治療性肽的製作方法
2023-10-05 00:40:14
專利名稱：治療性肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及治療性肽，特別是在疫苗的製備或者在其他對於感染的治療中及在篩選在感染的治療中具有潛在藥物活性的化合物中有用的治療性肽，。
本發明的發明者以前發現與癌胚抗原有關的細胞粘連分子(CEACAM)是黏膜病原物，特別是呼吸道病原物，如腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的受體。CEACAM屬於癌胚抗原(CEA)家族，該家族是免疫球蛋白超家族的一個成員。CEA基因家族包括表面表達的亞家族(CEA)和分泌型亞家族(妊娠特異的糖蛋白，PSG)。與膜相關的亞家族被重新界定為CEACAM(與CEA有關的細胞粘連分子)20，該亞家族包括許多有關的糖蛋白，其中CEACAM1在不同的人體組織中表達得最為廣泛。本發明的發明者報導的這些研究中主要使用CEACAM1(以前被命名為CD66a和BGPc)轉染了中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，CEACAM1包含四個細胞外結構域、一個TM區和一個短(S)或者長(L)的細胞質尾(其分子的表達式為NA1BA2-TM-S或L)。此外，還使用了包含一個或者多個細胞外結構域的可溶性截短的構建體。以前的研究表明腦膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血桿菌主要以許多CEACAM的N端結構域為靶標7.9.10。這種靶向定位可以導致對細胞表面的附著以及對細胞的侵襲。此外，細菌可以結合吞噬細胞上以及T和B淋巴細胞上的CEACAM。這種相互作用可以導致細菌細胞死亡、目標細胞死亡或者免疫功能的抑制，例如在奈瑟氏淋球菌(與腦膜炎奈瑟氏菌的親緣關係很近)與T和B淋巴細胞上的CEACAM結合時導致T和B淋巴細胞的抑制。
由於CEACAM長期被認為與腦膜炎奈瑟氏菌中與外膜不透過性有關的Opa蛋白相關，而流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌都不產生Opa蛋白，所以在流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌中發現存在CEACAM結合配基對於本發明的發明者來說是個意外。在以下對本發明的描述中，將特別涉及黏膜的感染，特別是呼吸道膜的感染，或者是耳部的感染(特別是中耳炎)，但是應該理解的是，在涉及CEACAM受體的其他部位感染，例如在生殖器黏膜或者尿道中的感染或其他受體結合過程，或者在可能從黏膜表面散布細菌的人類其他部位的感染中，本發明有同樣的作用。
黏膜病原腦膜炎奈瑟氏菌(Nm)、流感嗜血桿菌(Hi)和卡他莫拉菌(Mx)都是人類特異的生物體，存在於上呼吸道中，從那裡它們可以散布，導致嚴重的感染。至少25％的健康個體的鼻咽中攜帶有屬於不同血清群的腦膜炎球菌菌種1。但是，在許多個體中，該生物體侵襲黏膜屏障，導致一種發展最為迅速並且極為嚴重的疾病。增加宿主對於腦膜炎球菌感染易感性的確切因素還不完全清楚。而且，血清群特異的疫苗僅僅提供有限的保護以及B群多糖的非免疫原性增強了對於基礎研究的需要，以理解宿主的易感性，確定重要的亞莢膜特徵，這些可以作為對抗腦膜炎球菌的共同目標。本發明的發明者進行的研究提供了一種對腦膜炎球菌建群的分子生物學基礎的理解，和對於腦膜炎球菌群落與人類屏障細胞(上皮細胞和內皮細胞)以及吞噬細胞相互作用性質的理解。在最近一些年，對共生奈瑟氏菌的黏膜移殖的基礎進行了研究，以理解主要是無害的群落和偶然出現的但是嚴重的病原物例如腦膜炎奈瑟氏菌之間相互區別的特點。此外，這些研究確定了共生奈瑟氏菌是否可以被用作腦膜炎奈瑟氏菌可能的疫苗抗原的載體。
至少75％的健康個體可能攜帶屬於流感嗜血桿菌的菌種2。儘管由於Hib疫苗的結果，在西方b型疾病的發病率有了顯著的降低，但是由無法定型的Hi菌株(NTHi)導致的疾病仍然是一個問題。NTHi導致局部以及擴散的感染，包括會厭炎、中耳炎、蜂窩織炎、肺炎、心內膜炎、菌血症和腦膜炎。中耳炎是兒科醫療界的一個主要問題，而NTHi是兒童在生命第一年中20％以上中耳炎發病的原因2，3。NTHi還與具有慢性阻塞性肺炎(COPD)和囊腫性纖維化病人的急性復發性和持久性感染有關。是什麼決定了這些病人中由NTHi導致的復發性感染，或者兒童中中耳炎多次發作，這還不清楚。
卡他莫拉菌是人類呼吸道中的另一種寄生菌，通常與Hi一起從局部感染病例中分離出。這兩種生物體都與竇炎和哮喘的惡化有關。Mx是導致兒童中耳炎的第三種最常見病因(據估計為每年300到400萬病例)。它還導致成年人中的下呼吸道感染，特別是在患COPD的病人中5。在罕見的情況下，它與擴散性感染有關5。Hi和Mx都導致持續性感染，並且認為它們可以通過組織滲透逃過宿主的免疫機制以及抗生素的作用。已經研究了Mx的許多外膜蛋白的粘附性質。但是幾乎沒有發現Mx的細胞受體，而且許多病原性機制的詳情有待研究。
呼吸道黏膜病原物的一個基本需要是與呼吸道上皮細胞建立穩固的聯繫。這些人類病原物的目標是人類特異的分子，研究必須要有體外培養的人體組織和器官培養。粘附通常由細菌相和抗原性可變的結構來介導。此外，已經愈加清楚地知道病原物的粘附是多方面的，而且環境適應對於粘附的方式起重大的作用。儘管許多最近的研究已經開始確定複雜的細胞靶向機制的不同階段，但是對環境適應的詳情或者宿主和微生物體之間的交流還有待描述。
本發明的發明者最近進行的研究顯示Nm7-9和Hi10，11具有一些獨特的機制和另一些共有的機制，用來靶向某些人類細胞表面受體的CEACMA12。
而且，本發明的發明者最近發現卡他莫拉菌的臨床分離株也以人類的CEACAM分子為靶向。此外，現在已經發現一種卡他莫拉菌的高分子量外膜蛋白與該受體結合。已經證明CEACAM在不同組織中，包括在呼吸道上皮細胞中的表達。這些發現提示對CEACAM分子的特異靶向對於呼吸道細菌來說是一個特別的有利條件，它可能是由於趨同進化的結果而出現的。
在腦膜炎奈瑟氏菌的粘附因子中有菌毛(傘毛)13.14.15以及外膜不透過蛋白，Opa和Opc15.16。Nm菌毛是長的絲狀蛋白結構，由多個傘毛蛋白亞基組成。一般認為它們是莢膜細菌最重要的粘附素13.14.16，原因是莢膜部分或者全部掩蓋了外膜配基，導致配基的功能效力降低，而在完全莢膜細菌中菌毛穿過莢膜，仍然具有功能。Opa屬於抗原性可變的蛋白家族，在腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟球菌中都存在。在腦膜炎球菌中，有3-4個opa基因座編碼相關的、具有4個暴露於表面的環的跨膜蛋白，其中3個基因座有序列變異16，17。另一個跨膜蛋白Opc基本上沒有變異15.16。在過去的12年中，本發明的發明者對Nm菌毛的結構功能關係、Opa和Opc蛋白的毒力進行了研究，發現了奈瑟球菌屬不透過蛋白的兩個人類受體。而且發明者對表面唾液酸在細菌與人類靶細胞相互作用中的功能以及LPS和其他因子在細胞毒性中的作用進行了研究。
發明者們從結合CEACAM受體的莫拉菌外膜蛋白中分離出了高分子量配基，從而導致本發明的出現。
配基的性質可以通過其在SDS-PAGE中的遷移模式進行描述，其SDS-PAGE遷移特徵具有USP家族蛋白的特點，即配基在長時間煮沸後，分裂為分子量在大約60kD到150kD之間的單體。
在Mx菌株ATCC 25238(MX2)中的配基被鑑定為UspA1，並且測定了其胺基酸序列。該配基的特點被進一步研究，以確定受體結合的區域或者結構域，即結合受體的肽或者與肽相關的性質。
因此，本發明提供從與CEACAM受體結合的卡他莫拉菌外膜蛋白中分離出來的配基，所述的配基包含一個受體結合結構域，該結構域包含選自以下的胺基酸序列圖6所示的序列中463到863殘基、527到668殘基、527到863殘基、427到623殘基、427到668殘基以及427到863殘基，或者包含上述序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡併物或羥基化、磺化或者糖基化產物，或者其他次級加工產物。
在這裡使用配基一詞，既是指與受體結合的整個分子，又是指上述分子的包括使配基保持受體結合性質的受體結合結構域的任何部分。因此「配基」包含了僅僅由受體結合結構域組成的分子，即受體結合所需的一個或者幾個肽區域。
在一個實施方案中，本發明提供了由選自以下的胺基酸序列組成的配基圖6所示的序列中463到863殘基、527到668殘基、527到863殘基、427到623殘基、427到668殘基以及427到863殘基，或者所述配基是由上述序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡併物或羥基化、磺化或者糖基化產物或其他次級加工產物所組成。
由於在Mx中存在雜合蛋白，它們可能含有來自UspA1和UspA2兩個蛋白的嵌合表位23，所以結構和/或功能上等價的受體結合結構域也可以在其他的類Usp-A蛋白中出現。包含這種等價受體結構域的配基也屬於本發明的範疇。
優選地，配基或者受體結合結構域適用於感染的預防或者治療。
本發明還提供編碼本發明配基蛋白的核酸序列，以及所述核酸序列的同源物、多態物(polymorphism)、簡併物以及剪切變異體。
本發明的配基或者其組合，可以被用於疫苗或者感染的其他預防性處理。
疫苗或者其他的感染預防性處理可以包含任何已知的佐劑、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體、防腐劑及其類似物，以提供藥物上可以接受的配基製劑，用於治療病人。
本發明還提供了藥物上可以接受的用於醫療的配基製劑。
藥物上可以接受的配基製劑可以用於治療或者預防任何涉及到CEACAM受體的疾病，例如治療或者預防感染、呼吸道疾病、腫瘤性疾病以及與腫瘤病相關的病症和血管新生。
優選地，在進行感染治療時，感染是黏膜的感染或者是通過黏膜出現的，特別是呼吸道感染。
最優選地，配基被用作針對腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的疫苗或者用於對這些細菌的其他預防或治療。理想地，配基被用作針對中耳炎的疫苗或者中耳炎的其他預防或治療。
進一步說，本發明的配基還可以用於鑑別新型阻滯劑，可用作治療藥劑，以保護易感群體和一般公眾免受許多黏膜病原物的侵害。例如配基可以被用於鑑別受體類似物，這些類似物可以用於上面這些目的。
因此本發明還提供一種篩選試驗，用於鑑別用作治療藥劑的新型阻滯劑，該試驗包含下面的步驟篩選可能的治療藥劑模擬本發明中配基的能力或者其與本發明中配基的同源性。本發明進一步提供治療藥劑，它們是通過上述的篩選試驗鑑別出來的。
有效的疫苗組分可以通過使用本發明確定的受體靶向機制信息來製備，例如有生物活性的肽模擬物。這些組分能夠防止細菌向黏膜上形成菌落或侵襲，並且誘導出具有阻滯、調理和殺菌作用的抗體。
由於CEACAM分子與癌症和發育等過程有關，所以由本發明的配基確定的衍生自細菌的生物活性肽序列可以用於研究在癌症和發育中CEACAM的作用。這些肽序列還可以作為潛在的抗癌藥劑，用來控制或者治療血管新生。
在另一個實施方案中，本發明提供了CEACAM受體結合配基在製備用於治療或者預防疾病的藥物中的用途，所述疾病中CEACAM受體參與了導致這種疾病的病原物的細胞靶向，在這種藥物中，配基包含選自以下的胺基酸序列圖6所示的序列中463到863殘基、527到668殘基、527到863殘基、427到623殘基、427到668殘基以及427到863殘基，或者包含上述序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡併物或羥基化、磺化或糖基化產物，或者其他次級加工產物。
優選地，疾病選自下列疾病組成的組感染，呼吸道疾病、腫瘤性疾病以及與腫瘤病相關的病症，和血管新生。
如以上所述的藥物在病原物感染黏膜或者通過黏膜進入時是非常有用的。
這裡描述的藥物在治療和預防由卡他莫拉菌導致的感染(疾病)時非常有用。但是這裡描述的配基用於製備治療任何涉及CEACAM受體的疾病，例如腦膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血桿菌導致的疾病。
在一個特別優選地實施方案中，疾病是中耳炎。
本發明的配基還可以被用於治療由其他口腔細菌導致的疾病，例如齲齒。
現在完全通過非限制性的實施例對本發明的實施方案進行描述，這些實施例參考下述附圖。
圖1顯示了只有CEACAM1-Fc(1微克每毫升)可溶性受體構建體(白色、左側的長棒)存在或者在CEACAM1 N-結構域特異抗體YTH71.3(灰色、中間的長棒)存在時，與三個被固定在硝酸纖維素上的Mx菌株的相對結合水平。在每種情況中CD33-Fc的結合可以忽略(黑色，右側的長棒)。菌株1、2、3MX2(ATCC25238)，MX3，MX4(臨床分離株)。結合的確定使用斑點印跡上層覆蓋的方法，反應的強度使用NIH Scion成像程序進行光密度分析來定量。
圖2顯示在非解離(未加熱，泳道1)的條件或者煮沸10分鐘後(泳道2)的條件下分離出的菌株MX2蛋白的蛋白質印跡。印跡上面覆蓋CEACAM1-Fc(1微克每毫升)孵育，用與辣根過氧化物酶偶聯的抗人Fc抗體以及辣根過氧化物酶的底物來檢測受體的結合。
圖3顯示了菌株MX2、MX3、MX4的變性全細胞裂解產物(分別在泳道1-3中)的蛋白質印跡。印跡上面覆蓋CEACAM1-Fc(1微克每毫升；a)，抗UspA1肽抗體(10微克每毫升；b)以及抗UspA2肽抗體(10微克每毫升；c)孵育。注意在三個菌株中CEACAM1-Fc結合蛋白和抗UspA1結合蛋白具有相似的遷移模式。殘餘的未解離的蛋白大小約為250kD(由於使用了鹼性磷酸酶測定，具有更高的靈敏度，所以在這裡被檢測到)，與CEACAM1-Fc結合。這些僅僅被抗肽抗體微弱識別，大概是因為合成的肽中包含的表位在未變性的蛋白中沒有完全暴露，而隨著複合物的變性而逐漸暴露。抗UspA2抗體與表觀分子量大於200kD在煮沸後仍然未解聚的蛋白結合，這是UspA2蛋白所具有的一個性質。
圖4顯示MX2的CEACAM1結合蛋白在電洗脫之後用胰蛋白酶消化的肽質譜圖譜(4a)。輸入到ProFound蛋白質鑑定資料庫中的數據匯總於(4b)。鑑定的前10個蛋白以及其概率數值示於4c。排在第一位的候選者，這裡是一個Z分值為2.34的UspA1蛋白，其詳細情況示於(4d)，其中顯示了匹配的肽的數目、它們在蛋白質中的位置，該蛋白質被覆蓋的百分比以及這裡未匹配的肽的清單。
圖5顯示了MX2的UspA1經過胰蛋白酶消化之後的片段的蛋白質印跡。A使用二抗(分別在B和C中使用的山羊抗人Fc和山羊抗兔Ig的混合物)的對照印跡。B覆蓋CEACAM1-Fc以及山羊抗人Fc的印跡。C覆蓋親和純化的抗UspA1肽的兔抗體(ETNNHQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR)(參見圖6)，以及抗兔的免疫球蛋白的印跡。*＝具有分子量標記的泳道--在左側標示出來。用雙箭頭指明的肽與CEACAM1-Fc發生強烈反應(B)，也和抗UspA1肽的抗體發生強烈反應(C)。由於抗UspA1肽抗體與最低分子量的肽(箭頭所指)的結合，所以該CEACAM結合片段被鑑定為MX2的UspA1蛋白的天冬醯胺199到賴氨酸863(參見圖6)之間的C末端片段。
圖6顯示了MX2的UspA1蛋白的胺基酸序列。用粗體標示了出用於在兔中製備免疫抗血清的UspA1特異的肽。CEACAM結合區域包含在劃線的MX2UspA1蛋白的C末端片段中。
圖7顯示了與CEACAM發生反應的胰蛋白酶水解肽的分離。使用1毫克每毫升的胰蛋白酶處理卡他莫拉菌菌株MX2，在37攝氏度處理10分鐘。胰蛋白酶消化的樣品進行SDS-PAGE。染色之後，對50kD的區域進行電洗脫過夜。電洗脫出來的蛋白被凍幹，用緩衝液重懸後上第二塊膠。膠的一部分轉移到硝酸纖維素膜上進行蛋白質印跡。在印跡上覆蓋CEACAM1-Fc來確定與CEACAM發生反應的肽條帶。
「*」指的是被送去作N末端序列分析的肽。
圖8顯示MX2的UspA1蛋白在胰蛋白酶消化之後的一個肽的胺基酸序列。所示的50kD胰蛋白酶水解肽(胺基酸463到863)結合CEACAM以及抗UspA1肽(胺基酸753到780，劃線的)的抗血清。該分子量大約為50kD的CEACAM結合肽的N末端序列是「ALESNVEEGL」，該序列出現在胰蛋白酶切割位點462號胺基酸之後。
圖9是一幅示意圖，顯示了擴增產生uspA1基因片段用於進行重組蛋白表達的引物的位置。由引物P4和P7擴增出的DNA編碼CEACAM1結合位點，還設計和使用了通過該區域的其他引物(字母A至I)。
圖10顯示了重組片段4-7的序列。劃線的區域是具有CEACAM1反應性的胰蛋白酶肽的N末端區域。片段4-7的預測分子量大約是26kD。加上組氨酸標記的片段分子量約為28kD。截短的肽的位置用「T」標示出來(參見圖13)。
圖11是一幅示意圖，顯示了用於重組UspA1肽的一般克隆、表達以及純化策略，如pQE30系統所表示。
圖12是載體pQE30的圖。
圖13顯示了CEACAM1-Fc在印跡覆蓋試驗中與重組子4-8的結合(泳道3)、與4-T的結合(泳道4)以及與4-7的結合(泳道5)。泳道1含有梅毒螺旋體對照重組肽，泳道2含有未誘導的包含4-8構建體的M15的裂解產物。
圖14的蛋白質印跡顯示了重組肽與抗組氨酸標記抗體(上)以及與CEACAM-Fc(下)的反應性。泳道2到4包含6-8肽，泳道1包含4-8肽作為對照。預測的肽遷移位置示於右側。兩個肽都與抗組氨酸標記抗體結合。但是儘管4-8與CEACAM1-Fc結合，但是6-8則不然。
圖15顯示D-8肽與CEACAM1-Fc結合(泳道1)，但是不與用作對照的CD33-Fc結合(泳道2)。此肽的來源由其與抗組氨酸標記抗體發生反應得到證實(泳道3)。
圖16是一幅示意圖，顯示了重組rUspA1片段的相對大小和位置。使用了重組的4-7用於細菌阻滯試驗——參見圖17。
圖17顯示，CHO-CEACAM1轉染子在沒有肽(A)的條件下孵育，或者與重組的對照肽(梅毒螺旋體肽)一起孵育(B)，或者與UspA1 r4-7肽(序列與MX2菌株的相應，C和D)一起孵育。加入肽的濃度以及細菌如圖所示，孵育的時間為2小時。在孵育結束時，漂洗掉未結合的細菌，結合上的細菌使用抗卡他莫拉菌的多克隆抗血清以及與四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)偶聯的二抗進行檢測。重組的卡他莫拉菌UspA1肽的濃度為1微克每毫升時，已經對異源的卡他莫拉菌株(MX1)有了顯著的抑制，且濃度為10微克每毫升時，對於流感嗜血桿菌有顯著的抑制。
實施例1卡他莫拉菌株通過UspA1蛋白與人CECAM1-Fc結合在本研究中使用的卡他莫拉菌株(Mx)包括臨床分離物(MX3和MX4)以及從美國模式培養物保藏所購得的參考菌株(ATCC25238，該菌株的一個克隆培養物被命名為MX2)。
受體覆蓋試驗顯示Mx與CEACAM1-Fc受體構建體結合為了評價卡他莫拉菌株與CEACAM1的相互作用，將細菌(大約4-8×106個)加到硝酸纖維素膜上，空氣乾燥後使用3％BSA-PBST封閉非特異位點。在硝酸纖維素條上覆蓋CEACAM1-Fc(1-2微克每毫升)或者同時加入CEACAM1的N端結構域抗體YTH71.3。CD33-Fc(1-2微克每毫升)用作陰性對照。根據以前所述製備嵌合蛋白構建體。通過偶聯辣根過氧化物酶或者鹼性磷酸酶的山羊抗人Fc抗體檢測嵌合受體的結合。顯色底物分別用二氨基聯苯胺和過氧化氫或者硝基藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。所有的菌株都與CEACAM1-Fc結合，但是都不與CD33-Fc結合(圖1)。在單克隆抗體YTH71.3存在時受體的結合受到抑制，這提示該菌株與受體的N末端結構域結合。因此，所有的菌株與只包含N端結構域的CEACAM1的截短的N-Fc構建體都有很好的結合(未顯示結果)。
卡他莫拉菌中CEACAM1-Fc結合蛋白的鑑定將未經過事先熱處理的或者在100攝氏度煮沸10分鐘的Mx的全細胞裂解產物(大約3×107個細胞)加入到10％雙tris聚丙烯醯胺(Invitrogen)凝膠的各泳道中，在180伏電泳45分鐘。使用標準的印跡條件將凝膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素濾膜上。根據上面的描述，將可溶性嵌合構建體覆蓋在膜上。在每種情況下都觀察到與CEACAM1-Fc特異結合的單個蛋白。蛋白在凝膠上的遷移顯示為Mx的UspA1蛋白，因為細菌的裂解產物在上樣時若沒有加熱變性則CEACAM1結合蛋白以＞200kD的表觀分子量遷移，如果裂解產物首先經過變性，則CEACAM1結合蛋白以降低的分子量(大約92kD)遷移(圖2)。
抗UspA1的抗體而非抗類似蛋白UspA2的抗體與Mx菌株的CEACAM1-Fc結合蛋白有結合根據出版的卡他莫拉菌的UspA蛋白的序列設計肽。即ETNNRQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR(UspA1肽)以及KDEHDKLITANKTAIDANKAS(UspA2肽)。肽通過N末端的半胱氨酸殘基與KLH偶聯，偶聯的肽用於免疫兔(每隻兔200微克肽)，免疫間隔14天。開始使用完全弗氏佐劑，之後使用不完全弗氏佐劑。在第0天和免疫之後每隔14天進行採血。使用與AminoLink Plus柱(Pierce)偶聯的適宜的肽來純化多克隆抗體。在蛋白質印跡覆蓋試驗中使用UspA特異的抗體，濃度為1-10微克每毫升，抗體的檢測使用偶聯鹼性磷酸酶的山羊抗兔二抗。印跡的顯色如前所述。三個Mx菌株的CEACAM1-Fc結合蛋白在SDS-PAGE上的遷移與UspA1抗體結合蛋白的遷移相同，但是與UspA2抗體結合蛋白的遷移不同(圖3)。
與CEACAM1-Fc共沉澱的卡他莫拉菌配基被確定為UspA1細菌的過夜培養物用含有100mM的辛基βD吡喃葡萄糖苷的PBSB重懸，其中含有蛋白酶抑制劑混合物(圖；1mM PMSF，1mM E-64，1μM胃蛋白酶抑制劑A，6nM苯丁抑制素以及100μM EDTA)。樣品在4攝氏度不斷混和過夜。同時將100微升與SepharoseCL-4B偶聯的蛋白A(Sigma)與20微克的CEACAM1-Fc或者CD33-Fc(做為對照使用)一同孵育，在4攝氏度過夜。然後用PBSB漂洗3次，去掉任何未結合的受體。15000g離心30分鐘去除不溶的細菌物質。可溶性的提取物分別與兩種受體-蛋白A-Separose複合物之一同在4攝氏度孵育2小時。(比例為5×108個細菌每微克的受體構建體)。在使用50mM的辛基βD吡喃葡萄糖苷和PBSB反覆漂洗之後，在變性條件下用SDS-PAGE電泳和蛋白質印跡分析樣品。
在與CEACAM1-Fc的共沉澱試驗中，MX4產生了一個強烈染色的蛋白條帶(約97kD)，而MX3產生一條相對弱染色的蛋白條帶，約92kD。被共沉澱的蛋白的分子量與那些在受體覆蓋實驗中觀察到的蛋白的分子量相符合(在圖3中顯示)。兩個蛋白都不與CD33-Fc共沉澱。由於被共沉澱的蛋白與抗UspA1肽的抗體結合，所以它們被進一步確定為UspA1蛋白。此外，將MX4蛋白從凝膠上切下來之後，用MALDI-TOF質譜對其進行分析(見下面)。
通過MALDI-TOF質譜鑑定CEACAM1配基(a)Western覆蓋樣品。MX2和MX3的全細胞裂解產物在Trench膠中進行SDS-PAGE。用電洗脫的方法將與CEACAM1-Fc結合配基相對應的蛋白條帶洗脫出來。將樣品濃縮，加入第二塊膠中的一個泳道中，進行電泳，然後對電泳之後適當的蛋白進行膠內胰蛋白酶消化。得到的肽使用基質輔助雷射解吸/離子化-飛行時間(MALDI-TOF)質譜進行分析。圖4a顯示了得到的MX2的CEACAM結合蛋白質譜圖譜的一個例子。得到的肽分子量輸入ProFound蛋白鑑定位點中，得到的結果如圖4b，c所示。在此有10個蛋白的分子量與卡他莫拉菌的UspA1蛋白經過胰蛋白酶消化後產生的肽的預測分子量相配，該片段佔UspA1蛋白的大約18％(圖4d)。估算的Z分值為2.34，有力地提示該蛋白是UspA1(Z分值高於1.65就是高於95％；http//129.85.19.192/profound_bin/webProFound.exe)。此外，經類似分析，MX2的另一個非結合的高分子量條帶被確定為UspA2。類似地對於MX3菌株，CEACAM1結合和非結合蛋白被分別確定為UspA1和UspA2。
(b)共沉澱的樣品對於MX4，被CEACAM1-Fc共沉澱的蛋白(如上所述)也在一次全分類查詢中經MALDI-TOF質譜被確定為UspA1，Z分值為2.27。12個肽被匹配上，覆蓋了該蛋白的21％。
因此本研究確定在所述的參考和臨床菌株中卡他莫拉菌通過高分子量蛋白UspA1靶向人CEACAM1。
對UspA1和重組肽的酶切(a)UspA1經過胰蛋白酶酶切之後的肽與CEACAM1-Fc結合使用0.1-1毫克每毫升的胰蛋白酶(Sigma)處理MX2細菌懸液(1010個細胞每毫升)，在37攝氏度孵育1-4小時。消化後的裂解產物用SDS-PAGE緩衝液解離，煮沸並且上樣進行電泳。轉移至硝酸纖維素膜上之後，使用受體構建體CEACAM1-Fc或者親和純化的抗UspA1肽抗體覆蓋印跡。與受體反應的小片段也與抗UspA1的特異抗體結合(圖5)。
(b)卡他莫拉MX2菌株UspA2蛋白的CEACAM結合結構域的定位使用1毫克每毫升的胰蛋白酶處理MX2細菌懸液，37攝氏度孵育10分鐘。
胰蛋白酶消化的樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳。染色後，對50kD區域進行過夜電洗脫。凍乾電洗脫出的蛋白，用緩衝液重懸，上第二塊膠。膠的一部分轉移到硝酸纖維素膜上，通過使用CEACAM1-Fc的蛋白質印跡覆蓋，確定了與CEACAM反應的肽條帶(圖7)。
對應於分子量大約50kD和大約150kD的肽進行N末端測序。N末端的序列是ALESNVEEGL(大約50kD的肽)和ALESNV(大約150kD的肽)。150kD的蛋白顯然是50kD蛋白的三聚體，因為它們有相同的N末端序列。該MX2UspA1肽的N末端序列示於圖8。
(c)重組肽構建的由圖6所示的序列中1-449號胺基酸組成的N末端重組MX2肽與CEACAM不發生結合。這進一步顯示大約50kD的胰蛋白酶消化後的肽(由圖8所示的序列中的463-863號胺基酸組成)，具有包含CEACAM結合結構域的ALESNVEEGL的N末端序列。
實施例2在黏膜病原物的多重毒力決定簇上確定受體結合結構域腦膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血桿菌通過與CEACAM上的重疊位點結合的配基靶向人CEACAM分子。本發明的Mx配基也靶向N結構域為。這些觀察結果顯示了一個令人興奮的可能性，即受體靶向可能涉及許多黏膜病原物配基上的相似特徵。
由於Nm和Hi與CEACAM的相互作用受到在表面表達的可變結構域的結構特徵影響，這提示它們可能包含相似的關鍵胺基酸，這些胺基酸的空間構型使它們能夠與受體結合，這些關鍵胺基酸可能在可變蛋白中是保守的。確實，我們的研究和其他人的研究提示Opa的兩個高變環(HV1和HV2)可能參與CEACAM靶向9.18。一項有力的技術可以確定配基和受體之間相互作用的可能決定簇，該技術是噬菌體展示，它可以用於確定模擬表位(模擬結合結構域的隨機序列)19以及適體(與抑制配基結合的初始結構更為接近的序列)20。
本發明還使下面的情況變得十分可行，即與CEACAM結合的Mx配基結構域會做為其他結合CEACAM的黏膜病原物的模擬物，並且該配基的結構特徵會有助於確定在Nm和Hi的配基靶向CEACAM的N端結構域所需的重要特點。Mx結構域的抗體可能具有確定其他能夠靶向受體中相同、相似或者相近位置區域的配基的潛力。
目前正在使用已知的蛋白質工程方法以及重組DNA技術來開展確定MX2 UspA1中最小CEACAM1結合結構域的工作。可以通過以上描述的受體覆蓋試驗在體外篩選重組肽，以檢測與受體結合的MX2結構域。組氨酸標記的肽可以在鎳柱上分離，並根據需要進行切割，並用於免疫兔和小鼠，以得到抗體，用於進一步的研究。
可以通過檢查其免疫刺激性質以及其他功能例如對受體結合的阻滯，來確定對於生物應用具有適宜長度的肽。
實施例3受體與配基相互作用所需的重要特徵由於CEACAM的N端結構域足以使CEACAM與Opa蛋白相互作用，本發明的發明者正在使用噬菌體展示技術，也對CEACAM N端結構域的粘附表位進行研究。本發明的發明者已經使用對受體的丙氨酸掃描突變研究了受體上的配基結合區域的信息，此研究對於本研究是有所幫助的。還有對於這種情況，也可用配基覆蓋試驗對於攜帶有受體序列的嵌合噬菌體進行生物淘選(親和濃縮)。
受體類似物具有阻滯多種菌株的潛能，這與產生的Opa蛋白類型無關，因為我們的研究已經顯示儘管Opa蛋白具有抗原變異，但是對於初級粘附，不同的Opa蛋白需要受體上具有相同的性質。另外有趣的是，注意到CEA抗原從腸道黏膜上脫落，並且有可能阻滯大腸桿菌菌株的粘附，而已知大腸桿菌也靶向CEACAM。這已經被提出做為一個先天免疫應對腸內病原物的機制。因此這些受體類似物用作治療藥劑。
實施例4與CEACAM結合的重組卡他莫拉菌UspA1肽的製備概述沿著UspA1的全長由PCR擴增出許多片段，使用如圖9所示的引物。如下描述獲得重組肽。在第一輪，發現與CEACAM1結合的重組肽由P4和P8引物擴增得到的DNA編碼，而不是由P1和P5之間的DNA區域編碼，而且，P4到P7區域重組子與CEACAM1結合，而P6到P8區域的不能。在P4到P7區域內還使用了其他的引物。D-7區域保留了與CEACAM結合的性質。4-7片段的序列示於圖10。
對於重組UspA1肽的一般克隆、表達以及純化策略使用pBAD系統製備UspA1片段1-5。所需的PCR產物以TA克隆到pBAD載體中，並且使用TOP10大腸桿菌菌株進行擴增。剩餘的步驟如圖11所示，唯一的區別在於使用阿拉伯糖誘導pBAD。使用pBAD和pQE30(圖11)兩個系統製備片段4-7，得到相似的與CEACAM結合結果。剩餘的片段使用圖11中的策略進行製備。
載體和pQE30表達系統使用pQE30載體(圖12)以及大腸桿菌菌株M15。M15包含質粒pREP4，該質粒編碼一個抑制因子，該因子抑制了克隆到pQE30載體中DNA的轉錄。加入IPTG濃度達到1mM抑制了該抑制因子的編碼，則克隆到pQE30中的片段得到轉錄。
克隆策略首先將PCR擴增產物連接到pCR2.1中。這樣產生了一個穩定的宿主，擴增產物可以通過限制性酶切(BamHI/PstI)進行回收，這也保證了基因片段的兩端都已被切割。pQE30也進行類似的酶切並且用凝膠純化回收酶切後的載體，這也保證了兩個限制性位點都已被切割。已經酶切的pQE30和UspA1擴增產物使用T4DNA連接酶在16攝氏度連接過夜，連接產物轉化入用氯化鈣處理的大腸桿菌M15感受態細胞中。在含有氨苄青黴素(100微克每毫升)和卡那黴素(25微克每毫升)的LB瓊脂平板上篩選轉化子。挑取4-8個菌落在添加有抗生素的LB液體培養基中培養。3-4毫升的培養物離心得到菌體，用鹼裂解的方法小量提取質粒。經過純化的載體如上所述進行酶切，檢查uspA1插入片段。包含具有正確插入片段大小的pQE30載體的細菌在50毫升培養基中生長，培養物用IPTG誘導(見下面)。然後使用蛋白質印跡篩選重組蛋白的表達。此外還對載體進行測序，以確定插入片段是否是正確的DNA區域，並且檢查是否有任何的序列錯誤。
表達和純化包含pQE30/uspA1構建體的M15生長在含有氨苄青黴素(100微克每毫升)和卡那黴素(25微克每毫升)的LB液體培養基中，振蕩培養直至OD600＝0.5，然後加入IPTG至濃度為1mM。培養物進一步培養3-4小時，離心回收菌體。菌體沉澱物在緩衝液B(8M尿素，50mMTris，10％乙醇，2％Tween，5mM咪唑，pH7)中增溶1-3小時，20,000g離心20分鐘出去膜物質。上清與鎳樹脂一起在搖床上孵育1-2小時，然後通過聚丙烯柱。用5-10毫升緩衝液B漂洗剩餘的樹脂，使用0.5毫升的洗脫緩衝液(緩衝液B中加入100mM咪唑)洗脫結合上的蛋白。洗脫的蛋白用SDS-PAGE檢查，然後進行透析去掉尿素和其他的鹽類。
重組片段A片段1-5和4-8這些由pBAD系統製備的片段顯示1-5不與CEACAM1結合而4-8與CEACAM1結合。
B使用pQE30系統製備的片段4-8，4-8T，4-7以及6-8片段4-8是第一個製備的重組UspA1片段，在印跡覆蓋試驗中發現它與CEACAM1高度親和地結合。除了全長的4-8重組UspA1肽以外，還觀察到一個較小的、截短的蛋白。該肽(命名為4-T)也與CEACAM1結合，看起來其表達水平比4-8要低(圖13)。對pQE30/4-T進行序列分析發現，由於一個錯配(CAA到TAA)導致在殘基谷胺醯胺624處出現一個終止密碼子(參見圖10)。
製備肽4-7和6-8以排除在6-8中出現第二個CEACAM結合位點的可能性。正如從肽4-T所預測的那樣，4-7顯示了與CEACAM的結合(圖13)，而6-8沒有與CEACAM結合(圖14)。
C由pQE30系統製備的片段D-8和D-7發現rUspA1片段D-8(圖15)以及D-7(未顯示)與CEACAM1都結合。
重組肽4-7的生物活性卡他莫拉菌菌株MX1以及流感嗜血桿菌菌株Rd與轉染了CEACAM1的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞結合。它們的結合可以被卡他莫拉菌的UspA1重組肽4-7抑制，但是不能被對照肽抑制(圖17)。
參考文獻1.Cartwright，K.et al.1995.In Meningococcal Disease.John Wiley Sons.
2.van Alphen，L. van Ham，S.M..1994.Rev Med Microbiol 5245.
3.Foxwell，A.R.et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev 62294.
4.van Alphen，L.et al.1995.Am J Respir Crit Care Med 1512094.
5.Karalus，R.et al.2000.Microbes Infection 256.Kraft，M.2000.Clin Chest Med 21301.
7.Virji，M.et al.1996.Mol Microbiol 22929.
8.Virji，M.et al.1996.Mol Microbiol 22941.
9.Virji，M.et al.1999.Mol Microbiol 34538.
10.Virji，M.et al.2000.Mol Microbiol 36784.
11.Hill，D.et al.2001 Mol Microbiol 39850.
12.Hammarstrm，S.1999 Cancer Biol 967.
13.Stephens，D.S.1989.Clin Microbiol Rev 2S104.
14.Virji，M.et al.1991.Mol Microbiol 51831.
15.Achtman，M.1995 Trends Microbiol 3186.
16.Merz，A.J. So，M.2000 Annu Rev Cell Dev Biol 16423.
17.Woods，J.P. Cannon，J.G.1990 Infect Immun 58569.
18.Wang，L-F Yu，M.1996 In Methods Mol Biol 66269(Morris，G.E.ed).Humana Press.
19.Colman-Lerner.2000.Trends Guide p.56(Wilson，E.ed.).
20.Beauchemin，N.，et al.，1999 Exp Cell Res 252243-249.
21.Boulton I.C. Gray-Owen S.D.2002 Nat Immunol 3(3)229-36.
22.Chen T.et al.，2001 J Leukoc Biol 70(2)335-40.
23.Lafontaine，E.R.，et al.，2000 J Bacteriol 1821364-1373.
24.Virji，M.2001 Trends in Microbiology，9258-259.
權利要求
1.包含CEACAM受體結合結構域的配基，所述的配基由選自以下的胺基酸序列組成圖6所示序列的殘基463-864、527-668、527-863、427-623、427-668以及427-863，或者所述的配基由上述序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡併物或羥基化、磺化或糖基化產物或者其他的次級加工產物組成。
2.包含根據權利要求1的配基以及一或多種藥物上可以接受的佐劑、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體或者防腐劑的藥物。
3.根據權利要求2的藥物用於治療或者預防感染的用途。
4.根據權利要求2的藥物用於治療或者預防任何涉及CEACAM受體的疾病的用途。
5.根據權利要求4的用途，用於治療或者預防感染、呼吸道疾病、腫瘤病以及與腫瘤相關的病症和血管新生。
6.根據權利要求3-5中的任何一項的用途，其中感染是黏膜感染或者通過黏膜出現的感染。
7.根據權利要求6的用途，其中的感染是由腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌或者卡他莫拉菌引發的。
8.根據權利要求2的藥物用於治療或者預防中耳炎的用途。
9.用於鑑定做為治療劑的新型阻滯劑的篩選試驗，該試驗包含篩選可能的治療劑的模擬根據權利要求1中配基的能力或者其與根據權利要求1中配基的同源性。
10.包含根據權利要求1的配基以及一或多種藥物上可以接受的佐劑、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體或者防腐劑的疫苗。
11.對有需要的個體治療或預防感染的方法，該方法包含給服有效量的根據權利要求2的藥物。
13.基本上根據本發明前面參考附圖中的圖6所描述並由圖6給予圖解的配基。
14.基本上根據本發明前面所描述的包含權利要求13的配基的藥物。
15.CEACAM受體結合配基在生產用於治療或者預防一些疾病的藥物中的用途，所述疾病中CEACAM受體涉及致病病原物的細胞靶向，其中該配基包含選自以下的胺基酸序列圖6所示序列的殘基463-864、527-668、527-863、427-623、427-668以及427-863；或者所述的配基包含上述胺基酸序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡併物或羥基化、磺化或糖基化產物或者其他的次級加工產物。
16.根據權利要求15的用途，其中所述疾病選自感染、呼吸道疾病、腫瘤病和與腫瘤相關的病症以及血管新生。
17.根據權利要求15或者16的用途，其中病原物感染黏膜或者通過黏膜進入。
18.根據權利要求15-17中任何一項的用途，其中導致疾病的病原物選自腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌。
19.根據權利要求18的用途，其中所述疾病是中耳炎。
全文摘要
本發明提供了從與CEACAM受體結合的卡他莫拉菌外膜蛋白中分離出的配基，所述的配基包含一個受體結合結構域，該結構域包含選自所公開組的一個胺基酸序列，或者上述序列的一個片段、同源物、功能等價物、衍生物或羥基化、磺化或糖基化的產物或者其次級加工產物。本發明還提供了包含所述配基的藥物和疫苗，以及它們在治療和預防感染中的用途。還提供了鑑定新型治療用化合物的篩選方法。
文檔編號A61K39/00GK1705678SQ200380101766
公開日2005年12月7日 申請日期2003年10月1日 優先權日2002年10月2日
發明者M·沃基 申請人:布里斯托大學