定向非球形細胞的方法和裝置的製作方法

2023-10-04 18:10:54

專利名稱：定向非球形細胞的方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明通常涉及定向期望的細胞、或細胞部分、優選地期望的精細胞的一種方法和裝置，更具體地，本發明涉及定向、選擇和保留有活力的期望精細胞的一種方法和裝置。
背景技術：
長期以來需要一種可靠、定性、定量和划算的方法來選擇精子，其可以用於產生期望性別的動物。
尤其是，畜牧業的農夫或飼養員要求優先性別的牛、豬、綿羊、山羊、鹿、水牛、馬等等。例如，公牛對於乳牛業農夫的用途很少，而養豬農夫長期知道母豬比公豬長得快。
類似地，養牛和山羊的農夫非常明白這些物種的雄性比雌性更快長肉。
哺乳動物的卵子只攜帶X染色體而精子攜帶X或Y染色體。所以後代的性別由精細胞確定。當精子與卵子結合併且精子攜帶X染色體時，後代是雌性(XX)。然而，如果精子攜帶Y染色體，一旦與雌性攜帶的X染色體結合，所得到的後代將是雄性(XY)。
已知在X(較大)和Y(較小)精子之間存在DNA含量的差異，例如豬的是3.4％，牛的是3.9％，綿羊的是4.2％。這種可測量的差異可以用來確定精子的性別，即，是攜帶X染色體(雌性)還是Y染色體(雄性)的精子。
現有技術討論和提供了把哺乳動物精子揀選為X和Y群體的方法。然而，能夠在檢測後保持精子活力的唯一可靠方法介紹了測量各精子的DNA質量(mass)。這些方法基本上使用了改良的應用螢光測量的流式細胞儀來檢測X和Y精子之間的小差異，其中精子以單行穿過一個系統，其測量單個精子的DNA含量。
已經發展了許多技術以使用前方位置的傾斜(bevelled)的樣品注射尖和第二螢光檢測器。該第二螢光檢測器適於當精子經過此系統時，確定扁平卵圓形的精子頭部相對於第一檢測器的方向。
在兩種情況中，所測量的是螢光的量級。這要求兩個單獨的螢光檢測器，或至少兩個不連續的螢光讀數。
進一步的改進考慮到那些不需要的精子將要被阻擋並作為廢物穿過和被丟棄。
現有技術因此介紹了一種流式細胞計數系統，其要求兩套單獨的精細胞螢光量級的測量儀器，一個用來確定精子的性別，另一個確定精子的方向。本領域技術人員將認識到，由於精細胞的形態學(扁平卵圓形)和極高的折射指數，不可能準確地測量精子的DNA含量，除非所述精子正確地定向於DNA螢光檢測器。
現有技術的方法已經證明是昂貴的-並且通常不能提供超過常規效率80％的效率，儘管已經報導了95％的效率。而且，此前使用的方法有時會使得光電倍增管超負荷，而導致相對高的背景噪音對信號比和無法接受的大量錯誤性別精子。
Johnson和Pinkel在Cytometry 7268-273(1986)中的教導提供了兩個螢光檢測器，一個在90度，第二個在0度。這些檢測器同時從精子核的邊緣側和扁平側收集螢光信號。在90度的螢光檢測器用於確定垂直於第二螢光檢測器的單個精子的方向，第二檢測器測量螢光量級並因此測量精子的總DNA含量(以及性別)。
Lawrence Johnson在屬於XY Inc.的US 5,135,759中公開的現有技術教導了一種方法，其測量兩個檢測器的螢光量級以提供相應數據。即，用螢光來確定任何所給精細胞的方向和DNA含量(性別)。此Johnson專利使用折射的非螢光光線發射，不能看到確定方向的新概念。
Johnson方法/裝置完全地基於一種改良的流式細胞儀。流式細胞儀是分析單個細胞和把細胞分成3個群體的常用實驗室工具。本質上流式細胞儀把細胞注射到一種鞘流系統，其將細胞梳理為單列並將它們定向到一個光學/聚焦平面中。取決於內幾何學，噴嘴也可以將細胞徑向定向在鞘式流體流中。
然後在來自噴嘴的壓力下把細胞噴射為小滴的流，每個小滴理想上包含單個精子(一些小滴包含多個精子而一些不含)。單個精子通常在小滴內光學地分析，通過對單個小滴施加根據分析確定的正、負或零電荷，然後將所述小滴穿過帶電的偏轉平面，揀選為單個群體而達到。無需詳述，此過程是有問題的，尤其在高速時。然而XY Inc.聲明揀選純度90-98％依賴於操作速度，即速度越高，揀選的準確性越低。
Johnson/XY，Inc.方法的一個顯著缺點是揀選的精子的存活度。小滴以高速離開噴嘴，並且取決於揀選速率，小滴的速度可以到達每秒20米的速率，導致巨大壓力作用於精子而作用於收集導管中的流體或其壁。小滴在空氣中流動也將精子暴露於氧化脅迫，認為這種脅迫可能影響精子存活度並導致活精子產量相對較低。
US 6,263,745、US 6,357,307US 6,604,435公開了各種噴嘴系統。這些文獻形成了同一發明的不同方面。它們都涉及對流式細胞儀的改良噴嘴系統，大致描述了一種加速精細胞運輸的方法，有希望地在將要被揀選和分析的正確方向。US 5,985,216。此文獻描述了一種錐形的揀選噴嘴。報導它能夠從一個樣品中對期望的和存活的精子類型定向和允許揀選。上述文獻都未公開本發明的新方面。
WO98/34094教導了一種適於流式細胞儀的上射照明(epillumination)系統，其不要求精子被對準或定向。它有效地組織並指導收集流式細胞儀的發光的樣品流的螢光，通過使用拋物面或橢圓體形的收集器。』094方法給出了相對低的通道流動並可能危及細胞存活度。
WO01/85913描述了一種分析攜帶X和Y的精子的DNA體積的方法。此文獻討論了使用電磁輻射(或僅僅電磁輻射的光)和改良的差分幹涉反差光學來測量性別差異特徵，諸如精細胞頭部的體積。電磁輻射可以是雷射、微波或紫外光。』913文獻的核心攻擊了螢光測量導致的定向、失真讀數和背景信號的問題。此文獻陳述了這「能夠使得光電發射光中的小差異可被區分，甚至當每次光電發射事件發出的總光線高時，或者甚至當每秒有大量光連續事件時」。此』913專利測量了相位偏移中的微小改變，即光的波形特徵在穿過精子之前和之後的差異。此文件教導了使用複雜的改良幹涉光學和偏振光來確定樣品方向。並未預期使用相位對比或暗場光學來測量折射的非螢光光線來確定樣品方向。
因此需要一種簡單和有效的方法和裝置，其能夠使單獨細胞準確和快速地從細胞群體中被揀選，並且其中的細胞保持存活。
發明目標本發明的一個目標是提供一種改進的方法和/或裝置來選擇期望的細胞、或細胞部分，或是一種避免或最小化前述缺點的，或將至少給公眾提供一種有用的選擇。
發明概述因此，本發明的一個方面提供了一種方法來確定一種流程中的一個細胞的方向，其中所述方向用於允許確定細胞由於大小、質量、體積或密度的差異，並且因此由測量非螢光光線而確定細胞方向。
優選地，由使用通帶濾片以排除除了一種相位對比光學系統或一種使用暗場光學技術的系統以外的所有光來確定方向。
優選地，此細胞是非球面細胞。
優選地，此細胞是精細胞。
優選地，確定細胞方向的方法不要求細胞包被在小滴內。
優選地，確定細胞方向的方法與測量細胞的DNA含量的方法協作。
優選地，確定細胞方向的方法與測量細胞的DNA含量的方法同時使用。
優選地，確定細胞方向的方法用於選擇期望的染色體組的精子的方法中。
優選地，確定細胞方向的方法進一步用於一種方法來區分攜帶X染色體的精子和攜帶Y染色體的精子和/或選擇具有期望性別的細胞群體。
因此，本發明的第二個方面提供了一種方法來選擇期望的細胞或細胞部分，此方法具有以下步驟(i)將合適地維持的細胞從細胞樣品穿過到測試區域中，(ii)將所述感興趣的細胞樣品暴露於具有第一波長的第一光源，(iii)將所述感興趣的細胞樣品暴露於具有第二不同波長的第二不同光源，(iv)收集在以上(ii)和(iii)發射的光能，(v)分析在(iv)收集的光以確定是否達到期望的預先確定參數，(vi)選擇達到所述期望參數的細胞或細胞部分，(vii)將所選擇的細胞收集到合適地保持存活度的培養基中，和/或(viii)除去不需要的細胞或細胞部分作為廢物。
優選地，細胞是精細胞。
優選地，精細胞以合適的DNA-特異性結合螢光染料染色。
優選地，第一光源是在所述DNA特異性結合螢光染料中激發螢光的合適波長。
優選地，第一光源形成有一種或多種波長的發射螢光，以使得分析精細胞的DNA含量。
優選地，螢光染料選自SYBR green I、SYBR green II、SYBR gold、和雙苯醯亞胺(Bisbenzimide)H33342。
優選地，第二光源用於確定細胞的方向。
優選地，第二不同光源使用一種衍生自相位對比光學系統或使用暗場光學技術的光源。
優選地，細胞同時暴露於所述第一光能和第二不同光能。
優選地，細胞穿過一個定位裝置，其中細胞的方向被流體力學地定向以達到相對於檢測器的均一徑向幾何學。
優選地，測試區域是矩形的容納區域，其適於在分析過程中保持單獨細胞最優選地精細胞的方向。
優選地，將要測試的細胞被以足以維持和保持細胞存活度的流動速度運送到矩形測試區域，優選地以每秒超過1,000細胞，最優選地在每秒1,000至100,000細胞之間。
優選地，將要測試的細胞被以每秒從5,000至40,000細胞的流動速度運送到矩形測試區域。
本發明的第三方面提供了一種裝置以選擇期望的細胞或細胞部分，此裝置包括(i)從感興趣的細胞樣品把合適地維持的細胞傳遞到測試區域的裝置，(ii)將所述感興趣的細胞樣品暴露於具有第一波長的第一光源的裝置，(iii)將所述感興趣的細胞樣品暴露於具有不同波長的第二不同光源的裝置，(iv)收集和如有必要的話，放大所述樣品在(ii)和(iii)發射的光的單獨裝置，(v)分析由單獨裝置(iv)收集的數據以確定是否達到期望的預先確定參數的裝置，(vi)選擇、收集和維持細胞在存活狀態達到所述期望的預先確定參數的裝置，和/或(vii)除去不需要的細胞或細胞部分作為廢物的裝置。
優選地，所述第一光源是電磁輻射源，諸如雷射。
優選地，所述第一光源適於允許分析細胞的DNA含量。
優選地，所述第二光源衍生自相位對比光學系統或使用暗場光學技術的系統。
優選地，所述第二光源適於確定細胞的方向。
優選地，在暴露於所述第一光源之後收集從所述樣品發射的光的所述裝置包括一個或多個顯微鏡物鏡或類似物。
優選地，在暴露於所述第二光源之後收集從所述樣品發射的光的所述裝置是一種光學檢測系統，適於收集非螢光波長的光能。
優選地，所述分析和辨識裝置是多通道分析器或裝有合適地開發的計算機軟體程序的計算機。
本發明的第四方面提供了一種運輸裝置以從樣品注射管經由流體力學徑向地定向的噴嘴以層流運輸合適地維持的精細胞並流向測試區域，所述運輸裝置包括具有第一末端部分和第二末端部分的細長管，包括一噴嘴的第一末端部分，包括預-收集或減速區域的第二末端部分，並且其中，第一和第二末端部分分開在一大致矩形的截面測試區域的兩側，並且其中，包括所述噴嘴的所述第一末端部分具有第一末端和第二末端，所述第一末端適於與一個樣品注射管連通以接收所述樣品，所述第二末端靠近所述測試區域，所述噴嘴的大小和形狀足以維持所述精細胞在流體力學徑向方向的層流，且包括所述預-收集或減速區域的所述第二末端部分構造為搬運精細胞到收集裝置，如此所述細胞在離開測試區域之後被維持在存活狀態，適於用在體外或體內授精步驟。
優選地，預-收集或減速區域從大致矩形截面的測試區域向外展開。
優選地，在使用中，當細胞從注射管傳遞到運輸裝置時，定向噴嘴將單獨細胞定向並維持在一個位置，其允許每個單獨細胞穿過具有第一波長的第一光源，並允許所述細胞發射的光被檢測並分析DNA質量，並且其同時允許所述細胞穿過具有第二不同波長的第二不同光源以被檢測並分析正確方向。
優選地，單獨細胞同時暴露於所述第一和第二光源。
本發明的第五方面提供了一種方法以選擇期望的精細胞或精細胞部分，此方法具有以下步驟(i)將從雄性哺乳動物收集來的完整、活精子用合適的螢光染料染色，如此DNA均一地吸收螢光染料，(ii)在一種合適的維持培養基中維持染色的精子，此培養基足以維持精子和/或細胞中包含的DNA在存活狀態，(iii)將含有精子的維持培養基傳遞到合適的激發光源前，導致染色的DNA發螢光，(iv)將含有精子的維持培養基傳遞到兩個裝置，一個裝置用來測量染色的DNA的螢光，另一個用來檢測精子的方向，(v)收集所述精細胞發射的光能，將光能轉化為電信號，並由多-通道分析器或合適地裝有程序的CPU分析電信號，(vi)選擇達到期望的預先確定標準的精細胞或精細胞部分，並(vii)除去不能達到期望的預先確定標準的細胞或細胞部分的一種裝置。
發明概要Lawrence Johnson在屬於XY Inc.的US 5,135,759中公開的現有技術教導了一種方法，其使用90度和0度光學檢測器來收集和測量螢光的量級，以確定任何所給精細胞的方向和DNA含量(性別)。
與之相比，本發明提供了一種新方法，其使用第一檢測器來測量從精子扁平表面的螢光的量級以測量DNA，使用第二檢測器來測量衍生自單獨光源的折射的非螢光光線的量級。單獨光源衍生自相位對比或暗場光學系統的部分以提供方向數據。重要地，所有激發光和螢光以及來自任何其它光源的任何不需要的或異常光都被第二檢測系統由合適的通帶光學濾片排除，從而提供來自凹面的更清晰的信號(即精子扁平表面發射的任何螢光都被排除而不測量)。使用相位對比或暗場光學來測量所述非螢光光線達到了顯著較少的PMT負荷。PMT負荷的減少因此允許較高的處理速率、處理成本的經濟和顯著較高的精子存活度保持，由於較短的單個樣品處理時間。Johnson方法是速度受限的，因為較高的處理速度會導致信號彈跳造成背景噪音對信號的比值不期望的高。
令人驚訝地，本發明人發現一種方法，其中精細胞的方向通過將使用相位對比或暗場技術的光穿過感興趣的精細胞而確定，此方法提供了改進的效率並增加了所得結果的可靠性。換言之，精細胞的方向-確定結果是否應被接受用於進一步分析的正確方向-可以通過測量由精細胞發射的非螢光光線而確定。
使用相位對比光學或暗場光學技術作為一種方法來測量折射的非螢光此前從未被認為是一種確定非球形細胞方向的方法。
本發明也發現，不同於現有技術，在方法的分析和收集階段不需要將感興趣的細胞包被或限制在帶電的培養基中。以前，一旦已經確定了精細胞的DNA含量，細胞就被包被在附帶有電荷的小滴中，此電荷取決於細胞的X或Y性染色體含量。然後基於小滴容納的電荷而分離小滴。本發明僅僅基於分析器程序中預先確定的參數而選擇具有期望性別染色體的細胞。如果達到標準，細胞不被處理地通過，並保持在存活狀態，適於體內或體外授精使用。如果未達到標準，細胞可以永久固定穿過質膜的滲透性，通常由熱傳遞，但並非必需地，由暴露於雷射，或部分地或完全地由燒蝕光解方法而破壞，通常由暴露於雷射。
本發明還教導了使用位於定向噴嘴下遊的矩形測試區域。從定向噴嘴出現的細胞可以被保持在正確的徑向方向以允許準確地DNA分析。已經發現，本發明的測試區域的大致矩形構造提供了所獲得結果的較高準確度和可靠性。此前的測試方法將被測量的細胞保持在圓形的橫截面流或液態小滴中，當細胞離開噴嘴時，其是大致橢圓或圓形結構的。這種結構儘管允許期望方向的商業上可接受的細胞流動率，但也造成了誤差，由於被液流或小滴的曲面折射的光是被測量的。
重要地，這種矩形測試區域提供了4個扁平表面。這種改進導致比使用曲面的系統顯著減少不需要的折射光，因此排除了錯誤讀數。同樣地，提供了4個扁平表面提供了比此前公開的系統大大改善的可靠性。
本發明因此包括至少4個新部分，其方面此後將以更深度地列出。第一，本發明使用相位對比或暗場光學來確定相對於DNA測量檢測器期望的細胞方向。第二，本發明不要求感興趣的細胞被包被在小滴中或以其它方式以使得期望的細胞被物理地與不需要的細胞分離開。第三，使用大致矩形的測試區域減少了不需要的光對方法的影響測量。第四，本發明教導了一種雷射促動裝置來臨時或永久地固定不需要的細胞或甚至破壞不需要的細胞。
因此，上述特徵提供了優於現有的細胞選擇/揀選方法顯著的、令人驚訝和新的優勢，尤其是優於那些所指為精細胞的性別的選擇方法。
發明詳述以下實施例僅為示範性的，其中特定整數是指具有已知等價物的，認為這種等價物合併於此處，如同單獨地提出的。
實施例僅僅描述了優選的實施方案，並非限制性的。
本申請特定地相關於選擇攜帶期望的性染色體的精細胞。現在可達到提供純度為95％或甚至98％或更高的存活的帶有X染色體的精子的群體或帶有Y染色體的精子的群體的能力。


本發明的各種其它目標和特徵以及附帶優勢將會更完全地被理解，當它們與附圖結合理解時，其中相似的參考數字在多幅圖中指相同或類似部分，並且其中圖1是表示系統方法學的示意圖。
圖2是整個方法的流程圖。
圖3表示運輸裝置。
圖4圖示注射管、運輸裝置和收集點的關係。
圖5表示由圖4的『A-A』線，組成裝置的部件的截面關係。
圖6提供了包括各部件的裝置的綜觀。
實施例1現在轉向圖1至6，詳述了本方法中涉及的各裝置和方法步驟。
將要根據性別特徵區分的活精子通過標準收集技術收集，並維持在合適的培養基諸如Tris緩衝培養基中。細胞內的DNA以非毒性的螢光染料染色，優選地SYBR green I、SYBR green II、SYBR gold或雙苯醯亞胺(Bisbenzimide)H33342。完整的染色精子然後置於由光學纖維或中空的玻璃纖維(26)提供的螢光激發能源下。優選的激發波長是約488-497mm並取決於所使用的特定螢光染料。發射的信號由螢光收集物鏡(11)或類似物收集，由光倍增管(PMT)(18A)測量，並由裝有合適程序的CPU/分析器(19)處理/分析以確定單獨精子的方向。如果在分析後，所研究的細胞達到期望的標準，選擇、收集精細胞，並維持在合適的維持液體中-為了之後用於體內或體外授精步驟。
沒有達到預先確定標準的細胞可以由熱傳遞過程(通常但並非必需地由暴露於雷射)永久地固定，或者由燒蝕光解方法而破壞，通常由暴露於雷射(20)。
現在參考圖1、3-6，單列的單獨精細胞被允許穿過一個噴嘴(8)(見圖3)進入測試區域(10)。測試區域(10)(見圖5)通常是矩形的，其大小允許單獨精細胞被容納並且保持它們的方向為了DNA分析。精細胞的流動在整個過程中是連續的。預期的處理流動率為每秒約10,000至35,000精子，儘管每秒1,000至100,000的流動率也認為是可能的。流動率將是使得精子保持存活的並取決於系統因子。因子包括系統運行的壓力，其大約在30psi和70psi之間，強度/PMT負荷和雷射重複頻率為約3至300KHz。
DNA分析和選擇期望的精子包括兩個階段。這些階段優選地同時進行，但不是必需的。可能有一些情況時這些階段是伴隨的，例如當分析後單獨精子排成列而在不需要的精子被固定化之前。還可能有一些情況是當離開測試區域的精子在取決於預先確定標準被保持或丟棄之前經歷進一步測試時。
在階段A，一個單獨精細胞(1)已經預先用螢光染料染色了。螢光染料結合於DNA。螢光染料結合DNA的量取決於存在DNA的量。由於X染色體比Y染色體含有更多DNA，雌性精子(X)將比雄性精子(Y)吸收更多可測量的螢光染料。
吸收的螢光染料越多，發射的螢光越多，可以測量各螢光細胞之間的差異。
單獨精細胞穿過矩形測試區域(10)並暴露於由中空矩形玻璃纖維(26)輸送的螢光染料激發光源(27)。結合於DNA的螢光染料被激發和發螢光。由一個物鏡(11)收集螢光，由合適的通帶濾片(24、25)過濾以濾去所有非螢光光線並由PMT(18A)收集，並發送到裝有合適程序的CPU/分析器(19)以分析。
參考圖1，階段B與階段A同時工作。這裡，到達矩形測試區域(10)的單獨精子(1)置於相位對比或暗場光學電容器(22)從而收集被測試精子發射的折射非螢光光線。通帶濾片(24)用於確保排除了任何殘留的螢光或任何其它不需要的發生在帶寬(450nm-550nm)之內的光。折射的光任意地過濾過另一濾片(24)以排除熱傳遞或燒蝕光分解雷射發射的電磁能，由PMT(18)收集，並運輸到裝有合適程序的CPU/分析器(19)以分析。使用上述相位對比或暗場方向確定方法基本上要求除了衍生自相位對比系統(16、22、22A)的電磁能以外其它所有可測的電磁能都被90度的PMT系統排除而不測量，由提供合適的光學濾片(23、24)。
一完成分析，未達到預先確定標準的細胞由熱傳遞方法永久固定，或由燒蝕光分解裝置(雷射)破壞。雷射/固定輸出(21)位於分析/測量操作點的下遊並由CPU/分析器(19)控制。
圖1由以下描述1.細胞
10.測試區域(矩形地構造以提供四個大致扁平的表面)11.螢光收集物鏡16.相位對比或暗場物鏡17.預-放大器(任選)18.PMT18A.PMT19.CPU/分析器20.固定外部觸發的Q-開關雷射或燒蝕外部觸發的Q-開關雷射21.光學纖維或中空的矩形玻璃纖維以運輸固定或燒蝕能22.相位對比或暗場電容器22A.用於相位對比或暗場光學系統的第二光源23.通帶濾片以排除450nm-550nm的波長24.通帶濾片以排除來自20的異常的不需要的光25.通帶濾片以排除所有非螢光的波長26.提供螢光激發光的光學纖維或中空矩形玻璃纖維27.螢光激發光源還預期了包括第二幾何軸向運動系統的一種裝置，其允許對將要收集的期望細胞柔和地減速，經由一個吸液管或類似物收集並維持在一種合適培養基中為了之後的使用。收集裝置位於運輸裝置和測試區域的下遊，作用相似於河流系統中的丁壩。見圖4。
實施例2圖3至6所示的裝置描述了機制，通過此機制合適地保持的完整精子被提供用於如上所述的測試。
在一個實施方案中，運輸裝置由一個具有五個功能區域的細長管界定。在第一個區域即定向區域，離開樣品注射管(110)的大部分精子(1)(優選地具有傾斜的注射尖以最小化由入口點(18)進入噴嘴的鞘流對層流的效應)，定向為進入測試區域(10)的期望位置以分析。噴嘴的獨特內部幾何學與鞘流的層流結合產生特殊的流體動力學力，其提供精子的一種流，其大部分在用於測試的正確方向。由一個大致矩形截面的管(5)達到維持精子的方向，其鄰近一個噴嘴(8)。方向維持區域的下遊是第二區域即測試區域(10)。在分析後，不需要的精子被固定或排出在第三區域。第四區域是減速預-收集區域(『3-3』)，在被選擇的期望性別的存活精子被收集到第五區域即收集區域之前。收集的細胞維持在合適的環境(4、41)中用於選擇後用途。
測試區域(10)大致是個空腔、管或孔，其大小和形狀足於容納和維持單獨細胞的方向並允許測試、分析和隨後選擇達到期望標準的細胞。在一個實施方案中，矩形測試區域的小軸在截面觀看時是大約32μm，長軸是70μm。
尤其是，矩形截面管(5)維持了精細細胞(delicate cell)由噴嘴(8)產生的方向，並使得細胞以單列(file)進入測試區域(10)通過第一光源。第一光源優選地衍生自雷射。用合適的螢光染料諸如SYBR I、SYBR II、SYBR gold、雙苯醯亞胺(bisbenzimide)H33342等染色的細胞被激發，發螢光並測量螢光的量級。例如SYBR II，在488nm處具有峰值激發，在525nm處具有峰值發射。
與上述同時，單獨精細胞暴露於第二不同的光源，諸如衍生自光相位對比或暗場系統的光。此光源垂直地設立於第一光源。被測試的精子發射光。捕獲光，放大並由多通道分析器或合適的計算機分析工具分析。
精子穿過第一光源時發射的螢光用於鑑定精子攜帶的是X染色體還是Y染色體。精細胞從第二不同光源折射的非螢光光線提供了改良地確定其方向。
實施例3考慮到圖3-6，發明人使用了實施例2中描述的新的流體動力學徑向定向的噴嘴(8)來將單獨精子徑向定位進入位於噴嘴「出口」(『A-A』)的矩形截面毛細管。定向噴嘴(8)的出口鄰近測試區域(10)。這使得從樣品注射管(110)發射的精子建立理想的徑向和焦平面方向，同時如光學分析所要求的穿過噴嘴。作為一個結果，更多部分進入測試區域(10)的單獨精子將會正確地與螢光物鏡(11)校正以便於鑑別測試區域(10)內單獨精子的染色體組。測試區域的下遊一種高速雷射(20)永久地固定或破壞不確定性別的精子，即未能正確定向的和並非期望的染色體組的精子。
一旦完成加工，精子柔和地減速通過柔和地變細的減速區域或預-收集區域(『3-3』)進入收集管(未顯示)。
獨特的預-收集/減速區域是毛細管的柔和擴張的延長物。已經觀察到，發散的角度和擴張的長度直接影響減速速率。一個實施方案中的預-收集區域採用「P」彎管(4)的形式並位於減速區域的末端。「P」彎管(4)預先裝有在開始處理前稀釋到所示水平(41)的精子以阻止從分析/處理區域噴射。
為了體外授精的目的，不能遊動的/死精子可以由矽石膠態懸浮液(percoll)密度梯度離心或如對IVF預計的漂浮(swim-up)技術移去。熟練的讀者將明白任何非活性、不能遊動或死亡的精子是不能用於體外授精應用的。
實施例1至3描述了現有技術與本發明的關鍵差異，即使用相位對比或暗場光學系統或類似的，用於確定單獨精子(90度檢測器)相對於DNA檢測器(0度檢測器)的方向。這提供了獲得令人驚訝的系統效率，並提供了較高的加工速度，增加分析的準確度，通過非-超負荷光倍增管(PMT)。
實施例4來自樣品注射管(110)和通過流體力學定向噴嘴(8)的精子的顯著高比例在進入測試區域(10)之前被正確地校正，如上所述。一進入測試區域，單獨精子就同時被在90度的相位對比或暗場光學(16、22、22A)分析方向和被0度(11)的螢光檢測器分析DNA含量，如圖6所示。收集數據並由CPU/分析器(19)處理數據，使用固定的外部觸發Q-開關雷射(20)選擇期望性別的精子，優選地在2.69μm波長發射，儘管其它波長也可以使用，或可以使用採用其它波長的燒蝕外部觸發Q-開關雷射。
不用說，選擇/固定化階段在測試區域的下遊發生，並在進入減速/預-收集區域之前。已經發現，2.69μm雷射系統很好地適於本發明的精子性別方法，因為它輸送所需的動力、穿過和吸收性能。
上述固定化雷射(儘管一些詳述可以在整體工作要求內改變)的詳述為·波長2,690nm(或對較高穿過但較低吸收的2,620nm，還沒對這個波長計算)·固態。摻雜鉻、銩、鉺的YAG晶體(CTE:YAG)(儘管可以使用二極體雷射，假如在所需的重複頻率和脈衝寬度水平能產生足夠動力)·外部觸發的Q開關·脈衝寬度大約500ns·重複頻率-可變地至300kHz·分裂波束，脈衝輸送通過兩個直接相對的脫水的(低OH)矽光學纖維或中空的矩形低OH玻璃纖維。在樣品界面的內核或中空中心輸送纖維的表面測量＝70×10μm帶有圓末端的矩形，成形自展平的直徑30μm(內核)的光學纖維，或電磁能可以由兩個基本矩形截面的空心、低OH玻璃纖維，中空部分為約70μm×32μm。
·外部觸發的Q開關雷射將回復到脈衝之間非常低的動力CW校正模式以維持諧振器的正確內部熱狀態。
讀者將會明白，只有正確定向的細胞可以用於準確預測DNA含量並因此預測精子的性別特徵。
本詳述(包括任何附帶權利要求、摘要和附圖)中公開的所有特徵，和/或公開的任何方法或工藝的所有步驟，可以組合在任意組合中，除了至少一些這種特徵和/或步驟被互相排除的組合。
服務於同樣、相當或類似目標的可替換特徵可以取代本詳述(包括任何附帶權利要求、摘要和附圖)中公開的各特徵，除非另外明確指出。因此，除非另外明確指出，公開的每個特徵僅僅是相當或類似特徵的一類系列的一個例子。
本發明不受限於前述實施方案的細節。本發明擴展到本詳述(包括任何附帶權利要求、摘要和附圖)中公開的各特徵中的任何一個新的、或任何新的組合，或擴展到如此公開的任何方法或工藝的步驟的任何一個新的、或任何新的組合。
優勢本發明具有以下優勢的一個或多個△相對廉價△允許優良的樣品流動率△提供所收集樣品的純度增加△所選樣品的存活度改進△提供增加的效率△更容易機械操作△改進的可靠性△增加樣品定向的可靠性變更已經描述並以示例的方式圖示了本發明的一些優選方面，但將要理解的是，對本發明的其它變更和改變也可以發生而不離開本發明。
例如，可以想像，儘管本詳述主要地是指選擇攜帶X和Y染色體的精細胞，也可以設想從血液樣品中選擇紅細胞或白細胞，或者從合適地製備的樣品選擇革蘭氏陰性菌。
使用這種方法來分離和選擇感興趣的病毒也是一種選擇。
熟練的讀者也將立刻意識到，除去不需要的波長的光能也取決於所研究的樣品而變化。類似地，儘管使用波長在2.69μm的光學/中空纖維布置對於實施例中所指的固定或燒蝕雷射是優選的，不那麼合適但更完美適當的波長可以由空氣輸送。事實上，一些可能的波長不適於纖維輸送。相應地，儘管螢光可以由空氣輸送，優選的是螢光激發波長由纖維光學輸送。
也將理解的是，所指的一個細胞也可以是指一個細胞部分並尤其是指一個細胞的成分，諸如核DNA、線粒體DNA、RNA，或指有機體或病毒，其已經侵襲了所述細胞，或並非通常發現在細胞中，或伴隨所述細胞或所述細胞部分。
本文件描述了使用本發明關於從農業上重要的動物選擇具有期望性別的精子，但一個熟練的讀者將立刻意識到，以上描述的方法和裝置將可以應用於對所有有胎盤哺乳動物選擇期望性別的精子。
在本詳述的描述和權利要求中，詞語「包括」和其變化形式諸如「包括」和「包括著」，不意味著排除其它附加物、組成、整體或步驟。
參考文獻1.M.Montag，K.Rink，G.Delacretaz H.van der Ven，2,000.Laser-inducedimmobilisation and plasma membrane permeabilization in human sperm.Human Reproduction， Vol 15，No.4，846-852.
2.V.Kachell，et al.1977.Uniform Lateral Orientation caused by Flow Forces，of Flat Particles in Flow through Systems，Journal of Histochemistry andCytochemistry，Vol.25，No.7，pp.774-780.
3.XY，Inc.PCT Patent Application 15 Nov 2001 No.WO 01/85913 A24.XY Inc.US Patent 12 August 2003，US 6,604,435 B25.G.M.Hale and M.R.Querry，Optical constants of water in the 200nm to200um wavelength region，Appl.Opt.，12，555-563，(1973).Web page-http//omic ogi edu/spectra/water/data/hale73.dat
6.US 6,263,745,US 6,357,307 US 5,985,216 to nozzle systems.
7.WO 98/34094.
8.L.A.Johnson and D Pinkel，″Modification of a Laser-based FlowCytometer for High Resolution DNA Analysis of Mammmalian Spermatozoa″，Cytometry 7268-273(1986).
權利要求
1.確定非球形細胞在一過程中的方向的第一方法，其中所述方向用於在第二方法中由於細胞或細胞部分的大小、質量、體積或密度差異從細胞樣品選擇期望的細胞或其部分，所述方法特徵在於，細胞的方向通過測量由相位對比或暗場光學系統提供的折射非螢光光線而確定，所述折射非螢光光線已經先穿過一個或多個通帶濾片，其足以排除除了來自相位對比或暗場光源以外的所有波長。
2.根據權利要求1所述的方法，當與所述第二方法協同和優選地同時使用來選擇期望細胞或細胞部分時，其中所述細胞或細胞部分的大小、質量、體積或密度的差異通過測量所述細胞或其部分的DNA含量而確定。
3.根據權利要求2所述的確定非球形細胞或其部分的方向的方法，其進一步用於在一種方法中通過測量單獨精細胞的DNA質量自攜帶Y染色體的精子選擇出攜帶X染色體的精子。
4.根據前述任一權利要求所述的方法，其中選擇期望細胞或細胞部分的方法包括以下步驟(i)將合適地維持和定向的細胞或細胞部分從感興趣的細胞樣品運輸到一測試區域，(ii)將所述感興趣的細胞樣品暴露於具有第一波長的第一光源，(iii)將所述感興趣的細胞樣品暴露於具有第二不同波長的第二光源，(iv)由合適檢測器收集在以上(ii)和(iii)發射的光能，(v)分析在(iv)收集的光以確定是否達到期望的預先確定參數，(vi)選擇達到所述期望參數的所述細胞或所述細胞部分，(vii)將所選擇的細胞收集到合適地維持存活度的培養基中，和/或(viii)固定或破壞不需要的細胞或細胞部分。
5.根據權利要求4所述的方法，其中將被選擇的細胞是攜帶X染色體或攜帶Y染色體的精細胞。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其中所述精細胞以合適的DNA特異性結合螢光染料染色。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述螢光染料選自SYBR greenI、SYBR green II、SYBR gold、和雙苯醯亞胺(Bisbenzimide)H33342。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述第一光源是一種適於提供螢光的激發光源，優選地在從488nm-497nm處具有峰值激發。
9.根據權利要求4至8中任一所述的方法，其中所述第一光源用於使螢光染料處理的細胞發螢光，從而產生足夠的螢光來測量精細胞的DNA含量。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述第一光源用於使螢光染料處理的細胞發螢光，從而產生足夠的螢光來測量精細胞的DNA質量。
11.根據權利要求4至10中任一所述的方法，其中所述第二光源用於確定所述精細胞的方向。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述第二光源包括相位對比或暗場光學系統的部分和一個或多個通帶濾片，所述濾片足以排除所述第一光源發射的激發光和螢光波長以及固定或燒蝕裝置發射的任何不需要的、異常光。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述細胞同時暴露於所述第一光源和第二光源。
14.根據權利要求13所述的方法，其中精細胞穿過適於流體力學地定向單獨精細胞的樣品定向裝置，以使大部分精細胞對所述第一和第二檢測器呈現為均一的方式，所述定向裝置適於運輸存活的單獨精細胞到測試區域，並且其中所述測試區域是一個大致矩形的容納區域，適於容納和維持單獨精細胞的方向，用於檢測、測量DNA，以及依據一個或多個預先確定的選擇參數的選擇、固定或破壞。
15.根據權利要求14所述的方法，其中將待測試的所述精細胞，以每秒超過5,000細胞的流速，優選地以每秒超過10,000精細胞的流速，運輸到一個矩形測試區域。
16.根據權利要求15所述的方法，其中分析每個單獨精細胞以確定它在測試過程是正確地校正的，正確地校正表示讀數真實，並且其中一旦每個細胞的DNA含量已經被測量以確定其性別，細胞呈現為不能授精或相反，取決於單獨精細胞是否是期望的染色體含量和維持在合適的培養基中。
17.一種選擇期望細胞或細胞部分的裝置，所述裝置包括(i)從感興趣的細胞或細胞部分的樣品把合適地維持和定向的細胞傳遞到測試區域的裝置，(ii)將所述感興趣的細胞樣品暴露於具有第一波長的第一光源的裝置，(iii)將所述感興趣的細胞樣品暴露於具有不同波長的第二不同光源的裝置，(iv)收集和如有必要的話，放大所述樣品在(ii)和(iii)發射的光的單獨檢測裝置，(v)分析由單獨檢測裝置(iv)收集的數據以確定是否達到期望的預先確定參數的裝置，(vi)收集、選擇和維持期望的細胞在存活狀態達到所述期望的預先確定參數的裝置，和/或(vii)固定或除去不需要的未達到所述預先確定參數的細胞或細胞部分的固定或燒蝕裝置。
18.根據權利要求17所述的裝置，其中待測試的所述細胞或細胞部分是完整的存活的精細胞。
19.根據權利要求18所述的裝置，其中所述精細胞以每秒超過5,000細胞的流速，優選地以每秒超過10,000精細胞的流速被運輸到一個矩形測試區域。
20.根據權利要求18或19所述的裝置，其中被選擇的精細胞包括大致同源性別的活精細胞群體，所述群體具有攜帶X染色體的群體或攜帶Y染色體的群體，純度為大於95％，優選地純度為大於98％。
21.根據權利要求17至20中任一所述的裝置，其中所述第一光源是一種激發光源，優選地在488nm波長處具有峰值激發並在525nm處提供峰值發射，取決於所用的DNA-結合螢光染料。
22.根據權利要求17至21中任一所述的裝置，其中所述第一光源用於分析細胞的DNA含量。
23.根據權利要求17至22中任一所述的裝置，其中所述第二光源使用相位對比或暗場光學和一個或多個通帶濾片，所述濾片足以排除所述第一光源發射的激發光和螢光波長以及固定或燒蝕裝置發射的任何不需要的、異常光。
24.根據權利要求17至23中任一所述的裝置，其中每個單獨細胞同時暴露於所述第一和第二不同光源。
25.根據權利要求17至24中任一所述的裝置，其中所述收集所述樣品暴露於所述第一光源之後發射的光的裝置，包括相位對比或暗場光學系統的部分。
26.根據權利要求25所述的裝置，其中所述收集所述樣品暴露於所述第二光源之後發射的光的裝置是能夠收集非螢光波長光能的光學檢測器。
27.根據權利要求17至26中任一所述的裝置，其中所述分析裝置是多通道分析器或裝有合適地開發的計算機軟體的計算機。
28.根據權利要求17至27中任一所述的裝置，其中所述提供所述第一光源和固定或燒蝕裝置的裝置是纖維光學運輸系統，優選地包括空心的低OH玻璃纖維。
29.一種運輸裝置，其適於根據權利要求1-16中任一所述的方法，連續地從樣品注射管由一個流體力學徑向定向的噴嘴運輸單獨的完整、存活精細胞到一個測試區域、一個減速或預-收集區域和一個收集裝置，所述運輸裝置包括一細長管，其包括第一末端部分和第二末端部分，所述第一末端部分包括一個噴嘴，所述第二末端部分包括一個預-收集或減速區域，並且其中，所述第一和第二末端部分分開在大致矩形截面測試區域的兩側，並且其中，包括所述噴嘴的所述第一末端部分具有第一末端和第二末端，所述第一末端適於與所述樣品注射管連通以接收所述樣品，所述第二末端靠近所述測試區域，所述噴嘴的大小和形狀足以維持大部分所述精細胞在期望的流體力學徑向方向的層流中，且包括一個預-收集或減速區域的所述第二末端部分構造為搬運精細胞到收集裝置，以使所述細胞在離開所述測試區域之後，所選擇的精細胞被維持在存活狀態，適於用於體外或體內授精步驟。
30.根據權利要求28所述的運輸裝置，其中所述預-收集或減速區域從所述大致矩形截面的測試區域向外展開。
31.根據權利要求29或30所述的運輸裝置，其中所述預-收集區域包括一系列格柵或丁壩，其足以在測試後當單獨精子從所述測試區域到所述收集裝置時對單獨精子減速。
32.根據權利要求29至31中任一所述的運輸裝置，其中在使用中，當細胞從注射管傳遞到所述運輸裝置時，定向噴嘴將大多數單獨細胞的正確方向維持在一個位置，其允許每個單獨細胞穿過具有第一波長的第一光源，並允許所述細胞發射的光被檢測並分析DNA質量，並且其同時允許所述細胞穿過具有第二不同波長的第二不同光源以被檢測並分析正確方向。
33.一種選擇適用於體內或體外授精的期望存活精細胞的方法，所述方法具有以下步驟(i)將從雄性哺乳動物收集來的完整、活精子用合適的DNA特異性結合螢光染料染色，如此DNA均一地吸收螢光染料，(ii)在一種合適的維持培養基中維持染色的精子，此培養基足以維持精子和/或細胞中包含的DNA在存活狀態，(iii)將含有精子的維持培養基傳遞到合適的激發光源前，導致染色的DNA發螢光，(iv)將含有精子的維持培養基傳遞到兩個裝置，一個裝置用來測量染色的DNA的螢光，另一個用來檢測精子的方向，(v)收集所述精細胞發射的光能，將光能轉化為電信號，並由多-通道分析器或合適地裝有程序的CPU分析電信號，(vi)選擇達到期望的預先確定標準的精細胞，並(vii)固定或破壞不能達到期望的預先確定標準的細胞。
34.根據權利要求1-16中任一所述的方法或根據權利要求33所述的方法，用以產生用於體外授精步驟的存活精子。
35.根據權利要求1-16中任一所述的方法或根據權利要求33所述的方法，用以產生用於體內授精步驟的存活精子。
36.一種存活精細胞，其是根據權利要求1-16中任一所述的方法或根據權利要求33所述的方法的產物，來自根據權利要求17-27中任一所述的一種裝置，或來自根據權利要求29-32中任一所述的一種運輸裝置。
37.根據權利要求17所述的選擇期望的細胞或細胞部分的裝置，其參考任一實施例和圖1和圖5基本描述於此。
38.根據權利要求29所述的運輸裝置，其參考任一實施例和圖3、4和6基本描述於此。
全文摘要
本發明涉及使用一種精細胞定向的方法來確定細胞由於大小、質量或密度的差異。諸如DNA質量差異等細胞差異用於將攜帶X染色體的精細胞與攜帶Y染色體的精細胞區分開，然後用於體外或體內授精步驟。單獨精細胞的方向由測量非螢光光線而確定。本方法使用一個檢測器來測量螢光(對精子扁平表面的DNA(性別)測量)的量級，使用第二個檢測器來測量衍生自單獨光源的折射的非螢光光線的量級。單獨光源來自一個相位對比或暗場光學系統的部分以提供方向數據。重要地，所有激發光和螢光都被通帶光學濾片排除在第二檢測系統之外，從而提供來自凹面更清晰的信號(沒有來自精子扁平表面的螢光信號)。據報導，當精細胞的方向由將使用光學相位對比或暗場光學的光穿過目標精細胞而確定時，提供了所獲得結果中改進的效率、改進的處理速度和增加的可靠性。本發明的進一步方面描述了用於固定或破壞不需要的精子的固定或燒蝕雷射。
文檔編號G01N21/64GK1918286SQ200580004125
公開日2007年2月21日 申請日期2005年1月19日 優先權日2004年2月5日
發明者安德魯·弗朗汀－羅萊特 申請人:賽萊特Xy有限責任公司