長鏈二元酸製備過程中的串罐發酵工藝的製作方法

2023-10-24 23:57:52

專利名稱：長鏈二元酸製備過程中的串罐發酵工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於長鏈二元酸製備過程中的發酵技術領域，尤其涉及長鏈二元酸製備過 程中的串罐發酵工藝，即在生產長碳鏈二元酸的過程中通過串罐技術用微生物三階段同步 發酵正構烷烴高產相應碳鏈二元酸的工藝。
背景技術：
長碳鏈二元酸(Long chain dicarboxy acids)是指碳鏈中含有10個以上碳原子 的脂肪族二羧酸(簡稱DCn或DCA)，包括飽和及不飽和二羧酸，是一類有著重要和廣泛工業 用途的精細化工產品，是化學工業中合成高級香料、高性能工程塑料、高溫電介質、高檔熱 熔膠、耐寒增塑劑、高級潤滑油、高級油漆和塗料等重要原料。發酵法生產DCA是七十年代 興起的微生物發酵技術在石油化工領域的應用。它以原料來源廣、反應專一性強和反應條 件溫和等優點逐漸取代了傳統的化學合成法，在國內外受到了普遍的重視。為以DCA為原 料的精細化工新材料產業的發展開闢了廣闊的空間。在生物法生產長碳鏈二元酸的過程中，長碳鏈二元酸的產品收率通過提取、精製 技術的改進進一步提升的空間非常有限，降低長碳鏈二元酸生產成本的潛力在發酵技術的 提高。如何提高生產菌株的產酸水平是每個生產廠家研究的重點。目前，生物法發酵生產 DCA都採用歇間式分批培養發酵，種子培養需採取逐級擴大的方法，即從斜面到搖瓶，再依 次經過一級和二級種子罐逐級培養後，轉入發酵罐進行目的產物生產。這種培養方式，種子 培養累計需要3 5天，造成設備利用率降低，由於轉種的次數多，在轉種的過程中種子發 生染菌的機率大大增加，同時，發酵批次之間產酸水平波動較大，造成生產不穩定。

發明內容
本發明所解決的技術問題是提供了一種新的以微生物發酵穩定高產長碳鏈二元 酸的方法。DCA的發酵過程分為菌種培養和發酵產酸兩個階段。一般種子培養PH值應控制在 4 6，當菌培養到一定濃度後轉入到發酵罐中培養，發酵初期以菌體生長為主，應控制pH 值在4 6 ；當菌體長到一定濃度後，光密度OD在1.0以上，再將pH值上調到6. 5 8. 5， 以產酸為主。菌體由生長期轉入發酵產酸期稱為轉發酵，菌種培養是發酵生產DCA的關鍵步驟。串罐發酵即將在發酵罐中生長良好的發酵液接種到另一隻發酵罐中繼續培養發 酵。一般取生長旺盛，產酸速度快時期的發酵液。時間發酵培養至20 60小時，光密度 (OD620)大於0. 8，發酵強度大於1. 25g/l. h，取發酵液的一部分作為種子接種到另一發酵罐 進行培養發酵，依次類推，進行串罐發酵培養。本發明中生產長碳鏈二元酸過程中的串罐發酵工藝具體步驟為1)種子培養其中，所採用的菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis),
一級種子培養基的配方為玉米漿0. 15 0.6%、酵母膏0. 2 0.5%、尿素0. 1 0.4%、蔗糖2 3%、 KH2P04 0. 6 1. 0%、消泡劑0. 02 0. 07 (ν/ν)，蠟油:3 5%。控制條件罐溫27 29°C，通風比1 0. 5 0. 7vvm，罐壓0. 09 0. llMpa， PH 4. 5 6. 5，培養時間20 30小時，OD620大於0. 60。二級種子培養基的配方為玉米漿0. 15 0. 6%、酵母膏0. 2 0. 5%、尿素 0. 1 0. 4%、蔗糖2 3%、KH2PO4 0. 6 1. 0%、消泡劑0· 02 0. 07 (ν/ν)。控制條件罐溫27 30°C，通風比1 0. 4 0. 8vvm，罐壓0. 09 0. llMpa， PH 4. 5 6. 5，培養時間12-18小時，OD620大於0. 60。2)發酵串罐培養發酵罐培養基的配方為玉米菜2 7%、Nacl 0. 1 0. 3%、酵母膏0· 15 0. 3%、尿素0· 1 0. 25%, 葡萄糖3 7%、蔗糖0. 5 2%,KN03 1. 0 2%, KH2PO4 0. 5 2%、細胞調節劑3 7%、乳化劑:0· 001 0. 05 (ν/ν) %、消泡劑0. 03% (ν/ν)。發酵控制條件接種量8 10%，罐溫28 30°C，通風比1 0. 4 0. 7vvm，罐壓0. 03 0. 12Mpa,8小時後開始流加葡萄糖，發酵液中葡萄糖濃度控制在0. 5 3%，OD620大於1. 0 時停止葡萄糖流加，開始流加烷烴，PH 加烷烴前4. 0 6. 0,加烷烴後6. 5 7. 5，培養至 72 80小時，光密度(OD62tl)大於0.8，發酵強度大於1.25g/l.h，無雜菌，可取少量部分發 酵作為下一發酵罐的種子，接入發酵液的發酵罐在菌種的培養時期，PH控制4 6。以後每個發酵罐的種子都直接來源於前一個發酵罐的發酵液，而不經過逐級擴大 培養，依次類推。原發酵罐繼續發酵至120 165小時，殘烴為0%，結束髮酵。發酵工藝示意圖如附圖1所示圖中I和II分別表示2種規格的種子罐，工業發酵中分別為2M3和30M3，①，②， ③□ □ η代表發酵罐。從斜面到搖瓶，再依次經過二級種子罐的培養後轉入發酵罐①是傳 統的逐級種子培養方式。發酵罐②的種子液直接從發酵罐①接入，發酵罐③的種子液從罐 ②接入，以此類推。因此，②和③以後各批發酵罐的種子不再進行逐級培養，而取自上一發 酵罐的部分發酵液進行串罐發酵培養。取種時間的選擇按傳統的間歇式發酵理論，隨著發酵的進行，細胞代謝物會對微生物造成毒害，菌 體也將逐步衰老、死亡。特別是到發酵後期，隨著細胞自溶，菌體濃度將下降。因此，取種時 機至關重要，取發酵培養至40 60小時發酵液作為種子最佳。判斷標準，光密度OD62tl在 0.8以上，發酵強度為1.41g/l.h，鏡檢，無雜菌。正常情況下，一個循環可以循環30 50批次。本發明的有益效果為縮短了發酵生產周期，提高了設備的利用率；穩定了發酵 生產，減少了染雜菌的機率；提高了發酵的轉化率5%以上；單罐產量提高了 10%以上。


圖1為發酵工藝示意圖
具體實施例方式下面通過具體實施例進一步說明本發明的技術方案，但是本發明不以具體實施例 為限。實施例1發酵串罐培養發酵罐培養基的配方為玉米漿2%、Nacl :0. 1 %、酵母膏0. 15 %、尿素0. 1 %、葡萄糖3 %、蔗糖 0.5%、KN03 1.0%, KH2PO4=O. 5 %、細胞調節劑3%、乳化劑0. 001 (ν/ν) %、消泡劑
0.03% (ν/ν)。發酵控制條件接種量8%，罐溫28°C，通風比1 0. 4vvm，罐壓0. 03Mpa，8小時後開始流加 葡萄糖，發酵液中葡萄糖濃度控制在0.5%，OD62tl為1.03時停止葡萄糖流加，開始流加烷 烴，PH 加烷烴前4. 0，加烷烴後6. 5，培養至72小時，光密度(OD620)為0.9，發酵強度1. 35g/
1.h，無雜菌，可取少量部分發酵作為下一發酵罐的種子，接入發酵液的發酵罐在菌種的培 養時期，PH控制4。實施例2發酵串罐培養發酵罐培養基的配方為玉米漿3%、Nacl:0. 2%、酵母膏0. 2%、尿素0. 15%、葡萄糖4%、蔗糖1%、 KN03 1. 3%,KH2PO4 0. 8%、細胞調節劑4%、乳化劑0. 001 (ν/ν) %、消泡劑0. 03% (ν/ν)。發酵控制條件接種量9%，罐溫29°C，通風比1 0. 5vvm，罐壓0. 08Mpa，8小時後開始流加 葡萄糖，發酵液中葡萄糖濃度控制在1. 7%，( 62(|為1. 0時停止葡萄糖流加，開始流加烷烴， PH 加烷烴前5. 0，加烷烴後7. 0，培養至75小時，光密度(OD620)為0.9，發酵強度為1. 26g/ 1. h，無雜菌，可取少量部分發酵作為下一發酵罐的種子，接入發酵液的發酵罐在菌種的培 養時期，PH控制4 6。實施例3發酵串罐培養發酵罐培養基的配方為玉米漿5%、Nacl0. 3%、酵母膏0. 3%、尿素0. 25%、葡萄糖7%、蔗糖2%、 KN03 2%, KH2PO4 :2%、細胞調節劑7%、乳化劑0. 05 (ν/ν) %、消泡劑0. 03% (ν/ν)。發酵控制條件接種量10%，罐溫30°C，通風比1 0. 7vvm，罐壓0. 12Mpa，8小時後開始流加 葡萄糖，發酵液中葡萄糖濃度控制在3%，OD620為1. 0時停止葡萄糖流加，開始流加烷烴， PH 加烷烴前6. 0，加烷烴後7. 5，培養至80小時，光密度(OD620)為0. 92，發酵強度為1. 3Ig/ 1. h，無雜菌，可取少量部分發酵作為下一發酵罐的種子，接入發酵液的發酵罐在菌種的培養時期，PH控制6。實施例4發酵串罐培養發酵罐培養基的配方為玉米漿4%、Nacl :0. 3 %、酵母膏0. 25%、尿素0. 18%、葡萄糖5%、蔗糖 1. 7%,KN03 :1. 8%,KH2PO4 :1. 5%、細胞調節劑6%、乳化劑0. 05(v/v) %、消泡劑0. 03% (ν/ν)。發酵控制條件接種量9%，罐溫29°C，通風比1 0. 6vvm，罐壓0. 09Mpa，8小時後開始流加 葡萄糖，發酵液中葡萄糖濃度控制在2. 5%，0062(|為1. 1時停止葡萄糖流加，開始流加烷烴， PH 加烷烴前5. 0，加烷烴後7. 2，培養至76小時，光密度(OD620)為0. 88，發酵強度為1. 28g/ 1. h，無雜菌，可取少量部分發酵作為下一發酵罐的種子，接入發酵液的發酵罐在菌種的培 養時期，PH控制5。實施例5發酵串罐培養發酵罐培養基的配方為玉米漿6%、Nacl :0. 3%、酵母膏0.、尿素0. 23%、葡萄糖6%、蔗糖 1. 8%,KN03 :1. 2%,KH2PO4 :0. 9%、細胞調節劑7%、乳化劑0. 05 (ν/ν) %、消泡劑0. 03% (ν/ν)。發酵控制條件接種量10%，罐溫28°C，通風比1 0. 4wm，罐壓0. 10Mpa，8小時後開始流加 葡萄糖，發酵液中葡萄糖濃度控制在1. 5%, OD620為1. 05時停止葡萄糖流加，開始流加烷 烴，PH 加烷烴前5. 0，加烷烴後6. 8，培養至80小時，光密度(OD620)為0. 89，發酵強度為 1. 29g/l. h，無雜菌，可取少量部分發酵作為下一發酵罐的種子，接入發酵液的發酵罐在菌 種的培養時期，PH控制5。間歇式發酵與串罐培養發酵結果比較如下表(在200M3發酵罐上，以生產DC12為 例，生產結果如下)。
權利要求
1.長鏈二元酸製備過程中的串罐發酵工藝，有①，②，③......η個發酵罐，其特徵在於發酵罐②的種子液直接從發酵罐①接入，發酵罐③的種子液從罐②接入，以此類推，即 ②和③以後各批發酵罐的種子不再進行逐級培養，而取自上一發酵罐的部分發酵液進行串 罐發酵培養。
2.如權利要求1所述的長鏈二元酸製備過程中的串罐發酵工藝，其特徵在於發酵液 的取種時機為取發酵培養至40 60小時發酵液作為種子最佳，判斷標準為光密度OD62tl 在0. 8以上，發酵強度大於1. 25g/l. h，鏡檢，無雜菌。
3.如權利要求1所述的長鏈二元酸製備過程中的串罐發酵工藝，其特徵在於發酵罐 培養基的配方為玉米漿2 7%、Nacl :0. 1 0. 3%、酵母膏0. 15 0. 3%、尿素0. 1 0. 25%、葡萄糖3 7%、蔗糖0. 5 2%、KN03 :1. 0 2%、KH2P04 :0. 5 2%、細胞調節 劑3 7%、乳化劑0. 001 0. 05(v/v) %、消泡劑0. 03% (ν/ν)。
4.如權利要求1或3所述的長鏈二元酸製備過程中的串罐發酵工藝，其特徵在於發 酵酵控制條件為接種量8 10%，罐溫28 30°C，通風比1 0. 4 0. 7vvm，罐壓 0. 03 0. 12Mpa, 8小時後開始流加葡萄糖，發酵液中葡萄糖濃度控制在0. 5 3%，OD620大 於1. 0時停止葡萄糖流加，開始流加烷烴，PH 加烷烴前4. 0 6. 0，加烷烴後6. 5 7. 5，培 養至72 80小時，光密度(OD62tl)大於0. 8，發酵強度大於1. 25g/l. h，無雜菌，可取少量部 分發酵作為下一發酵罐的種子，接入發酵液的發酵罐在菌種的培養時期，PH控制4 6。
全文摘要
本發明屬於長鏈二元酸製備過程中的發酵技術領域，尤其涉及長鏈二元酸製備過程中的串罐發酵工藝，本發明中每個發酵罐的種子都直接來源於前一個發酵罐的發酵液，而不經過逐級擴大培養，依次類推。取發酵液的一部分作為種子接種到另一發酵罐進行培養發酵，依次類推，進行串罐發酵培養，能夠縮短周期，提高設備的利用率，並且微生物發酵穩定高產長碳鏈二元酸。
文檔編號C12R1/74GK102071226SQ20101016030
公開日2011年5月25日 申請日期2010年4月30日 優先權日2010年4月30日
發明者傅深展, 曹務波, 王志洲, 葛明華, 陳遠童 申請人:山東瀚霖生物技術有限公司