一種端粒位置效應細胞模型及其用途的製作方法

2023-10-27 15:39:37

專利名稱：一種端粒位置效應細胞模型及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於篩選影響端粒功能的藥物或化合物的細胞模型，具體地說，是一種端粒位置效應細胞模型及其用途。
背景技術：
端粒是染色體末端具有重複序列的特殊結構，它是由簡單的DNA高度重複序列組成的，染色體末端沿著5』到3』方向的鏈富含GT。在酵母和人體中，端粒序列分別為C1-3A/TG1-3和TTAGGG/CCCTAA，並有許多端粒蛋白與端粒結合。端粒的主要功能有:第一，保護染色體不被核酸酶降解；第二，防止染色體相互融合；第三，為端粒酶提供底物，解決DNA複製的末端隱縮，保證染色體的完全複製。端粒、著絲粒和複製原點是染色體保持完整和穩定的三大要素。同時，端粒又是基因調控的特殊位點，常可抑制位於端粒附近基因的轉錄活性，沉默它附近基因的表·達，並與端粒長度有關，稱之為端粒位置效應(Telomere PositionEffect，TPE)，而正常細胞端粒隨細胞分裂逐漸縮短，端粒附近沉默的基因是重新表達的。已有研究表明證實TPE與細胞老化和腫瘤存在密切聯繫。中國期刊《第三軍醫大學學報》，2005年4月，第27卷第8期，刊出的論文「胃癌細胞中端粒位置效應研究」，作者將pTET-OFF調節質粒和攜帶螢光素酶報導基因的pTRE2-Hyg-Luc if erase反應質粒共轉染胃癌細胞SGC7901，經強力黴素誘導24h後檢測報導基因活性，觀察強力黴素誘導的抑制反應。然後將插入有端粒片段的螢光素酶報導質粒PBX質粒和對照質粒pBX-ntf (noteloemere fragment)分別與pTET_0FF調節質粒共轉染細胞,在強力黴素誘導下,檢測報導基因活性的改變。結果發現共轉染pTET-OFF和pTRE-Hyg-Luc if erase質粒的SGC7901細胞在強力黴素作用下螢光素酶報導基因的活性逐漸降低。強力黴素誘導分別共轉染有pTET-OFF和pBX質粒或pTET-OFF和pBX-ntf的細胞時，前者螢光素酶活性較後者降低4倍。得出結論:轉染TET-OFF基因表達調控系統的胃癌細胞SGC7901受強力黴素的誘導抑制；轉染入胃癌細胞中的端粒片段降低了存在它附近螢光素酶報導基因的表達水平，也即TPE引起基因的不穩定。中國期刊《細胞生物學雜誌》，2004，26:513_515，刊出的論文「端粒位置效應與人類衰老」表明TPE可能對細胞生長停止、以及衰老發生時等許多隨端粒縮短密切相關基因的程序性表達產生重要作用。總之，端粒在細胞老化和腫瘤中起著重要作用，成為抗衰老和抗腫瘤治療的重要靶點。篩選對端粒功能有影響的藥物，進一步開發以端粒為靶點的臨床藥物對於腫瘤或其他相關疾病的治療以及延緩衰老具有重要意義。但是目前並沒有方法可以高通量篩選影響端粒功能的藥物，尤其是影響TPE的藥物。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種端粒位置效應質粒。本發明的再一的目的是，提供上述端粒位置效應質粒的用途。本發明的另一的目的是，提供一種端粒位置效應細胞模型。
本發明的第四個目的是，提供端粒位置效應細胞模型的用途。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是:
一種端粒位置效應質粒，它是在pCMV-GFP載體的GFP基因或pCMV-Luciferase載體的Lucif erase基因的下遊插入如SEQ ID N0.1所示的T2AG3序列構建得到的；所述的pCMV-Luciferase載體是用Luciferase基因片段置換pCMV_GFP載體的GFP基因片段構建得到的。其中，所述的端粒位置效應質粒的具體構建方法是:使用NotI和PvuI雙酶切pSXneo270 (T2AG3)質粒，回收T2AG3序列片段；使用NotI酶切pCMV-Luc if erase載體或pCMV-GFP載體，回收大片段；再使用連接酶連接上述T2AG3序列片段和大片段，並用補齊酶補齊一端酶切位點不匹配導致的鹼基缺損；最後經轉化，篩選，一代測序獲得正確連接的克隆。為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是:
如上所述的端粒位置效應質粒在建立端粒位置效應細胞模型中的用途；
如上所述的端粒位置效應質粒在高通量篩選抑制端粒位置效應的藥物中的用途。為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是:
一種端粒位置效應細胞模型，它是含有如上所述的端粒位置效應質粒的細胞；
其中，所述的端粒位置效應細胞模型可以是含有如上所述的端粒位置效應質粒的C33A宮頸癌細胞。為實現上述第四個目的，本發明採取的技術方案是:
如上所述的端粒位置效應細胞模型在高通量篩選影響端粒功能的藥物中的用途；如上所述的端粒位置效應細胞模型在高通量篩選增強或抑制端粒位置效應的藥物中的用途。本發明優點在於:
本發明成功構建了端粒位置效應質粒和細胞模型，運用該細胞模型可以高通量篩選對端粒功能有影響的藥物，尤其是篩選抑制端粒位置效應的藥物，彌補了高通量篩選影響端粒功能藥物方面的空白，為進一步開發以端粒為祀點的涉及腫瘤、衰老的臨床藥物打下基礎。


附圖1 是 PGL3_Luciferase 載體圖譜。附圖2是pCMV-GFP載體圖譜。附圖3是pCMV質粒、Luciferase-TPE質粒、GFP-TPE質粒的結構示意圖。其中，pCMV為對照質粒；TPE-Telo為Luciferase-TPE質粒和GFP-TPE質粒，其可通過TPE作用影響報告基因Luciferase或GFP的表達。附圖4是對照C33A細胞株和Luciferase-ΤΡΕ細胞模型的Luciferase檢測結果。其中，三角形代表對照細胞株，正方形代表Luciferase-TPE細胞模型；橫坐標為不同時間段，縱坐標為Luciferase的化 學發光強度。附圖5是運用Luciferase-ΤΡΕ細胞模型高通量自動篩選Prestwick Chemicals藥庫結果。其中，橫坐標是被篩選的藥物名稱，縱坐標是Luciferase表達量；pCMV_24hr表示pCMV對照組經藥物處理24h，pCMVTelo-24hr表示Luciferase-ΤΡΕ細胞模型經藥物處理24h，pCMV-72hr 表示 pCMV 對照組經藥物處理 72h，pCMVTelo_72hr 表示 Luciferase-ΤΡΕ 細胞經藥物處理72h。附圖6是在GFP-TPE模型中，運用GFP作為報告基因，用流式細胞儀檢測證實Acacetin和Chrysin作用後GFP表達量升高，提示該藥物對端粒的TPE作用有影響。附圖7A、7B和7C是運用分子生物學方法證實chrysin和acacetin對TPE的抑制作用的結果。圖7A為C33A腫瘤細胞經Chrysin和Acacetin處理後，表現出經典的TIF信號(Telomere dysfunction Induced Foci,即端粒受DNA損傷通路攻擊的特異性信號)明顯增多；圖7B為MR90正常成纖維細胞經Chrysin和Acacetin處理後，表現出經典的TIF信號明顯增多。其中，圖7A、圖7B中上端的圖片為代表性TIF信號圖，下端的柱狀圖是根據TIF信號圖定量計算得到的TIF信號值。圖7C為Chrysin和Acacetin處理後引起端粒失功能特異性的染色體末端畸變等表型(C左)和定量分析結果(C右)。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。需要說明的是，下述免疫螢光法結合雷射共聚焦檢測的方法及染色體中期端粒原位雜交法均屬於本領域技術人員公知常識。實施例1
1、材料
PGL3-Luc if erase載體，載體圖譜如圖1所示，購自Promega公司；pCMV_GFP載體，載體圖譜如圖2所示，購自Addgene公司；pSXneo270 (T2AG3)質粒，購於Addgene公司，載體圖譜見Addgene公司網站http://www.addgene.0rg/ ；C33A宮頸癌細胞系來源於LifeTechnology公司細胞庫。Lipofectamine 2000 細胞轉染試劑購自 Invitrogen ;Luciferase/Renilla 化學發光試劑盒購於Promega公司；潮黴素(Hygromycin)購自Invitrogen ；5, 7-二輕基-4』 -甲氧基黃麗(acacetin)和 5，7_ 二輕基黃麗(chrysin)購自 Sigma 公司。acacetin 和 chrysin的結構式如下:
權利要求
1.一種端粒位置效應質粒，其特徵在於，它是在PCMV-GFP載體的GFP基因或pCMV-Luciferase載體的Luciferase基因的下遊插入如SEQ ID N0.1所不的T2AG3序列構建得到的；所述的pCMV-Luciferase載體是用Luciferase基因片段置換pCMV_GFP載體的GFP基因片段構建得到的。
2.根據權利要求1所述的端粒位置效應質粒，其特徵在於，所述的端粒位置效應質粒的具體構建方法是:使用NotI和PvuI雙酶切pSXneo270 (T2AG3)質粒，回收T2AG3序列片段；使用NotI酶切pCMV-Luciferase載體或pCMV_GFP載體，回收大片段；再使用連接酶連接上述T2AG3序列片段和大片段，並用補齊酶補齊一端酶切位點不匹配導致的鹼基缺損；最後經轉化，篩選，一代測序獲得正確連接的克隆。
3.權利要求1或2所述的端粒位置效應質粒在建立端粒位置效應細胞模型中的用途。
4.權利要求1或2所述的端粒位置效應質粒在高通量篩選抑制端粒位置效應的藥物中的用途。
5.一種端粒位置效應細胞模型，其特徵在於，它是含有權利要求1或2所述的端粒位置效應質粒的細胞。
6.根據權利要求4所述的端粒位置效應細胞模型，其特徵在於，它是含有權利要求1或2所述的端粒位置效應質粒的C33A宮頸癌細胞。
7.權利要求5或6所述的端粒位置效應細胞模型在高通量篩選影響端粒功能的藥物中的用途。
8.權利要求5或6所述的端粒位置效應細胞模型在高通量篩選增強或抑制端粒位置效應的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種端粒位置效應細胞模型及其用途。具體的，本發明提供一種端粒位置效應質粒，它是在pCMV-GFP載體的GFP基因或pCMV-Luciferase載體的Luciferase基因的下遊插入如SEQIDNO.1所示的T2AG3序列構建得到的；另提供了含有上述端粒位置效應質粒的細胞模型；還提供了上述細胞模型在高通量篩選影響端粒功能的藥物中的用途。運用本發明的細胞模型可以高通量篩選對端粒功能有影響的藥物，尤其是篩選抑制端粒位置效應的藥物，彌補了高通量篩選影響端粒功能藥物方面的空白，為進一步開發以端粒為靶點的涉及腫瘤、衰老的臨床藥物打下基礎。
文檔編號C12N15/63GK103074355SQ20131000822
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月10日 優先權日2013年1月10日
發明者葉靜, 陸一鳴, 魏波華, 應亦林, 梁慧欣 申請人:上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院