組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片的製作方法

2023-10-05 06:39:54

專利名稱：組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片的製作方法
技術領域：
本發明屬集成微生化分析系統技術，尤其涉及一種用於細胞分離富集的微流控晶片。
技術背景-在化學和生物等領域中，以細胞為主的生物樣品體系的分離是從大量非均一細胞樣品群 體中獲取性質均一的目標細胞的一種技術，常用於細胞生物學、臨床醫學以及藥物研發等領 域，尤其對疾病的檢測、診斷和治療具有重要意義。以微流控晶片作為技術平臺的細胞分離 技術和方法中，集成微流控介電電泳(DEP)晶片已成為國內外研究人員十分關注的新型生化分析技術。目前，相關研究只是藉助介電電泳(DEP)手段作為達到細胞富集的目的，而 將介電電泳分離晶片與微流控技術結合，作為細胞的連續分離、富集和檢測手段的晶片研究 在國內外仍是處於開始階段，有待深入系統的研究和開發。近兩年，最具特色的研究主要是 針對集成化介電電泳晶片系統和DEP生化檢測應用方面的研究。傳統DEP晶片研究主要集中 在通過陣列微電極設計實現微粒的靜態分離富集和顯微觀測方面，對於將微流控技術與微粒 富集分離過程的融合，微粒在DEP過程中特性參數的定性定量測試，以及在晶片上集成傳感 檢測器等尚有待深入研究；對於將DEP晶片應用於細菌和細胞體系實現定量檢測尚在初級階 段，人們十分關注針對生化檢測的更廣泛目標的研究。

發明內容
基於現有技術的不足，本發明提出了一種組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富 集晶片，設計並製作出組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片和相應的控制電 路，並基於該晶片實現了細胞介電電泳分離富集，該晶片可應用於不同種類細胞或細菌的快 速、連續的分離和富集。本發明的技術方案如下 1. 一種組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片，該晶片包括有基片和鍵合在 基片上的蓋片，在所述基片上採用微機電加工技術MEMS工藝加工有兩組夾板式電極，在該片上加工有進樣資道、分離管道、富集管道、樣品池、緩衝溶液池、進樣池和廢液池。所述晶片包括兩組夾板式電極、進樣管道、分離管道、富集管道、樣品池、緩衝溶液池、 進樣池和廢液池，所述進樣管道為"Y"型管道，其進樣端有三個埠，其中一個埠與進 樣池相連，另外兩個埠分別和兩個緩衝溶液池相連，進樣管道的另一端與所述分離管道首 端連接，分離管道的尾端接三條支管道，所述中間支管道為樣品富集管道，樣品富集管道後 埠接樣品池，所述分離管道的尾端的另兩條支管道位於樣品富集管道的兩側並與廢液池相 連；所述兩組夾板式電極，其中一組電極布置於分離管道的底部，用於實現混合細胞樣品的 連續分離，另一組電極布置於富集管道的底部，用於實現單一細胞樣品的連續富集，進樣池 中的樣品與緩衝溶液池中的緩衝溶液經進樣管道混合後進入到分離管道，樣品組分根據自身 的介電特性在兩組夾板式電極產生的非均勻電場的作用下發生介電電泳分離實現樣品的分 離和富集，實現分離的不同樣品分別流入樣品池和廢液池。 本發明具有以下優點1. 將介電電泳原理與微流控晶片技術成功的結合在一起，建立了連續介電電泳細胞分離 富集的方法；2. 採用MEMS工藝加工製作的組合夾板微電極式微流控DEP晶片，具有分離富集電壓低、 功耗少、不損壞樣品生物活性等優點。


-圖1為本發明的夾板式微流控介電電泳細胞分離富集晶片示意圖；圖2為本發明的晶片管道圖；圖3是第一組電極的結構示意圖；圖4是第二組電極的結構示意圖；圖5為本發明的晶片控制電路結構示意圖
具體實施例方式下面根據說明書附圖，通過具體實施例對本發明的技術方案進一步詳細闡述。 圖1為本發明的夾板式微流控介電電泳細胞分離富集晶片示意圖。組合夾板微電極式微 流控介電電泳細胞分離富集晶片結構包括第一、二組夾板式電極4-l和4-2、進樣分離管 道3和富集管道6。參見圖2，進樣分離管道3為Y型管道，埠接有進液池2和兩個緩衝溶液池l，分離管道尾端有三條支管道，中間一條為樣品富集管道6,埠接有樣品池7，其 餘兩個管道直接聯通到廢液池8。圖中5是電極導線。組合式夾板微電極分為兩組，第一組夾板式電極41布置於進樣分離管道3的底部，目的 是實現混合細胞樣品的連續分離，結合圖3，具體由三條平行於管道軸向的平面電極組成， 一條處於中間位置的寬電極B和其兩側的窄電極A,和A2，且電極之間的間距相等；第二組夾 板式電極4-2布置於富集管道6的底部，目的是實現單一樣品的連續富集，參見圖4，它是 由兩條成9(T且互不相連的平面夾板電極組成。在分離區域晶片的結構參數為電極Al和A2的長度L為500 2000u m,寬度U為5 20um,電極B的長度為U500 2000ura，寬度U為30 55 n m，電極之間的間距J為1 20 yra，分離管道長度Lx為800 2200um，分離管道寬度LY為42 160um (如圖2所示)。在富集區域晶片的結構參數為夾板電極寬度L5為5 20ym，電極與管道壁成45。角， 電極長度U為2 0 28 n m，夾板電極間距最小處比為5 10 u m,最大處H2為45 55 y m,富集 管道寬度"為45 55 y m，長度LX1不短於300 y m，晶片微管道整體深度為10 50 y m。晶片微電極和微管道採用基於微機電加工技術MEMS工藝的加工技術製作。基片採用平整 度好、表面具有優良透光性和光潔度的專用光學玻璃材料或石英。通過在基片表面沉積厚度 小於lnm的金膜，獲得兩組DEP夾板式電極，晶片的蓋片採用有微管道的聚二甲基矽氧垸 (PDMS)片，兩者直接鍵合，得到可用於細胞分離富集的DEP晶片。夾板式微電極採用金電 極，首先在玻璃片上鍍鈦膜，然後，通過光刻將設計好的電極結構圖形轉移到晶片上，然後 脫金脫鈦，再經高溫固化後完成玻璃基片上夾板式微電極組的製作。蓋片上微管道的製作， 首先採用聚合物MEMS技術，利用SU-8材料形成要求的微管道陽模，然後採用PDMS聚合物 直接澆注法倒模，經固化後，從陽模上剝離下帶有微管道形狀的PDMS聚合物蓋片，形成如 圖l的深度為30nm微管道網絡。最後，通過清洗和吹乾，直接將含微電極玻璃基片與含微 管道的PDMS蓋片直接鍵合，形成夾板組合式微流控介電電泳細胞分離富集晶片。圖5為組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片的控制電路，晶片基片上的 電極均設計有由金引線，直接引接到PCB板的接線孔。在分離區域，電極A1和A2連接為同 極，其與電極B及外接電源組成一個控制電路；在富集區域，夾板電極為異極並與及外接電 源連接形成另一組控制電路。兩組控制電路由一個雙向開關連接，當開關與分離區域的控制 電路相連接時，富集區域的龜極保持斷路狀態；當開關與富集區域的控制電路相連接時，分離區域的電極保持斷路狀態。這能保證實現按給定時序對所設計的DEP晶片的指定區域施加 高頻低電壓的控制過程。根據介電電泳分離原理，在空間非均勻電場中，懸浮在一定介質中的微粒相對於緩衝溶 液的誘導偶極距不同而產生電遷移。如果樣品微粒比緩衝溶液容易極化，則其向高電場的區 域遷移，形成正向介電電泳；相反，如果它的極化趨勢弱於緩衝溶液的極化度，則其向低電 場區域遷移，形成負向介電電泳。因為不同的樣品微粒存在不同的極化度，因而可以在相同 外加條件下實現分離和富集。為此，本發明將夾板組合式微流控介電電泳細胞分離富集晶片 按功能劃分為分離區域和富集區域。在分離區域的分離管道底部布置三條與管道軸向平行的平面電極Ab B和Az,並設計相 應的外圍電路控制這三條電極，對電極施加電壓範圍在0 20V，頻率範圍在100KHz 20MHz 的低壓高頻交流信號，從而產生一個與管道軸向垂直的非均勻電場。在分離初期，樣品與緩 衝溶液經Y型管道混合後進入到分離管道中，進而樣品組分根據自身的介電特性在非均勻電 場中發生介電電泳分離，並在流動的過程中分別朝電極的邊緣和中間電極B的中心線遷移， 隨流體的驅動，遷移到中間電極B中心線位置的樣品進入到富集區域的富集管道中，而遷移 到電極邊緣的樣品則流向富集區域兩邊的支管道，最終流向廢液池。在富集區域的富集管道底部布置有兩條成9(T的夾板電極，並設計有相應的外圍電路控 制這兩條夾板電極，對夾板電極施加一個電壓範圍在0 20V，頻率範圍在100KHz 20MHz 的低壓高頻交流信號，產生一個與管道軸向平行的非均勻電場。在富集初期，在分離區域實 現分離後進入富集區域的樣品在此處將受到介電電泳力的阻力，進而使分散的樣品組分向中 心線進一步富集，排列成行通過夾板電極的中心，實現樣品的富集過程。下面通過具體實施例，介紹該發明的實施過程。首先進行樣品前處理。採集新鮮血液置 於添加有抗凝劑的燒杯中，然後在低轉速離心機上以2000r/min離心10分鐘，棄去上清液， 然後加入醫用氯化鈉等滲溶液(2.25g/250ml)，安上述方法重複三次即可。然後進行晶片 介電電泳試驗。樣品進樣前，採用壓力進樣方式將PBS緩衝溶液從緩衝溶液池通入到管道中， 然後採用微量注射泵將20ul樣品注入樣品池中，將雙向開關與分離區域控制電路連通，並 施加電壓範圍在1一10V,頻率範圍在l一5MHz的交流信號，樣品在分離區域微管道中完成介 電電泳運動後，將雙向開關與富集區域控制電路連通，並施加相同範圍的低壓高頻交流信號， 樣品在斜向夾板區域產生富集。
權利要求
1.一種組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片，該晶片包括有基片和鍵合在基片上的蓋片，其特徵在於在所述基片上採用微機電加工技術MEMS工藝加工有兩組夾板式電極，在該片上加工有進樣管道、分離管道、富集管道、樣品池、緩衝溶液池、進樣池和廢液池；所述進樣管道為「Y」型管道，其進樣端有三個埠，所述三個埠中的一個與進樣池相連，另外兩個與緩衝溶液池相連，進樣管道的後端與所述分離管道首端連接，分離管道的尾端接三條支管道，中間支管道為樣品富集管道，樣品富集管道後埠接樣品池，所述分離管道的尾端的另兩條支管道位於樣品富集管道的兩側並與廢液池相連；所述兩組夾板式電極，其中一組電極布置於分離管道的底部，實現混合細胞樣品的連續分離，另一組電極布置於富集管道的底部，實現某種細胞樣品的連續富集，進樣池中的樣品與緩衝溶液池中的緩衝溶液經進樣管道混合後進入到分離管道，樣品組分根據自身的介電特性在兩組夾板式電極產生的非均勻電場的作用下發生介電電泳分離實現樣品的分離和富集，分離的不同樣品分別流入樣品池和廢液池。
2. 根據權利要求1所述組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片，其特徵在於 所述布置於分離管道的底部的一組夾板式電極，由三條平行於分離管道軸向的平面電極組成，中間電極與兩側電極的間距相等，所述三個電極與分離管道的管道壁之間的間距相等， 所述兩側電極電連接，為同極性，且與所述中間電極電極性相異，所述兩側電極和中間電極分別通過導線與電源的正負極相連，形成分離區域控制電路；所述布置於富集管道的底部另一組夾板式電極，由兩條成90°且互不相連的平面夾板電 極組成，所述兩個平面夾板電極經導線分別連接於電源的正負極，形成富集區域控制電路； 所述兩組夾板式電極均是在玻璃基片表面沉積1 500nm的電鍍金膜電極。
3. 根據權利要求2所述的組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片，其特徵為 所述布置於分離管道的底部的一組夾板式電極其兩側電極的長度為500 2000um，寬度為5 20um;中間電極的長度與兩側電極相同，中間電極的寬度為30 55"m,中間電極與兩側電極之間的間距為1 20u m;所述分離管道長度大於其底部夾板式電極的長度， 分離管道的長度為800 2200y m，分離管道寬度為42 160u m:所述布置於富集管道的底部另一組夾板式電極該組電極寬度為5 20um，該組兩個 電極與管道壁成45°角，電極長度為2 0 28um，該組兩個電極最小間距為5 10u m, 最大間距為45 55um;所述富集管道寬度為45 55 u m，長度不短於300iim;所述晶片的進樣管道、分離管道、富集管道整體深度為10 50nm，所述電極的厚度小 於1 u m。
4. 根據權利要求1一3之任意一項所述的組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集 晶片，其特徵為所述晶片的基片採用玻璃或石英材料，採用環氧樹脂光刻膠SU-8材料制 備所述三個管道的陽模，再採用聚二甲基矽氧垸聚合物直接澆注倒模，形成三個微管道網絡， 然後，通過清洗和氮氣吹乾，直接將基片與含微管道的聚二甲基矽氧烷聚合物蓋片鍵合，形 成組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片。
5. 根據權利要求2所述的組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片，其特徵為 所述分離區域控制電路和富集區域控制電路由一個雙向開關連接，當雙向開關與分離區域的 控制電路相連接時，富集區域電極保持斷路狀態；當開關與富集區域控制電路相連接時，分 離區域的電極保持斷路狀態，按給定時序對不同兩個控制電路施加高頻低電壓，在樣品分離 初期，雙向開關將電源和所述布置於分離管道的底部的一組夾板式電極連通形成迴路，實現 樣品分離過程；然後，將雙向開關轉向，使電源與所述布置於富集管道的底部另一組夾板式電極連通形成迴路，使分離後的樣品在夾板中央部位實現富集。
6. 根據權利要求5所述的組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片，其特徵為所述電源電壓範圍為0 20V，頻率為100KHz 20MHz。
7. 根據權利要求5或6所述的組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片，其特 徵為在富集管道中，在富集區域控制電路作用下，使樣品進一歩富集成行，向前流動最終 到達樣品池。
全文摘要
本發明公開了一種組合夾板微電極式微流控介電電泳細胞分離富集晶片，是一種應用於細胞樣品分離富集的微流控晶片，通過在玻璃表面沉積金膜獲得介電電泳(DEP)夾板組合式電極，該電極可與相應的外接低壓高頻交流電路連接實現DEP分離富集過程控制。本發明提出的組合式夾板微電極設計將細胞等樣品的在線分離和在線富集功能有效地集成在一塊晶片上，實現了微流控晶片技術與介電電泳原理有機結合，此晶片可以應用和實現不同種類的細胞或細菌的分離和富集。
文檔編號C12M1/42GK101250483SQ200810069550
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月11日 優先權日2008年4月11日
發明者溢 徐, 強 曹, 雪 曾, 郝敦玲 申請人:重慶大學