木酚素類化合物用於治療或預防炎症性疾病的用途的製作方法

2023-10-27 06:25:17

專利名稱：木酚素類化合物用於治療或預防炎症性疾病的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及木酚素類化合物用於治療或預防炎症性疾病的用途。更具體地說，本發明涉及用於治療或預防炎症性疾病的藥物組合物、利用該組合物治療炎症性疾病的治療方法及用途，所述組合物含有通式I表示的木酚素類化合物。

背景技術：
炎症反應是指在組織(細胞)損傷或受外部感染源感染時發生的，在局部血管與體液內顯現出的酶活化、炎症介質物質分泌、體液浸潤、細胞移動、組織破壞等的一系列綜合的生理反應以及紅斑、浮腫、發熱、疼痛等的外部症狀，其中涉及各種炎症介質因子及免疫細胞。進一步地，其結果會導致急性炎症與肉芽腫、以及諸如類風溼性關節炎、骨關節炎等的慢性炎症(Goodwin J.S.et al.，J.Clin.Immunol.，9295-314，1989)。
在對血液凝固以及炎症產生重要影響的酶中，環氧化酶(以下稱作「COX」)起到了重要的作用，COX生成前列腺素以及血栓素兩種主要產物。前列腺素是具有極其多樣的生理活性的不飽和脂肪酸，作為人體內的局部的荷爾蒙或細胞功能調節因子而起作用，例如炎症及疼痛傳達、血管擴張、體溫調節、胃液分泌促進等(Marnett，L.J.et al.，J.Biol.Chem.，27422903-22906，1999)。COX-1通過維持諸如胃腸管保護、腎臟的血流調節及血小板凝集等正常生理反應，對細胞的正常維持起到重要的作用。另一方面，在受外部刺激而誘發的炎症的傳導過程中，可誘導的同工酶COX-2暫時表達而在產生炎症的部位釋放過量的前列腺素。前列腺素能引起作為炎症的主要症狀的紅斑、浮腫及疼痛，具有將作為內因性炎症介質物質的組胺等的作用增強的活性，因而抑制炎症部位中的前列腺素的生成在炎症治療中有很大的作用。
現在，商業上使用的作為非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的阿司匹林(aspirin)、吲哚美辛(indomethacin)、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)等，是通過抑制COX-2酶的活性來阻礙前列腺素的生成，從而顯示出抗炎效果(Meade E.A.et al.，J.Biol.Chem.，2686610，1993)。但是，這些NSAID藥物不僅抑制由於炎症刺激而暫時表達的COX-2，也抑制對胃腸管、腎臟血小板的正常功能的維持起重要作用的COX-1，因而有導致胃腸管出血、腎臟功能不全等的嚴重副作用的問題(Surh Y.J.et al.，Mutation Research 480-481243-268，2001)。因此，從天然物中發掘使副作用最小化、同時提供抗炎症作用的物質，在產業上及其重要。
另一方面，木酚素(lignan)是n-苯基丙烷在n-丙基側鏈的β位上結合而成的天然化合物的總稱，廣泛分布在自然界中。已針對木酚素的降血糖作用、抗癌作用、抗喘息作用、美白作用等的多種生理學活性進行了研究。例如，已報導了作為從芝麻分離出的木酚素的芝麻素(sesamin)、異芝麻素(episesamin)、芝麻素酚(sesaminol)、芝麻林素(sesamolin)及異芝麻素酚(episesaminol)具有抗炎症效果(韓國公開專利公報第1997-7001043號)；此外，還公開了從辛夷(白木蓮)(Magnoliae flos)分離出的木酚素類化合物能夠作為抗喘息劑使用(韓國註冊專利第0263439號)。進一步地，已報導了肉豆蔻木酚素(macelignan)，其是從肉豆蔻(Myristica fragrans)中發現的代表性的木酚素類化合物(Tuchinda P.etal.，Phytochemistry，59169-173，2002)，其具有對誘導細胞凋亡的caspase(天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶)-3的增強作用(Park B.Y.et al.，Biol.Pharm.Bull.，27(8)1305-1307，2004)及抗氧化作用(Sadhu，S.K.et al.，Chem.Pharm.Bull.，51(9)595-598，2003)。但是，對於包括上述肉豆蔻木酚素的木酚素類化合物的抗炎症活性，至今還沒有報導過。


發明內容
發明要解決的課題 本發明人為了尋找具有抗炎症活性的來自天然物質的化合物，進行了長期的探索，其結果發現從肉豆蔻提取物中分離純化的木酚素類化合物呈現出卓越的抗炎症活性，從而完成了本發明。
本發明的目的是，提供木酚素類化合物治療或預防炎症性疾病的用途。
解決課題的方法 為了達到上述目的，本發明提供一種治療或預防炎症性疾病的藥物組合物，該藥物組合物包含由下述通式I表示的木酚素類化合物或其藥學上可接受的鹽的有效成分。


通式I 式中，R1及R2獨立地是C1-5烷氧基或羥基；R3是

或
進一步地，本發明提供一種通過施用有效量的由上述通式I表示的木酚素類化合物或其藥學上可接受的鹽而預防或治療炎症性疾病的方法。
進一步地，本發明提供一種由上述通式I表示的木酚素類化合物用於製造預防或治療炎症性疾病的藥物組合物的用途。
本發明中，「有效量」是指本發明的木酚素類化合物能夠有效地治療作為使用對象的受試者體內的炎症性疾病的量。
進一步地，本發明中，「受試者(subject)」是指哺乳動物，特別是包括人類在內的動物。上述受試者也可以是需要治療的患者。
下面，詳細說明本發明。
本發明的特徵在於提供從肉豆蔻提取物中分離純化的木酚素類化合物的新用途。
本發明的木酚素類化合物由下述通式I表示

通式I 其中，R1及R2獨立地是C1-5烷氧基或羥基；R3是

或
優選本發明的木酚素類化合物可以為上述R1是甲氧基、R2是羥基、R3是
的由下述式1表示的肉豆蔻木酚素[(8R，8』S)-7-(3，4-亞甲基二氧苯基)-7』-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-8，8』-二甲基丁烷)]

式1 本發明的木酚素類化合物，可以以鹽的形式，優選為藥學上可接受的鹽的形式使用。上述鹽優選為由藥學上可接受的游離酸形成的酸加成鹽。上述游離酸可使用有機酸及無機酸。所述有機酸包括檸檬酸、醋酸、乳酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟醋酸、安息香酸、葡萄糖酸、甲磺酸、羥基乙酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、穀氨酸及天門冬氨酸，但並不限制於此。另外，所述無機酸包括鹽酸、溴酸、硫酸及磷酸，但並不限制於此。
本發明的木酚素類化合物，可利用通常的提取和分離物質的方法從植物或植物的一部分獲得。對莖、根或葉進行適宜的脫水、浸漬，或僅僅脫水以獲得所需的提取物，然後利用本發明所屬技術領域的技術人員公知的純化方法進行純化。進一步地，對應於上述通式I表示的木酚素類化合物的合成化合物或它們的衍生物，一般為可商購的物質，或可利用公知的合成方法製造而得到。
上述由通式I表示的本發明的木酚素類化合物，可從肉豆蔻(Myristica fragnance Houtt.)中分離純化而得到(Jung Yun Lee etal.，Kor.J.Pharmacogn.21(4)270-273，1990；Masao Hattori et al.，Chem.Pharm.Bull.，34(9)3885-3893，1986；Masao Hattori et al.，Chem Pharm.Bull.，35(2)668-674，1987)。優選地，可從核仁(nutmeg)或假種皮(aril)中分離純化而得到。上述核仁，是指肉豆蔻的成熟的果實或果實中的種子。進一步地，本發明的木酚素類化合物，可從壓榨核仁而得到的油中分離純化而得。進一步地，也可從肉豆蔻科的另一種植物長形肉豆蔻(Myristica argentea Warb)等中分離純化而得(Filleur，F.et al.，Natural Product Letters，161-7，2002)。或，也可以從紅楠(Machilus thunbergii)(Park B.Y.et al.，Biol.Pharm.Bull.，27(8)1305-1307，2004)、蜂巢草(Leucas aspera)中分離純化而得(Sadhu，S.K.et al.，Chem.Pharm.Bull.，51(9)595-598，2003)。
用於分離本發明的木酚素類化合物的提取溶劑可以是水或C1-C6的有機溶劑。優選地，可單獨使用或混合使用的提取溶劑包括純化水、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、乙醚、苯、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷、環己烷、石油醚等。更優選地，可使用甲醇或己烷。從肉豆蔻提取物中分離純化本發明的木酚素類化合物時，可單獨或組合使用填充有矽膠或活性氧化鋁等各種合成樹脂的柱色譜及高效液相色譜(HPLC)等。但是，有效成分的提取及分離純化方法，並不限制於使用上述方法。
如上所述，本發明的木酚素類化合物，可以以純的分離純化的化合物的形式使用，也可直接以含有該化合物的提取物的形式使用。例如，也可以以如上述記載的肉豆蔻的種子、果實或假種皮的提取物形式或壓榨肉豆蔻的種子得到的油的形式使用。如上所述，上述提取物可用水或C1-C6有機溶劑對肉豆蔻進行提取而得到。優選地，也可以是肉豆蔻的種子，即核仁的提取物。
本發明的木酚素類化合物通過抑制作為炎症反應的介質的多種物質而具有抗炎症活性。
NO作為與神經傳達、血管舒張及細胞介質性免疫反應有關的物質，通過NOS(一氧化氮合成酶)從L-精氨酸生成(Nathan and Xie，1994；Aldertonet al.，2001)。特別地，當巨噬細胞被IFN-γ或LPS(內毒素)刺激時，iNOS(誘導型一氧化氮合成酶)被表達，通過上述iNOS生成大量的NO。本發明的木酚素類化合物，能夠濃度依賴性地抑制巨噬細胞內NO的生成及參與NO生成的iNOS的表達(參照圖8及圖9)。
進一步地，COX-2作為與體內的炎症反應有關的物質，產生致炎性PG。COX-2的表達通過細菌類分泌的內毒素LPS以及炎症性細胞活素類IL-1、TNF-α、IFN-γ等誘導。本發明的木酚素類化合物不僅抑制COX-2的表達，而且也濃度依賴性地抑制PG類之一的PGE2(前列腺素E2)的生成(參照圖10及圖11)。
腫瘤壞死因子TNF-α是革蘭陰性菌與其它感染性微生物引發的急性炎症反應的主要的介質因子。被LPS刺激的巨噬細胞增強TNF-α的合成。TNF-α的生物學作用是在低濃度時作用於白細胞與內皮細胞而引發急性炎症；中等濃度時，其介導全身炎症反應；高濃度時，其由於導致敗血症休克的病理學異常而引起死亡。進一步地，TNF-α增強PG的合成而產生熱量，抑制凝血酶調節蛋白(trombomodulin)的表達，導致血管堵塞(Abbas andLichtman，″Cellular and Molecular Immunology″the fifth edition.pp.247-253，2003)。本發明的木酚素類化合物具有抑制巨噬細胞和人類單核細胞中TNF-α的生成的效果(參照圖12及圖13)。
進一步地，通過TPA(佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate))處理誘發浮腫的大鼠的耳朵局部塗布本發明的木酚素類化合物，其結果表明能夠濃度依賴性地抑制浮腫生成率，比現在可商購獲得的抗炎劑吲哚美辛呈現出更高的浮腫抑制率(參照表2)。進一步地，製造含有木酚素類化合物的乳膏，並將其局部塗敷在大鼠的耳朵上，其結果表明能夠抑制浮腫生成率(參照表4)。
另一方面，本發明人等，在通過對TPA處理誘發浮腫的大鼠的耳朵局部塗布肉豆蔻提取物(甲醇及己烷粗提物)，其結果表明能夠確認可濃度依賴性地抑制浮腫生成率(參照表5)。
如上所述的結果意味著本發明的木酚素類化合物不僅抑制COX-2，也抑制作為炎症反應介質的多種因子，呈現出卓越的抗炎症作用。進一步地，結果表明肉豆蔻提取物本身也能夠得到相同的抗炎症效果。如上述的由通式I表示的本發明的木酚素類化合物及肉豆蔻提取物的抗炎症活性，是本發明首先發現的。
相對於現在產業上使用的非甾體類抗炎藥大部分都是抑制了COX-2酶的活性而表現出抗炎症效果，能夠確認本發明的木酚素類化合物可作為比以往的抗炎症劑具有更優異的效果的抗炎症劑來使用。
因此，本發明提供一種治療或預防炎症性疾病的藥物組合物，該藥物組合物含有作為活性成分的由上述通式I表示的木酚素類化合物、其藥學上可接受的鹽。進一步地，本發明提供一種治療或預防炎症性疾病的藥物組合物，該藥物組合物含有作為有效成分的肉豆蔻提取物。上述肉豆蔻提取物的製造如上所述。
進一步地，本發明提供一種治療或預防炎症性疾病的方法，該方法將有效量的由通式I表示的木酚素類化合物或其藥學上可接受的鹽施用於所需受試者。
進一步地，本發明提供由通式I表示的木酚素類化合物在製造治療或預防炎症性疾病的藥物組合物中的用途。
本發明的木酚素類化合物或其藥學上可接受的鹽，在臨床使用時，可以口服或胃腸外給藥的形式使用，可以以一般的藥物製劑的形式使用。以一般的藥物製劑的形式進行製劑化時，可採用通常使用的填充劑、增稠劑、粘結劑、溼潤劑、崩解劑、表面活性劑等稀釋劑或賦形劑進行調製。用於口服的固體製劑包括片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、膠囊等，如上所述的固體製劑，是在上述木酚素類化合物或肉豆蔻提取物中混合至少一種以上的賦形劑例如澱粉、炭酸鈣、蔗糖或乳糖、凝膠等製成。進一步地，除單純的賦形劑以外，也可以使用硬脂酸鎂或滑石粉等潤滑劑。用於口服的液體製劑，包括混懸劑、液體、乳劑、糖漿等。液體製劑除了廣泛使用的單純的稀釋劑如水、液體石蠟以外還包括各種賦形劑，例如溼潤劑、甜味劑、芳香劑、防腐劑等。用於胃腸外給藥的藥物製劑包括滅菌的水溶液、非水溶液、混懸劑、乳劑、凍幹製劑、軟膏、乳膏。非水溶液和混懸液可使用丙二醇、聚乙二醇、橄欖油等的植物油、油酸乙酯等的可注射酯等製備。
進一步地，本發明的木酚素類化合物或其藥學上可接受的鹽，可採用胃腸外給藥途徑給藥，如可採用皮下注射、靜脈注射、肌肉注射或腹內注射方式。製備胃腸外給藥製劑時，將上述通式I的木酚素類化合物或肉豆蔻提取物與穩定劑或緩衝劑一起在水中混合製成溶液或混懸液，然後將其製成存在於安剖或小瓶中的單位劑型。劑量單位可含有，例如單獨劑量的1、2、3或4倍，或1/2、1/3或1/4倍。單獨劑量，優選含有有效藥物的一次給藥量，這相當於通常一天給藥量的全部、1/2、1/3或1/4倍。
本發明的由通式I表示的木酚素類化合物或肉豆蔻提取物的有效劑量為0.1-50mg/kg，優選為1-10mg/kg，可一天服用1～3次。對特定患者的給藥量基準，也可根據患者的體重、年齡、性別、健康狀態、飲食、給藥時間、給藥方法、排洩率、疾病的嚴重程度等變化。
大鼠口服本發明的木酚素類化合物時的毒性實驗的結果，顯示了口服毒性試驗的50％致死量(LD50)為2,000mg/kg以上。
特別是，含有本發明的木酚素類化合物或肉豆蔻提取物的藥物組合物，能夠製成皮膚塗布用劑型，即軟膏、乳膏的形式，相對於製劑總重量，可根據劑型在0.001-10.0重量％，優選為0.005-5.0重量％的範圍內適宜配製。當添加量低於0.005重量％時，抗炎症活性降低，當添加量超過10.0重量％時，只是添加量增多而抗炎症活性沒有大的差別。
本發明中的炎症性疾病，是指因NO、iNOS、COX-2、PGE2、TNF-α等引起一系列炎症反應的多種刺激因素而誘發的炎症疾病。上述炎症性疾病包括，例如浮腫等一般性炎症症狀、炎症性腸病、腹膜炎、骨髓炎、蜂巢炎、胰腺炎、創傷性休克、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、囊性纖維化、急性支氣管炎、慢性支氣管炎、急性細支氣管炎、慢性細支氣管炎、骨關節炎、痛風、脊柱關節病、強直性脊柱炎、賴特爾綜合症、乾癬性關節病變、與炎症性腸病相關的脊柱炎、幼年關節病、幼年強直性脊柱炎、反應性關節炎、感染性關節炎、感染後關節炎、淋菌性關節炎、結核性關節炎、病毒性關節炎、真菌性關節炎、梅毒性關節炎、萊姆病、與「血管炎綜合症」相關的關節炎、結節性多動脈炎、過敏性血管炎、Luegenec’s肉芽腫症(Luegenec’sgranulomatosis)、風溼性多肌痛、關節細胞動脈炎、鈣結晶沉積性關節病、假痛風、非關節性風溼症、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎(網球肘)、神經性關節病(neuropathic joint disease)、關節血腫(hemarthrosic)、過敏性紫癜(Henoch-Schonlein Purpura)、肥大性骨關節病、多中心網狀組織細胞瘤、脊柱側凸、血色病、血紅蛋白病、高脂蛋白血症、低丙種球蛋白血症、家族性地中海熱、白塞氏病(Behat’s disease)、系統性紅斑狼瘡、回歸熱、多發性硬化症、敗血症、敗血症性休克、急性呼吸窘迫綜合症、多器官衰竭、慢性阻塞性肺疾病、類風溼性關節炎、急性肺損傷、支氣管肺發育不良，但並不限制於此。進一步地，也包括急性和慢性溼疹、接觸性皮炎、異位性皮炎、脂溢性皮炎、剝脫性皮炎、日光性皮炎、銀屑病等炎症性皮膚病。



圖1是從肉豆蔻(Myristica fragrans)分離木酚素類化合物的流程圖。
圖2是本發明的木酚素類化合物的13C-NMR譜圖。
圖3是本發明的木酚素類化合物的1H-NMR譜圖。
圖4是本發明的木酚素類化合物的1H-1H COSY譜圖。
圖5是本發明的木酚素類化合物的1H-13C HMBC譜圖。
圖6是本發明的木酚素類化合物的EI-Mass譜圖。
圖7顯示了本發明的木酚素類化合物的細胞毒性效果。
圖8顯示了本發明的木酚素類化合物抑制NO生成的效果。
圖9顯示了本發明的木酚素類化合物抑制iNOS表達的效果。
A免疫印跡分析結果。
B相對於LPS刺激的對照群的iNOS蛋白水平圖。
圖10顯示了本發明的木酚素類化合物(A)及薑黃素(B)抑制PGE2生成的效果。
圖11顯示了本發明的木酚素類化合物抑制COX-2表達的效果。
A免疫印跡分析結果。
B相對於LPS刺激的對照群的COX-2蛋白水平圖。
圖12顯示了本發明的木酚素類化合物(A)及薑黃素(B)抑制用LPS刺激的巨噬細胞生成TNF-α的效果。
圖13顯示了本發明的木酚素類化合物(A)及吲哚美辛(B)抑制痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)刺激的人類單核細胞U937細胞生成TNF-α的效果。
本發明的最佳實施方式 以下，通過實施例詳細地說明本發明。
其中，下述實施例僅用於示例本發明，本發明的內容並不限於下述實施例。而且，在下述實施例及實驗例中，百分含量沒有特別表明是體積％的時候，則表示重量％。進一步地，所有的活性分析，都重複進行3次以上，其結果用平均值±標準偏差來表示。另外，統計分析是利用Students’s t-test來進行的，p＜0.05時判定為具有統計學上的顯著性。
實施例1 從肉豆蔻分離及純化木酚素類化合物 木酚素類化合物的分離及純化 向乾燥粉碎的核仁100g(乾燥重量)中添加75體積％、400ml的甲醇，常溫下放置2天。利用Whatman 2號濾紙過濾上述溶液。重複2次上述過程。真空濃縮甲醇濾液，並冷凍乾燥，製得核仁的甲醇粗提物(7g)。依次用乙酸乙酯、丁醇、水對甲醇粗提取物進行分級分離，得到乙酸乙酯分級物(4.2g)。利用矽膠柱色譜(Merck Kieselgel 66；70-230目)，用己烷與乙酸乙酯以10∶1(v/v)的比例混合成的溶劑洗脫乙酸乙酯分級物，得到分級物III(1.0g)。用真空旋轉濃縮器，完全除去溶劑，製得核仁的粗提物。接下來，利用矽膠柱色譜(Merck Kieselgel 66；70-230目)，用己烷與乙酸乙酯以20∶1(v/v)的比例混合的溶劑洗脫分級物III，得到分級物III-B(0.52g)。利用Rp-18柱色譜(Merck LiChroprep；25-40μm)，用80％甲醇洗脫分級物III-B，得到單一物質分級物III-B-2(0.5g)。將如上所述的分離工序示於圖1中。
結構分析 為了確定上述分離的單一物質III-B-2的結構，分別於600MHz、150MHz(溶劑DMSO)下測定了1H-NMR譜與13C-NMR譜。將其結果分別示於圖2及圖3中。為了確定基於13C-NMR譜與1H-NMR譜結果的1H-1H相互關係以及1H-13C相互關係，測定了1H-1H COSY譜與1H-13C HMBC譜。將其結果分別示於圖4及圖5中。對1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY及1H-13C HMBC結果綜合分析，並示於表1中。
表1 質量分析 為了對上述分離的單一物質進行質量分析而測定的EI/MS的結果示於圖6中。該化合物的EI/MS在m/z 328時觀察到[M]+，判斷其分子量為328，分子式為C20H24O4。
將上述的1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、1H-13C HMBC及EI/MS的結果與已經發表的研究報告(Woo，W.S.et al.，Phytochemistry，261542-1543，1987)進行比較分析所鑑定的結果，可確認分離出的單一物質為用下述式1表示的肉豆蔻木酚素(macelignan)。


式1 實施例2 本發明的木酚素類化合物的細胞毒性效果的調查 RAW264.7細胞系的培養 為了調查上述實施例1得到的肉豆蔻木酚素對炎症反應介質物質的生成產生的影響，使用了巨噬細胞RAW264.7細胞。巨噬細胞RAW264.7細胞是使用從American Tissue Culture Collection(ATCC TIB TIB-71，Rockville，MD，USA)購買的產品。在補充有熱失活的10％FBS(胎牛血清，Gibco，USA)、100U/ml盤尼西林G及100μm/ml鏈黴素的DMEM(Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium，Gibco，USA)培養基上，在含有5％CO2的37℃的培養器中培養上述細胞系。
細胞毒性的測定 為了調查本發明的肉豆蔻木酚素對RAW264.7細胞的存活率產生的影響，通過線粒體脫水素酶使MTT還原成紫色甲月替(formazan)生成物為基礎進行分析(Hayon T.et al.，Leuk.Lymphoma.44(11)1957-1962，2003)。將1×106細胞/ml的RAW264.7細胞接種到RPMI 1640培養基，6小時後，用本發明的肉豆蔻木酚素以1～80μM/ml的濃度處理所述細胞。24小時後，利用MTT分析法，測定細胞存活率。
其結果是，如圖7所示，本發明的肉豆蔻木酚素，在1-20μM的濃度時，對RAW264.7細胞的存活率沒有大的影響。基於上述結果，接下來的炎症實驗中，使用了1-20μM濃度的肉豆蔻木酚素。
實施例3 本發明的木酚素類化合物的NO抑制效果的調查 NO生成的抑制 被IFN-γ或LPS刺激的巨噬細胞高表達iNOS，生成大量的作為炎症反應介質的物質NO(Miyasaka and Hirata.，Immunol.Today.，16128-130，1995；Guzik et al.，J.Physiol.Pharmacol.，54(4)469-487，2003)。因而，調查了本發明的肉豆蔻木酚素對通過LPS活化的RAW264.7細胞內NO的生成所產生的影響。
將RAW264.7細胞稀釋至1×106細胞/ml的濃度後，接種至RPMI 1640培養基。5小時後，添加1～20μM的各濃度的本發明的肉豆蔻木酚素，然後培養2個小時。接下來，用LPS(10μg/ml)處理培養基，並培養24小時。對照群僅用LPS處理。NO的生成量，是利用細胞培養液、通過測定NO的反應產物NO2-的方法進行定量(Han et al.，Life Sci.，75(6)675-684，2004)。在96孔組織培養板上混合100μl培養液與相同體積的Greiss試劑(0.5％磺胺、0.05％N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽/2.5％H3PO4)，在常溫陰暗處反應10分種。接下來，利用ELISA酶標儀，測定試樣在550nm處的吸光度。NO2-的濃度是利用NaNO3製作標準曲線，與其進行比較測定NO的生成量。所有的試驗重複進行3次以上，利用student’s t-test，對其分別定量。
其結果是，如圖8所示，僅通過LPS處理，NO的生成被大幅地增強，並確認了通過本發明的肉豆蔻木酚素的處理，能夠濃度依賴性地抑制該增強。特別是，在1μM與5μM的低濃度下，也確認了抑制NO生成的效果優異(P＜0.01)。另外，用20μM肉豆蔻木酚素處理時，其抑制NO生成的程度達到與未經任何處理群近乎相似的程度。
iNOS表達的抑制 用LPS刺激巨噬細胞，iNOS被過量表達的同時生成大量的NO。因此，為了調查上述實施例中確認的本發明的肉豆蔻木酚素對NO生成的抑制與iNOS的關係，測定了上述肉豆蔻木酚素對iNOS的表達產生的影響。
溶解用本發明的肉豆蔻木酚素及LPS處理的RAW264.7細胞，用考馬斯亮蘭(Bradford assay)方法定量蛋白質。用10％SDS-PAGE分離蛋白質10μg，然後利用轉移溶液(轉移溶液；20％甲醇，25mM Tris，192mM氨基乙酸，pH8.3)將上述分離的蛋白質移至硝化纖維素膜上(Hall，Methods Mol.Biol.，261167-174，2004)。使SDS-聚丙烯醯胺凝膠與硝化纖維素膜緊密接觸，並裝入微型凝膠轉移試劑盒中。接下來，將樣品裝載到試劑盒中，在100V下電泳移動1小時。接下來，用TBST(Tris緩衝生理鹽水吐溫20，trisbuffered saline tween-20)溶液洗滌膜1次，將上述膜移至乾燥的濾紙上，在常溫下進行乾燥。為了除去非特異反應，用含有5％脫脂乳的TBST在4℃下充分振動24小時以上，然後放置。接下來，用TBST溶液洗滌膜3次，然後注入抗-iNOS抗體(1∶2,000)(Calbiochem)，在室溫下反應1小時。再次利用TBST溶液將膜洗滌3次，每次洗滌10分鐘。注入結合有HRP(辣根過氧化物酶)的抗-兔IgG-HRP(1∶2,000)(Calbiochem)，在震蕩器上反應1小時。接下來，再次用TBST溶液洗滌上述膜3次後，浸泡在ECL(增強化學發光)溶液中，在振動1分鐘的同時，使其全部被浸漬。上述ECL溶液的製造，是通過相同量地混合溶液A(含有發光氨與增強劑)與溶液B(含有過氧化氫)，振動1分鐘而製造。從上述ECL溶液取出上述膜，除去水分，在暗室中用X射線膠片掃描。
其結果是，如圖9所示，確認本發明的肉豆蔻木酚素能夠濃度依賴性地抑制巨噬細胞中的iNOS的表達，從5μM開始抑制效果顯著(P＜0.01)。從上述結果能夠確認本發明的肉豆蔻木酚素不僅抑制炎症誘發因子NO的生成，也抑制了生成該因子的iNOS的表達。
實施例4 本發明的木酚素類化合物的COX-2抑制效果的調查 PEG2生成的抑制 類似於iNOS同炎症反應密切相關，COX-2是作為炎症反應介質的PG類生成中必須的酶，已知iNOS與COX的表達及活性相互關聯(Surh et al.，Mutat.Res.，481243-268，2001)。因此，調查了本發明的肉豆蔻木酚素對LPS活化的巨噬細胞的PGE2的生成產生的影響。
首先，將1×106細胞/ml的RAW264.7細胞接種至96孔組織培養板上，常溫下放置5小時。接下來，分別添加1～20μM濃度的本發明的肉豆蔻木酚素，培養2小時。在陰性對照群中，不進行任何處理；陽性對照群中，進行已報導過的具有PGE2抑制活性的薑黃素(curcumin)(是從薑黃(Curcumalonga)分離的物質，Sigma社製造)處理。接下來，用1μg/ml的LPS處理細胞，並培養18小時。利用檢測試劑盒(R&D System Inc，Minneopolis，USA)，用ELISA法定量巨噬細胞中的PGE2的生成量(Chen et al.，Biochem.Pharmacol.，681089-1100，2002)。
其結果是，如圖10所示，通過LPS單獨處理時PGE2被大量生成，能夠確認通過本發明的肉豆蔻木酚素的處理，可濃度依賴性地抑制該生成。其抑制效果即使在5μM時也能表現出來。如上所述的本發明的肉豆蔻木酚素抑制PGE2生成的效果與用薑黃素處理的效果近乎相似，顯示出與實施例3中確認的NO及iNOS的抑制效果的相同模式(P＜0.05)。
COX-2表達的抑制 本發明人利用免疫印跡分析，調查了對PGE2生成產生直接影響的COX-2的表達。除了作為一次抗體使用抗-COX-2抗體(1∶2,000)(Calbiochem社製造)、作為二次抗體使用抗-山羊IgG-HRP(1∶2,000)(Calbiochem社製造)以外，以與上述實施例中記載的相同方法進行。
其結果是，如圖11所示，確認了本發明的肉豆蔻木酚素能夠濃度依賴性地抑制COX-2蛋白的表達。特別是，10-20μM的濃度時表達量明顯地減少。
從上述結果能夠確認本發明的肉豆蔻木酚素不僅抑制作為炎症誘發因子的PGE2的生成，也抑制生成它的COX-2的表達。
實施例5 本發明的木酚素類化合物的TNF-α抑制效果的調查 TNF-α是對炎症反應有重要作用的炎症細胞因子。因此，調查了本發明的肉豆蔻木酚素對TNF-α的生成的影響。
巨噬細胞株中的TNF-α生成的抑制 首先，將1×106細胞/ml的RAW264.7細胞接種至96孔組織培養板上，常溫下放置5小時。接下來，分別添加1～20μM濃度的本發明的肉豆蔻木酚素，培養2小時。對陰性對照群不施加任何處理，對陽性對照群用薑黃素(Sigma)處理(Araujo and Leon，Mem.Inst.Oswaldo.Cruz.，96(5)723-728，2001；Chainani-Wu，J.Altern.Complement.，9(1)161-168，2003)。接下來，用1μg/ml的LPS處理，培養18小時。利用檢測試劑盒(R&DSystem Inc，Minneopolis，USA)，用ELISA法定量巨噬細胞中的TNF-α的生成量(Chen et al.，J.Dermatol.Sci.2997-103，2002)。其結果是，如圖12所示，用本發明的肉豆蔻木酚素處理時，從5μM開始顯示出了TNF-α的生成有明顯的減少(P＜0.05)。
人類單核細胞中的TNF-α生成的抑制 本發明人用與上述實施例相同的方法測定了用痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)活化的人類單核細胞(Human monocytic)U937細胞中的TNF-α的生成量。其中，陽性對照群使用吲哚美辛(Sigma)進行處理(Walch and Morris，Endocrinology.143(9)3276-3283，2002)。
其結果是，如圖13所示，能夠確認本發明的肉豆蔻木酚素可濃度依賴性地減少人類單核細胞中的TNF-α的生成(P＜0.01)。
從上述結果能夠確認本發明的肉豆蔻木酚素抑制誘發和/或介導急性炎症及全身炎症反應的介質TNF-α的生成。
實施例6 利用動物實驗對本發明的木酚素類化合物的抗炎症活性進行調查 通過動物實驗確認上述實施例1中分離純化的木酚素類化合物的抗炎活性。通過對大鼠的浮腫抑制實驗，測定上述抗炎活性。實驗動物採用5周齡的Wistar大鼠(DaeHan Biolink Co.，Ltd，韓國)。飼料供給標準鼠飼料(Cheiljedang Corporation，Korea)，並自由供給飼料與水。大鼠是在12小時的螢光燈日照、25±2℃及60±10％溼度的條件下進行飼養。作為炎症引發劑的TPA(佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)；Sigma)，在丙酮中溶解達到200μg/mL。大鼠耳的浮腫，是通過在耳廓的外面與內面局部分別塗敷10μl/耳(4μg/耳)的TPA溶液而引發。將實施例1中生成的純的肉豆蔻木酚素和作為對照物質的非甾體類抗炎藥吲哚美辛溶解在丙酮中，且其使用量為20,200和2000μg/耳。將肉豆蔻木酚素與吲哚美辛分別局部塗布在用TPA處理30分鐘後的大鼠耳上。對照群局部塗布丙酮。用各物質處理8小時後，利用卡尺(calliper)測定大鼠耳的厚度。樣品處理群的耳厚度的增加，與未經樣品處理群相比較，通過計算浮腫抑制百分率，測定炎症抑制效果。將其結果示於下述表2中。
表2 *p＜0.01 實施例7 含有肉豆蔻木酚素的乳膏的製造及其抗炎症活性調查 含有肉豆蔻木酚素的乳膏的製造 利用本發明的肉豆蔻木酚素，分別製造具有下述表3中記載的多種組成的膏霜劑。首先，在75-80℃下溶解下述表3中用B表示的物質。進一步，在相同溫度下溶解下述表3中用C表示的物質中的十六醇與防腐劑。將上述C物質在上述B物質中乳化。接下來，分別以5.0、0.5、0.05、0.005％的濃度投入下述表3中用A表示的本發明的肉豆蔻木酚素，進行混合。最後，加入香料和餘量的純化水，製得乳膏。
表3 抗炎症活性調查 通過對大鼠的浮腫抑制實驗，測定上述實施例中製造的含有肉豆蔻木酚素的乳膏的抗炎症活性。浮腫抑制實驗以與實施例6相同的方法進行實施。將其結果示於下述表4中。
表4 從上述表4的結果可知，含有本發明的肉豆蔻木酚素的乳膏以乳膏內含有的肉豆蔻木酚素的濃度依賴性地抑制TPA誘發的大鼠的浮腫。
實施例8 肉豆蔻提取物的抗炎症活性調查 甲醇提取物的製備 往100g乾燥粉碎的核仁(乾燥重量)中添加95體積％、400ml的甲醇，在常溫下放置2天。利用Whatman 2號濾紙過濾上述溶液。重複兩次上述過程。真空濃縮並冷凍乾燥甲醇濾液，製得甲醇粗提物(16.2g)。
己烷提取物的製備 往100g乾燥粉碎的核仁(乾燥重量)中添加100體積％、400ml的己烷，在常溫下放置2天。利用Whatman 2號濾紙過濾上述溶液。重複兩次上述過程。真空濃縮並冷凍乾燥己烷濾液，製得己烷粗提物(37.0g)。
利用動物實驗進行肉豆蔻提取物的抗炎症活性調查 通過動物實驗，確認了上述實施例及製造的肉豆蔻提取物的抗炎活性。通過與上述實施例6相同的方法，利用對大鼠的浮腫抑制實驗，測定了上述抗炎活性。其結果如下述表5所示。
表5 *p＜0.01 如上述表5所示，能夠確認本發明的肉豆蔻的甲醇粗提物與己烷粗提物，全都能夠濃度依賴性地抑制TPA誘發的大鼠浮腫(統計學上的顯著性p＜0.01)。
製備例1 含有本發明的治療或預防炎症性疾病的藥物組合物的藥劑的製備 片劑的製造 將25mg本發明的木酚素類化合物或肉豆蔻提取物、26mg作為直接壓片用賦形劑的乳糖、3.5mg Avicel(微晶纖維素)、1.5mg作為崩解輔助劑的葡萄糖酸澱粉鈉、以及8mg作為粘結劑的直接壓片用的L-HPC(低取代羥丙基纖維素)一起加入U型混合機中，混合20分鐘。混合結束後，再添加1mg作為潤滑劑的硬脂酸鎂，混合3分鐘。經過定量分析與溼度含量分析，壓片、包膜，製成片劑。
糖漿的製備 通過如下所述的方法，製備將本發明的肉豆蔻木酚素或其藥學上可接受的鹽作為2％(w/v)的有效成分而含有的糖漿。將2g本發明的肉豆蔻木酚素的酸加成鹽、0.8g糖精及25.4g糖，溶解到80g溫水中。冷卻上述溶液後，往其中加入8.0g丙三醇、0.04g香料、4.0g乙醇、0.4g山梨酸及適量的蒸餾水加以混合。往上述混合物中添加水至100ml。
膠囊的製備 混合50mg本發明的木酚素類化合物或肉豆蔻提取物、50mg乳糖、50mg澱粉、1mg滑石粉、及適量的硬脂酸鎂，將其填充至硬明膠膠囊中，製成膠囊劑。
注射液的製備 按照如下所述的方法，製造含有10mg有效成分的注射液將1g本發明的肉豆蔻木酚素的鹽酸鹽、0.6g氯化鈉及0.1g抗壞血酸溶解在蒸餾水中，製成100ml的溶液。將上述溶液裝入瓶中，並在20℃下加熱30分鐘滅菌。
應用例1 胃炎消化性疾病 已知胃炎與多種外部原因及不規則的飲食習慣有關，但主要由受腸道細菌Helicobacter pylori影響。腸道細菌Helicobacter pylori，不僅能夠引起胃潰瘍、胃炎，甚至會引起胃癌。腸道細菌Helicobacter pylori增殖過程中，COX-2酶(環氧化酶-2)也同時增加(Nam N.T.et al.，Clin.CancerRes.10(23)8105-8113，2004)。當被Helicobacter pylori感染時，胃的黏膜細胞會增殖成癌細胞，但確認了COX-2抑制劑能夠阻止胃黏膜細胞生長增殖成癌細胞，並且抑制從正常組織演變成癌組織。已發現，使用COX-2抑制劑群與未使用群相比，在通過凋亡方法使癌組織死亡的效果方面非常優異(Nam N.T.et al.，Clin.Cancer Res.10(23)8105-8113，2004)。
因此，本發明的木酚素類化合物的COX-2抑制效果，能夠在早期預防胃癌的胃炎治療中起作用，從而具有充分的治療效果。
應用例2 關節炎 關節炎由自身免疫異常引起，但在病情發展的同時，關節間的滑液腔上產生慢性炎症，誘使血管增生因而破壞軟骨。關節炎包括感染性關節炎、退行性關節炎、類風溼性關節炎、股骨頭缺血性壞死、強直性脊柱炎、先天性畸形引起的關節炎等多種。不管是何種原因，已知在病情發展的過程中，滑液腔上出現的慢性炎症誘使血管增生，並且具有新的毛細血管侵襲關節導致損傷軟骨的特徵(Kocb A.E.et al.，Arth.Rheum.，29471-479，1986；Stupack D.G.et al.，J.Med.Biol.Rcs.，32578-281，1999；Koch A.E.，Arthritis Rheum.，41951-962，1998)。已有報導，根據疾病種類，炎症反應發生在幾個步驟而破壞軟骨，在疾病的發展過程中起到了重要的作用，並且關節內的新毛細血管的形成作為重要的病理機理而起作用(Colville-Nash，P.R.et al.，Ann.Rheum.Dis.，51，919-925，1992；Eisenstein，R.，Pharmacol.Ther.，491-19，1991)。關節炎的治療，與根據原因來治療相比，優選抑制疼痛和感染現象，最大限度地抑制關節或肌肉等的破壞速度、使功能消失最小化。因此，本發明的木酚素類化合物或肉豆蔻提取物，對防止與治療關節炎的發展極為有效。
工業實用性 如上所述，本發明的木酚素類化合物，通過阻礙炎症介質因子NO、iNOS、PGE2、COX-2及TNF-α的生成或表達，有抑制炎症反應的效果。因此，本發明的木酚素類化合物或肉豆蔻提取物能夠極其有效地用於炎症性疾病的治療或預防中。
權利要求
1.一種治療或預防炎症性疾病的藥物組合物，其含有由下述通式I表示的木酚素類化合物或其藥學上可接受的鹽，
通式I
其中，R1及R2獨立地是C1-5烷氧基或羥基；R3是
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特徵在於，R1是甲氧基、R2是羥基、R3是
3.一種治療或預防炎症性疾病的藥物組合物，其含有肉豆蔻的水提取物或肉豆蔻的C1-C6有機溶劑提取物作為活性成分。
4.根據權利要求1或3所述的藥物組合物，其特徵在於，所述炎症性疾病選自由炎症性腸病、腹膜炎、骨髄炎、蜂巢炎、胰腺炎、創傷性休克、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、囊性纖維化、急性支氣管炎、慢性支氣管炎、急性細支氣管炎、慢性細支氣管炎、骨關節炎、痛風、脊柱關節病、強直性脊柱炎、賴特爾綜合症、乾癬性關節病變、與炎症性腸疾病相關的脊柱炎、幼年關節病、幼年強直性脊柱炎、反應性關節炎、感染性關節炎、感染後關節炎、淋菌性關節炎、結核性關節炎、病毒性關節炎、真菌性關節炎、梅毒性關節炎、萊姆病、與「血管炎綜合症」相關的關節炎、結節性多動脈炎、過敏性血管炎、Luegenec’s肉芽腫症、風溼性多肌痛、關節細胞動脈炎、鈣結晶沉積性關節病、假痛風、非關節性風溼症、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎、神經性關節病、關節血腫、過敏性紫癜、肥大性骨關節病、多中心網狀組織細胞瘤、脊柱側凸、血色病、血紅蛋白病、高脂蛋白血症、低丙種球蛋白血症、家族性地中海熱、白塞氏病、系統性紅斑狼瘡、回歸熱、多發性硬化症、敗血症、敗血症性休克、急性呼吸窘迫綜合症、多器官衰竭、慢性阻塞性肺疾病、類風溼性關節炎、急性肺損傷、支氣管肺發育不良及炎症性皮膚病所組成的組群。
5.一種治療或預防炎症性疾病的方法，其包括將有效量的由下述通式I表示的木酚素類化合物或其藥學上可接受的鹽施用於所需受試者
通式I
其中，R1及R2獨立地是C1-5烷氧基或羥基；R3是
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，R1是甲氧基，R2是羥基，R3是
7.一種治療或預防炎症性疾病的方法，其包括將有效量的肉豆蔻的水提取物或肉豆蔻的C1-C6有機溶劑提取物施用於所需受試者。
8.通式I表示的木酚素類化合物在製造治療或預防炎症性疾病的藥物組合物中的用途
通式I
其中，R1及R2獨立地是C1-5烷氧基或羥基；R3是
9.根據權利要求8所述的用途，其特徵在於，R1是甲氧基，R2是羥基，R3是
10.肉豆蔻的水提取物或肉豆蔻的C1-C6有機溶劑提取物在製造治療或預防炎症性疾病的藥物組合物中的用途。
全文摘要
本發明涉及木酚素類化合物用於治療或預防炎症性疾病的用途。更具體地說，本發明涉及含有由通式I表示的木酚素類化合物的用於治療或預防炎症性疾病的藥物組合物、利用該組合物的炎症性疾病的治療方法及用途。本發明的木酚素類化合物，具有通過阻礙炎症介質因子NO、iNOS、PGE2、COX-2及TNF-α的生成或表達來抑制炎症反應的效果。因此，本發明的木酚素類化合物或肉豆蔻提取物能夠極其有用地用於炎症性疾病的治療或預防中。
文檔編號A61K31/357GK101102761SQ200680001988
公開日2008年1月9日 申請日期2006年1月6日 優先權日2005年1月7日
發明者黃在寬, 金道彥, 鄭栽潤, 鄭熹徹, 韓奎利 申請人:黃在寬, 新樹工業股份有限公司