人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab及其應用的製作方法

2023-10-19 05:48:37

專利名稱：人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab及其應用的製作方法
技術領域：
:本發明屬於免疫學或分子生物學技術領域，涉及利用基因重組技術，提供一種人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab及其應用。
背景技術：
:鼻咽癌是來源於鼻咽上皮的高度惡性腫瘤，腫瘤進展極易侵犯顱底等重要結構，並較早發生頸部淋巴結轉移和遠處轉移。鼻咽癌表現為種族和地區分布的特點，是我國十大高發惡性腫瘤之一，其發病率為20/100,000，已引發嚴重健康問題。鼻咽癌是由Epstein-Barr病毒(EBV)的潛伏感染、環境因素和宿主的基因遺傳因素共同參與的多步驟交互作用而逐步形成的複雜性疾病。所有的鼻咽癌細胞都含有EBV基因組，並表達EBNA1，EBERl, EBER2， 和LMP1，LMP2A，LMP2B，這使得這些病毒蛋白成為理想的腫瘤標誌物，其中latent membrane protein2A(LMP2A)在鼻咽上皮細胞的轉化、癌變和復發的過程中的作用倍受關注，是目前公認的病毒癌基因。它以其獨特的蛋白分子結構參與鼻咽癌發生和發展的全過程。

發明內容
解決的技術問題:本發明目的是提供一種人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab及其藥物用途，為鼻咽癌中表達的LMP2A的檢測提供檢測工具及為鼻咽癌的靶向治療奠定基礎。技術方案:人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab，所述抗體的'鏈的互補決定區具有以下的⑶Rs胺基酸序列:SEQ ID N0.3 所示的 L-CDR1 ；SEQ ID N0.4 所示的 L-CDR2 ；SEQ ID N0.5 所示的 L-CDR3 ；並且所述抗體的Vh鏈的互補決定區具有以下的⑶Rs胺基酸序列:SEQ ID N0.8 所示的 H-CDR1 ；SEQ ID N0.9 所示的 H-CDR2 ；SEQ ID N0.10 所示的 H-CDR3。所述抗體的八鏈的可變區胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示，Vh鏈的可變區胺基酸序列如SEQ ID N0.7所示。所述抗體的'鏈的可變區核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，Vh鏈的可變區核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab在製備治療鼻咽癌藥物中的應用。人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab在治療鼻咽癌中的應用。SEQ ID N0.1輕鏈可變區核酸序列GAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC
TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTACACTTTT
GGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAASEQ ID N0.2輕鏈可變區胺基酸序列ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNffYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIKSEQ ID N0.3L-CDR1 =QSISSYSEQ ID N0.4L-CDR2:AASSEQ ID N0.5L-CDR3:QQSYSTPYTSEQ ID N0.6重鏈可變區核酸序列CAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATTGGAAACAGCACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCASEQ ID N0.7重鏈可變區胺基酸序列QLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHffVRQAPGKGLEffVAVIffYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYYYCARDffKQHWYFDLffGRGTLYTYSSSEQ ID N0.8H-CDR1:GFTFSSYGSEQ ID N0.9H-CDR2:1WYDGSNKSEQ ID N0.10H-CDR3 =ARDffKQHWYFDL有益效果:本發明提供了一種既具有抗體特異性又具備較好親和力的抗鼻咽癌作用的ant1-LMP2A人源抗體，該抗體可用於免疫螢光、免疫組化和免疫共沉澱實驗。該人源抗體能為鼻咽癌的靶向治療提供一個新的靶向抗體。


圖1為LMP2A胞外區 融合基因在大腸桿菌系統中的表達純化和SUNE、CNE中LMP2A蛋白的鑑定:A.LMP2A胞外區融合基因在大腸桿菌系統中的表達I空菌2誘導後全菌3超生上清4超生沉澱(SDS-PAGE) ；B.純化後的胞外融合蛋白LMP2A12KD (SDS-PAGE ;純度>95%) ；C.LMP2A 在細胞內表達的鑑定 1SUNE2CNE55KD (Western Bloting)；圖2為噬菌體抗體庫篩選的ELISA檢測結果和抗LMP2A人源抗體Fab29的鑑定、純化:A.差減法陽性克隆的挑選；B.Fab29在ToplO空菌中表達I空菌對照2超生上清3超生沉澱(Western Bloting) ；C.Fab29 純化結果(SDS-PAGE ;純度 >95%)；圖3為純化的Fab29與細胞株SUNE/CNE以及不相關抗體與SUNE結合的細胞ELISA測定結果和Fab29與SUNE/CNE細胞結合的FACS結果以及SUNE細胞與CNE細胞裂解液與Fab29免疫共沉澱結果:A.純化的Fab29與細胞株SUNE/CNE以及unrelated Fab與SUNE的結合測定；B.流式細胞計數顯示Fab29與SUNE細胞結合(I)而unrelated Fab不與SUNE
(2)細胞結合而且Fab29不能與CNE細胞結合；C.免疫共沉澱結果顯示Fab29能夠捕獲LMP2A蛋白圖4為Fab29和細胞株SUNE/CNE以及不相關抗體Fab與SUNE結合的細胞免疫螢光圖:A.Fab29(l-4)和 unrelated Fab (5_8)與腫瘤細胞株 SUNE 以及 Fab29 (9-12)與 CNE的結合-免疫螢光，4，8，12分別是普通光學顯微鏡檢視；圖5為Fab與重組蛋白LMP2A的親和力和動力學測試結果:Fab29在不同濃度下與重組LMP2A蛋白的親和力和動力學分析結果。結果顯示Fab29對重組LMP2A的親和力是1.79E-0.9 ；圖6為Fab29與Rat ant1-EBV LMP2A和不相關Fab做鼻咽癌患者免疫組化的差別:1是經商業化Rat ant1-EBV LMP2A抗體鑑定的陽性鼻咽癌患者的腫瘤切片；2是Fab29與該陽性患者切片孵育結果；3是unrelated Fab與鼻咽癌患者腫瘤切片孵育的結果.4-6是鼻咽癌LMP2A陰性切片結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。實施例中如無特別說明，各物質濃度均為質量百分比濃度 :實施例1人源抗LMP2A胞外區抗體Fab的製備與鑑定:一、潛伏膜蛋白2A(LMP2A)胞外區抗原的製備與純化1.LMP2A胞外區的基因序列來源於B95-8細胞系，通過GenBank公布數據(AJ507799.2)確認，LMP2A 二段胞外區LMP2A由南京佰傑斯生物公司進行全基因合成，並將LMP2A胞外區重組基因克隆到pET28a+載體中而構建成質粒pET28a+_LMP2A。2.His-LMP2A胞外肽段質粒的構建(I).用限制性內切酶BamH I和Xho I雙酶切質粒pET28a+_LMP2A，將LMP2A胞外基因片段使用TAKARA公司膠回收試劑盒切膠回收；(2).使用T4DNA連接酶聯接到pET28a+表達質粒；3.Hi S-LMP2A胞外肽段融合蛋白的表達(I).將含有重組質粒pET28a+-LMP2A和空載體pGEX_4T_2的BL21菌株接種到含卡納黴素(50ug/mL)的LB中，37°C震蕩過夜；(2).次日轉接，37 °C培養至菌液吸光度㈧值600約0.6時，加異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)誘導表達蛋白，至終濃度為 lmmol/L,25 °C 190r/min 震蕩；(3).誘導12小時，以未轉質粒的空菌作對照。用12 % SDS-PAGE電泳分析His-LMP2A融合蛋白表達。4.His-LMP2A融合蛋白的純化(I).離心收集表達His-LMP2A膜外肽段融合蛋白菌液。用PBS45mL重懸細菌，超聲碎菌。4°C收集上清過濾；(2).將含有His_LMP2A膜外肽段融合蛋白的上清經親和層析柱，用洗脫液(500mmol/L 咪唑，0.5M/L NaCl, 20mmol/L NaH2PO4)洗脫，收集蛋白；(3).經SDS-PAGE分析蛋白表達含量與純度，樣品於_70°C貯存。
二、交替固相法與差減法的篩選抗體Fab1.本發明採用基於固相抗原的篩選與基於細胞的篩選，差減篩選法選擇人鼻咽癌細胞CNE為陰性細胞(由南京醫科大學衛生部抗體重點實驗室保存)，天然在膜表面表達LMP2A的鼻咽癌細胞株SUNE為陽性細胞(上海諾華諾華製藥有限公司)；固相篩選時His-LMP2A胞外肽段融合蛋白為抗原；2.基於細胞表面的差減篩選(I)抗體庫滴度測定:將_80°C保存的噬菌體庫於冰上解凍後用pH7.4的PBS稀釋至1X10—9，取14 1^稀釋的抗體庫與5(^1^對數生長期的乂1^1-1311^ (OD6tltl約1.0)於室溫下混合30min後鋪板，於第二天通過菌落數測滴度，公式如下:每微升噬菌體數=稀釋倍數X菌落數首輪準備約1013phage ;篩庫加入的phage數按需要的曬菌體數+每微升phage數計算；如噬菌體滴度低，則將幾個不同離心管內的噬菌體混合後加入1/5體積20%wt的PEG, 15%wt NaCl 溶液沉澱後用 lmLl%wt 的 BSA-PBS 溶解；(2)篩庫前一天接種單克隆XLl-blue於含10mL30 μ g/mL四環素SB培養液的50mL燒瓶中，37°C，250r/min，過夜，第二天按體積比1: 100用含10 μ g/mL四環素的SB培養液轉接，注意OD6tltl不要超過1.0 ;(3)準備CNE細胞(為消除部分非特異性結合的陰性細胞)與SUNE細胞(為細胞表面高表達抗原的陽性細胞，用於結合特異性抗體)各100萬個，即150cm2的細胞培養瓶70%長滿後1-2瓶；(4)首先移去CNE細胞培養瓶內的培養基，用IOmL pH7.4的PBS洗三次，移去PBS，再向每個培養瓶中移入IOmL細胞解離液，37°C孵育IOmin ；(5)此時大部分細胞應已經從瓶壁分離，少量仍貼壁者可用細胞鏟將細胞從培養瓶壁中緩慢刮下，收集至一個1.5mL的聚丙烯離心管內，1800r/min離心5min ；(6)仔細吸去上清，再加入ImL pH7.4PBS吹打重懸，按前述轉速及時間離心，用pH7.4PBS洗滌三次；(7)最後一次洗滌後移去PBS，用溶於lmL5%wt脫脂牛奶-PBS的噬菌體抗體庫重懸CNE細胞，37°C混合30min ;在此同時按照相同方法準備SUNE細胞；(8)離心，1800r/min，5min，然後將上清轉移至SUNE細胞(注意不要將CNE細胞帶出)，與SUNE細胞37°C混合30min ；(9)離心，1800r/min, 5min,棄去上清，再用 ImL0.l%wt BSA-PBS 洗漆,共 8 次；(10) 50 μ L0.25%wt trypsin, 0.53mmol EDTA 重懸細胞沉澱，37°C 20min;把以上液體再加入 2mL XLl-blue (OD600 約 1.0)，37°C 30min ；(11)向裝有感染了洗脫噬菌體細菌的離心管中補加事先預熱至37°C的6mL SB培養液，向其中補充1.6 μ L羧苄黴素(0.lg/mL)保存液，吸取2 μ L加入200 μ L SB，混勻。取IOyLUOOy L鋪板，計算洗脫噬菌體產量為第一輪產出(output);洗脫噬菌體產量=菌落數X稀釋倍數XlO3 ;剩餘菌液轉到50mL三角瓶中，250r/min，37°C Ih ；(12)補充2.4μ L羧苄黴素保存液，相同條件再培養Ih ；(13)加入100yL1013VCSM13輔助噬菌體 ，將整個培養液轉移至含91mL預熱(37°C)SB培養液的500mL燒瓶中，補充46 μ L羧苄黴素保存液與184 μ L四環素保存液，繼續前述條件培養2h ；(14)加入14(^1^卡那黴素保存液(0.058/1^)，過夜培養；(15)將培養液轉移至500mL離心瓶中，室溫離心3000g，15min ；(16)上清中加入4g PEG，3g NaCl，搖晃混勻後於冰上靜置Ih ；(17)4。〇離心，1500(^\151^11;(18)棄上清，將離心瓶口朝下置於紙上，將剩餘的液體清除；(19)用lmLl%wt BSA-PBS溶解噬菌體，用前述方法測定滴度，取IO13噬菌體用於下一輪篩選，共篩選5輪；剩餘保存於_80°C。3.固相篩選法方法(I)包被抗原:在兩個1.5mL的離心管中，將純化的His_LMP2A溶於ELISA coatingbuffer使終體積達到400 μ L, LMP2A濃度為3 μ g/mL,每孔中分別加入50 μ L,每次篩庫每個濃度用8孔，4°C過夜；篩庫前一天及當天按前述方法準備細菌；(2)次日，將被His-LMP2A蛋白結合的孔加入pH7.4PBST洗三次，每孔加入300mL脫脂牛奶37 °C Imin，pH7.4PBST洗三次；(3) Fab 抗體庫 250 μ L 與 5%wt 脫脂牛奶 250 μ L, 37°C 30min ；

(4)將上步所得液體以每孔50 μ L加入His-LMP2A包被的ELISA8孔板中，S卩(2)中，蓋上塑料膜，37 °C 2h ；(5)甩去噬菌體，0.5%wt TffEEN-TBS 洗滌:向孔中加滿 0.5%wt TffEEN-TBS,用 ImLTip頭反覆吹打10次，靜置約5min，待氣泡完全消失，甩去孔中洗滌緩衝液，孔頂朝下拍打3次，反覆10次後再用裝於無菌塑料瓶中的洗滌緩衝液衝洗，甩去緩衝液後再拍打3次，反覆5次；(6)向每孔中加入約50 μ L0.25%胰酶一 EDTA，37°C 30min，用Tip頭猛烈吹打10次；剩餘轉移到2mL當日接種培養的XLl-blue (OD600L O左右)的12mL聚丙烯培養管中，室溫孵育20min ；(7)向裝有感染了洗脫噬菌體細菌的離心管中補加事先預熱至37°C的6mL SB培養液，向其中補充1.6μ L羧苄黴素保存液(0.lg/mLXUyL四環素保存液(0.2g/mL)，於37°〇，25017/11^11，111;同時取24 1^加入20(^1^ SB，混勻。取 10 μ L、100 μ L 於 LB-Agar/羧苄青黴素(0.lX10_3g/mL)，37°C過夜生長後數單菌落數目，計算產出噬菌體(output)；(8)補充2.4μ L羧苄黴素保存液，相同條件再培養Ih ；(9)加入1013VCSM13輔助噬菌體，將整個培養液轉移至含91mL預熱(37°C) SB培養液的500mL燒瓶中，補充46 μ L羧苄青黴素保存液與184 μ L四環素保存液，繼續前述條件培養2h ；(10)加入140 μ L卡那黴素保存液(0.05g/mL)，過夜培養；(11)將培養液轉移至250mL離心瓶中，4°C離心,3000g, 15min ；(12)上清中加入4gPEG，3gNaCl,37°C，250r/min, 15min搖晃混勻完全溶解後於冰上靜置Ih ；(13) 4°C離心，15000g, 30min ；(14)棄上清，將離心瓶口朝下置於紙上，將剩餘的液體清除；(15)用500 μ Ll%wtBSA-TBS溶解噬菌體，用前述方法測定滴度，取IO13噬菌體用於下一輪篩選；剩餘保存於_80°C。4.噬菌體ELISA挑選陽性克隆(I)本過程需新鮮準備的包被抗原。用ELISA coating buffer稀釋純化的His-LMP2A至濃度為3 μ g/mL,每孔中加入50 μ L，4°C過夜；(2)第二天甩去每板中的包被緩衝液,每孔中加滿ELISAwashing buffer,甩去，於紙上拍打三次洗滌，反覆三次；(3)每孔中加新鮮配製的 1% wt BSA_PBS，37°C，1.5h ；(4)最後一輪產出噬菌體2mL鋪四塊板，37°C孵箱中過夜培養；(5)次日晨用tip頭挑選58個單菌落分別接種於ImL SB培養基(內含100 μ g/mL氨苄青黴素和l%wt葡萄糖)，於12mL聚丙烯培養管中37°C震蕩培養；(6)約8-10h後，0D_達到0.3，此時向每個培養管中加入109VCSM13輔助噬菌體，繼續37°C震蕩培養2h ；

(7)每管中加入1.4 μ L50mg/mL的卡那黴素至終濃度為70 μ g/mL,搖床中37°C過夜培養。(8)次日，將每根培養管標號,3000g離心,15min,每管中剩餘的曬菌體暫存於4 0C ；(9)甩去ELISA板中的封閉牛奶，吸取出50μ L過夜培養液上清與50 μ Ll%wtBSA-PBS混勻，按順序加入實驗孔(LMP2A)中，一孔加入一個克隆的噬菌體，留至少兩對孔加入含相同濃度抗生素及葡萄糖的SB培養液作為空白對照，37°C，2h ；(10)棄去噬菌體培養液，拍打三次後再用IOmL移液管吸取0.l%wt TffEEN-PBS衝洗後再拍打三次，用此方法共洗滌五次；(11)每孔中再加入50μ Ll:3000稀釋的HRP標記的羊抗M13 二抗(Amersham codenumber: 27-942-01)，室溫 Ih ；(12)用(3)中的溶液再次洗滌；(13)顯色，每孔中加入100 μ L顯色底液(TMB與H2O2按1:1體積比混合)，20min後加入IM H2SO4停止顯色；(14)于波長450nm讀數記錄；(15)取ELISA讀值最高的29號克隆為最佳陽性克隆。5.陽性克隆的測序(I) 2mL過夜培養菌，12000r/min離心2min,棄上清；(2)加入 250μ L 的 Solution I (含 RNaseAl)，充分重懸細菌；(3)加入250 μ L的Solution II，輕輕地上下翻轉混合5_6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液；(4)加入400 μ L4°C預冷的Solution III，輕輕地上下翻轉混合5_6次，直至形成緊實凝集塊，室溫靜置2min;(5) 12000r/min 離心 lOmin，取上清；(6) Spin Column 安置於 Collection Tube,上清置於 Spin Column 中；(7) 12000r/min 離心 lmin,棄濾液；(8)將 500 μ L 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12000r/min 離心 30s,棄濾液;
(9)將 700 μ L 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，12000r/min 離心 30s,棄濾液;(10)重複上一步,然後再12000r/min離心lmin,棄濾液；(11)將Spin Column安置於新的1.5mL離心管,在Spin Column膜的中央處加入60 μ L經60°C預熱的洗脫液，室溫靜置Imin ；(12) 12000r/min 離心 lmin,洗脫 DNA,測序。二、Fab29 的表達1.ToplOF』接種於含30 μ g/mL四環素的LB-Agar中，取單菌落於37°C震蕩培養過夜；2.將過夜培養的ToplOF』培養液以1:100體積比接種於含30 μ g/mL四環素的SB培養液中，37°C震蕩培養至0D600約為0.8 ；3.吸取I μ L陽性克隆的噬菌體與50 μ L對數生長期的ToplOF』混合，於室溫下孵育15mins,然後鋪板生長於含100 μ g/mL氨節青黴素的LB-Agar, 37°C過夜生長；4.次日，挑選單菌落接種於含100 μ g/mL氨苄青黴素，2%wt葡萄糖的SB培養液中，37°C震蕩培養過夜；5.用含100 μ g/L氨苄青黴素，l%wt葡萄糖的SB培養液按1:100體積比轉接過夜生長的細菌，37°C震蕩培養直至0D600達到1.0 ；6.5000r/min, 5min, 37°C離心，棄上清,用ImL含100 μ g/L氨節青黴素的SB重懸
細菌；7.加入IPTG至終濃度為0.1mM,加入蔗糖濃縮液至終濃度為4%wt，於25°C震蕩培養過夜。三、陽性克隆表達的鑑定1.取100 μ L過夜誘導表達的細菌培養液，離心，IOOOOg;2.將上清與細菌沉澱分離，取10 μ L上清與相同體積的SDS2X 1adingbuffer混勻，100。。煮沸 5min ；3.向pH7.4PBS加入200mM PMSF至終濃度為ImM，用200 μ L重懸細菌沉澱，然後於冰水混合物中超聲處理5min ；4.再離心，IOOOOgX5min ;5.取10 μ L上清與相同體積的SDS 1adingbuffer混勻，100°C煮沸5min ;6.上樣，蛋白電泳，90V，大約Ih左右；7.轉膜，150mA，2h ;8.封閉，5%wt牛奶-PBS，將膜完全浸泡於封閉液中，37°C Ih ；9.洗漆三次(洗漆方法為加入wash buffer,室溫下於搖床上反覆搖晃5min,然後棄去再加入wash buffer);然後加入1:3000體積比稀釋的HRP標記的羊抗人IgG (Fab) 』 (catalog n0.A0293; Sigma)，室溫下於搖床上搖晃 Ih ；10.按前述方法再洗滌三次，加入HRP底物衝洗硝纖膜，約45s後曝光。四、陽性克隆表達 產物的純化1.按前述方法誘導表達Fab29 ;2.離心細菌培養液，IOOOOgX 15min ;3.細菌沉澱重懸於1/10細菌培養液體積的含ImM PMSF的pH7.4的20mM磷酸緩衝液；4.將重懸的液體分裝於50mL的聚丙烯離心管中，於冰水混合物中超聲處理，約12min ；5.將超聲後的菌液再次聚集在一起，離心，15000gX30min ;6.棄沉澱，上清通過0.22 μ L濾器過濾；7.準備好AKTA-FPLC與ProteinL親和層析柱，從柱中先後流過2倍柱體積的去離子水及10倍柱床體積的結合緩衝液，平衡Protein L親和層析柱；8.取待純化樣品上柱，流速為0.5 lmL/min ； 9.然後以同樣的流速依次用20倍柱床體積的結合緩衝液；10.上5mL洗脫緩衝液，在AKTA-FPLC上根據峰值收集洗脫蛋白，並用0.lmol/LTris鹼中和收集的洗脫液至ρΗ7.0 7.5 ;11.用BCA法測蛋白質含量，置4°C保存備用。使用後的層析柱經雙蒸水洗滌，再以20%的酒精衝洗、密封保存於4°C供再次使用；12.純化的Fab29用SDS — PAGE鑑定其純度。用0.12g/mL分離膠、0.04g/mL濃縮膠，設低分子量標準，恆壓下電泳。考馬斯亮藍R250染色。純化的Fab29的活性用上述ELISA法鑑定；13.經Centricon離心換緩衝液溶解於ρΗ7.4，PBS中濃縮保存。五、純化的Fab29與LMP2A胞外區結合能力ELISA1.包被抗原及封閉:將純化的His_LMP2A溶於ELISA coating buffer使終體積達到5mL，LMP2A濃度為600ng/mL，每孔中分別加入50 μ L，4°C過夜；2.次日，將被His-LMP2A蛋白結合的孔加入ρΗ7.4PBST洗三次，每孔加入300mL脫脂牛奶 370C lmin, pH7.4PBST 洗三次；3.將純化的 Fab29 分別稀釋為 10,5,2.5、1.25,0.625,0.313,0.156 μ g/mL,向每孔中加入50 μ L稀釋的Fab29於室溫下孵育Ih ；4.洗滌後加入1:2000體積比稀釋的HRP標記的羊抗人二抗(catalogn0.A0293; Sigma),室溫下 Ih ；5.洗滌後加入底物顯色30min，加入IM硫酸中止顯色，于波長450處讀數。六、Fab29細胞 ELISA 檢測1.用胰蛋白酶消化細胞培養瓶中的細胞；收集細胞並計數；離心，1500r/min，IOmin ；2.用完全培養基重懸細胞調整濃度4 X IO5個細胞/mL，分成三組，第一組鼻咽癌細胞株SUNE細胞，第二組對照組人鼻咽癌細胞株CNE細胞；第三組SUNE細胞和不相關的Fab蛋白；3.滴加到96孔培養板中，100 μ L/孔；37°C環境孵育過夜；4.用PBS洗板兩次；5.每孔加125 μ L10% wt福馬林緩衝液；於室溫環境下固定15min ；6.用雙蒸水洗滌三次；晾乾；貯存於2_8°C ；7.用雙蒸水洗滌ELISA板兩次；8.每孔加 250 μ L 含 2% wtBSA 的 PBS ;37°C孵育 Ih ；
9.雙蒸水洗板三次；10.每孔加50yLFab29(依次用含1% wt BSA的PBS稀釋至濃度為50、25、12.5、
6.25,3.15、1.56,0.78,0.00 μ g/mL)，37。。孵育 2h ；11.0.1% wt PBST 洗板五次；12.每孔加50yL用含1% wt BSA的1:2000體積比稀釋的HRP酶標羊抗人IgG (Fab) (catalog n0.A0293; Sigma) ;37°C鮮育 Ih ；13.TMB顯色，顯色前按TMB: H2O2=1:1體積比混合，100 μ L/孔，在室溫下孵育20min ;加IM硫酸溶液50 μ L/孔;在酶標儀上測0D490波長的值。七、突光激動的細胞分類(fluorescence-activatedcell sorting, FACS)1.分別培養CNE與SUNE細胞至約IO6個；2.用pH7.4PBS洗滌三次:向每個培養瓶中移入10mLpH7.4，PBS後倒出；反覆三次；3.向每個培養瓶中分別加入 2_3mL cell dissociation buffer, 37°C, IOmin ；4.用細胞刮將細胞刮落，再加入約lmLpH7.4PBS，轉入15mL的聚丙烯離心管，1800r/min 離心，5min ；5.棄去上清,用lmLpH7.4PBS重懸細胞,再離心，1800r/min,5min,反覆三次；6.用 10mLl%wtBSA-PBS 於 4°C封閉 30min ；7.離心，將兩種細胞分別於50 μ g/mL Fab29的PBSlmL重懸，細胞均置於microtube 中,於 mixer 上 4V轉動反應 45min ；8.1800r/min 離心，5min ;棄去上清；9.用 lmLpH7.4PBS 重懸細胞，再離心，1800r/min, 5min,反覆三次；10.用 ImLl: 200 體積比稀釋的 FITC-labeled anti human Fab IgG 重懸每份細胞，於4V轉動反應30min，本步驟中就用鋁箔包裹試管避光；11.1800r/min離心，5min ;棄去上清；再用pH7.4PBS洗漆三次；12.將每份細胞用200 μ LpH7.4PBS重懸，於流式細胞儀分析光強度。八、免疫共沉澱1.在非變性條件下收集SUNE和CNE細胞，去掉培養基，用4°C PBS清洗一次；2.將所有細胞刮下，收集到一個離心管中。冰浴中對樣品用超聲處理40秒，功率3W ；3.4°C,14000g離心10分鐘。將上清轉移到新的離心管中，即為細胞裂解物；4.取200 μ L的細胞裂解物，在其中加入50 μ g Fab29，4°C孵育過夜分鐘；5.向4中加入20 μ L的蛋白L瓊脂糖微球漿，4°C孵育60分鐘；

6.4°C離心10分鐘。棄上清，沉澱pH7.4PBS重懸洗3次；7.將 6 的沉澱加入 40 μ LpH7.4PBS 和 10 μ L 的 5 X loadingbuffer, 100°C 5 分鐘；8.取7中的20 μ L Western免疫印跡分析(詳見三、6-10)九、免疫螢光1.將上述兩種細胞分別接種於6孔培養皿中，CNE細胞兩孔，SUNE細胞四個孔(其中兩個孔加入不相關Fab)，每孔約1500細胞，直到約80%長滿，其中每種細胞培養I孔作為實驗觀察組，另I孔僅加入二抗作為陰性對照組；2.吸去培養液，用pH7.4PBS洗滌三次，方法為加入PBS後再吸去；3.加入按等體積混合的丙酮與甲醇混合液，室溫下固定20min ；4.吸去固定液，再用去離子水洗三次，洗滌方法為加入去離子水後吸去；5.用新鮮配製的5%wt脫脂牛奶-PBS在37°C封閉Ih ；6.陰性對照組繼續用封閉液處理，實驗組中加入20 μ g/mL HLEAFab抗體，37 °C，Ih ；7.用ρΗ7.4PBS洗滌，方法為加入PBS後再吸去；8.在無光條件下加入1:200 (PBS)體積比稀釋的FITC-1abeled羊抗人Fab (catalog n0.F5512; Sigma)，室溫 0.5h ；9.洗滌後於顯微鏡下觀察；FITC激發波長494nm。十、Fab的親和力和動力學分析(fort6B10 c0.，LTD.上海分公司代做)^^一、免疫組化1.南京醫科大學二附院病理科提供的鼻咽癌患者石蠟切片脫蠟至水；2.3%wt H2O2室溫孵育5-10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性；

3.蒸餾水衝洗，pH7 .4PBS浸泡5分鐘X 2次;4.5%wt小牛血清封閉，室溫孵育30分鐘，傾去血清，滴加純化後PBS稀釋的濃度為0.25 μ g/mL Fab29抗體蛋白，濃度為0.25 μ g/mL商業化Rat-EBV LMP2A抗體蛋白和濃度為0.25 μ g/mL不相關抗體Fab抗體蛋白工作液，37°C孵育2小時；5.PBS 衝洗，5 分鐘 X 3 次;6.滴加1:1000 (PBS)體積比稀釋後的HRP標記羊抗人IgG (catalogn0.A0293; Sigma), HRP 標記羊抗大鼠 IgG (112-035-003，Jackson ImmunoResearch)工作液，37 °C孵育I分鐘；7.PBS 衝洗，5 分鐘 X 3 次;8.顯色劑顯色3-15分鐘(DAB)；9.自來水充分衝洗，復染，脫水，透明，封片。結果一、LMP2A胞外肽段融合蛋白的表達與純化LMP2A胞外肽段的相對分子質量為11KD，加上0.84KD相對分子質量的His，融合蛋白預期的相對分子質量應為12KD。轉化有重組質粒pET28a+-LMP2A的BL21經IPTG誘導後，在相應區域有濃染蛋白帶一條，與預期大小相吻合。經SDS-PAGE分析，含有表達載體的BL21 (DE3)菌株經IPTG誘導，可表達與預期分子量相符蛋白帶(圖1)。二、陽性克隆的篩選、測序、表達與純化1.phage ELISA的陽性克隆挑選我們於第6輪篩庫結束後挑選單克隆噬菌體擴增進行phage ELISA selection.挑選29號信號最強的質粒送檢，結果提示29號的基因型符合Fab基因型，且該Fab輕鏈為K鏈，提示特異性29克隆從抗體庫中被挑選出來。挑選29號克隆命名為Fab29 (圖2)。2.陽性克隆序列的測定表129號克隆的輕鏈可變區(上)及重鏈可變區(下)序列
權利要求
1.人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab，其特徵在於，所述抗體的\鏈的互補決定區具有以下的CDRs胺基酸序列:SEQ ID N0.3 所示的 L-CDRl ；SEQ ID N0.4 所示的 L-CDR2 ；SEQ ID N0.5 所示的 L-CDR3 ； 並且所述抗體的Vh鏈的互補決定區具有以下的CDRs胺基酸序列:SEQ ID N0.8 所示的 H-CDRl ；SEQ ID N0.9 所示的 H-CDR2 ；SEQ ID N0.10 所示的 H-CDR3。
2.根據權利要求1所述人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab，其特徵在於，所述抗體的Vl鏈的可變區胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示，Vh鏈的可變區胺基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根據權利要求1所述人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab，其特徵在於，所述抗體的Vl鏈的可變區核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，Vh鏈的可變區核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
4.權利要求1 3任一人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab在製備治療鼻咽癌藥物中的應用。
5.權利要求1 3任一人源抗鼻咽癌`LMP2A胞外區抗體Fab在治療鼻咽癌中的應用。
全文摘要
人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab及其應用，人源抗鼻咽癌LMP2A胞外區抗體Fab，所述抗體的VL鏈的互補決定區具有以下的CDRs胺基酸序列SEQIDNO.3所示的L-CDR1；SEQIDNO.4所示的L-CDR2；SEQIDNO.5所示的L-CDR3；並且所述抗體的VH鏈的互補決定區具有以下的CDRs胺基酸序列SEQIDNO.8所示的H-CDR1；SEQIDNO.9所示的H-CDR2；SEQIDNO.10所示的H-CDR3。該抗體可用於免疫螢光、免疫組化和免疫共沉澱實驗。該人源抗體能為鼻咽癌的靶向治療提供一個新的靶向抗體。
文檔編號A61P35/00GK103102412SQ201310034700
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者陳仁傑, 曹清, 馮振卿, 朱進 申請人:陳仁傑