一種Y染色體微缺失檢測試劑盒的製作方法

2023-10-27 23:31:03

本發明涉及染色體缺失檢測領域，尤其涉及一種Y染色體微缺失檢測試劑盒。

背景技術：

據估計不育症困擾著世界上超過10％的育齡夫婦,其中男性因素佔了一半。引起男性不育的病因有很多,包括感染、生殖器官畸形、免疫功能異常、精索靜脈曲張、勃起機能障礙、藥物損傷以及染色體異常等。男性不育常伴隨著精子數量減少,國內學者已對其進行了大量相關研究。Y染色體長臂無精子症因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失是導致男性生精障礙主要的遺傳學因素之一。研究表明,亞洲地區男性不育患者中AZF微缺失的發生率在2％～19.4％之間,與研究對象納入標準、序列標籤位點(Sequence Tag Site，STS)的選擇、人群分布及遺傳背景有關。AZF區微缺失的患者極少有自然生育能力,但近年來睪丸取精(Testicular sperm extraction,TESE)和卵母細胞質內單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技術的發展,給無精子症、少精子症患者能夠生育帶來了希望,但也增加了將微缺失傳遞給下一代的風險。因此,對男性不育患者儘早進行Y染色體微缺失篩查有著重要意義,不僅可以明確患者真正病因,避免不必要的檢查及無效的治療,還可預知或者防止遺傳缺陷的傳遞。Y染色體微缺失一般在染色體核型分析時不易發現，目前主要通過AZF區域的序列標籤位點來診斷，根據歐洲男科協會建議的六個STS位點進行Y染色體微缺失的分析，即AZFa亞區sY84和sY86位點，Y染色體AZFb亞區sY127和sY134位點，Y染色體AZFc亞區sY254和sY255位點，對上述位點的分析，Y染色體微缺失的檢測準確率可以達到95％。

目前應用於檢測Y染色體微缺失的技術主要為通過PCR方法對Y染色體AZF區域的序列標籤位點進行特異性擴增，再用電泳或Southern blot雜交等方法對PCR產物進行檢測，這兩種檢測方法雖技術成熟，但同時也都存在缺陷，電泳檢測的方法準確率不高、靈敏度低，Southern blot雜交方法耗時耗力、成本較高且操作繁瑣。

技術實現要素：

為解決上述技術問題，本發明提供一種Y染色體微缺失檢測試劑盒。

本發明提供一種Y染色體微缺失檢測試劑盒，所述試劑盒包括盒體1、海綿襯墊2，所述的海綿襯墊2置於盒體1內，海綿襯墊2上設有多個容器孔並裝有多個裝有檢測試劑的試劑管，分別為裝有PCR反應液I的試劑管3、裝有PCR反應液II的試劑管4、裝有陽性對照的試劑管5、裝有陰性對照的試劑管6，裝有空白對照的試劑管7。

本發明根據歐洲男科協會建議的六個STS位點和SRY及ZFY內參基因設計特異性引物和探針，通過Taqman螢光PCR法對其進行多重檢測，可以快速、準確地檢測Y染色體微缺失。

根據本發明的實施例，本發明提供一種用於Y染色體微缺失檢測的引物和探針，所述引物和探針包括8組，可同時擴增檢測Y染色體微缺失的六個STS位點和SRY及ZFY內參基因,所述引物探針組合包括用於檢測SY84位點的引物探針組合、用於檢測SY86位點的引物探針組合、用於檢測SY127位點的引物探針組合、用於檢測SY134位點的引物探針組合、用於檢測SY254位點的引物探針組合、用於檢測SY255位點的引物探針組合、用於檢測SRY內參基因的引物探針組合以及用於檢測ZFY內參基因的引物探針組合。

所述的該試劑盒中反應液分為反應液I和反應液II，其中反應液I中含有檢測SY84位點、SY127位點、SY255位點、SRY和ZFY基因的引物探針組合，其中反應液II中含有SY86位點、SY134位點、SY254位點、SRY和ZFY基因的引物探針組合。

所述的PCR反應液I和PCR反應液II中SRY和ZFY基因的引物探針組合用於質控。

所述的PCR反應液I和PCR反應液II中用於檢測SY84位點、SY86位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY基因的引物濃度均為200nM，探針濃度均為100nM，用於檢測SY127位點、SY134位點的引物濃度均為200nM，探針濃度均為300nM。

所述的PCR反應液I和PCR反應液II中還包含有MgCL2、Taq酶、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、UDG酶、10×PCR Buffer。

所述的MgCL2反應終濃度為4.5mM。

所述的Taq酶反應終濃度為5U。

所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反應終濃度為0.5mM。

所述的UDG酶反應終濃度為0.3U。

所述的10×PCR Buffer反應終濃度為1×PCR Buffer。

進一步的本發明採用Taqman螢光探針PCR技術對Y染色體微缺失進行五重螢光檢測。

本發明的有益效果是：本試劑盒和方法採用實時螢光定量PCR結合Taqman探針對Y染色體微缺失SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點進行多重螢光檢測，內參基因SRY和ZFY基因檢測的加入可有效控制本發明試劑盒和方法對Y染色體微缺失檢測結果的有效性，該方法操作簡單、檢測通量高、快速、靈敏度高且特異性強，可有效縮短檢測周期和成本。

附圖說明

圖1為本發明的Y染色體微缺失檢測試劑盒結構示意圖；

圖2為PCR反應液I中SY84、SY127、SY255位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖3為PCR反應液II中SY86、SY134、SY254位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖4為PCR反應液I中SY127、SY255位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖5為PCR反應液II中SY134、SY254位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖6為PCR反應液I中SY84、SY255位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖7為PCR反應液II中SY86、SY254位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖8為PCR反應液I中SY84、SY127位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線；

圖9為PCR反應液II中SY86、SY134位點和SRY、ZFY基因的擴增曲線。

具體實施方式

本發明提供一種Y染色體微缺失檢測試劑盒，如圖1所示，所述試劑盒包括盒體1、海綿襯墊2，所述的海綿襯墊2置於盒體1內，海綿襯墊2上設有多個容器孔並裝有多個裝有檢測試劑的試劑管，分別為裝有PCR反應液I的試劑管3、裝有PCR反應液II的試劑管4、裝有陽性對照的試劑管5、裝有陰性對照的試劑管6，裝有空白對照的試劑管7。

本發明採用五重螢光PCR方法分兩管對Y染色體微缺失進行檢測，檢測位點包括SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點，其中PCR反應液I檢測位點為SY84位點、SY127位點、SY255位點和SRY以及ZFY內參基因，其中PCR反應液II檢測位點為SY86位點、SY134位點、SY254位點、SRY和ZFY內參基因，陽性對照採用正常已育男性DNA樣本，陰性對照採用女性DNA樣本，空白對照採用滅菌水以防止體系被汙染。

所述的SY84位點、SY86位點引物探針組合用於檢測Y染色體AZFa區域是否存在缺失情況。

所述的SY127位點、SY134位點引物探針組合用於檢測Y染色體AZFb區域是否存在缺失情況。

所述的SY254位點、SY255位點引物探針組合用於檢測Y染色體AZFc區域是否存在缺失情況。

所述的SRY和ZFY基因的引物探針組合用於質控，檢測反應體系即過程是否正常及檢測結果可使用性。

所述的PCR反應液I和PCR反應液II中用於檢測SY84位點、SY86位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY基因的引物濃度均為200nM，探針濃度均為100nM，用於檢測SY127位點、SY134位點的引物濃度均為200nM，探針濃度均為300nM。

所述的PCR反應液I和PCR反應液II中還包含有MgCL2、Taq酶、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、UDG酶、10×PCR Buffer。

所述的MgCL2反應終濃度為4.5mM。

所述的Taq酶反應終濃度為5U。

所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反應終濃度為0.5mM。

所述的UDG酶反應終濃度為0.3U。

所述的10×PCR Buffer反應終濃度為1×PCR Buffer。

本發明所述的Y染色體微缺失檢測包括以下步驟：

1.基因組DNA的提取：可通過柱式提取方法或Chelex法對EDTA抗凝全血或口腔拭子等來源的樣本進行DNA提取。

2.螢光PCR擴增檢測：所述的多重螢光PCR擴增檢測包括本發明的PCR反應液I和PCR反應液II同時對待檢樣本DNA和陽性對照、陰性對照以及空白對照進行擴增檢測。

3.PCR擴增檢測反應條件：37℃5min；95℃5min；95℃15S，60℃60S,40cycles。

4.結果分析：根據擴增曲線的有無判斷對應的SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點有無缺失。

實施例1

1.基因組DNA的提取：常規柱式提取方法或Chelex法提取200μl抗凝全血DNA作為模板。

2.螢光PCR擴增檢測：以PCR反應液I和PCR反應液II同時對樣本DNA和陽性對照、陰性對照以及空白對照進行擴增檢測，其中PCR反應液I和PCR反應液II中用於檢測SY84位點、SY86位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY基因的引物濃度均為200nM，探針濃度均為100nM，用於檢測SY127位點、SY134位點的引物濃度均為200nM，探針濃度均為300nM。MgCL2反應終濃度為4.5mM,Taq酶反應終濃度為5U,dUTP、dATP、dCTP、dGTP反應終濃度為0.5mM,UDG酶反應終濃度為0.3U,10×PCR Buffer反應終濃度為1×PCR Buffer，樣本基因組DNA、陽性對照、陰性對照、空白對照均加入5μl，加去離子水補足體積至50μl。引物探針信息如下：

SY84上遊引物為5』-AGGCAGACACTAAAGAAAGGGTCCCA-3』

SY84下遊引物為5』-AAAGAGAAGGGTCCTGAAAGCA-3』

SY84探針為5』-JOE-AGGCAAGCCCTTGAGCAAATTCCCT-BHQ1-3』

SY86上遊引物為5』-GTGACACACAGACTATGCTTC-3』

SY86下遊引物為5』-ACACACAGAGGGACAACCCT-3』

SY86探針為5』-JOE-TACAAAGAAATCCCAAAGACTGGGCCCCT-BHQ1-3』

SY127上遊引物為5』-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3』

SY127下遊引物為5』-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3』

SY127探針為5』-TAMRA-CAGCTTGTTTCCTTATATGGGTGAGCCAGAT-BHQ2-3』SY134上遊引物為5』-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3』

SY134下遊引物為5』-CATCATGCTATGCACTTCAGAAACT-3』

SY134探針為5』-TAMRA-AACATCTGGAACATTCTACTTGAAGCGTTCTGT-BHQ2-3』

SY254上遊引物為5』-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3』

SY254下遊引物為5』-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3』

SY254探針為5』-FAM-TCATGAACAATGGGATGTGGGCCCTGT-3』

SY255上遊引物為5』-TGCTGAGTTACAGGATTCGGC-3』

SY255下遊引物為5』-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3』

SY255探針為5』-FAM-CGCAGACGTTCTGAAACTGTGGTGGAGGA-3』

SRY基因上遊引物為5』-CCTTCCTTTGCACTGAAAGCTGTA-3』

SRY基因下遊引物為5』-ATTCTGGGATTCTCTAGAGCCATCT-3』

SRY基因探針為5』-ROX-AACGTCCAGGATAGAGTGAAGCGACCCA-3』

ZFY基因上遊引物為5』-AAGTTTACATAACCACCTGGAGAGC-3』

ZFY基因下遊引物為5』-CCACACTCCACACAAATATGAGGAA-3』

ZFY基因探針為5』-CY5-CGCCACCTCTTGGCAGTCCACAGCAA-3』

PCR擴增檢測反應條件：37℃5min；95℃5min；95℃15S，60℃60S,40cycles。

3.結果分析：

(1)檢測結果可用條件：PCR反應液I和PCR反應液II中待檢樣本和陽性對照內參基因SRY和ZFY均可檢測出螢光信號，曲線拐點清楚，陽性對照SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點均可檢測出螢光信號，曲線拐點清楚,陰性對照只有ZFY基因有擴增信號，空白對照無擴增信號。所有擴增檢測曲線Ct值應處於17至32之間為正常，否則實驗失敗。

(2)對不同檢測通道設置不同顏色，並根據不同通道擴增檢測結果判定相應位點是否存在缺失情況。

圖2和圖3為正常男性樣本檢測結果，其中SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY內參基因均有擴增曲線，陰性對照和空白對照無擴增曲線，陽性對照各檢測通道均有擴增曲線，表明該樣本檢測成功，檢測過程無汙染，該樣本無Y染色體微缺失。

圖4和圖5為一不育男性樣本，其中SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY內參基因均有擴增曲線，陰性對照和空白對照無擴增曲線，陽性對照各檢測通道均有擴增曲線，表明該樣本檢測成功，檢測過程無汙染，該樣本Y染色體存在SY84位點、SY86位點微缺失，其中圖4顯示SY84位點缺失,圖5顯示SY86位點缺失。

圖6和圖7為一不育男性樣本，其中SY84位點、SY86位點、SY254位點、SY255位點、SRY和ZFY內參基因均有擴增曲線，陰性對照和空白對照無擴增曲線，陽性對照各檢測通道均有擴增曲線，表明該樣本檢測成功，檢測過程無汙染，該樣本Y染色體存在SY127位點、SY134位點微缺失，其中圖6顯示SY127位點缺失，圖7顯示SY134位點缺失。

圖8和圖9為一不育男性樣本，其中SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SRY和ZFY內參基因均有擴增曲線，陰性對照和空白對照無擴增曲線，陽性對照各檢測通道均有擴增曲線，表明該樣本檢測成功，檢測過程無汙染，該樣本Y染色體存在SY254位點、SY255位點微缺失，其中圖8顯示SY254位點缺失，圖9顯示SY255位點缺失。

本發明的目的在於提供一種結合Taqman探針的多重螢光PCR方法對Y染色體微缺失進行檢測的試劑盒和方法。實時螢光PCR通過對模板的擴增並對每一擴增循環產生的螢光信號進行收集，從而實現對起始模板的定量及定性分析。本發明通過兩組反應液即PCR反應液I和PCR反應液II對SY84位點、SY86位點、SY127位點、SY134位點、SY254位點、SY255位點進行定性檢測，PCR反應液I和PCR反應液II均同時檢測SRY和ZFY內參基因作為質控，以正常男性樣本作為陽性對照，以女性樣本作為陰性對照，滅菌水作為空白對照以檢測體系是否汙染現象。

在此說明書中，本發明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發明的精神和範圍。因此，說明書和附圖應被認為是說明性的而非限制性的。