免疫殺手細胞及其製造方法,包含其的醫藥組成物及套組的製作方法

2023-10-24 02:27:27 2

專利名稱：免疫殺手細胞及其製造方法,包含其的醫藥組成物及套組的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫殺手細胞(immune killer)的製造方法，尤其涉及一種將免疫殺手細胞應用於抑制腫瘤的醫藥組成物。
背景技術：
目前有關以免疫療法治療癌症的研究，包括注射細胞因子(cytokine)，例如幹擾素(interferon)或白介素(interleukin)，以直接刺激免疫力、提升抗癌效果。但由於這些細胞因子本身的副作用過大，例如，包括幹擾素和白介素在內的一些常用細胞因子，都會引發類似感冒的症狀，包括發燒、發冷、疲倦和消化道問題，血壓亦會受其影響。其中白介素-2(interleUkin-2，簡稱IL-2)所引發的副作用通常較嚴重，在治療過程中，醫師需格外仔細觀察患者。因此注射細胞因子雖曾為癌症治療帶來了一線曙光，但已逐漸被認為不完全可行。除此之外，目前仍在試驗當中的免疫療法包括癌症疫苗療法，此法也有可能改善免疫力，但由於癌症病人的免疫系統多已受到抑制，效果仍然有待討論。目前免疫療法中較快速、較有效的，應屬免疫細胞(immune cell)醫療技術。所謂免疫細胞醫療技術，就是抽取病人的白血球進行培養，大量增殖淋巴激素活化殺手細胞(lymphokine activate killer cell，簡稱LAK細胞)、殺傷性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，簡稱CTL細胞)或自然殺手細胞(natural killer cell，簡稱NK細胞)後，再將其輸注回患者體內以產生抗癌功效。由於體內具有毒殺癌細胞能力的細胞，例如NK細胞及CTL細胞(LAK細胞則非體內正常的族群，它是將CTL細胞在體外利用高濃度的細胞因子培養後大量繁殖的細胞)， 在一般人體內的CTL細胞及NK細胞數量有限或活性受抑制，因此長期以來即有免疫學家試著在體外以細胞因子大量培養這些細胞後，再打入病人體內，直接提高病人的抗癌活性。這方法的優點是效果迅速、不會有排斥現象(因細胞取自於病人本身)，且由於注射前須先去除細胞因子，因此，也不致產生細胞因子的副作用。此法最重要的關鍵是要能夠增殖足夠的細胞並給予適當的活化，如此才能發揮充分的抗癌效果。此方法過去較無大量的臨床應用， 主要就是一直無法突破大量增殖的瓶頸，或所增殖的細胞活性不夠高之故。目前對於免疫細胞的體外培養方法，在培養過程中，往往因為必須使用動物來源的抗體蛋白作為刺激物，容易造成人畜共通疾病的傳染等副作用，危及病患的生命健康。例如，中國發明專利ZL 20031019565. 5號，使用植物血球凝集素(phytohemagglutinin，簡稱 PHA)及抗CD3單株抗體(anti-CD3monoclonal antibody，簡稱抗CD3mAb) 二種有絲分裂原聯合活化細胞，增強對細胞的刺激強度，進而提高細胞的體外增殖能力。然而，其使用的抗 CD3mAb，來源大多來自實驗老鼠，且老鼠與人類的基因非常接近，難保無人畜(鼠)共通疾病的病源菌汙染的可能，而容易造成危害人體生命的不良後果。

發明內容
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本發明的主要目的是提供一種免疫殺手細胞的製造方法，其特徵為於包含刀豆球蛋白(concanavalin Α)的培養基中，進行該免疫殺手細胞的誘導、維持或擴大培養的步驟， 而不需使用任何抗體蛋白。上述的方法，其中該培養基中進一步包含白介素、幹擾素或植物血球凝集素 (phytohemagglutinin)。上述的方法，其中該培養基中不包含任何抗體蛋白作為刺激物。上述的方法，其中該刀豆球蛋白於培養基中的濃度為0. 1 100yg/mL，較佳為 0. 1 30μ g/mL。上述的方法，其中進一步包含分離周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell)的步驟。上述的方法，其中該周邊血液單核細胞於培養基中的濃度為0. IXlO6 IOXlO6 個/mL。本發明的另一目的是提供一種免疫殺手細胞，其由上述的方法所製造。上述的免疫殺手細胞，其包含自然殺手細胞、自然殺手T細胞(natural killer T cell，簡稱NKT細胞)、gamma/delta T細胞(γ δΤ cell，簡稱γ δ T細胞)及殺傷性T 細胞(cytotoxic T cell，簡稱 Tc 細胞或 CTL)。上述的免疫殺手細胞，其組成比例為5 20%的自然殺手細胞、15 50%的自然殺手T細胞、10 30%的gamma/delta T細胞及40 70%的殺傷性T細胞。本發明的另一目的是提供一種抑制腫瘤的醫藥組成物，其包含有效量的上述的免疫殺手細胞。本發明的另一目的是提供一種套組，其包含上述的醫藥組成物。更明確地，本發明涉及一種自體免疫殺手細胞的製備方法及其應用，其是從取得的病患血液中，於無菌狀態下將周邊血液單核細胞(簡稱PBMC)分離出，用培養基進行培養，該培養基中包含刀豆球蛋白(簡稱ConA)、白介素-2(簡稱IL-2)、幹擾素-Y (interferon-γ)或植物血球凝集素(簡稱PHA)。其中並沒有使用來自老鼠或其他動物的抗體蛋白作為刺激物，可避免人畜共通疾病感染風險，並且有效增加免疫殺手細胞的數量及活性。本發明若在培養基中添加適量的ConA及IL-2等細胞因子作為刺激物，可以有效促成NK細胞、NKT細胞、Tc細胞及γ δ T細胞等免疫殺手細胞的增殖及活化，且各細胞間的組成比例具有一定的百分比分布時，可達到最好的活性效果。另外，當改變上述刺激物的濃度及比例時，可以調整上述各細胞間的組成比例百分比及增殖數量，以配合不同的應用。


圖1為本發明的免疫殺手細胞的培養生長曲線。
具體實施例方式為充分了解本發明的目的、特徵及功效，現利用下述具體的實施例，並配合所附的圖式，對本發明做詳細說明。以下實施例旨在進一步說明本發明的技術內容，並不用以限制本發明的申請專利範圍。
1.免疫殺手細胞的細胞培養實驗以下為免疫殺手細胞的細胞培養步驟(1)將從周邊靜脈血中分離抽出的PBMC移入細胞培養瓶中，並以培養基將細胞的濃度調整為0. 5X IO6 2X IO6個/mL，並放置於二氧化碳培養箱中培養。上述的培養基可為RPMI-1640培養基、IMDM培養基、ALys培養基或AIM-V培養基中的任何一種，而且培養基中應含有以下成份刀豆球蛋白0. 1 30 μ g/mL白介素-2 (Proleukin)200 1000IU/mL幹擾素-γ600 1500單位人自體血清(Human Auto Serum)5 12%(2)細胞在上述培養基中培養2至6天之後，以培養基或生理食鹽水洗滌1 2 次，再以新鮮的培養基將細胞打散並將細胞濃度調整為0. 3 X IO6 2 X IO6個/mL，並放置於二氧化碳培養箱中培養。上述的培養基可為RPMI-1640培養基、IMDM培養基、ALys培養基或AIM-V培養基中的任何一種，而且培養基中應含有以下成份白介素-2(Interleukin_2) 200 600IU/mL幹擾素-γ100 300U/mL白介素-1510 50ng/mL(3)以後視細胞生長密度而定，大約每隔2至3天加入新鮮的培養基，並調整細胞的濃度使其介於0. 3X IO6 2X IO6個/mL，最後放置於二氧化碳培養箱中培養。上述的培養基可為RPMI-1640培養基、IMDM培養基、ALys培養基或AIM-V培養基中的任何一種，而且培養基中應含有以下成份白介素-2 (Interleu kin-2) 100 500IU/mL幹擾素-γ80 150U/mL白介素-1510 30ng/mL(4)以後每隔2至3天重複上述步驟(3)的操作，直至總共培養14天為止。經過上述方法培養出來的免疫殺手細胞為混合細胞，其中包括NK細胞(具⑶3 陰性、⑶56陽性表型)、NKT細胞(具⑶3陽性及⑶56陽性表型)、Y δ T細胞(具有γ δ 型T細胞受體的T細胞)及Tc細胞(具α β型T細胞受體的典型殺傷性T細胞)，其為免疫系統中活性最強的殺手細胞。利用上述方法培養出來的免疫殺手細胞，由於個體間的差異，各細胞間的組成比例分布會因人而異，但總體而言，絕大多數人的組成百分比如下ΝΚ細胞約佔5 20%、 NKT細胞約佔15 50%、γ δ T細胞約佔10 30%、iTc細胞約佔40 70%。圖1為本發明的免疫殺手細胞的培養生長曲線，其是從6名自願者(以圖中的6 種顏色表示)的上臂靜脈各抽出30c. c.的血液，依上述方法進行處理、培養。培養後每隔1 到3天則從細胞培養液中取樣並計算細胞總數，對照培養天數繪製成圖。圖中縱軸為免疫殺手細胞的數量，橫軸為培養天數，由圖中數據可知，免疫殺手細胞經培養後其總數明顯增加，至第14天時總數已經超過IO9個。2.免疫殺手細胞毒殺癌細胞的實驗PBMC經過培養後變成免疫殺手細胞(簡稱IKC)，其抗肺癌及肝癌的活性大幅增加，如表1所示。其中六個志願者的免疫殺手細胞及PBMC在E/T = 50時，其毒殺肺癌細胞 (NCI-H23)及肝癌細胞(Hep3B)的活性(Specific release)有顯著差異。表1結果為利用 1 4h 51 Cr-release assay表 權利要求
1.一種免疫殺手細胞的製造方法，其特徵為於包含刀豆球蛋白的培養基中，進行該免疫殺手細胞的誘導、維持或擴大培養的步驟。
2.根據權利要求1所述的方法，其中該培養基中進一步包含白介素、幹擾素或植物血球凝集素。
3.根據權利要求2所述的方法，其中該培養基中不包含抗體蛋白作為刺激物。
4.根據權利要求1所述的方法，其中該刀豆球蛋白於培養基中的濃度為0.1 100μ g/mL0
5.根據權利要求4所述的方法，其中該刀豆球蛋白於培養基中的濃度為0.1 30yg/mLo
6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中進一步包含分離周邊血液單核細胞的步驟。
7.根據權利要求6所述的方法，其中該周邊血液單核細胞於培養基中的濃度為 0. IX IO6 10 X IO6 個/mL。
8.一種免疫殺手細胞，其由根據權利要求1至7中任一項所述的方法所製造。
9.根據權利要求8所述的免疫殺手細胞，其包含自然殺手細胞、自然殺手T細胞、 gamma/delta T細胞及殺傷性T細胞。
10.根據權利要求9所述的免疫殺手細胞，其組成比例為5 20%的自然殺手細胞、 15 50%的自然殺手T細胞、10 30%的gamma/delta T細胞及40 70%的殺傷性T細胞。
11.一種抑制腫瘤的醫藥組成物，其包含有效量的根據權利要求8至10中任一項所述的免疫殺手細胞。
12.—種套組，其包含根據權利要求11所述的醫藥組成物。
全文摘要
本發明涉及一種免疫殺手細胞及其製造方法，包含其的醫藥組成物及套組，其特徵為利用包含刀豆球蛋白的培養基中，進行該免疫殺手細胞的誘導、維持或擴大培養的步驟。由於其培養過程當中不使用抗體蛋白作為刺激物，可避免人畜共通疾病的感染風險，且可有效增加免疫殺手細胞的數量及活性。
文檔編號A61P35/00GK102212505SQ201010145549
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月8日 優先權日2010年4月8日
發明者張順浪 申請人:長春藤生命科學股份有限公司