用於超聲造影的造影劑的製作方法

2023-10-24 04:29:27

專利名稱：用於超聲造影的造影劑的製作方法
技術領域：
本發明是關於診斷造影領域。更詳細地，本發明是關於用於改善採用被稱為超聲造影的診斷造影技術時所得的影像。
利用超聲檢查人和動物內部器官是前些時期引入的診斷方法，它是基於兆赫範圍(1MHz以上)內的超聲波在不同類型組織之間的內表面上反射。所產生的回波因此被放大並顯示出來。對比介質超聲心動描記術是這種結合中特別重要的，它被用在M型和二維超聲心動描記術中的心臟病診斷。
超聲造影包括了超聲能量通過一種物質轉變，這種物質具有部分定向超聲波射線被反射(散射)並被設在需造影區域表面上的探測器接收的聲學性能。散射射線的強度在很大程度上取決於散射中心的尺寸以及散射中心和周圍介質之間的密度和可壓縮性的不同。通過散射超聲射線轉變成顯示在屏幕上的電信號而得到的最後造影的銳度和清晰度經常不足。因而人們在設計生物適應性造影劑(Contrast agents)上作了大量的努力，當將這些造影劑注入到血流中時，它們將使散射射線的強度增加，從而使所得造影的銳度和清晰度增加，提高了觀察血液由心臟輸送到其它器官流動的能力。
用於超聲心回波描記術的許多對比介質已有描述，如不穩定過氧化氫、用二氧化碳濃縮的不穩定氯化鈉溶液，由明膠包封的微氣泡以及以其它方式穩定的微氣泡。見美國專利4，572，203、4，718，433、4，774，958和4，844，882。到目前為止，這類造影劑都是由穩定(或不穩定)微氣泡組成。
分子生物系統(Molecular Biosystems)銷售的ALBUNEX是由微氣泡組成的，這種氣泡是通過使人體血清蛋白(HSA)溶液經聲波處理而製備的。在歐洲，正在研究中的其它體系包括ECHOVIST和LEVOVIST，這些造影劑中含有含大量捕集的空氣氣泡的半乳糖顆粒懸浮液。所有這些含氣泡的體系當受壓時都有不穩定缺陷，該壓力大約為心臟收縮的血壓，即130mmHg或更大。Meltzer及其同事研究發現，在120mmHg時，HSA微氣泡的壽命為10秒鐘;ECHOVIST的活性在1～2分鐘內會失去一半。壓力升高，該速度會劇烈增加。見Meltzer，R.S.等人，Advances in Echocardiography Conference，10/4-5/90，Chicago，IL。
因此需要一種對血流壓力有抵抗力的超聲造影劑。這種材料能使人們觀察到先前已不能接近含上述造影劑的氣泡的組織和器官，例如，在將造影劑注入遠距離末梢靜脈或動脈後，觀察血液通過心臟、肝及其它器官的灌注情景。造影劑還必須含有生物適應性材料，而且應具有一定的粒度分布以使該試劑能容易地通過肺的毛細床。
我們發現，製備由人體血清白蛋白(HSA)和脂肪酸組成的、對血流壓力具有很大穩定性的顆粒是可能的。這些顆粒散射超聲射線的水平與已有的微氣泡材料相似或更高。更詳細地，本發明提供了一些含由人體血清白蛋白包封的脂肪酸芯的超聲造影劑(imaging agents)。
另一方面，本發明提供了一種製備超聲造影劑的方法，該方法包括(a)通過將脂肪酸在一種溶劑中溶解而製備脂肪酸溶液;(b)將脂肪酸溶液與HSA溶液混合，從而形成具有HSA塗層的細顆粒脂肪酸懸浮液;和(c)加熱所得懸浮液至高於90℃，並同時迅速攪拌以使HSA凝結。加熱使白蛋白分子交聯成穩定的網絡並分離出可能使用過的任何低沸點(有機)溶劑。儘管通常選擇與水混溶的有機溶劑，但使用不與水混溶的溶劑也是有可能的。
在本發明可選擇的方法中，脂肪酸懸浮液是通過酸化脂肪酸的鹽溶液以形成脂肪酸乳濁液而製備的，所述鹽典型地為鈉鹽。在加熱使HSA凝結之後再加入HSA。在本方法中，避免了使用脂肪酸的溶劑。
本發明的造影劑的平均直徑必須在0.1到12微米的範圍內，其中0.1到10微米為優選，0.1到8微米為更加優選。
用於形成本發明造影劑的脂肪酸是選自具有6到18個碳原子的脂肪酸。它可以是飽和的[CH3(CH2)nCOOH，其中n為4到16的整數]或是不飽和的，可以是直鏈或是支鏈的。在體溫(32℃)時為液體為優選。脂肪酸的混合物也是適宜的。儘管這類混合物可以包括在32℃時通常是固體的脂肪酸，以及在32℃時通常是液體的脂肪酸，但是混合物在32℃時為液體為優選。
用於製備本發明造影劑的適宜脂肪酸例子包括己酸、十四烷酸、油酸、硬脂酸、辛酸、異硬脂酸、棕櫚酸和月桂酸。
根據脂肪酸的重量計算，本發明造影劑的脂肪酸部分可含高達50%重量的與生理相適應的輔助劑，在32℃時輔助劑為液體為優選。這些輔助劑可包括油(如膽固醇)，以及表面活性劑。它們可具有增加回波產生力(echogenicity)、控制顆粒尺寸等的作用。
另外，HSA可以是經過改性的，如為了預防免疫響應或增加造影劑在器官中的停留時間，可在HSA中加入聚亞烷基二醇。
在本發明的造影劑顆粒中，HSA部分與脂肪酸部分的重量比例大約為10∶1到1∶1，其中6∶1到3∶1為優選，大約4∶1為更優選。
在本發明的一種方法中，發明的造影劑是通過在HSA溶液中沉積脂肪酸，然後加熱使HSA凝結而製備的。在此過程中應充分攪拌以保證得到可接受的粒度分布。在本發明優選的一個實施例中，沉積是通過在使用聲波處理機提供所需攪拌的同時向HSA溶液中注入脂肪酸溶液而完成的。儘管可使用任意合適的攪拌速度，我們優先選擇60到600RPM的速度範圍。我們還發現，回波產生力的增加程度隨著攪拌速度的增加而增加。
在本發明一種可選擇的方法中，發明的造影劑是這樣製備的，即首先產生一種脂肪酸水懸浮液，如將酸的鈉鹽溶液酸化，然後將HSA與懸浮液混合，再加熱使HSA凝結。
在這種方法的一個優選實施例中，為了提高所得顆粒的回波產生力，在將脂肪酸懸浮液與HSA混合之前在該懸浮液中通入氣體以產生氣泡。儘管其它生理上可接受的氣體可被採用，優選的該氣體為氧氣。在該實施例中，氣體通入懸浮液產生氣泡的時間至少為8小時，更優選為至少24小時。在一個實驗(見實施例6)中，結果發現，向懸浮液中通6天的產生氣泡的氧氣能大大地增強回波產生力。
優選地，沉積後的加熱步驟是漸進進行的，持續至少大約45分鐘，至少一小時為優選。
實際上，造影劑通常是以本發明的顆粒在一種生理能接受的液體中的懸浮液形成注入到受體上去的，該懸浮液一般含0.1～3%(重量/體積)的固體，0.1～2%為優選，大約1.5%為更加優選。
實施例1 製備由HSA和十四烷酸組成的超聲造影劑將3.5ml含7%十四烷酸的四氫呋喃溶液注入到25ml含2%人體血清白蛋白的溶液中，此時溶液用加熱系統WP375聲波處理機攪拌。將所得懸浮液經3分鐘的聲波處理，處理後溫度為51℃(此溫度遠低於HSA的凝結溫度)。然後，在攪拌(大約60RPM)的同時將懸浮液加熱到大約95℃。該加熱步驟所耗費的總時間大約為55分鐘。此時，懸浮液基本上不含四氫呋喃並呈半透明外觀。顆粒平均直徑大約為6微米。我們利用7Mhz射線檢驗了這種懸浮液的一個樣品，此懸浮液的散射(回波產生力)水平大約為11mV(毫伏)，結果很好。這至少比水的散射水平多一個數量級。
實施例2 使用高攪拌速度根據實施例1中描述的方法重複製備HSA/十四烷酸造影劑，其造影劑的回波產生力水平為19MV。在同樣的製備中，攪拌速度提高一個數量級(從大約60RPM提高到600RPM)。這包括攪起大量空氣泡沫。大的捕集的空氣氣泡通過靜置懸浮液24小時而被消除，即通過使大的氣泡升至液面，然後，要測試的樣品由容器的底部取出。採用這種方法製備的造影劑的回波產生力水平為57mV。正如上面所指出的，應該注意，這個測量結果不應是大的捕集的氣泡的功效。在顆粒直徑放大3000倍的顯微鏡中觀看，沒有發現氣泡的存在。在此放大倍數時，人們能夠分辨直徑大於0.2微米的氣泡。顆粒的直徑範圍為大約1～12微米。在室內條件下存放一個月，其回波產生力水平實際上相同。(54mV)。
為了對比，在大約600RPM條件下迅速攪拌2%的HSA溶液。超初，其回波產生力值也很高(超過50mV)(攪拌後立即測量)。但是，散射強度隨時間很快下降，以致於一會兒之後，所獲得的信號僅僅高於背景(大約2MV)。
實施例3 利用不同的脂肪酸製備HSA/脂肪酸造影劑根據實施例1中描述的方法，使用下列脂肪酸製備HSA懸浮液棕櫚酸、油酸、月桂酸和硬脂酸。所有這些都顯示出了很高(大於30mV)的回波產生力。
實施例4 使用不與水混溶的有機溶劑根據實施例1中描述的方法製備HSA/十四烷酸懸浮液，但使用正己烷代替四氫呋喃。這樣，當將正己烷溶液與HSA混合時會形成水包油型乳狀液。隨後的加熱分離出正己烷並留下懸浮在HSA中的脂肪酸。用這種方法製備的濃度為含約1.9%固體的懸浮液顯示出與使用四氫呋喃時所得的懸浮液回波產生力基本相同(27mV)。
實施例5 可供選擇的製備方法(不使用有機溶劑)採用0.1NHCl滴定50ml0.5%油酸鈉的水溶液樣品，使最終pH值為3.5。由於生成了一種油酸懸浮液，所以溶液變得非常混濁。光學顯微術測量的粒徑在0.1微米範圍內。
將30%人體血清白蛋白的水溶液加入到此乳狀液中以使最後的白蛋白濃度為2.0%。然後將混合液在中等攪拌速度條件下加熱60分鐘以使最後溫度為94℃。與水相比(1.2mV)，測量上述溶液的回波產生力為15.9mV。
實施例6 使用氧化以提高回波產生力根據實施例5中描述的方法製備油酸乳狀液，在六天時間內將純氧氣通入乳狀液。如上所述，將人體血清白蛋白加入，並在中等攪拌速度下加熱此混合液30分鐘，該時間結束時，溫度為94℃。與水相比(1.2mV)，測量上述溶液的回波產生力為93mV。
儘管不打算與本發明的任何理論相聯繫，但卻注意到氧氣容易被油酸吸收。可以想像，在加熱過程中，溶解的氧氣被油酸的表面吸收，此時氧氣被包封油酸的白蛋白捕集(由於在高於其凝結溫度下加熱)。這些氣泡被假定成很小(在3000倍條件下不可見)而且在造影劑中顯然非常穩定。可以想像其它氣體如氬氣、氮氣、二氧化碳、氮氣以及氧化亞氮也具有同樣的作用。
因此，下面的結論也是可能的，即使沒有本實施例的氧氣增強技術，本發明的造影劑顆粒的回波產生力很大的原因是由於有被包封的氧氣微氣泡，這種氧氣微氣泡可能被捕集在脂肪酸和HSA之間的表面上。
實施例7 稀釋作用根據實施例6的方法製備了一種懸浮液。其平均粒徑為8微米。固體含量為2.5%時的回波產生力為35mV。通過加入水將溶液濃度稀釋成原始濃度的一半並測量其回波產生力。重複稀釋直至溶液濃度為原始濃度的1/32。此系列實驗的數據如下濃度 回波產生力(Mv)2.5% 351.25% 870.625% 780.31% 270.155% 170.0785 7.5
數據表明，當濃度降至小於0.1%時，該系統保持很好的散射水平。
實施例8 加熱前在油酸和HSA懸浮液中加入少量油酸鈉的作用根據實施例6描述的方法製備了一種懸浮液。其顆粒尺寸為6～10微米。固體含量為2.0%時的回波產生力為20mV。另一種懸浮液是通過加熱前加入少量油酸鈉(與HSA的重量比為2%)而製備的。在固體含量及顆粒尺寸相同時，由此方法製備的懸浮液的回波產生力為36mV。
實施例9 壓力作用將按實施例2描述的方法製備的HSA/棕櫚酸顆粒懸浮液的一個樣品在160mmHg壓力下作用30分鐘。結果表明在壓力作用前後的回波產生力變化很小(兩種情況下均為70mV)。這表明了這些造影劑對壓力變化的穩定性。
實施例10 稀釋脂肪酸的作用根據實施例1中描述的方法製備了一系列懸浮液，但其中部分脂肪酸(這裡採用十四烷酸)被膽固醇代替，以保證膽固醇與十四烷酸的比例為1∶1、2∶1和1∶2。只有十四烷酸含量高的樣品顯示出高的散射水平。也就是說，不是脂肪酸的油類(如膽固醇)不能使HSA具有足夠的增加穩定的回波產生顆粒的能力。相反地，它們用作稀釋劑，並且只能允許佔很小的比例。
實施例11 代替脂肪酸醇的作用(比較實施例)根據實施例1描述的方法製備懸浮液，但採用十四烷醇代替十四烷酸。這種醇也稱為1-十四烷醇。其散射水平比由十四烷酸得到的懸浮液低得多，這表明，在本發明的實際使用中不能使用脂肪醇代替脂肪酸。
實施例12 採用葡聚糖代替HSA根據實施例1描述的方法製備懸浮液，只是採用葡聚糖聚合物代替HSA。生成了很好的十四烷酸懸浮液，但其回波產生力很小(2.8mV)。這就表明在本發明的實際使用中只能採用HSA。
實施例13 採用非脂肪酸對比根據實施例1的方法進行對比實驗，只是不採用脂肪酸。結果沒有觀察到散射射線。這再一次證明本發明使用脂肪酸的必要。
實施例14 心臟左側造影的論證將按實施例1描述的方法製備的懸浮液注入兔子的右心室，可以觀察到左心臟造影，這就表明該造影劑經過肺的毛細床、肺移至左心室。另外，採用同樣的注射方法可以觀察到很好的肝充滿。當通過耳靜脈注射時，也能得到很好的左心臟造影。這些實驗是在麻薩諸塞總醫院(Massachusetts General Hospital)藥學和造影研究中心(Center for Pharmaceutical and Imaging Research)採用7.5Mhz射線和Acuson造影機進行的。
當然，可在不背離本發明的範圍和實質前提下進行改變和修正。
權利要求
1.一種診斷造影劑，含平均直徑不大於12微米的顆粒，所述顆粒含有由人體血清白蛋白包封的一種或多種脂肪酸芯體。
2.根據權利要求1的造影劑，所述顆粒平均直徑在0.1～12微米範圍內。
3.根據權利要求2的造影劑，所述顆粒平均直徑在0.1～10微米範圍內。
4.根據權利要求3的造影劑，所述顆粒平均直徑在0.1～8微米範圍內。
5.根據權利要求1的造影劑，所述脂肪酸具有6～18個碳原子。
6.根據權利要求5的造影劑，所述脂肪酸為飽和的。
7.根據權利要求5的造影劑，所述脂肪酸為直鏈的。
8.根據權利要求2的造影劑，所述脂肪酸為不飽和的。
9.根據權利要求5的造影劑，所述脂肪酸有一支鏈。
10.根據權利要求1的造影劑，其進一步包括能與脂肪酸相容的輔助劑。
11.根據權利要求10的造影劑，所述輔助劑為選自生理能接受的油類和表面活性劑。
12.根據權利要求11的造影劑，所述輔助劑為膽固醇。
13.根據權利要求10的造影劑，所述輔助劑的重量含量以脂肪酸的總重量計算為0～50%。
14.根據權利要求1的造影劑，所述人體血清白蛋白與脂肪酸的重量比為10∶1～1∶1。
15.根據權利要求14的造影劑，所述比例為4∶1。
16.一種製備診斷造影劑的方法，所述造影劑含平均直徑不大於12微米的顆粒，所述顆粒含有由人體血清白蛋白包封的一種或多種脂肪酸芯體，該方法包括形成包封有人體血清白蛋白的脂肪酸的細顆粒懸浮液和加熱所得懸浮液以凝結人體血清白蛋白。
17.根據權利要求16的方法，所述懸浮液被加熱到90℃以上。
18.根據權利要求17的方法，所述懸浮液被加熱至少45分鐘。
19.根據權利要求18的方法，所述懸浮液被加熱至少一小時。～600RPM範圍內。
20.根據權利要求16的方法，所述懸浮液的攪拌速度在60～600RPM範圍內。
21.根據權利要求16的方法，所包括的步驟為(a)通過將一種脂肪酸溶解在一種溶劑中製備一種脂肪酸溶液;(b)將所述脂肪酸溶液與人體血清白蛋白溶液混合以形成由人體血清白蛋白的包封的脂肪酸細顆粒懸浮液;及(c)在快速攪拌的同時加熱所得懸浮液至90℃以上以凝結人體血清白蛋白。
22.根據權利要求16的方法，所包括的步驟為(a)酸化脂肪酸的鹽溶液以形成脂肪酸乳狀液;(b)加入人體血清白蛋白;和(c)加熱凝結人體血清白蛋白。
23.根據權利要求22的方法，將氣體在步驟(b)之前通入脂肪酸溶液以產生氣泡。
24.根據權利要求23的方法，所述氣體含氧氣。
25.根據權利要求24的方法，所述氣體通入起泡持續至少8小時。
26.根據權利要求25的方法，所述氣體通入起泡持續至少24小時。
27.根據權利要求26的方法，所述氣體通入起泡持續6天。
全文摘要
本發明公開一種顆粒及其製備方法，所述顆粒的平均直徑小於大約12微米，此顆粒含由人體血清白蛋白包封的脂肪酸芯體。這些材料用作超聲造影的造影劑，其散射強度相當於或大於由分散的微氣泡而塗到的造影劑的散射強度。但是，與以分散的微氣泡為基礎的造影劑相比，不論是儲存或是在體內使用，本發明的造影試劑均穩定得多。
文檔編號A61B8/00GK1073880SQ92115180
公開日1993年7月7日 申請日期1992年12月4日 優先權日1991年12月4日
發明者J·尤德森, S·E·包爾 申請人:施特靈溫思羅普有限公司