共價固定生物分子的蛋白質晶片及其製備方法
2023-10-24 09:18:22 2
專利名稱：共價固定生物分子的蛋白質晶片及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測用蛋白質晶片，特別涉及一種可以在固體表面上共價固定配基分子，而且能夠有效抑制蛋白質分子在晶片表面上的物理吸附的蛋白質晶片及其製備方法。
背景技術：
蛋白質晶片是利用晶片表面上固定的配基分子來檢測生物分子的一項新技術。配基分子在蛋白質晶片表面上固定的質量，和晶片表面對其它非目標蛋白質的吸附是影響蛋白質晶片檢測的重要因素。目前，用於固定配基分子的方法大多是物理吸附法，如ELISA，RIA等檢測方法中採用的固定方法。通過物理吸附法固定在晶片表面上的配基分子的穩定性差，易脫落，而且易導致配基分子變性，失去生物活性。另外，使用物理吸附法固定配基分子的蛋白質晶片表面上易吸附非目標蛋白質，導致假陽性結果。
發明內容
本發明的目的在於提供一種固體表面上共價結合配基分子的蛋白質晶片，以克服上述通過物理吸附方法固定配基分子製備蛋白質晶片所帶來的缺點如配基分子不穩定，易從晶片上脫落，易變性，而且晶片表面易發生非目標蛋白質吸附，出現假陽性檢測結果等問題。
本發明的另一目的是提供一種簡單、易於實施的蛋白質晶片表面改性技術。
本發明的目的是這樣實現的本發明提供的共價固定生物分子的蛋白質晶片，包括固體基片和配基感應膜層，其特徵是在固體基片和配基感應膜層之間還包括一層改性層，改性層通過共價鍵分別與固體基片和配基感應膜層連接。
其中所述的固體基片為半導體材料(如矽片、鍺片等)、金屬、玻璃、塑料或固體複合材料(如表面為金屬膜、介質膜、化學膜或生物化學膜的固體複合材料)。
蛋白質晶片的改性層由氯矽烷聚乙二醇衍生物構成。
氯矽烷聚乙二醇衍生物分子ClaSi(CH2)m(OCH2CH2)nOX由氯矽烷，烷烴，聚乙二醇，末端基團X四部分構成。氯矽烷部分的a可以是1、2或3，即一氯矽烷(ClSi-)、二氯矽烷(Cl2Si-)或三氯矽烷(Cl3Si-)。聚乙二醇的聚合度n可以介於3到50之間，通常選擇n在3-8之間，m可以是5到20之間任意正整數。氯矽烷部分易與固體表面上的羥基反應生成矽氧鍵，從而把該化合物共價地固定在固體表面上。烷烴部分的存在有益於氯矽烷聚乙二醇衍生物分子在表面上的有序排列。聚乙二醇分子的親水性、柔性和電中性能夠有效抑制蛋白質分子在晶片表面上的物理吸附。按照是否用於共價固定配基分子，末端基團X被分為兩類一類是可以用來固定配基分子的基團，如羧基、氨基、巰基、醛基等，由於這些基團易與氯矽烷發生化學反應，所以在被用來固定配基分子前，根據不同的基團採取了不同的化學保護；另一類是惰性基團，不用來共價固定配基分子，如甲基，乙基等，帶有這類惰性末端基團的衍生物抑制蛋白質分子的物理吸附效果比帶有活性末端基團的衍生物更好，但是惰性基團無法活化來結合配基分子。因此，使用合適比例混合的帶有活性基團和帶有惰性基團的聚乙二醇衍生物改性的蛋白質晶片表面，不但能夠共價固定配基分子，而且能夠實現最大程度地抑制蛋白質分子在蛋白質晶片表面上的物理吸附。
配基感應膜層由被檢測的生物分子形成，如各種抗體、抗原、受體、配體、DNA片段等。
本發明提供的蛋白質晶片製備方法包括以下步驟1.固體基片的選擇和表面清潔處理選擇固體基片材料和大小，用常規清潔處理方法進行表面清潔處理，除去表面汙漬和灰塵。
2.固體基片表面處理，使之帶有易與氯矽烷發生化學反應的活性基團，如羥基、羧基、氨基、巰基、醛基、羰基等。如以半導體材料和玻璃為固體基片的，可以使用親水化處理方法，使表面上帶有大量羥基。以金屬或表面鍍金屬膜的複合材料為固體基片的，可以通過巰基試劑在金屬表面上引入上述活性基團。以塑料為固體基片的，可以通過等離子體處理技術在表面上引入上述基團。
3.氯矽烷聚乙二醇衍生物改性層的製備將帶有活性基團和帶有惰性基團的氯矽烷聚乙二醇衍生物(活性基團已經化學保護)按照合適的比例(隨固定的配基分子不同而不同)(1∶1至1∶100，摩爾比)溶於有機溶劑中，混合均勻。將2中準備好的固體基片浸泡於上述溶液中充分反應，清洗後備用。
4.氯矽烷聚乙二醇衍生物ClaSi(CH2)m(OCH2CH2)nOX末端活性基團X的活化根據氯矽烷聚乙二醇衍生物末端活性基團的不同，對3中製備好的基片採用不同的脫保護方法處理後，再根據要固定的配基分子的種類和要固定的基團對脫保護的末端基團或配基上的基團採用不同的活化處理。
5.配基感應膜層的製備將4中製備好的基片孵育在配基溶液中充分反應(反應時間隨溶液濃度不同而不同)。清洗後再使用合適的封閉溶液封閉基團，即製得本發明的蛋白質晶片。
本發明的蛋白質晶片適合於各種固相生物檢測方法。所謂固相生物檢測方法是指把配基分子首先固定在固體表面上，然後把帶有配基的表面與待測溶液孵育，再通過各種檢測方法檢測待測溶液中是否含有能夠與配基分子發生特異性結合的生物分子的一種檢測方法。目前，用於固相檢測的檢測方法很多，如酶聯免疫法、化學發光法、螢光法、同位素法、橢偏光學成象法、表面等離子共振法等。
本發明提供的蛋白質晶片可以用於生命科學研究中生物分子檢測、臨床疾病診斷和生物工業生產過程中的檢測等方面。
本發明的優點1.本發明提供的蛋白質晶片能夠共價固定配基分子，使之穩定，不易脫落。
2.本發明提供的蛋白質晶片能夠保持配基分子生物活性，不易變性失活。
3.本發明提供的蛋白質晶片能夠抑制非目標蛋白質分子的物理吸附，避免出現假陽性檢測結果。
圖1是本發明的蛋白質晶片結構示意圖；圖面說明如下1固體基片2改性層3配基感應膜層具體實施方式
實施例1按圖1製備用於檢測人免疫球蛋白G(IgG)的蛋白質晶片。
該晶片的固體基片1選用的是0.5mm的拋光矽片。改性層2由氯矽烷聚乙二醇衍生物，它分別是Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2COOCH2CH3和Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2CH3，按1∶50(摩爾比)混合製成的。配基分子是人免疫球蛋白G(IgG)的抗體(antiIgG)。
該蛋白質晶片的製備按以下步驟進行1.矽片表面的清潔處理用弱鹼性溶液(如氨水)清洗矽片表面，除去表面汙漬。
2.矽片表面親水化處理將步驟1處理過的矽片放入體積比為1∶3的30wt％的H2O2和98wt％的H2SO4的混合液中浸泡20分鐘，取出用去離子水清洗至中性，即得到表面帶有羥基的親水基片1。
3.氯矽烷聚乙二醇衍生物改性層製備把Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2COOCH2CH3和Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2CH3以1∶50摩爾比混合後溶於三氯乙烯中。把步驟2中處理的矽片放入聚乙二醇衍生物溶液中浸泡5分鐘。用三氯乙烯和無水乙醇輪流清洗後，得到改性後的晶片基片；4.Cl(CH3)2Si(CH2)11(OCH2CH2)3OCH2COOCH2CH3羧基脫保護和羧基激活用稀硫酸溶液處理步驟3的基片，脫除羧基保護。再使用N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)處理羧基生成活潑酯衍生物；5.antiIgG膜層的製備把經過步驟4處理的基片放入antiIgG溶液中浸泡20分鐘，清洗後再使用乙醇胺溶液封閉未結合antiIgG分子的活潑酯。得到檢測人免疫球蛋白G(IgG)的蛋白質晶片。
實施例2製備用於檢測人胰島素(insulin)的蛋白質晶片。
該晶片的固體基片選用的是0.5mm的拋光矽片，表面是自然生成的二氧化矽膜層。聚乙二醇衍生物分別是Cl2CH3Si(CH2)9(OCH2CH2)4OCH2COOCH2CH3和Cl2CH3Si(CH2)9(OCH2CH2)3OCH3。配基分子是胰島素抗體(anti-insulin)。
該蛋白質晶片的製備按以下步驟進行1.矽片表面的清潔處理用弱鹼性溶液(如氨水)清洗矽片表面，除去表面汙漬。
2.矽片表面親水化處理將步驟1處理過的矽片放入體積比為1∶3的30wt％的H2O2和98wt％的H2SO4的混合液中浸泡30分鐘，取出用去離子水清洗至中性，即得到表面帶有羥基的親水基片。
3.氯矽烷聚乙二醇衍生物改性層製備把Cl2CH3Si(CH2)9(OCH2CH2)4OCH2COOCH2CH3和Cl2CH3Si(CH2)9(OCH2CH2)3OCH3以1∶30摩爾比混合後溶於三氯乙烯中。把步驟2中處理的矽片放入氯矽烷聚乙二醇衍生物溶液中浸泡10分鐘。用三氯乙烯和無水乙醇輪流清洗後，得到改性後的晶片基片。
4.Cl2CH3Si(CH2)9(OCH2CH2)4OCH2COOCH2CH3羧基脫保護和羧基激活用稀硫酸溶液處理步驟3的基片，脫除羧基保護。再使用N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)處理羧基生成活潑酯衍生物。
5.antiinsulin膜層的製備把經過步驟4處理的基片放入anti-insulin溶液中浸泡30分鐘，清洗後再使用乙醇胺溶液封閉未結合anti-insulin分子的活潑酯。得到檢測人胰島素(insulin)的蛋白質晶片。
實施例3製備用於檢測白細胞介素6(IL-6)的蛋白質晶片。該晶片的固體基片選用的是0.5mm的拋光玻璃片。聚乙二醇衍生物分別是Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)5ONH4和Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)3OCH3。配基分子是白細胞介素6(IL-6)的受體(IL-6R)。
該蛋白質晶片的製備按以下步驟進行1.玻璃表面的清潔處理用弱鹼性溶液(如氨水)清洗玻璃表面，除去表面汙漬。
2.玻璃表面親水化處理將步驟1處理過的玻璃放入體積比為1∶3的30wt％的H2O2和98wt％的H2SO4的混合液中浸泡20分鐘，取出用去離子水清洗至中性，即得到表面帶有羥基的親水基片。
3.氯矽烷聚乙二醇衍生物改性層製備把Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)5ONH4和Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)3OCH3以1∶30摩爾比混合後溶於三氯乙烯中。把步驟2中處理的玻璃放入聚乙二醇衍生物溶液中浸泡10分鐘。用三氯乙烯和無水乙醇輪流清洗後，得到改性後的晶片基片。
4.Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)5ONH4氨基脫保護和氨基激活用稀硫酸溶液處理步驟3的基片，脫除氨基保護；再使用N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)處理氨基生成醯氨鍵。
5.白細胞介素6(IL-6)的受體(IL-6R)膜層的製備把經過步驟4處理的基片放入白細胞介素6(IL-6)的受體(IL-6R)溶液中浸泡30分鐘，清洗後再使用乙酸溶液封閉未結合受體(IL-6R)分子的醯氨鍵。得到檢測白細胞介素6(IL-6)的蛋白質晶片。
實施例4製備用於檢測人血清白蛋白(HSA)的蛋白質晶片。該晶片的固體基片選用的是鍍金膜的矽片。聚乙二醇衍生物分別是Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)5OH和Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)3OCH3。配基分子是人血清白蛋白(HSA)的抗體(antiHSA)。
該蛋白質晶片的製備按以下步驟進行1.金膜表面的清潔處理用弱鹼性溶液(如氨水)清洗金膜表面，除去表面汙漬；2.金膜表面親水化處理把基片放入HS-(CH)3-OH溶液中浸泡12小時，用無水乙醇清洗，即得到表面帶有羥基的金膜基片；3.聚乙二醇衍生物改性層製備把Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)5OH和Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)3OCH3以1∶60摩爾比混合後溶於三氯乙烯中。把步驟2中處理的金膜基片放入聚乙二醇衍生物溶液中浸泡10分鐘。用三氯乙烯和無水乙醇輪流清洗後，得到改性後的晶片基片；4.Cl3Si(CH2)12(OCH2CH2)5OH羥基脫保護和羥基激活用稀硫酸溶液處理步驟3的基片，脫除羥基保護。再使用1，4-丁二醇縮水甘油醚處理羥基生成環氧乙烷基團；5.人血清白蛋白(HSA)抗體(antiHSA)膜層的製備把經過步驟4處理的基片放入人血清白蛋白(HSA)抗體(antiHSA)溶液中浸泡30分鐘，清洗後再使用乙醇氨溶液封閉未結合抗體分子的環氧乙烷基團。得到檢測人血清白蛋白(HSA)的蛋白質晶片。
權利要求
1.一種蛋白質晶片，包括固體基片和配基感應膜層，其特徵是在固體基片和配基感應膜層之間還包括一層改性層，改性層通過共價鍵分別與固體基片和配基感應膜層連接。
2.按權利要求1所述的蛋白質晶片，其特徵在於它的固體基片是半導體材料、金屬、玻璃、塑料或表面鍍膜的固體複合材料。
3.按權利要求2所述的蛋白質晶片，其特徵在於所述的表面鍍膜的固體複合材料是表面為金屬膜、介質膜、化學膜或生物化學膜的固體複合材料。
4.按權利要求1所述的蛋白質晶片，其特徵在於它的配基感應膜層是由用於檢測的生物分子構成的。
5.按權利要求1所述的蛋白質晶片，其特徵在於它的改性層是由氯矽烷聚乙二醇衍生物ClaSi(CH2)m(OCH2CH2)nOX和ClaSi(CH2)m(OCH2CH2)nOCH3構成的，其中a為1、2或3；m可以是5到20之間任意數值，n可以是3到50之間任意數值，X是羧基、氨基、巰基或醛基等可以用於共價固定生物分子的活性基團。
6.按權利要求5所述的蛋白質晶片，其特徵在於n是介於3到8之間的任意數值，m是介於8到12之間的任意數值。
7.一種製備權利要求1所述的共價固定生物分子的蛋白質晶片及其製備方法，包括以下步驟(1)採用常規方法對清潔後的固體基片進行表面處理，使之固體基片帶有易與氯矽烷發生化學反應的活性基團；(2)氯矽烷聚乙二醇衍生物改性層的製備氯矽烷聚乙二醇衍生物ClaSi(CH2)m(OCH2CH2)nOX和ClaSi(CH2)m(OCH2CH2)nOCH3按照1∶1至1∶100，摩爾比稱料，然後溶於有機溶劑中，混合均勻後，將步驟(1)中準備好的固體基片浸泡於上述溶液中充分反應，常規清洗後備用；(3)氯矽烷聚乙二醇衍生物Cl3Si(CH2)m(OCH2CH2)nOX末端基團X的活化將步驟(2)製備好的基片按常規脫保護方法處理後，對脫保護的末端基團或配基上的基團進行常規活化處理；(4)配基感應膜層的製備將步驟(3)中製備好的基片孵育在配基溶液中充分反應，清洗後再用封閉溶液封閉基團，即製得本發明的蛋白質晶片。
8.按權利要求7所述的蛋白質晶片，其特徵在於，所述的蛋白質晶片表面處理包括半導體材料和玻璃為固體基片使用親水化處理方法。
9.按權利要求7或權利要求8所述的蛋白質晶片，其特徵在於，還包括以金屬或表面鍍金屬膜的複合材料為固體基片通過巰基試劑在金屬表面上引入活性基團。
10.按權利要求7或8所述的蛋白質晶片，其特徵在於，還包括以塑料為固體基片通過等離子體處理技術在表面上引入活性基團。
全文摘要
本發明涉及一種在固體表面上共價固定配基分子的蛋白質晶片。該晶片採用氯矽烷聚乙二醇衍生物作為改性層和固體基片共價連接，配基感應膜層通過共價鍵和氯矽烷聚乙二醇衍生物的活性基團連接。用這種方法製備的晶片能有效提高配基分子的穩定性，抑制固體表面對非目標蛋白質的吸附從而減少假陽性結果的發生。該晶片可以廣泛用於各類生物分子如抗體、抗原、受體、配體、DNA片段等的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1462885SQ0212071
公開日2003年12月24日 申請日期2002年5月29日 優先權日2002年5月29日
發明者靳剛, 王戰會 申請人:中國科學院力學研究所