一種磷酸甘露糖異構酶等溫擴增檢測試劑盒的製作方法

2023-11-02 12:02:42 2

專利名稱：一種磷酸甘露糖異構酶等溫擴增檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明提供一種磷酸甘露糖異構酶的檢測方法，屬於轉基因食品檢測領域，具體 地講，涉及用環介導等溫擴增方法來檢測磷酸甘露糖異構酶基因的技術。
背景技術：
植物遺傳轉化的轉化頻率通常較低，篩選時必須利用選擇標記來保證轉化細胞的 存活和防止非轉化細胞的再生。傳統的篩選方法是利用抗生素和除草劑類選擇劑，但這些 物質對人類和環境的影響還不完全了解，因此，非抗生素篩選系統應運而生。甘露糖陽性選擇系統屬於非抗生素篩選系統之一，它是利用大腸桿菌的磷酸甘露 糖異構酶基因(Pmi)作為選擇基因，甘露糖作為選擇劑進行轉基因植物的篩選。甘露糖經 由植物內源己糖激酶催化磷酸化為6-磷酸甘露糖，反應消耗ATP和磷酸鹽，會導致細胞分 裂、生長缺少能量，並且6-磷酸甘露糖的過量積累對植物細胞有毒害作用。整合有外源pmi 基因的轉化細胞能將6-磷酸甘露糖異構酶為6-磷酸果糖，使得代謝可繼續進行，避免了因 6-磷酸甘露糖的大量積累，並產生ATP，為細胞的正常代謝提供了能量。非轉化細胞因缺乏 磷酸甘露糖異構酶，不能利用6-磷酸甘露糖正常生長。因此，在含有甘露糖的培養基上，只 有轉化細胞能正常生長，而非轉化細胞則被淘汰。在轉基因植株篩選過程中主要用氯酚法(chlorophenol red，CPR)進行檢測，這種 方法僅適用於活植株的篩選，對於已經沒有活性的植株或加工產品就不適用。楊彩雲等為 了方便載體構建在引物前都設計了 Xho玉的酶切位點，並在引物兩邊加入保護鹼基。引物 序列為Ppmi-I 5' -GCACTCGAGCATGCAAAAACTCATTAACTCAG-3『；Ppmi-2 5' -GCACTCGAGCTCTTACAGCTTGTTGTAAAC-3『擴增片段大小1. 2kb左右，對轉基因食品檢測就不太適用。因為食品大部分是進 行深加工處理，DNA片段破碎比較嚴重，檢測目標片段太長就容易出現假陰性結果。本專利應用環介導等溫擴增技術建立的檢測方法用於快速篩選鑑別磷酸甘露糖 異構酶基因。為基層實驗室開展轉基因玉米篩選檢測和監控工作提供有效的技術手段。

發明內容
本發明的第一個目的是提供了一種應用等溫擴增方法檢測磷酸甘露糖異構酶的 方法。本發明是通過以下技術方案實現的1.磷酸甘露糖異構酶核酸序列2.引物的設計通過I^rimer Premier 5. 0和01igo6. 0針對磷酸甘露糖異構酶基 因設計特異性引物和特異性探針。磷酸甘露糖異構酶基因的全基因序列1 TCCCCGATCA TGCAAAMCT CATTAACTCA GTGCMAACT ATGCCTGGGG CAGCAAAACG61 GCGTTGACTG MCTTTATGG TATGGMAAT CCGTCCAGCC AGCCGATGGC CGAGCTGTGG
121ATGGGCGCACATCCGAMAGCAGTTCACGAGTGCAGAATGCCGCCGGAGATATCGTTTCA
181CTGCGTGATGTGATTGAGAGTGATAMTCGACTCTGCTCGGAGAGGCCGTTGCCAAACGC
241TTTGGCGAACTGCCTTTCCTGTTCAMGTATTATGCGCAGCACAGCCACTCTCCATTCAG
301GTTCATCCAAACAAACACAATTCTGMATCGGTTTTGCCAAAGAMATGCCGCAGGTATC
361CCGATGGATGCCGCCGAGCGTAACTATAAAGATCCTAACCACAAGCCGGAGCTGGTTTTT
421GCGCTGACGCCTTTCCTTGCGATGAACGCGTTTCGTGAATTTTCCGAGATTGTCTCCCTA
481CTCCAGCCGGTCGCAGGTGCACATCCGGCGATTGCTCACTTTTTACAACAGCCTGATGCC
541GMCGTTTAAGCGAACTGTTCGCCAGCCTGTTGAATATGCAGGGTGAAGAAAAATCCCGC
601GCGCTGGCGATTTTAAMTCGGCCCTCGATAGCCAGCAGGGTGAACCGTGGCAMCGATT
661CGTTTAATTTCTGAATTTTACCCGGMGACAGCGGTCTGTTCTCCCCGCTATTGCTGAAT
721GTGGTGMATTGAACCCTGGCGAAGCGATGTTCCTGTTCGCTGAAACACCGCACGCTTAC
781CTGCAAGGCGTGGCGCTGGAAGTGATGGCAAACTCCGATAACGTGCTGCGTGCGGGTCTG
841ACGCCTMATACATTGATATTCCGGMCTGGTTGCCAATGTGAAATTCGAAGCCAAACCG
901GCTAACCAGTTGTTGACCCAGCCGGTGAAACAAGGTGCAGAACTGGACTTCCCGATTCCA
F3
961GTGGATGATTTTGCCTTCTCGCTGCATGACCTTAGTGATAAAGAAACCACCATTAGCCAG
F2
1021CAGAGTGCCGCCATTTTGTTCTGCGTCGAAGGCGATGCAACGTTGTGGAA AGGTTCTCAG
FlCBlC
1081CAGTTACAGCTTAAACCGGGTGAATCAGCGTTTATTGCCGCCAACGAATC ACCGGTGACTB21141 GTCAAAGGCC ACGGCCGTTT AGCGCGTGTT TACAACAAGC TGTAAGAGCT TACTGAAAMB31201 ATTA引物 1 :5-TCCCGATTCCAGTGGATGA引物 2 5-ACAGTCACCGGTGATTCGT 引物 3 5-ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC引物 4 5-CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT這一系列的引物可以使不與上述鹼基序列的互補鏈完全互補的寡核苷酸。S卩，前 述各引物中，除3』末端的鹼基以外的部分可以與完全互補的寡核苷酸有1-5個鹼基不同。而且，本發明的磷酸甘露糖異構酶擴增用試劑，其特徵在於，其為用於通過基因擴 增法擴增磷酸甘露糖異構酶的試劑，含有上述本發明的磷酸甘露糖異構酶擴增用引物對。本發明的擴增產物的製備方法，其特徵在於，其為通過基因擴增法製備磷酸甘露 糖異構酶擴增產物的方法，含有下述步驟以試樣中的核酸作為模板，使用本發明所述的磷 酸甘露糖異構酶擴增用引物對，在反應液中擴增所述的磷酸甘露糖異構酶的步驟。試樣可以是玉米、甜菜、小麥、水稻、木薯、甜橙和葡萄及其加工產品，通過磷酸甘 露糖異構酶擴增來判斷其是否有轉基因成分。如果出現磷酸甘露糖異構酶陽性結果則試樣 中含有轉基因成分，如果出現磷酸甘露糖異構酶陰性結果則試樣中不含轉基因成分。此外，根據常規方法，將等溫擴增的引物用於PCR反應。反應體系包括以下組分Thermopol buffer、dNTP、MgS04、Betaine、ddH20、Bst DNApol。反應體系組分可以有變化， 例如加入甘油、礦物油等。根據常識，各組分的體積可根據條件不同而變化，每次不同批次 試劑的最佳組合均可能會不同。反應條件可以是55°C -65°C, 30-75分鐘。最佳的溫度可以是60°C _63°C，時間是 40-50分鐘。3.檢測方法其檢測方法可以是STOR Green染色方法，也可以是常規電泳或者實時螢光的方法。 PCR反應體系可以和上述一致，也可以有變動。酶可以是Bst DNApol，也可以是其他具有相同功能的酶。應當理解的是，整個擴增反應體系可以是每個組分是單獨存放，在進行擴增前將 各組分按照合適的濃度加入，混勻後進行反應。也可以事先將所有的組分按照一定的配比 混好後，在進行擴增前加入去離子水和模板即可以進行擴增。與現有技術相比，本發明涉具有以下優點1.本發明的引物能夠特異地擴增磷酸甘露糖異構酶；2.能夠在等溫條件下對磷酸甘露糖異構酶進行擴增，可以不用高端的儀器只需要 保溫杯即可完成擴增，適合現場檢測；3.當使用本發明的引物對時，能以優於以往的擴增效率進行擴增反應，因此還能 夠縮短擴增時間；4.由於本引物設計時針對目標片段上6個不同的區域，因此檢測特異性提高，假 陰性結果大大降低，有效提高陽性檢出率；5.適用範圍更加廣泛，不僅能檢測植株，而且能夠對深加工食品進行檢測。總之，本發明的引物對、含有其的試劑以及使用他們的擴增產物的製備方法，能夠 迅速而簡單地檢測磷酸甘露糖異構酶，在檢驗檢疫系統等是非常有效地。


圖 1 是用 SYBRG reen 染色進行檢測結果。1 :3272,2 :MIR604，3 :M0N89034,4 BT176, ,5 :1507,6 :M0N810，7 :M0N863，8 :NK603，9 :GA21，10 :BT21，11 空白對照。從該檢測
結果可以看出，1，2為磷酸甘露糖異構酶陽性。圖2 是用瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。1 :3272,2 :MIR604，3 :M0N89034，4 :BT176，， 5:1507,6:M0N810，7 :M0N863，8:NK603，9:GA21，10 :BT21，11 空白對照，M :DL2000DNA
marker.從該檢測結果可以看出，圖2中1，2為磷酸甘露糖異構酶陽性。
具體實施例方式現在僅用參考下面非限制性的實施例的方式進一步描述本發明。但是應當理解， 下面的實施例僅僅是作為例證的，不應以任何方式當作對上述本發明總體的限制。除非有 其它說明，本發明的實施例使用本領域中的分子生物學常規技術。這些技術是技術人員熟 知的，並在文獻中有詳細解釋。參見，例如，分子克隆等。各引物長度自身沒有特別的限制，可以適當調整到通常的長度，作為引物長度的一例，例如在13-50mer的範圍內，優選1445mer，更優選15_40mer。而且由於上述引物的3， 末端被固定，由引物延伸出的區域是固定的，獲得的擴增產物的總長根據所使用的引物長 度而變化。實施例1樣品已知是轉基因玉米事件3272，MIR604, M0N89034, BT176,1507, M0N810, M0N863，NK603, GA21，BT21，其中3272和MIR604磷酸甘露糖異構酶陽性，檢測時用到的引 物對為磷酸甘露糖異構酶引物 1 5-TCCCGATTCCAGTGGATGA引物 2 5-ACAGTCACCGGTGATTCGT引物 3 5-ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC引物 4 5-CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT反應體系如下表1磷酸甘露糖異構酶檢測體系權利要求
1.一種磷酸甘露糖異構酶擴增用引物對，其特徵在於，其為用於通過等溫擴增法擴增 磷酸甘露糖異構酶的引物對，含有以下引物對引物 1 :5-TCCCGATTCCAGTGGATGA引物 2 5-ACAGTCACCGGTGATTCGT引物 3 :5-ACAAAATGGCGGCACTCTGCT-GCCTTCTCGCTGCATGAC引物 4 :5-CGTCGAAGGCGATGCAACGT-GGCGGCAATAAACGCTGAT
2.根據權利要求1所述的磷酸甘露糖異構酶擴增用引物對，所述磷酸甘露糖異構酶擴 增用引物對是用於擴增生物試樣中的磷酸甘露糖異構酶的引物對。
3.根據權利要求2所述的磷酸甘露糖異構酶擴增用引物對，所述試樣可以是玉米、甜 菜、小麥、水稻、木薯、甜橙和葡萄及加工產品。
4.一種磷酸甘露糖異構酶擴增用試劑，其特徵在於，其為用於通過基因擴增法擴增磷 酸甘露糖異構酶的試劑，含有權利要求1所述的磷酸甘露糖異構酶擴增用引物對。
5.一種擴增產物的製備方法，其特徵在於，其為通過基因擴增法製備磷酸甘露糖異構 酶擴增產物的方法，含有下述步驟以試樣中的核酸作為模板，適用權利要求1所述的磷酸 甘露糖異構酶擴增用引物對，在反應液中擴增所述的磷酸甘露糖異構酶的步驟。
6.根據權利要求5所述的擴增產物的製備方法，其在所述步驟中，還向反應液中添加 能夠與磷酸甘露糖異構酶的檢測對象位點雜交的螢光標記探針。
7.根據權利要求5所述的擴增產物的製備方法，其還含有下述步驟對於所述反應液， 測定所述螢光標記探針的螢光標記的螢光強度的步驟。
8.根據權利要求5所述的擴展產物的檢測方法，反應條件可以是55-65°C，30-75分鐘。
9.根據權利要求5所述的擴展產物的檢測方法可以是試紙條、常規電泳和染色法。
10.一種檢測結果的判斷方法，其特徵在於，如果出現磷酸甘露糖異構酶陽性結果則試 樣中含有轉基因成分，如果出現磷酸甘露糖異構酶陰性結果則試樣中不含轉基因成分。
全文摘要
本發明涉及一種磷酸甘露糖異構酶等溫擴增檢測試劑盒，屬於食品檢驗領域。本發明為一種磷酸甘露糖異構酶擴增用引物，以及一種磷酸甘露糖異構酶擴增用試劑及擴增產物製備方法。本發明靈敏度高、精確度好，適合於玉米、甜菜、小麥、水稻、木薯、甜橙和葡萄中轉基因成分篩查，便於在各檢測機構推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102094085SQ201010566579
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者劉偉, 劉躍庭, 廖芳, 張裕君, 朱水芳, 賀豔, 鄭文杰 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心