胞變異的問題。


圖1為金屬纖維製作的刷子的結構示意2為小麥莖尖轉化及TO代抗性植株圖3為不同莖尖刺傷工具對小麥除草劑抗性率的影響圖4為小麥苗齡對除草劑抗性率的影響圖5為轉基因小麥及其後代的獲得
圖6為轉kVPl和&VP2小麥Tl代PCR檢測結果圖7為鹽角草抗性植株的獲得及真空滲透處理對除草劑抗性率的影響圖8為鹽角草Tl代抗性植株的獲得圖9為bar基因在鹽角草Tl代植株的轉錄本相對表達量
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例數據統計分析用統計軟體SPSS 12.0進行多重比較的(LSD)統計分析，在P < 0. 05和P < 0. 01水平上對各處理和株系差異的顯著性進行比較。實施例1、利用小麥莖尖轉化體系獲得轉基因小麥一、小麥莖尖轉化體系的建立1、材料A、小麥品種中麥12小麥(以下簡稱野生型小麥)，冬性；分櫱力較強，成穗率較高；穗紡錘型， 長芒，白殼，白粒，籽粒角質；產量要素中畝穗數和穗粒數較多，千粒重偏低；植株較矮，節水區試株高65釐米左右，高肥區試70釐米左右，抗倒性好；抗寒性較好；抗、慢條銹病，慢葉銹病，感白粉病和稈銹病。購買自北京中農金土地農業發展研究中心種子銷售部。B、轉染重組菌C58/pCAMBIA3300-ubinos重組農桿菌C58/pCAMBIA3300-ubinos 為將命名質粒 pCAMBIA3300_ubinos 轉入農桿菌C58獲得的重組菌。質粒pCAMBIA3300_ubinos含有ubiquitin啟動子和篩選標記基因編碼草丁膦乙酉先基轉移酶(PAT, phosphinothricinacetyltransferase)基因 bar。農 If 菌 C58 菌株在文獻"Overexpression of Organellar and Cytosolic AtHSP90 in Arabidopsis thaliana Impairs Plant Tolerance to Oxidative Stress. Hongmiao Song, Pengxiang Fan, Yinxin Li. Plant Mol Biol Rep(2009) 27 :342-349. "ψ 公開過，公眾可從中國科學院植物研究所獲得。質粒pCAMBIA3300-ubinos 為在載體 pCAMBIA 3300 的 Hind III 和 BamH I 中插入ubiquitin啟動子序列，得到的載體，ubiquitin啟動子序列見序列表中的序列1， PCAMBIA3300中含有基因bar，其核苷酸序列為序列4。PCAMBIA3300購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。C、金屬纖維刷將約6萬條直徑為20微米的金屬纖維成束(金屬纖維束直徑為 0. 5cm)地塞到竹製毛筆竿的小孔中，用萬能膠和線固定住。為了保持刷子的剛性，露在筆竿外的金屬纖維長度為0.5釐米。金屬纖維購自西安菲爾特金屬過濾材料有限公司。筆竿購自文具店。分別用直徑為20和25微米的金屬纖維製作的刷子如圖1所示。為了保持刷子的剛性，刷子的金屬纖維長度為0.5釐米。D、培養基
YEP培養基的配製酵母提取物(yeast extract)蛋白腖(ρ印tone)NaCl瓊脂粉(agar)用IM 的 NaOH 溶液調 pH7. 0。1/2MS培養基的配製培養基母液的配製和保存
權利要求
1.一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟1)刺傷目的植物的莖尖生長點，得到處理後目的植物；2)用含有目的DNA的重組農桿菌菌液侵染步驟1)得到的所述處理後目的植物，得到浸染後幼苗；3)培養步驟2)得到的浸染後幼苗，得到含有所述目的DNA的轉基因植物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述刺傷採用如下權利要求6-8中任一所述的金屬刷；步驟2)中，所述含有目的DNA的重組農桿菌菌液按照如下方法製備A)將所述目的DNA通過重組載體導入根癌農桿菌得到重組農桿菌；B)將步驟A得到的所述重組農桿菌重懸於如下權利要求9或10所述培養基，得到的菌液即為含有目的DNA的重組農桿菌菌液。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於步驟2)中，所述侵染在大氣壓力為0.05MI^下進行；所述侵染的時間為15-20min，所述侵染的時間具體為15min。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述目的植物為所述目的植物的種子萌發1-7天得到的植物。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於步驟1)中，所述目的植物為所述目的植物的種子萌發1、2、3或7天得到的植物。
6.一種用於刺傷所述目的植物莖尖生長點的金屬刷，包括金屬纖維束和套設在所述金屬纖維束外側的套筒，所述金屬纖維束的一端設於所述套筒外，所述金屬纖維束的另一端位於套筒內。
7.根據權利要求6所述的金屬刷，其特徵在於所述金屬纖維束的直徑為0. 3-0. 8釐米，所述金屬纖維束的直徑具體為0. 5釐米；所述金屬纖維束具體由若干條直徑為20-25微米的金屬纖維組成；所述金屬纖維束尤其具體由若干條直徑為20微米或25微米的金屬纖維組成；所述設於所述套筒外的金屬纖維束的長度為0. 2-0. 5釐米，所述設於所述套筒外的金屬纖維束的長度具體為0. 5釐米。
8.根據權利要求6或7所述的金屬刷，其特徵在於所述金屬纖維束和所述套筒固定連接。
9.一種用於配製所述重組農桿菌菌液的培養基，按照如下方法製備將乙醯丁香酮、 SilweetL-77和1/2MS液體培養基混合，得到培養基，所述乙醯丁香酮在所述培養基中的濃度為150μΜ-250μΜ ；所述SilweetL-77在所述培養基中的濃度為0. 005% -0. 015% (體積百分比)。
10.根據權利要求9所述的培養基，其特徵在於所述乙醯丁香酮在所述培養基中的濃度為200 μ M ；所述SilweetL-77在所述培養基中的濃度為0. 01% (體積百分比)。
全文摘要
本發明公開了一種植物莖尖轉化方法及其專用工具。本發明提供的培育轉基因植物的方法，包括如下步驟1)用如下所述的金屬刷刺傷所述目的植物的莖尖生長點，得到處理後目的植物；2)用含有目的DNA的菌液侵染步驟1)得到的所述處理後目的植物，得到浸染後幼苗；3)將步驟1)得到的浸染後幼苗依次進行共培養和繼續培養，得到含有所述目的DNA的轉基因植物。本發明的實驗證明，分別以單子葉植物小麥和雙子葉植物鹽角草幼苗的莖尖分生組織為農桿菌轉化受體，通過對莖尖損傷工具的改造、對幼苗苗齡的研究，及輔助真空滲透處理和助滲劑使用等措施，建立了一套高效快速的植物轉化體系，提高了莖尖轉化效率。
文檔編號A01H5/00GK102321662SQ20111019727
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月14日 優先權日2011年7月14日
發明者呂素蓮, 李銀心 申請人:中國科學院植物研究所