神經調節蛋白突變體及其用途的製作方法

2023-10-05 12:12:59 1

專利名稱：：神經調節蛋白突變體及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及細胞信號傳導通路中EGFR酪氨酸激酶家族中ErbB受體的配體即神經調節蛋白，具體涉及神經調節蛋白突變體及編碼神經調節蛋白突變體的核苷酸序列、表達載體、基因工程菌株及應用。發明背景神經調節蛋白(Neuregulin，NRG)是表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶家族[EGFR家族有4個成員，即ErbB-l(HERl，EGFR)、ErbB-2(HER2，neu)、ErbB-3(HER3)和ErbB-4(服R4)]的一個重要配體,包括神經調節蛋白1(NRG1)、神經調節蛋白2(NRG2)、神經調節蛋白3(NRG3)、神經調節蛋白4(NRG4)。神經調節蛋白1P為一種跨膜蛋白(Holmes等，Scie/7ce256，1205-1210，1992)，膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白類似區(Ig-likedomain)和EGF類似區(EGF-likedomain)(受體結合的必需有效部位)，膜內部分是C末端。神經調節蛋白對心臟的發育尤其重要(W00037095;CN1276381;WO03099300;WO9426298;US6444642;\TO9918976;W00064400;Zhao等，/273,10261-10269，1998)。WO0037095揭示了一定濃度的重組人神經調節蛋白(rh-neuregulin)可持續激活ERK信號通路，促進心肌細胞的生長及分化，引導心肌細胞和細胞粘連處肌節和細胞骨架的重建，改善心肌細胞的結構，增強心肌細胞的收縮。通過動物模型研究發現rh-neuregulin可以降低缺血、缺氧、病毒感染等因素對心肌細胞的損害程度，修復受損的心肌細胞結構，改善心臟的血流動力學；顯著提高模型動物的存活率，有效治療各種原因導致的動物心力衰竭。NRGl的受體包括ErbB3和ErbB4，NRGl雖不與ErbB2直接結合，但可誘導ErbB2分別與ErbB3或ErbB4形成ErbB2/ErbB3或ErbB2/ErbB4異源二聚體並進一步啟動這些受體下遊的信號傳導途徑。而大量研究證明在心血管系統中ErbB4受體高表達，在心肌中NRG1介導的ErbB2/ErbB4信號傳導途徑是維持心臟正常生理功能的重要途徑，而ErbB3卻廣泛表達於神經系統和其它各種組織。因此，NRG1在實際臨床應用中的一個顧慮是該藥物可能會通過激活ErbB2/ErbB3信號傳導途徑，從而在神經系統及其它各種組織中產生副作用。因此，確有必要改變NRG1的特性，提高NRG1激活ErbB2/ErbB4信號傳導途徑的活性，降低其激活ErbB2/ErbB3信號傳導途徑的活性，從而在提高其對心血管組織作用的同時，降低NRG1在其它系統及組織中產生的副作用。
發明內容本發明的目的正是提供一種對心肌細胞具有高特異性，而對其它系統或組織具有降低的副作用的神經調節蛋白突變體。在本發明的第一方面，提供了一種神經調節蛋白突變體，其包含神經調節蛋白EGF類似區，其特徵在於，該突變體是所述神經調節蛋白的第177-223位胺基酸殘基發生突變而形成的突變體，且所得突變體對ErbB2/ErbB4共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性高於神經調節蛋白，而對ErbB2/ErbB3共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性低於神經調節蛋白。在一個優選例中，所述的神經調節蛋白選自神經調節蛋白1，優選為神經調節蛋白，更優選神經調節蛋白IP1、神經調節蛋白102、神經調節蛋白1P2類似物或神經調節蛋白最優選神經調節蛋白1P2。在另一優選例中，所述突變體至少包括神經調節蛋白IP的第177位至229位的胺基酸序列，優選包括神經調節蛋白1P的第177位至237位的胺基酸片段，上述位點均從神經調節蛋白的N端起計算。在另一優選例中，所述突變體優選包括神經調節蛋白132的第177位至237位的胺基酸片段，上述位點均從神經調節蛋白的N端起計算。在本發明的一個實施方式中，所述神經調節蛋白的第223位胺基酸殘基N突變為非N的其它胺基酸殘基。在另一優選例中，所述神經調節蛋白的第223位胺基酸殘基對應於重組人神經調節蛋白的47位。在另一優選例中，所述的非N的其它胺基酸殘基選自R和K。在本發明的一個實施方式中，所述突變體的胺基酸序列中包括SEQIDN0:2或SEQIDNO:4所示的序列。在一個優選例中，所述胺基酸序列包括序列SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQgYVMASFYKAEELYQ或SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ。在另一優選例中，所述突變體由SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示的序列組成。在本發明的第二方面，提供了本發明神經調節蛋白突變體的編碼序列。在一個優選例中，所述編碼序列編碼本發明神經調節蛋白突變體。在本發明的一個實施方式中，該核苷酸序列包括SEQIDNO:1或SEQIDNO:3所示的序列。在本發明的第三方面，提供了一種包含本發明編碼序列的表達載體。在一個優選例中，所述表達載體包含序列表中SEQIDNO:l或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。在本發明的一個實施方式中，所述表達載體為pET22b。在本發明的第四方面，提供了一種用於表達本發明神經調節蛋白突變體的宿主細胞。在一個優選例中，所述宿主細胞是原核生物細胞或真核生物細胞。在另一優選例中，所述宿主細胞是基因工程菌株，該基因工程菌株是將本發明的表達載體轉化大腸桿菌得到的。在本發明的第五方面，提供了神經調節蛋白突變體在製備治療心臟病的藥物中的用途。在一個優選例中，所述心臟病選自病毒性心肌炎、擴張型心肌病、急性心功能不全、冠心病、肥厚性心肌病、缺血性心臟病、心功能障礙、心力衰竭、心臟毒性、心肌梗死或它們的組合。在一個優選例中，所述的神經調節蛋白突變體為權利要求3所述的神經調節蛋白突變體。在本發明的第六方面，提供了一種藥物組合物，其包含(i)有效量的活性物質，所述活性物質為本發明的神經調節蛋白突變體；(ii)藥學上可接受的載體。在一個優選例中，所述藥物組合物用於治療心臟病。在另一個優選例中，所述心臟病選自病毒性心肌炎、擴張型心肌病、急性心功能不全、冠心病、肥厚性心肌病、缺血性心臟病、心功能障礙、心力衰竭、心臟毒性、心肌梗死或它們的組合。在另一優選例中，以藥物組合物的總重量為基準計，所述藥物組合物中活性物質的含量為0.001-99.9wt%，優選0.01-95wt%,更優選0.1-90wt%，最優選0.5-80wt%。本發明的突變體可在提高對心肌細胞作用效果的同時，降低對乳腺等其它組織或系統的副作用，有望成為較rhNRGip2更好的治療心臟病的藥物。具體實施方式己有研究證明NRG1通過EGF類似區與ErbB3或ErbB4受體結合而激活相應的信號傳導途徑，因此EGF類似區是NRG1生物學活性的關鍵部位。本發明人經過廣泛而深入的研究，製備並篩選了大量神經調節蛋白的突變體，從中獲得了一類突變體，此類突變體對ErbB2/ErbB4共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性高於神經調節蛋白，且對ErbB2/ErbB3共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性低於神經調節蛋白。在此基礎上完成了，發明人完成了本發明。具體而言，發明人採用常規技術使得神經調節蛋白(例如rhNRGlP2)的胺基酸序列發生突變，由此獲得了多種神經調節蛋白突變體。通過試驗發現，神經調節蛋白EGF類似區的第223位胺基酸殘基N突變為非N的其它胺基酸殘基(例如突變為R或K)的一類突變體對ErbB2/ErbB4共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性高於神經調節蛋白，且對ErbB2/ErbB3共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性低於神經調節蛋白。由此，本發明人發現了一類比神經調節蛋白對心臟的特異性更高，對其它系統、組織副作用更小，且更為有效的心臟病治療藥物。神經調節蛋白在本發明中，術語"神經調節蛋白"是指表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶家族的一類重要配體。在較佳的實施方案中，所述神經調節蛋白選自神經調節蛋白1(31、神經調節蛋白1(52或神經調節蛋白1(53。這些神經調節蛋白的胺基酸序列在EP0586607B1中已經公開，這些序列信息全部納入本文作為參考。在本發明中，所述的"神經調節蛋白EGF類似區"是指人神經調節蛋白EGF類似區，即neuregulinEGF類似區，簡寫NRGEGF類似區，其至少包括神經調節蛋白1P的第177位至223位的胺基酸序列，優選包括神經調節蛋白1P的第177位至229位的胺基酸片段，更優選包括神經調節蛋白的第177位至237位的胺基酸片段，上述位點均從神經調節蛋白的N端起計算。在一個優選實施方式中，所述神經調節蛋白EGF類似區優選包括神經調節蛋白1P2的第177位至237位的胺基酸片段(見EP0586607B1)神經調節蛋白ipi、神經調節蛋白lp2或神經調節蛋白1(33的EGF類似區的胺基酸起始位置相同，但長度不同，從230開始不同，但其223位的胺基酸都是N。在本發明中，術語"包含EGF類似區的神經調節蛋白"包括神經調節蛋白ie，而所述的神經調節蛋白ie優選選自神經調節蛋白iei、神經調節蛋白ie2、神經調節蛋白ie2類似物或神經調節蛋白ie3;在本發明中，優選地選擇神經調節蛋白lP2。所述神經調節蛋白可誘導ErbB2分別與ErbB3或ErbB4形成ErbB2/ErbB3或ErbB2/ErbB4異源二聚體，並進一步啟動這些受體下遊的信號傳導途徑，其誘導作用不具有心臟選擇性。在本發明中，可對天然的包含EGF類似區的神經調節蛋白序列進行突變，也可對重組的包含EGF類似區的神經調節蛋白序列進行突變，例如重組人NRG1P2(rhNRGlP2)。神經調節蛋白突變體本發明中，術語"神經調節蛋白突變體"或"突變體"是指在神經調節蛋白的第177-223位胺基酸殘基發生突變而形成的突變體，且所得突變體對ErbB2/ErbB4共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性高於神經調節蛋白，而對ErbB2/ErbB3共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性低於神經調節蛋白。本文中的"神經調節蛋白突變體"可包括在下述蛋白或多肽中發生突變而形成的突變體包含神經調節蛋白EGF類似區的全長神經調節蛋白、至少包含神經調節蛋白EGF類似區的神經調節蛋白部分區域、神經調節蛋白EGF類似區、神經調節蛋白中的第177-223位胺基酸序列(優選神經調節蛋白中的第177-229位胺基酸序列、更優選第177-237位胺基酸序列)。在一個優選實施方式中，在包含EGF類似區的神經調節蛋白的胺基酸序列第223位由殘基N突變為非N的其它胺基酸殘基而形成的一類突變體。優選地，所述的非N的其它胺基酸殘基選自Gin;His;Lys;Arg。在更佳的實施方案中，所述非N的其它胺基酸殘基選自賴氨酸(Lys，R)或精氨酸(Arg，K)。在本發明的較佳實施方案中，所述神經調節蛋白突變體相對於天然神經調節蛋白而言，其區別僅僅在於EGF類似區，更佳的僅僅在於第223位胺基酸。在另一較佳實施方案中，所述突變體至少包含神經調節蛋白中的177-237位胺基酸序列，更優選僅包含神經調節蛋白的177-237位胺基酸序列。在本發明中，優選對rhNRGlP2的177-237(SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ)之間的胺基酸殘基進行突變，獲得一種重組人神經調節蛋白突變體(rh-neuregulinlP2突變體，rhNRGl突變體)，這種重組人神經調節蛋白突變體對ErbB2/ErbB4異源二聚體的誘導激活比重組人神經調節蛋白(rhNRGlP2)本身具有更高的活性，從而有望成為比rhNRGl32更為有效的新一代藥物。在本發明的一個優選實施方式中，神經調節蛋白突變體是指重組人神經調節蛋白的第47位從N突變為R的胺基酸序列，該神經調節蛋白突變體簡寫為rhNRGl(32-N47R，包括SEQIDNO:2所示的序列，即SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ。在本發明的另一優選實施方式中，神經調節蛋白突變體還指重組人神經調節蛋白EGF類似區的第47位從N突變為K的胺基酸序列，該神經調節蛋白突變體簡寫為rhNRGl卩2-N47K，包括SEQIDNO:4所示的序列，gp:SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ。神經調節蛋白突變體的編碼序列、表達載體及宿主細胞在本發明中，術語"神經調節蛋白突變體的編碼序列"是指編碼所述突變體的核苷酸序列。所述序列可為在天然神經調節蛋白的編碼序列基礎上進行誘變(例如定點突變)而得到的序列，也可為人工合成的序列，只要其表達產物為本發明的突變體蛋白。在本發明的一個優選實施方式中，所述編碼序列包括SEQIDNO:l或SEQIDNO:3所示的序列。在另一優選實施方式中，所述編碼序列編碼的突變體包括序列SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ或SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQpVMASFYKAEELYQ。在本發明中，術語"神經調節蛋白突變體的表達載體"是指負載有本發明的編碼序列，且在基因操作中可用於轉化宿主細胞的複製子，包括但不限於質粒、病毒或噬菌體。在本發明的優選實施方式中，所述表達載體為pET22b。在本發明中，術語"用於表達神經調節蛋白突變體的宿主細胞"或"宿主細胞"可互換使用，均是指能夠接收和容納重組分子，並在其中實現重組基因的擴增和表達的細胞。在本發明中，所述宿主細胞可以是原核生物細胞或真核生物細胞。在本發明的一個優選實施方式中，所述宿主細胞是基因工程菌株，該基因工程菌株是用本發明的表達載體轉化大腸桿菌得到的。以上表達載體及宿主細胞的選擇和獲得均可通過本領域技術人員所知曉的常規方法得以實現。藥物組合物本發明還提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有有效量的本發明的突變體，以及藥學上可接受的載體。在較佳的實施方案中，所述藥物組合物可用於治療與現有技術中已知可由神經調節蛋白所能治療的各種疾病，例如與ERK信號通路相關聯的疾病，包括心臟病，例如病毒性心肌炎、擴張型心肌病、急性心功能不全、冠心病、肥厚性心肌病、缺血性心臟病、心功能障礙、心力衰竭、心臟毒性、心肌梗死或它們的組合。如本文所用，術語"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由……構成"、禾B"由……構成"。如本文所用，術語"藥學上可接受的"成分是適用於人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即有合理的效益/風險比的物質。如本文所用，術語"有效量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。如本文所用，術語"藥學上可接受的載體"指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身並不是必要的活性成分，且施用後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在《雷明頓藥物科學》(Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPub.Co.,N丄1991)中可找到關於藥學上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、潤溼劑或乳化劑、矯味劑、pH緩衝物質等。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。本發明的組合物中神經調節蛋白突變體有效成分佔組合物總重量的0.00199.9wt%;優選為組合物總重量的l95wt。/。，較優選為590wt。/。，更優選1080wt。/。。餘量為藥學上可接受的載體以及其它添加劑等物質。如本文所用，術語"單位劑型"是指為了服用方便，將本發明的組合物製備成單次服用所需的劑型，包括但不限於各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。在本發明的另一優選實施方式中，所述組合物為單位劑型或多劑型，且其中神經調節蛋白突變體的含量為0.012000mg/劑，優選0.11500mg/劑，更優選l1000mg/劑。在本發明的另一個優選例中，每天施用16劑本發明的組合物，優選施用13劑；最優選的，每天服用的劑量為l劑。應理解，所用神經調節蛋白突變體的有效劑量可隨待施用或治療的對象的嚴重程度而變化。具體情況根據對象的個體情況(例如對象體重、年齡、身體狀況、所需達到的效果)來決定，這在熟練醫師可以判斷的範圍內。本發明的組合物，可以為固態(如顆粒劑、片劑、凍乾粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(如口服液)或其它合適的形狀。此外，本發明的組合物中還可含有用於改善和治療心臟病的其它活性物質，所述的其它活性物質選自下組ACE抑制劑、P腎上腺素阻斷劑和/或地高辛。本發明的優點本發明的積極進步效果在於篩選了大量神經調節蛋白突變體，並獲得了較未突變的神經調節蛋白而言，能增強誘導ErbB2/ErbB4共表達細胞中ErbB受體的磷酸化，同時降低誘導ErbB2/ErbB3共表達細胞中ErbB受體的磷酸化的突變體。在此基礎上，開發出一類對心肌細胞具有提高的作用效果，而對於乳腺、神經系統等其它組織或系統具有降低的副作用，並有望成為較rhNRGl卩2更好的治療心臟病的藥物。實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件、或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1編碼rhNRGl(J2突變體(rhNRGlp2N47R，rhNRGip2N47K)的質粒的構建、表達和rhNRGip2突變體的純化參照Stratagene公司QuikChangeSite-Directedmutagenesiskit的使用手冊，用在目標位點已引入編碼突變胺基酸密碼子的2個互補核苷酸序列(長30個核苷酸左右)作為正反向引物，以含編碼人神經調節蛋白61個胺基酸片段的核苷酸序列的重組質粒pET22b-rhNRGl(i2(參見中國專利申請CN03811866.1及TO2003/099300的實施例l)為模板，用PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene公司)進行PCR環形擴增，隨後用DpnI酶解掉甲基化的初始模板，剩下合成的帶點突變的有缺口的雙鏈DNA，將該雙鏈DNA轉化大腸桿菌DH5a以修復缺口並擴增，純化得到含有編碼NRG突變體的質粒。將少量純化的質粒送上海博亞生物技術公司測序。將序列正確的質粒轉化入大腸桿菌感受態細胞BL21，接種到含氨苄卡黴素的瓊脂板上，37'C過夜培養，挑單菌落轉入LB液體培養基中，培養至OD,約為0.40.6時加入IPTG(異丙基硫代-P-D-半乳糖苷)(終濃度為O.3,ol/L)，37X:誘導表達3小時。4°C、8,000rpm離心IO分鐘收集菌體，將收取的菌體用PBS洗一遍，重懸於PBS中超聲破菌。4°C、8000r/分鐘離心IO分鐘，分別收集上清和沉澱。取少量上清和沉澱進行SDS-PAGE,發現目標蛋白主要在沉澱中，即在包涵體中。在沉澱中加入適量清洗液(lOOmMTris，pH7.0，5mMEDTA，5mMDTT，1.5M尿素，2%TritonX-IOO)後超聲，離心收集沉澱。在沉澱中加入溶解液(20mMNa2HP04-NaH2P04，pH8.0，6M尿素，5mMDTT)室溫溶解包涵體30分鐘，所得溶液於17000g離心10分鐘後收集上清。將上清與復性液以1:8的比例(v/v)混合[復性液10mMNa2HP04-C6H807，pH8.0,0.5mMGSSG(氧化型穀胱甘肽)，0.5mMGSH(穀胱甘肽)，lmMEDTA]，先於室溫放置2小時，再置於4。C過夜。將混合液上SPS印haroseHP離子交換柱(GEhealthcare)後，用NaCl梯度洗脫液(10mMNa2HP04-CBH807，PH6.O)洗脫，收集主洗脫峰。將收集的蛋白溶液和4M的NaCl溶液等體積混合，隨後上Phenyl疏水柱(GEhealthcare),再用低鹽洗脫液(10mMNa2HP04-C6H807，pH8.0)洗脫，收集洗脫液即得純化的rhNRGl(J2突變體(rhNRGl卩2N47R或rhNRGip2N47K)。實施例2rhNRGlp2突變體(rhNRGl卩2N47R,rhNRGip2N47K)誘導ErbB2/ErbB4共表達細胞中ErbB磷酸化的活性測定在96孔細胞培養板中，接種穩定表達ErbB2、ErbB4的CHO細胞(用脂質體轉染法轉染篩選獲得)，置於37。C培養箱中培養24小時後，用無血清IMDM培養液再培養24小時。吸去培養液，然後各孔分別加入100pl不同濃度的rhNRGlP2或rhNRGlP2突變體溶液(rhNRGlP2或其突變體最高濃度為2ug/mL，取適量該溶液用無血清IMDM稀釋3倍，再取適量稀釋後的溶液稀釋3倍，重複上述操作5次，得到由高到低8個濃度的rhNRGlP2或其突變體蛋白溶液)，其中兩孔僅加無血清培養液作陰性對照，37。C保溫20分鐘後，吸去培養液，用PBS洗1次後加入100^1細胞裂解液(50mMTris，pH7.4，150mMNaCl，1%TritonX-100,5mMEDTA，50mMNaF，2mM釩酸鈉，2mMPMSF，cocktail蛋白酶抑制劑(Roche，每25ml溶液加一片))，將板放在振蕩器上於4'C冰箱振蕩30分鐘，再於4。C，15000rpm離心15分鐘，從而使得培養板小孔中澄清的細胞裂解液和沉澱完全分離。用鼠抗人ErbB2單克隆抗體(用常規的單克隆抗體製備方法獲得)包被酶標板，置於4'C過夜。用PBS洗板5次後，以含5y。脫脂奶粉的PBS封閉。再用PBS洗板5次，每孔分別加入90nl上述澄清的細胞裂解液，於37'C保溫1小時。吸去各孔的細胞裂解液，用PBS洗板5次，每孔加入10(^1稀釋了500倍的HRP偶聯鼠抗人磷酸化酪氨酸抗體[p-Tyr(PY99):sc-7020HRP(SantaCruzBiotechnology)],於37'C保溫1小時。吸去抗體溶液，洗板5次，每孔加入100(al底物溶液[9ml底物緩衝液(50mM檸檬酸，100mMNa2HP04，pH5.0，0.2mg/ml3,3'，5，5'-四甲基聯苯胺(TMB)，0.003%HA]，於37。C保溫10分鐘後，每孔再加入50^12NH2S04。將板置於酶標儀中，在測定波長450nm，參比波長655nm分別測OD值。以rhNRG1(32或rhNRG1(32突變體濃度的對數為橫坐標，對應的OD值差值為縱坐標，以GraphPadPrism軟體對數據進行非線性回歸分析並作S型劑量一效應曲線。分別計算rhNRGl卩2或其突變體的半效劑量(ECj，再按下式計算效價比rhNRGlP2突變體的效價=rhNRGie2突變體的ECsoNRG1P2的效價NRG1P2的ECmj實驗結果見表1:表1rhNRGl02及其突變體誘導ErbB2/ErbB4共表達細胞_之ErbB受體磷酸化的ECs。值__^_效價比r固Gl卩2N47Rrh腦l320.00570.058210.24rh跳l卩2N47KrhNRGlP20.01570.05693.62由表1可知，重組人神經調節蛋白突變體rhNRG1(32N47R誘導ErbB2/ErbB4共表達細胞中ErbB受體磷酸化的活性為rhNRG1(32的10.24倍，rhNRGlp2N47R的活性也為rhNRG1(32的3.62倍，均較rhNRG1(32的活性有顯著提高。結果提示對心肌細胞使用這兩種突變體可顯著降低蛋白濃度，預期在用這兩種突變體治療心血管疾病時也可顯著降低用藥劑量，同時也能降低藥物的副作用。實施例3rhNRGl卩2突變體(rhNRGl卩2N47R，rhNRGl(32N47K)誘導ErbB2/ErbB3共表達細胞中ErbB磷酸化的活性測定在96孔細胞培養板中，接種表達ErbB2、ErbB3的C0S7細胞(用脂質體轉染法轉染獲得)，置於37。C培養箱中培養24小時後，用無血清DMEM培養液再培養24小時。吸去培養液，然後各孔分別加入100pl不同濃度的rhNRGlP2或rhNRGle2突變體溶液(rhNRGlP2或其突變體最高濃度為2yg/mL，取適量該溶液用無血清DMEM稀釋3倍，再取適量稀釋後的溶液稀釋3倍，重複上述操作5次，得到由高到低8個濃度的rhNRGlP2或其突變體蛋白溶液)，其中兩孔僅加無血清培養液作陰性對照，37'C保溫20分鐘後，吸去培養液，用PBS洗1次後加入lOO(il細胞裂解液(50mMTris，pH7.4，150mMNaCl，1%TritonX-IOO，5mMEDTA，50mMNaF,2mM釩酸鈉，2mMPMSF，cocktail蛋白酶抑制劑(Roche，每25ml溶液加一片))，將板放在振蕩器上於4。C冰箱振蕩30分鐘，再於4°C，15000rpm離心15分鐘，從而使得培養板小孔中澄清的細胞裂解液和沉澱完全分離。用鼠抗人ErbB3單克隆抗體(R&Dsystems)包被酶標板，置於4'C過夜。用PBS洗板5次後，以含5呢脫脂奶粉的PBS封閉。再用PBS洗板5次，每孔分別加入90^1上述澄清的細胞裂解液，於37'C保溫1小時。吸去各孔的細胞裂解液，用PBS洗板5次，每孔加入100pl稀釋了500倍的HRP偶聯鼠抗人磷酸化酪氨酸抗體[P-Tyr(PY99):sc-7020HRP(SantaCruzBiotechnology)]'於37。C保溫1小時。吸去抗體溶液，洗板5次，每孔加入100^1底物溶液[9ml底物緩衝液(50mM檸檬酸，lOOmMNa2HP04，pH5.0，0.2mg/ml3，3',5，5'-四甲基聯苯胺(TMB),0.003%H202)，於37。C保溫10分鐘後，每孔再加入50pl2NH孤。將板置於酶標儀中，在測定波長450nm，參比波長655nm分別測0D值。rhNRGlp2或rhNRGl卩2突變體誘導ErbB3磷酸化活性的效價計算方法同實施例2。實驗結果見表2:tableseeoriginaldocumentpage14由表2可知，重組人神經調節蛋白突變體rh服Gip2N47R誘導ErbB2/ErbB3共表達細胞中ErbB受體磷酸化的活性為rhNRGl(i2的0.34倍，rhNRGip2N47K的活性也僅為rhNRGl(i2的0.57倍，均較rhNRGl(J2的活性有顯著降低。因此，與同濃度的rhNRGlp2相比，這兩種突變體對表達ErbB2/ErbB3的非心肌細胞的作用明顯降低。也就是說，當用這兩種突變體治療心血管疾病時可明顯降低藥物對非心臟組織的副作用。實施例4包含rhNRGip2突變體(rhNRG1(52N47R,rhNRGlp2N47K)注射劑的製備取實施例1中製備得到的純化的rhNRGl|32突變體(rhNRGl(52N47R或rhNRGip2N47K)，加入無菌緩衝液(10niMNa2HP04-C6H807，pH8.0)，並分裝到安瓿瓶中，每瓶0.75mL，即得包含rh腦lP2突變體(rhNRGle2N47R，rhNRGlP2N47K)的注射劑。根據實施例2、3所述的方法測定該注射劑的效價。結果表明，與同濃度的rh服Gip2相比，含有兩種突變體的注射液對心肌細胞的活性顯著提高，而對表達ErbB2/ErbB3的非心肌細胞的作用明顯降低。該結果提示，包含rhNRGlp2突變體(rhNRG1(J2N47R，rhNRGl(i2N47K)的藥物組合物可用於高特異性地治療心臟病，而對其它組織具有降低的副作用。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。序列表<110〉上海澤生科技開發有限公司<120〉神經調節蛋白突變體<130〉0754314<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉183〈212〉DNA人工序列<221〉CDS<222〉(1)..(183)<柳〉1agecatcttgtaaaatgtgcggagaaggagaaaactttctgtgtgaat48SerHisLeuValLysCysAlaGluLysGluLysThrPheCysValAsn151015ggaggggagtgcttcatggtgaaagaccttteaaacccctegagatac96GlyGlyGluCysPheMetValLysAspLeuSerAsnProSerArgTyr202530ttgtgcaagtgcccaaatgagtttactggtgatcgctgccaacgctac144LeuCysLysCysProAsnGluPheThrGlyAspArgCysGinArgTyr354045gtaatggccagettctacaaggcggaggagctgtaccag183ValMetAlaSerPheTyrLysAlaGluGluLeuTyrGin5055602<211〉61<212〉PRT<213〉人工序列<400〉2SerHisLeuValLysCysAlaGluLysGluLysThrPheCysValAsn151015GlyGlyGluCysPheMetValLysAspLeuSerAsnProSerArgTyr202530UuCysLysCysProAsnGluPheThrGlyAspArgCysGinArgTyr354045ValMetAlaSerPheTyrLysAlaGluGluLeuTyrGin505560<210〉<211〉<212〉<213〉3183DNA人工序列〈220〉<221〉<222〉CDS(l)..(183)<400〉agecatSerHis13cttgtaaaatgtgcgLeuValLysCysAla5gagaaggaga犯actttctgtgtg33tGluLysGluLysThrPheCysValAsn101548ggaggggagtgcUcatggtgGlyGlyGluCysPheMetVal20aaagaccttteaaacccctegagatacLysAspLeuSerAsnProSerArgTyr253096ttgtgcaagtgcccaaatgagLeuCysLysCysProAsnGlu35tttactggtgatcgctgccaaaagtacPheThrGlyAspArgCysGinLysTyr4045144gtaatggccagettctacaagValMetAlaSerPheTyrLys5055gcggaggagctgtaccagAlaGluGluLeuTyrGin60183<210〉461PRT人工序列<400〉4SerHisLeuValLysCysAlaGluLysGluLysThrPheCysValAsn151015GlyGlyGluCysPheMetValLysAspLeuSerAsnProSerArgTyr202530UuCysLysCysProAsnGluPheThrGlyAspArgCysGinLysTyr354045ValMetAlaSerPheTyrLysAlaGluGluLeuTyrGin505560權利要求1.一種神經調節蛋白突變體，其包含神經調節蛋白EGF類似區，其特徵在於，該突變體是所述神經調節蛋白的第177-223位胺基酸殘基發生突變而形成的突變體，上述位點從神經調節蛋白的N端起計算，且所得突變體對ErbB2/ErbB4共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性高於神經調節蛋白，而對ErbB2/ErbB3共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性低於神經調節蛋白。2.如權利要求1所述的神經調節蛋白突變體，其特徵在於，所述神經調節蛋白的第223位胺基酸殘基N突變為非N的其它胺基酸殘基。3.如權利要求1所述的神經調節蛋白突變體，其特徵在於，所述突變體的胺基酸序列中包括SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示的序列。4.權利要求1所述的神經調節蛋白突變體的編碼序列。5.如權利要求4所述的編碼序列，其特徵在於，該核苷酸序列包括SEQIDN0:1或SEQIDNO:3所示的序列。6.—種包含權利要求4所述的編碼序列的表達載體。7.如權利要求6所述的表達載體，其特徵在於，所述表達載體為pET22b。8.—種用於表達權利要求1所述的神經調節蛋白突變體的宿主細胞。9.權利要求1或3所述的神經調節蛋白突變體在製備治療心臟病的藥物中的用途。10.—種藥物組合物，其包含(i)有效量的活性物質，所述活性物質選自權利要求1或3所述的神經調節蛋白突變體；(ii)藥學上可接受的載體。全文摘要本發明涉及一種包含EGF類似區的神經調節蛋白突變體，其在神經調節蛋白的第177-223位胺基酸殘基發生突變，且所得突變體對ErbB2/ErbB4共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性高於神經調節蛋白，而對ErbB2/ErbB3共表達的細胞中ErbB受體磷酸化的誘導活性低於神經調節蛋白。本發明還公開了神經調節蛋白突變體的編碼序列、表達載體、和宿主細胞及其用途。本發明的神經調節蛋白突變體誘導ErbB4磷酸化的活性都明顯提高，同時它們誘導ErbB3磷酸化的活性都有所降低。因而，在能用較低濃度的神經調節蛋白突變體治療心血管疾病的同時，也降低了其對其它組織的副作用。文檔編號A61K38/17GK101397337SQ200710046358公開日2009年4月1日申請日期2007年9月25日優先權日2007年9月25日發明者周明東申請人:上海澤生科技開發有限公司