一種糖肽綴合物微球或微囊及其製備方法
2023-10-27 10:34:47
專利名稱：一種糖肽綴合物微球或微囊及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種糖肽綴合物微球或微囊及其通過界面聚合的製備方法。
背景技術：
微球或微囊作為一種新型控/緩釋給藥體系，具有能保護藥物免遭破壞、控制藥物釋放速度、延長藥物作用時間、減少藥物不良反應及降低用藥量等優點，在藥物釋放領域受到極大關注。在臨床治療上微球屬於被動靶向製劑，它能被器官組織的網狀內皮系統(RES)所內吞或被細胞融合，集中於靶區逐步擴散釋出藥物或被溶酶體中的酶降解而釋出藥物。目前，微球的控緩釋行為研究已進行得相當廣泛。其中，對抗生素、避孕藥和麻醉藥等藥物的控/緩釋放研究較為普遍，技術也相對成熟。另外，微球用作蛋白、多肽及疫苗等大分子藥物載體也越來越受到重視。
製備藥物緩釋用微球的材料必須具備無毒、生物相容性好和可生物降解等性質。近年來在藥物釋放材料研究中，生物降解高分子材料因其具備無毒、無免疫活性及不在體內積累滯留等優點而逐漸受到重視。
目前使用最多的是以聚α-羥基酸，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(PLGA)、聚己內酯(PCL)、聚原酸酯等為代表的不飽和聚酯類，憑藉其良好的生物相容性以及降解產物無毒等優點，被FDA批准廣泛用作藥物控制載體(Uhrich，K.E.et al，Polymeric Systems forControlled Drug Release.Chem.Rev.(Review)；1999；99(11)3181-3198)。例如，US6,551,522中製備了一種以PCL為基材的多孔藥物緩釋材料，並製成兩端封閉的中空管，在中空管的內外表面間含有通道，使藥劑填入從可以中空管通道中進出，從而達到控制釋放。US7,041,320公開了一種高載藥量的可注射性微球材料，由PLA、PCL及其共聚物組成。
另一種被廣泛使用的天然高分子類脂質是一類分子結構中具有兩親基團(親水基與親油基)的化合物，能形成被稱為脂質體的類脂雙分子層微球，其中，磷脂與膽固醇是脂質體主要製備材料。由類脂質形成的脂質體雙層分子層與生物膜極其相似，生物相容性優良，易被組織吸收。不同的細胞因子包括粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素(IL)-1-α，IL-2，IL-6，IFN-γ及腫瘤壞死因子(TNF)等均被製成脂質體製劑，以改變其體內的分布特性，使藥物更易進入細胞發揮作用，提高受體敏感性及細胞毒活性(田瑞琴等，細胞因子類藥物製劑研究進展，中國生化藥物雜誌，200526(5)315-317)。Yuyama等(Yuyama et al，Potential usage ofthermosensitive liposomes for site-specific delivery of cytokines.Cancer Letters，2000，155(1)71-77)用熱敏性脂質體包裹的TNF在37℃血漿中是穩定的，但是在42℃時能被迅速釋放，因此，具有很好的靶向性。Kedar等(Kedar E，et al.Delivery of cytokines by liposomes.III Liposome-encapsulated GM-CSFand TNF-alpha show improved pharmacokinetics and biological activity andreduced toxicity in mice.J.Immunother，1997，20(3)180-193)將rhGM-CSF包囊於0.3～2.2μm的脂質體中，包囊後顯示了較高的穩定性和活性，半衰期及藥時曲線下面積是未包囊前的10-20倍，在4℃放置4個月生物活性降低不顯著，且能顯著提高粒細胞的數量。另外近年來日益受到矚目的是陽性脂質體。它是由一種中性磷脂和一種或多種陽性成分組成的。其中，中性磷脂起到穩定雙層膜和降低陽性成分毒性的作用，同時提供陽性脂質的細胞滲透功能，如膽固醇、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺以及二油醯磷脂醯乙醇胺等。陽性成分是具有不同化學結構的兩性分子，多為雙鏈季胺鹽表面活性劑，為整個脂質體提供正電荷。正是由於這種性質，它可作為負電荷物質的傳遞載體，特別適用於蛋白質、多肽、寡核苷酸類物質、脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等(扈木荃等，螢光素鈉陽離子脂質體的製備及向金黃色葡萄球菌轉運的效率。華西藥學雜誌2003，23199-202)。如可以用其介導基因轉染，使陽性脂質體與DNA形成複合物，介導與細胞的作用，並將DNA釋放到細胞中，實現基因轉染，所以在基因治療方面有獨特應用。
然而這些材料還並非理想，對於聚酯類合成高分子來說，細胞親和性差、缺乏細胞識別信號、與細胞間缺乏生物性相互作用等是它們共同的缺陷。聚酯在體內降解主要是酯鍵的隨機、非酶性水解。由於PLA及PLGA疏水性較強，與親水性藥物，尤其是蛋白類藥物親和性較差，且在降解過程中微球內部局部酸性環境不利於藥物穩定(Sood，A.et al.Peroral RouteAn Opportunity for Protein and Peptide Drug Delivery，Chem.Rev.；(Review)；2001；101(11)；3275-3304，Ha，C.S.et al.Surface Chemistry ofBiodegradablePolymers for Drug Delivery Systems，Chem.Rev.；(Review)；2005；105(11)；4205-4232)。脂質體作為一種對人體無毒、無免疫原性的定向藥物載體，能控制藥物釋放，提高藥效，降低毒副作用。但在實際應用中，脂質體需要克服儲存期限短、過度融合造成藥物洩漏、組織專一性和靶向性差、易被吞噬細胞的網狀內皮細胞系統迅速清除等困難。因此，開發性能優良的微球體系對於藥劑學的發展具有重要意義。
根據微球和微囊形成的原理，常見微球(囊)的製備方法大致可分為利用反應形成微球或囊壁的化學方法、利用相分離形成微球或囊壁的物理化學方法和利用機械或其它物理作用，如噴霧乾燥、空氣懸浮、靜電結合等形成微球或囊壁的物理方法等。上述製備微球或微囊的過程中一般都需加入表面活性劑或乳化劑。例如CN02137781.2採用油包油技術，以水溶性抗癌藥物和聚乳酸及其共聚物的有機溶劑為內油相，液體石蠟或植物油為其外油相，製備了含有阿黴素、氟尿嘧啶、柔紅黴素等抗腫瘤藥物的微球。CN1607033A針對蛋白質、多肽、抗癌劑、激素等親水性藥物和油溶性藥物，將親水性藥物溶於殼聚糖和醋酸水溶液中，將該水相用壓力通過微孔膜壓入油相中，得到尺寸均一的乳滴，然後採用一定的固定方法使乳滴固化，得到尺寸均一、分散穩定的殼聚糖微球或微囊藥物載體；將油溶性藥物溶於油性溶劑中，親水性藥物溶於殼聚糖醋酸水溶液中，先用均相乳化器製備O/W初乳，將該初乳用壓力通過微孔膜壓入油相中，得到尺寸均一的復乳滴，然後採用一定的固化方法使乳滴固化，得到尺寸均一、分散穩定的殼聚糖微球或微囊藥物載體。
近年來，在製備微膠囊方面，又發展了許多新的製備方法，如模板組裝、表面接枝聚合、分散聚合等。其中，基於弱相互作用的層-層自組裝技術製備的微膠囊具有結構和性能可控、易賦予各種獨特功能的特點。這些弱相互作用包括靜電力、氫鍵、疏水力等。然而通過這種方法製備的聚合物微膠囊的穩定性常常不足，不能抵禦較為苛刻的外部條件，如有機溶劑的溶解、酸鹼鹽的侵蝕、高溫的分解等而被破壞。利用高分子聚合技術，使小分子單體在模板表面聚合成薄膜是近十幾年發展起來的一種新技術。CN1772366A公開了一種製備中空微膠囊的方法，以二氧化矽微粒為模板，在其表面接枝雙鍵，然後在另外一種分子模板聚乙烯基吡咯烷酮存在下，將丙烯酸聚合，生產含氫鍵的複合物，這種複合物或丙烯酸單體被捕捉或聚合到接雙鍵的二氧化矽粒子表面，從而形成核-殼結構的微粒。最後把模板除去，得到中空微囊。CN1772365A則是基於共價鍵相互作用層-層組裝方法，採用將兩種可反應的聚合物在氨基化的二氧化矽顆粒表面進行反應，獲得具有多層結構的聚合物超薄膜；然後採用氫氟酸去除無機粒子，得到囊壁為共價交聯多層膜結構的中空微膠囊。但通過模板法製備微囊步驟較複雜。
發明內容
本發明的目的是提供一種糖肽綴合物微球或微囊及其製備方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。
本發明的構思是這樣的從仿生的角度，模擬天然組織中細胞外基質對生長因子等生物活性物質的控釋過程是一種設計藥物緩釋體系的新思路。細胞外基質(ExtracellularMatrix，ECM)是構成組織的3種主要結構單元之一，天然ECM在組織和器官中起骨架作用，同時也是生長因子的貯存器，將生長因子控制釋放至相鄰細胞和組織。細胞外基質中，糖不僅以多糖或寡糖的游離形式直接參與生命過程，更重要的是以糖綴合物(Glycoconjugates)，即糖鏈與蛋白等生物大分子以共價鍵相連的形式參與許多重要的生命過程。
以具有良好生物相容性並且與細胞外基質中糖胺多糖結構相似的天然高分子多糖殼聚糖為糖肽綴合物的糖基部分，以化學合成的聚肽作為糖肽綴合物中的肽鏈，殼聚糖和聚肽通過共價鍵相連，可形成仿細胞外基質結構的糖肽綴合物材料。
目前在聚肽合成中普遍使用的方法是α-胺基酸-N-羧酸內酐(NCA)的開環聚合法。該方法屬於陰離子開環聚合機理，其引發劑可選用多種親核試劑或鹼類。胺是NCA法常用的引發劑，它的親核性強於鹼，可以使多種NCA單體聚合。殼聚糖分子上帶有自由氨基，可作為一種大分子引發劑引發胺基酸NCA單體的開環聚合。通過殼聚糖的氨基引發胺基酸羧酸內酐單體的開環聚合，形成主鏈為殼聚糖，側聯為聚肽，多糖和聚肽以共價鍵相連的糖肽綴合物結構。
此處，發生接枝共聚反應的兩種物質分別溶解於水相和油相(有機溶劑)中，利用非均相反應的特點，可以在合成糖綴合物的同時通過界面聚合方法原位製備糖肽微球材料。此外，殼聚糖經疏水化處理後，分子結構中同時具有疏水基團和親水基團，具備了表面活性劑的兩親性特點，容易在溶液表面吸附，降低反應體系的表面張力。因此殼聚糖在引發NCA開環聚合的同時，又充當了乳化劑，使製備微球的過程中無需添加乳化劑。
本發明製備糖肽綴合物微球或微囊，採用多糖-聚肽接枝共聚的形式，由天然多糖殼聚糖構成糖肽綴合物的糖基部分，由聚(Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸)、聚(Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸)、聚(L-亮氨酸)、聚(L-異亮氨酸)、聚(L-丙氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-天冬氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-穀氨酸)、聚(γ-甲酯-L-穀氨酸)、聚(γ-乙酯-L-穀氨酸)、聚(O，O』-二苄氧羰基-3，4-二羥基-L-苯丙氨酸)中的一種或一種以上的均聚肽或其共聚物構成糖肽綴合物的肽鏈部分，多糖和聚肽以共價鍵相連接。所製備的微球或微囊的直徑為10-1000μm。
本發明所說的糖肽綴合物微球或微囊，由多糖構成糖肽綴合物的糖基部分，由聚肽構成糖肽綴合物的肽鏈部分，多糖和聚肽以共價鍵的形式連接；所說的多糖為天然多糖殼聚糖，所說的天然多糖殼聚糖為水溶性殼聚糖；所說的聚肽為均聚肽或共聚肽，所說的均聚肽或共聚肽為通過化學方法合成的胺基酸聚合物；所說的聚肽選自聚(Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸)、聚(Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸)、聚(L-亮氨酸)、聚(L-異亮氨酸)、聚(L-丙氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-天冬氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-穀氨酸)、聚(γ-甲酯-L-穀氨酸)、聚(γ-乙酯-L-穀氨酸)、聚(O，O』-二苄氧羰基-3，4-二羥基-L-苯丙氨酸)中的一種以上；製備糖肽綴合物微球或微囊的方法，包括以下幾個步驟1)將乙醇和吡啶依次加入重量濃度為0.5～10％的殼聚糖/醋酸溶液，然後加入乙酸酐，反應1～4小時，將反應液倒入乙醇中，過濾，得到殼聚糖凝膠，乾燥，並經水/乙醇提純得到水溶性殼聚糖，脫乙醯度為40～60％；乙醇和吡啶的體積比為乙醇∶吡啶＝2～5∶1；
吡啶在殼聚糖/醋酸溶液中的濃度為1～5mol/L；乙酸酐的體積用量為殼聚糖/醋酸溶液的1～5％；2)將α-胺基酸單體加入溶劑四氫呋喃溶液中，在氬氣保護下，加入三光氣，並升溫至50～60℃反應，直至溶液變為澄清，將反應液倒入正己烷中，在0～25℃下靜置8～15小時，過濾，得到白色固體結晶α-胺基酸-N-羧酸內酐單體；α-胺基酸單體與三光氣的摩爾比例為，α-胺基酸單體∶三光氣＝1∶0.3～3；所說的α-胺基酸-N-羧酸內酐單體選自Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸-羧酸內酐、Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-羧酸內酐、L-亮氨酸-羧酸內酐、L-異亮氨酸-羧酸內酐、L-丙氨酸-羧酸內酐、γ-苯甲酯-L-天冬氨酸-羧酸內酐、γ-苯甲酯-L-穀氨酸-羧酸內酐、γ-甲酯-L-穀氨酸-羧酸內酐、γ-乙酯-L-穀氨酸-羧酸內酐或O，O』-二苄氧羰基-3，4-二羥基-L-苯丙氨酸-羧酸內酐；3)將步驟1)得到的水溶性殼聚糖溶解在水中，配成濃度為0.01g/ml～5g/ml的殼聚糖水溶液；將步驟2)得到的α-胺基酸-N-羧酸內酐單體溶解在與水互不相溶的有機溶劑中，使單體濃度為0.01mol/l～10.0mol/l，在氬氣保護下，將α-胺基酸-N-羧酸內酐溶液加入殼聚糖水溶液中，α-胺基酸-N-羧酸內酐單體與殼聚糖中氨基多糖單元的摩爾比為0.5～20，有機溶劑與水的比例為0.1～5，反應2小時；所說的有機溶劑選自醋酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯等或它們的混合物；4)將反應產物倒入N，N-二甲基甲醯胺/水混合溶液中，過濾，並依次用水、二甲基甲醯胺、丙酮溶液洗滌，經冷凍乾燥得到糖肽綴合物微球或微囊。
本發明是建立在反應體系中水/油兩相存在下，通過界面聚合，使殼聚糖上的氨基攻擊α-胺基酸-N-羧酸內酐環狀單體的開環聚合，形成殼聚糖-接枝聚肽材料。並利用水溶性殼聚糖本身具有一定乳化能力的特點，使在合成糖肽綴合物的同時，原位製備了微球或微囊。
本發明的優點在於(1)本發明提供了一種新型的以糖肽綴合物為主體材料的微球和微囊的製備方法。本發明以生物相容性良好的殼聚糖-接枝聚肽為主體材料，具有良好的組織相容性和可降解性，在體內不會造成組織的不良反應。
(2)本發明中，多糖和聚肽通過共價鍵形成高度交聯的聚合物網絡，相比通過弱相互作用的自組裝技術形成的微囊，本發明提供的微球或微囊結構更為穩定，一旦反應完成，就不能被大部分有機溶劑溶解，也不能被一般濃度的酸、鹼和鹽破壞。
(3)本發明方法製備工藝簡單、材料易得、聚合速率快、製備微球和微囊的過程在合成糖肽綴合物材料的過程中一步完成，並且無需外加乳化劑，反應條件溫和，可望能夠保持生物活性藥物的活性。
(4)適用範圍廣。本發明製備的微球和微囊在酸性溶液和有機溶劑中均具有一定的溶脹性，製作工藝可適用於包埋蛋白類生長因子、抗癌劑、激素等多種酸溶性藥物和油溶性藥物。
(5)可控性。通過簡單控制反應的組分比可以控制材料的糖基和聚肽的比例，並調控微球和微囊的降解性和溶脹性。通過控制反應條件可控制製備微球或微囊並控制微囊的壁厚。
圖1是實施例1的產物在光學顯微鏡下觀察的微球在溼態下的圖像。
圖2是實施例1的產物冷凍乾燥後在掃描電鏡下觀察的圖像。
圖3是實施例1的產物掃描電鏡觀察下的微球表面形貌。
圖4是實施例2的產物冷凍乾燥後在掃描電鏡下觀察的微囊圖像。
圖5是實施例2的產物掃描電鏡下觀察的微囊斷面圖像。
圖6是實施例1和實施例3的產物微球在不同介質中的溶脹情況。
具體實施例方式
下面通過本發明方法的具體實施例的詳細描述來進一步闡述本發明，但這些實例並不用來限制本發明。
實施例1取4克殼聚糖溶解於100ml去離子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解後加入100ml無水乙醇、32ml吡啶，攪拌至澄清，然後加入3.6ml乙酸酐，室溫下攪拌2小時。將反應液倒入乙醇中，抽濾，得到白色沉澱。粗產物用水溶解，離心除去不溶物，濾液加入200ml無水乙醇，離心分離後棄去上清液，沉澱物依次用丙酮和無水乙醚洗滌，室溫真空乾燥24h，得白色絮狀固體。採用酸鹼滴定法測定產物的脫乙醯度為43％。
在Ar保護下，在100ml三口燒瓶中配製0.1g/10ml上述殼聚糖水溶液。稱取0.6825gL-亮氨酸-N-羧酸內酐單體溶於乾燥的乙酸乙酯中配成0.5mol/l溶液，並轉移至反應瓶中，使L-亮氨酸-N-羧酸內酐單體與殼聚糖中氨基多糖單元的摩爾比為8，並且體系中的油/水相體積比例為0.8。控制攪拌速度為800r/min，反應2h。將反應混合液倒入DMF中，生成白色沉澱，抽濾，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗滌沉澱，冷凍乾燥得白色微球。顯微鏡下觀察所製備的微球在溼態時外觀圓整，球形較好，尺寸較均勻，如圖1。冷凍乾燥後在掃描電鏡下可見，所得微球能基本保持球形，直徑在幾十到一百微米之間(圖2)，微球表面緻密但不光滑(圖3)。
實施例2取4克殼聚糖溶解於100ml去離子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解後依次加入100ml無水乙醇、32ml吡啶，攪拌至澄清，然後加入3.6ml乙酸酐，室溫下攪拌3小時。將反應液倒入乙醇中，抽濾，得到白色沉澱。粗產物用適量去離子水溶解，離心除去不溶物，濾液加入200ml無水乙醇，離心分離後棄去上清液，沉澱物依次用丙酮和無水乙醚洗滌，室溫真空乾燥24h，得白色絮狀固體。採用酸鹼滴定法測定產物的脫乙醯度為43％。
在Ar保護下，在100ml三口燒瓶中配製0.1g/10ml上述殼聚糖水溶液。稱取0.4263g L-亮氨酸-N-羧酸內酐單體溶於乾燥的乙酸乙酯中配成0.14mol/l溶液，並轉移至反應瓶中，使L-亮氨酸-N-羧酸內酐單體與殼聚糖中氨基多糖單元的摩爾比為5，並且體系中的油/水相的體積比例為2。
控制攪拌速度為800r/min，反應2h。將反應混合液倒入DMF中，生成白色沉澱，抽濾，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗滌沉澱，冷凍乾燥得白色粉末。顯微鏡下觀察所製備的微球在溼態時外觀圓整，球形較好，尺寸較均勻，形貌類似於實施例1製備的微球。冷凍乾燥後在掃描電鏡下可見出現明顯凹凸和塌陷，如圖4，將其在冷凍狀態下粉碎可見其內部為中空結構，如圖5，壁厚為50μm左右。
實施例3取4克殼聚糖溶解於100ml去離子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解後依次加入100ml無水乙醇、32ml吡啶，攪拌至澄清，然後加入3.4ml乙酸酐，室溫下攪拌4小時。將反應液倒入乙醇中，抽濾，得到白色沉澱。粗產物用適量去離子水溶解，離心除去不溶物，濾液加入200ml無水乙醇，離心分離後棄去上清液，沉澱物依次用丙酮和無水乙醚洗滌，室溫真空乾燥24h，得白色絮狀固體。採用酸鹼滴定法測定產物的脫乙醯度為50％。
在Ar保護下，在100ml三口燒瓶中配製0.1g/10ml上述殼聚糖水溶液。稱取1.3382g Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸內酐單體溶於乾燥的乙酸乙酯中配成0.87mol/l溶液，並轉移至反應瓶中，使Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸內酐單體與殼聚糖中氨基多糖單元的摩爾比為8，並且體系中的油/水相體積比例為0.5。控制攪拌速度為800r/min，反應2h。將反應混合液倒入DMF中，生成白色沉澱，抽濾，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗滌沉澱，冷凍乾燥得白色微球。顯微鏡下觀察所製備的微球外觀圓整，球形較好，尺寸較均勻，形貌類似於實施例1製備的微球，直徑在200到500μm。
實施例4取4克殼聚糖溶解於100ml去離子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解後依次加入100ml無水乙醇、32ml吡啶，攪拌至澄清，然後加入3.4ml乙酸酐，室溫下攪拌1小時。將反應液倒入乙醇中，抽濾，得到白色沉澱。粗產物用適量去離子水溶解，離心除去不溶物，濾液加入200ml無水乙醇，離心分離後棄去上清液，沉澱物依次用丙酮和無水乙醚洗滌，室溫真空乾燥24h，得白色絮狀固體。採用酸鹼滴定法測定產物的脫乙醯度為50％。
在Ar保護下，在100ml三口燒瓶中配製0.1g/10ml上述殼聚糖水溶液。稱取0.8315g Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸內酐單體溶於乾燥的乙酸乙酯中配成0.11mol/l溶液，並轉移至反應瓶中，使Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸內酐單體與殼聚糖中氨基多糖單元的摩爾比為5，並且體系中的油/水相體積比例為2.5。控制攪拌速度為800r/min，反應2h。將反應混合液倒入DMF中，生成白色沉澱，抽濾，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗滌沉澱，冷凍乾燥得白色粉末。顯微鏡下觀察所製備的微球在溼態時外觀圓整，球形較好，尺寸較均勻，形貌類似於實施例1製備的微球。冷凍乾燥後在掃描電鏡下可見出現明顯凹凸和塌陷，類似於實施例2製備的微囊。
實施例5取4克殼聚糖溶解於100ml去離子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解後依次加入100ml無水乙醇、32ml吡啶，攪拌至澄清，然後加入3.6ml乙酸酐，室溫下攪拌2小時。將反應液倒入乙醇中，抽濾，得到白色沉澱。粗產物用適量去離子水溶解，離心除去不溶物，濾液加入200ml無水乙醇，離心分離後棄去上清液，沉澱物依次用丙酮和無水乙醚洗滌，室溫真空乾燥24h，得白色絮狀固體。採用酸鹼滴定法測定產物的脫乙醯度為43％。
在Ar保護下，在100ml三口燒瓶中配製0.1g/10ml上述殼聚糖水溶液。稱取0.6825gL-亮氨酸-N-羧酸內酐單體溶於乾燥的二氯甲烷中配成0.5mol/l溶液，並轉移至反應瓶中，使L-亮氨酸-N-羧酸內酐單體與殼聚糖中氨基多糖單元的摩爾比為8，並且體系中的油/水相體積比例為0.8。控制攪拌速度為800r/min，反應2h。將反應混合液倒入DMF中，生成白色沉澱，抽濾，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗滌沉澱，冷凍乾燥得白色微球。顯微鏡下觀察所製備的微球外觀圓整，球形較好，尺寸較均勻，形貌類似於實施例1所製備的微球。
實施例6取4克殼聚糖溶解於100ml去離子水(含2.8ml冰乙酸)，全部溶解後依次加入100ml無水乙醇、32ml吡啶，攪拌至澄清，然後加入3.2ml乙酸酐，室溫下強烈攪拌3小時。將反應液倒入乙醇中，抽濾，得到白色沉澱。粗產物用適量去離子水溶解，離心除去不溶物，濾液加入200ml無水乙醇，離心分離後棄去上清液，沉澱物依次用丙酮和無水乙醚洗滌，室溫真空乾燥24h，得白色絮狀固體。採用酸鹼滴定法測定產物的脫乙醯度為53％。
在Ar保護下，在100ml三口燒瓶中配製0.1g/10ml上述殼聚糖水溶液。稱取0.6825gγ-苯甲酯-L-天冬氨酸-N-羧酸內酐單體溶於乾燥的醋酸乙酯中配成0.14mol/l溶液，並轉移至反應瓶中，使γ-苯甲酯-L-天冬氨酸-N-羧酸內酐單體與殼聚糖中氨基多糖單元的摩爾比為8，並且體系中的油/水相體積比例為2。控制攪拌速度為800r/min，反應2h。將反應混合液倒入DMF中，生成白色沉澱，抽濾，依次用DMF/H2O混合溶液、丙酮洗滌沉澱，冷凍乾燥得白色微球。顯微鏡下觀察所製備的微球在溼態時外觀圓整，球形較好，尺寸較均勻，形貌類似於實施例1所製備的微球，冷凍乾燥後在掃描電鏡下可見出現明顯凹凸和塌陷，類似於實施例2製備的微囊。
實施例7本實驗主要用於研究微球在酸溶液和有機溶劑中的溶脹性。
將按照實施例1和實施例3製備好的微球稱取適量，分別記作微球1和微球2。將其分別放入去離子水、pH＝5，pH＝3的鹽酸溶液、N，N-二甲基甲醯胺(DMF)中浸泡48h，取出洗滌後吸乾表面水份，稱重。按照下式計算出其溶脹率Wwet-WdryWdry100%]]>其中，Wwet-溶脹前微球質量Wdry-溶脹後微球質量結果如圖6所示。由圖6不難發現，兩種微球在水、不同pH的鹽酸溶液以及有機溶劑(DMF)均有一定的溶脹性，其中在DMF中的溶脹率最高；並且接枝聚Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸的微球比接枝L-亮氨酸的微球溶脹率更高，在DMF中可達到560％。實驗說明通過調節不同的聚肽組分，可以控制微球的溶脹性能。
權利要求
1.一種糖肽綴合物微球或微囊，其特徵在於，由多糖構成糖肽綴合物的糖基部分，由聚肽構成糖肽綴合物的肽鏈部分，多糖和聚肽以共價鍵的形式連接。
2.根據權利要求1所述的糖肽綴合物微球或微囊，其特徵在於，所說的多糖為天然多糖殼聚糖。
3.根據權利要求2所述的糖肽綴合物微球或微囊，其特徵在於，所說的天然多糖殼聚糖為水溶性殼聚糖。
4.根據權利要求1所述的糖肽綴合物微球或微囊，其特徵在於，所說的聚肽為均聚肽或共聚肽。
5.根據權利要求4所述的糖肽綴合物微球或微囊，其特徵在於，所說的聚肽選自聚(Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸)、聚(Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸)、聚(L-亮氨酸)、聚(L-異亮氨酸)、聚(L-丙氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-天冬氨酸)、聚(γ-苯甲酯-L-穀氨酸)、聚(γ-甲酯-L-穀氨酸)、聚(γ-乙酯-L-穀氨酸)、聚(O，O』-二苄氧羰基-3，4-二羥基-L-苯丙氨酸)中的一種以上。
6.製備糖肽綴合物微球或微囊的方法，包括以下幾個步驟1)將乙醇和吡啶依次加入殼聚糖/醋酸溶液，然後加入乙酸酐反應，將反應液倒入乙醇中，過濾，得到殼聚糖凝膠，乾燥，並經水/乙醇提純得到水溶性殼聚糖；2)將α-胺基酸單體加入溶劑四氫呋喃溶液中，在氬氣保護下，加入三光氣，並升溫至50～60℃反應，將反應液倒入正己烷中，在0～25℃下靜置，過濾，得到白色固體結晶α-胺基酸-N-羧酸內酐單體；3)將步驟1)得到的水溶性殼聚糖溶解在水中，配成濃度為0.01g/ml～5g/ml的殼聚糖水溶液；將步驟2)得到的α-胺基酸-N-羧酸內酐單體溶解在與水互不相溶的有機溶劑中，使單體濃度為0.01mol/l～10.0mol/l，在氬氣保護下，將α-胺基酸-N-羧酸內酐溶液加入殼聚糖水溶液中，α-胺基酸-N-羧酸內酐單體與殼聚糖中氨基多糖單元的摩爾比為0.5～20，有機溶劑與水的比例為0.1～5，反應2小時；4)將反應產物倒入N，N-二甲基甲醯胺/水混合溶液中，過濾，並依次用水、二甲基甲醯胺、丙酮溶液洗滌，經冷凍乾燥得到糖肽綴合物微球或微囊。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟1)中，乙醇和吡啶的體積比為乙醇∶吡啶＝2～5∶1；吡啶在殼聚糖/醋酸溶液中的濃度為1～5mol/L；乙酸酐的體積用量為殼聚糖/醋酸溶液的1～5％，反應時間為1～4小時。
8.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，α-胺基酸單體與三光氣的摩爾比例為，α-胺基酸單體∶三光氣＝1∶0.3～3。
9.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所說的α-胺基酸-N-羧酸內酐單體選自Nε-苄氧羰基-L-賴氨酸-羧酸內酐、Nε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸-羧酸內酐、L-亮氨酸-羧酸內酐、L-異亮氨酸-羧酸內酐、L-丙氨酸-羧酸內酐、γ-苯甲酯-L-天冬氨酸-羧酸內酐、γ-苯甲酯-L-穀氨酸-羧酸內酐、γ-甲酯-L-穀氨酸-羧酸內酐、γ-乙酯-L-穀氨酸-羧酸內酐或O，O』-二苄氧羰基-3，4-二羥基-L-苯丙氨酸-羧酸內酐。
10.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所說的有機溶劑選自醋酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷或甲苯等或它們的混合物。
全文摘要
本發明公開了一種糖肽綴合物微球或微囊及其製備方法。糖肽綴合物微球或微囊由多糖構成糖肽綴合物的糖基部分，由聚肽構成糖肽綴合物的肽鏈部分，多糖和聚肽以共價鍵的形式連接。該方法採用界面聚合反應，首先製備水溶性殼聚糖，然後利用殼聚糖上氨基的親核性引發多種胺基酸羧酸內酐單體開環聚合，形成以殼聚糖為主鏈，側連結枝聚肽鏈段的多糖和聚肽以共價鍵相連的糖肽綴合物結構。利用水溶性殼聚糖本身具有的兩親性，在接枝共聚反應過程中可一步生成微球或微囊，並且無需添加乳化劑。本發明方法工藝簡單、材料易得、聚合速率快、反應條件溫和。製得的微球或微囊可用於藥物緩釋領域。
文檔編號A61K9/50GK1931370SQ20061011606
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月14日 優先權日2006年9月14日
發明者劉昌勝, 王靖 申請人:華東理工大學