一種海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法
2023-10-27 20:37:52 1
專利名稱：一種海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種大分子化合物的測定方法，特別是涉及一種海參 及海參製品中海參多糖含量的測定方法。
背景技術：
海參多糖是海參中一種重要的活性成分。海參中多糖類化合物結 構複雜，且因海參種類和生長環境的不同而有差別。不同種類海參中
的多糖結構不同，而同種海參中海參巖藻聚糖硫酸酯(SC-FUC)和海 參硫酸軟骨素(SC-CHS)的含量也不盡相同。另外，海參中還含有大 量的蛋白質、多糖、脂肪、微量元素等複雜成分，這必然會給海參中 總多糖的測定帶來很多困難。
目前已有關於海參中多糖含量測定方法的報導，如申請號為 200410036250.7的"測定海參多糖含量的方法"，該方法對幹海參樣 品經鹼溶，超聲提取，二次醇沉等步驟，最後將樣品乾燥至恆重後測 得多糖含量，但該方法對目標測定物的選擇性不強，樣品中的雜質如 鹽、微量元素、蛋白質等成分易引起較大的測定誤差，且不適合海參 製品中海參多糖含量的測定；申請號為200410048001的"測定盧薈多 糖的新方竭"採用了分光光度法測定蘆薈多糖，具有較好的重複性和 精密度，然而因為海參多糖中含有葡萄糖醛酸和氨基糖，在該方法中 不顯色，所以也不適合海參多糖含量的測定；近年來以高效液相為基 礎的海參多糖的定量方法發展較快，如申請號為200410052907.9的 "一種多糖定量檢測方法與系統"，該方法靈敏準確，但對設備要求較 高，而且該方法通常適用於以中性糖含量為主的多糖，海參多糖中的 含有較高含量的糖醛酸和氨基糖，用該方法不能夠柱後顯色。另外， 海參多糖中兩種糖的種間差異大，無法確定具體以何種多糖作為標準 品進行分光光度或者液相色譜測定。隨著人們生活水平的提高，與海 參相關的食品、保健品和藥品日益成為市場消費的熱點和主流。海參 多糖作為主要的活性成分，其含量對其食用及藥用價值影響很大，是 不可或缺的海參營養評價指標。因此迫切需要建立一種簡便可信的海 參多糖測定方法。而市面上目前的海參製品品種複雜，因此採用簡單 的分光光度法或稱重法很難滿足以海參多糖為評價指標建立海參製品 質量標準的要求。 發明內容本發明目的在於提供一種海參及海參製品中海參多糖含量的測定 方法，它無需複雜的前處理，取樣少、簡便、靈敏、快速、準確，能 滿足以海參多糖為評價指標建立海參製品質量標準的要求。
一種海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法，其特徵在於 (l)取海參或海參製品，用蛋白酶於緩衝業液中酶解，將酶解液離心， 取上清液用2-5倍體積的乙醇使海參多糖沉澱，離心，所得沉澱用水
溶解後定容至l-100ml; (2)取O.l-lml所得水溶液，加入等體積 0.5-6mol/L的三氟乙酸水溶液，氮氣封管，在100-120。C下水解1-12h; 將所得水解液吹乾和/或加鹼中和，用水定容至0.1-10ml，過濾，作為 供試液；(3)精確稱取巖藻糖標準品，配成濃度為0.01mmol/L-lmmol/L 呈梯度的多個標準水溶液；(4)分別精密吸取相同體積的上述多個標 準水溶液，分別加入0. 1-0.5mol/L的NaOH水溶液和等體積的1_苯 基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑，50-70"C下水浴衍生0.2-2h，冷卻， 用酸的水溶液中和至中性，用氯仿萃取，吸棄下層，重複萃取2-6次， 將水層過濾，進行液相色譜分析，得到分離譜圖，以所得譜圖中巖藻 糖的峰面積對巖藻糖的濃度進行線性回歸，得到回歸方程；(5)取上 述供試液進行衍生和液相色譜分析，以巖藻糖衍生物的峰面積代入上 述回歸方程中，求出樣品中巖藻糖的含量；將巖藻糖的含量乘以轉化 係數即得海參樣品中海參多糖的含量。
本發明的優點在於(1)操作簡便，只需對樣品進行簡單的粗提取 等預處理，便可以直接經過酶解進行水解。(2)靈敏度高，巖藻糖衍 生物在250nm有很強的吸收，檢測限可以達到0.37 y M。 (3)取樣少， 所需海參樣品可小於0.01克乾重。(4)適用範圍，可同時應用於固態、 液態等多種海參製品中海參多糖含量的測定。(5)檢測時間短，單個 測定耗時僅為3h左右；由於可同時進行水解、衍生等步驟，因此也適 用於大批量測定。(6)穩定性好，24小時內巖藻糖衍生物峰面積穩定， RSD〈2.5%。 (7)本方法可同時測定海參製品中葡萄糖醛酸的含量，可 同時用於鑑定海參製品中的實際添加海參樣品量。
附圖1為單糖標準品高效液相色譜分離圖。
附圖2為刺參粗多糖的單糖組成分析圖。
附圖3為海參肽中海參多糖的單糖組成液相色譜圖。
具體實施例方式
實施例1海參肽中多糖含量的測定 (1)精確稱取樣品A海參肽6g，研細，加入30ml的濃度為0.05M/L、 pH為6的醋酸鈉緩衝液和100mg的木瓜蛋白酶，於37。C反應24h後， 離心，取上清液並加入2倍體積的乙醇，使酶解後產生的海參多糖沉澱，離心所得沉澱用水溶解後定容至3ml;
(2) 取0. 5ml所得的液體加入等體積2mol/L的三氟乙酸(TFA)水 溶液於12(TC水解2小時，將所得水解液以氮氣吹乾，以O. 3M氫氧化 鈉水溶液中和，用水定容至2ml後作為樣品供試液。
(3) 精確稱取巖藻糖標準品用水配成lmmol/L的水溶液作為儲備液。 進一步依次稀釋成0. 01mmol/L、 0. 05mmol/L、 0. lmmol/L、 0. 2mmol/L、 0.4mmol/L、 0. 6mmol/L、 0. 8mmol/L和1. 0mmol/L的8個濃度梯度的 標準水溶液。
(4) 標準物質的衍生分別吸取上述濃度的標準水溶液各250u L， 分別加入濃度為0. 5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液 250 uL和等體積的0.3mol/L的氫氧化鈉水溶液，70°C衍生反應 30min，冷卻10min,用0.3mol/L鹽酸中和至中性；加入lmL氯仿萃 取，充分震蕩，吸棄下層，重複萃取3次，水層過濾後作高效液相色譜分 析。
液相色譜分離和所得工作曲線Z0RBAX Eclipse XDB-C18型色譜 柱；流動相採用梯度洗脫模式，流動相採用乙腈-0. 05mol/L磷酸二氫 鉀緩衝溶液，30分鐘內實現從15%-40%的乙腈梯度；溫度25。C;流 速1 mL / min，檢測波長250nm。上述8個濃度梯度的標準水溶液的 衍生液經液相色譜分析，得到巖藻糖的出峰時間為22.5min，以巖藻 糖峰面積對巖藻糖標準溶液濃度進行線性回歸，得到回歸方程y = 9675x + 9.0095(R2 = 0.9986)，其中x為巖藻糖標準溶液的濃度，y 為巖藻糖峰面積。
(5) 樣品測定吸取供試液250iiL，按步驟(4)進行衍生反應和液 相色譜分析，將巖藻糖峰面積帶入工作曲線算得樣品中巖藻糖的含量， 再乘以轉化係數，得樣品A中海參多糖含量。所測巖藻糖的峰面積為 1230，帶入工作曲線計算表明，樣品A中巖藻糖含量為5.12 mg/g， 由於該樣品為剌參製品，所以轉化係數為7.01。測定結果為樣品A中 含海參多糖35.89 mg/g。
實施例2 幹刺參中海參多糖含量的測定
(1) 精確稱取市售幹參(刺參)樣品B10g，加入60ml的濃度為 0.05M/L、 pH為7.5的醋酸鈉緩衝液和lg胰蛋白酶於60'C酶解24小 時，將所得酶解液離心後，採用3倍體積的乙醇，使所得上清液中的 海參多糖沉澱，所得沉澱定容至5ml。
(2) 取0.5ml上述液體，加入等體積的6mol/LTFA，氮氣封管，110 'C下水解8h;水解液以氮氣吹乾，以0. 5M氫氧化鈉中和，定容至100ml， 作為樣品供試液。(3) 取供試液250 u L,按實施例1中(3) — (5)步驟進行衍生 和液相色譜分離，並得到相關的工作曲線y = 9675x + 9.0095 (R2 = 0.9986)。所測巖藻糖的峰面積為10000，帶入工作曲線計算表明，樣 品B中巖藻糖含量為8.41mg/ml，由於該種製品為刺參製品，所以轉 化係數為7.01，測定結果為樣品B中含海參多糖59.11 mg/ml。
實施例3海參衝劑中海參多糖含量的測定
(1) 取海參衝劑樣品C和海參衝劑樣品D各lg，加入60ml的濃度 為0.05M/L、 pH為6.5的醋酸鉀緩衝液加lmg木瓜蛋白酶酶解，將所 得酶解液離心後，採用2倍體積的乙醇，使所得上清液中的海參多糖 沉澱，離心，沉澱定容至lOOml。
(2) 取0.5ml上述液體，加入等體積的lmol/L三氟乙酸，氮氣封管， ll(TC下水解lh;水解液以氮氣吹乾，以0.3M氫氧化鈉中和，定容至 2ml為樣品供試液。
取供試液250 u L，按實施案1中(3) — (5)步驟進行衍生和液 相色譜分離，並得到相關的工作曲線y = 9675x + 9. 0095 (R2 = 0. 9986)。 所測巖藻糖的峰面積為865和725，帶入工作曲線計算結果表明，海 參衝劑樣品C中巖藻糖含量為0.806 mg/g，樣品D中巖藻糖含量為 0.687 mg/g，由於該兩種樣品均為刺參製品，所以轉化係數為7.01。 測定結果為海參衝劑樣品C中含海參多糖5.654 mg/g， 海參衝劑樣 品D中含海參多糖4.819 mg/g。 實施例4海參牛奶中海參多糖含量的測定
(1) 精確量取樣品E海參牛奶60ml，加入等體積0.3MNaAc緩衝 溶液(pH6.0)於60"C木瓜酶解24h，將所得酶解液離心後，採用2 倍體積的乙醇，使所得上清液中的海參多糖沉澱，離心，所得沉澱定 容至100ml;
(2) 取0.5ml上述液體，加入等體積的6mol/L三氟乙酸溶液置於 IO(TC水解I小時，水解液以氮氣吹乾，以0. 3M氫氧化鈉水中和，定 容至一定體積後作為樣品供試液。
(3) 取供試液250 u L，按實施案例中(2) — (6)步驟進行衍生和 液相色譜分離，並得到相關的工作曲線y = 9675x + 9.0095(R2 = 0.9986)。計算結果表明，樣品E巖藻糖含量為0.705mg/100ml，該樣 品為剌參製品。因此樣品E中多糖含量為4.95mg/100ml。
同種海參多糖中的巖藻糖含量一定，因此同種海參中的多糖含量 和巖藻糖含量之間存在固定的轉換係數，能夠直接以巖藻糖的含量來 比較和評價其中的海參總多糖的含量。按Marao等人的方法提取的海 參多糖，轉化係數為100/PMP測定海參多糖中巖藻糖百分含量。對己知海參品種可以按照提取後的多糖中的巖藻糖含量，以其倒數算得轉
化係數，如日本刺參多糖(^^W/c/zo/7ws /apom'cws)中巖藻糖的含量 為14.26%,其轉換係數可算得為7.01;墨西哥肉參(Zso^/c/zopw /mcw)中巖藻糖含量為18. 26%，其轉換係數為5.47。
本法除了使用實施例中說明的樣品外，同樣適用於海參酒、海參 原漿等海參水解樣品，且無需酶解這一步驟，直接採用一定體積沉澱， 其它步驟如衍生和液相色譜分離同實施例1即可。
本發明所述蛋白酶為海參或海參製品乾重的0.1%-10%。所述的 蛋白酶為木瓜蛋白酶胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶。所述的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑的濃度為0.卜O. 5mol/L甲醇溶液。 所述的轉化係數為1/所測海參或海參製品中海參多糖所含的巖藻糖 百分含量。
權利要求
1. 一種海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法，其特徵在於(1)取海參或海參製品，用蛋白酶於緩衝業液中酶解，將酶解液離心，取上清液用2-5倍體積的乙醇使海參多糖沉澱，離心，所得沉澱用水溶解後定容至1-100ml；(2)取0.1-1ml所得水溶液，加入等體積0.5-6mol/L的三氟乙酸水溶液，氮氣封管，在100-120℃下水解1-12h；將所得水解液吹乾和/或加鹼中和，用水定容至0.1-10ml，過濾，作為供試液；(3)精確稱取巖藻糖標準品，配成濃度為0.01mmol/L-1mmol/L呈梯度的多個標準水溶液；(4)分別精密吸取相同體積的上述多個標準水溶液，分別加入0.1-0.5mol/L的NaOH水溶液和等體積的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑，50-70℃下水浴衍生0.2-2h，冷卻，用酸的水溶液中和至中性，用氯仿萃取，吸棄下層，重複萃取2-6次，將水層過濾，進行液相色譜分析，得到分離譜圖，以所得譜圖中巖藻糖的峰面積對巖藻糖的濃度進行線性回歸，得到回歸方程；(5)取上述供試液進行衍生和液相色譜分析，以巖藻糖衍生物的峰面積代入上述回歸方程中，求出樣品中巖藻糖的含量；將巖藻糖的含量乘以轉化係數即得海參樣品中海參多糖的含量。
2、 按權利要求1所述的海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法，其特徵在於所 用蛋白酶的重量為海參或海參製品乾重的0.1%-10%。
3、 按權利要求1所述的海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法，其特徵在於所 述的蛋白酶為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶或中性蛋白酶。
4、 按權利要求1所述的海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法，其特徵在於所 述的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生試劑的濃度為0. 1-0. 5mol/L甲醇溶液。
5、 按權利要求書1所述的海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法，其特徵在於 所述的液相色譜分離的條件為色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18型；流動相為 梯度洗脫模式，採用乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀緩衝溶液，30分鐘內實現從15 %-40%的乙腈梯度，溫度25。Cj流速1 mL / min，檢測波長250nm。
6、 按權利要求1所述的海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法，其特徵在於所 述的轉化係數為1/所測海參或海參製品中海參多糖所含的巖藻糖百分含量。
7、 按照權利要求書1所述的海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法，其特徵在 於所述的海參製品為海參粉、海參酶解肽、海參酒、海參牛奶、海參原漿或海參口 服液。
全文摘要
本發明公開了一種海參及海參製品中海參多糖含量的測定方法，其特徵在於先將海參及海參製品用蛋白酶酶解，採用醇沉分離出酶解產生的海參多糖，再用三氟乙酸水解制出供試液，配製巖藻糖標準水溶液，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生，所得衍生物經高效液相色譜測定其中巖藻糖衍生物的峰面積，以巖藻糖為基準計算得出樣品中海參製品中的海參多糖含量。本發明為各種海參及海參製品中海參多糖的測定提供了一種簡便、準確、可靠的標準化定量分析方法。
文檔編號G01N33/48GK101285826SQ20081001662
公開日2008年10月15日 申請日期2008年5月23日 優先權日2008年5月23日
發明者尹利昂, 常耀光, 傑 徐, 李兆傑, 平 董, 勇 薛, 薛長湖, 陳士國 申請人:中國海洋大學