一種鑑定油葵康地6和7號品種純度的方法
2023-09-22 18:25:05 1
專利名稱：一種鑑定油葵康地6和7號品種純度的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體說，本發明具體涉及一種鑑定油葵康地品種純度方法的技術領域。
背景技術：
向日葵iBelianthus annuus L.)是世界四大油料作物之一，也是我國北方地區的主要油料作物，其作為油料或蛋白質資源日益受到人們的重視。隨著向日葵育種技術的不斷發展和雜交品種的大面積推廣，品種鑑定已成為新品種保護及保護農民利益的重要手段。傳統的品種鑑定多用形態學方法，是根據作物的形態特徵和農藝生理特徵鑑定特定的基因型，它雖是一種最原始的品種純度檢驗方法，但簡單、直觀、易觀測記載、長期以來形態標記是鑑定雜交向日葵品種的主要手段。但隨著育種新技術的不斷發展，品種間的形態學差異越來越小，能用於鑑定的形態性狀已顯不足，增加了鑑定的困難；而且此法鑑定時間長，費用高。近年來，蛋白質和DNA多態性檢測技術迅速發展，尤其是DNA多態性檢測技術以其檢測材料少、時間短、結果穩定性好、重複性高、 技術簡單、成本低而逐漸成為目前檢測的主流方法。 DNA分子檢測技術基於DNA分子的缺失、插入、易位、倒位、重排或由於存在長短與排列不一的重複序列機制而產生的多態性(polymorphism diversity or fingerprints),從本質上能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特徵的DNA片段。雜交向日葵品種純度鑑定應用的分子檢測技術有RFLP技術、RAPD技術、SSR技術、AFLP技術。RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)是由 Grodzicker (1974)最早創立的，該技術是利用限制性內切酶酶解不同生物體的DNA分子後，用特異性探針進行 Sothern分子雜交，通過放射自顯影來揭示DNA的多態性。由於RFLP標記對DNA的需要量較大(5-10ug)，質量要求較高，技術較為複雜，程序繁多，周期長，費用較高，多態有限，對材料需求量大巨有放射性同位素的潛在汙染和危害，因而目前尚不宜於用於品種的純度鑑定。RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)技術是以基因組 DNA 為模板，以一個隨機的寡核普酸序列為引物，一般為9 一 IObp鹼基，通過PCR擴增反應，產生不連續的DNA 產物，再經過脂糖凝膠電泳得到多態性的DNA譜帶。RAPD技術主要特點是反應靈敏，多態性強，具有簡便、快速的優點，既有大量的隨機引物可供篩選使用，又不受種屬的限制，因而被廣泛用於多種作物的品種純度鑑定。SSR標記在人類及植物的基因組中，均存在著由I 一 4個鹼基對組成的簡單重複序列(simple sequence repeats,簡稱SSR),又稱之為微衛星(microsatellite), SSR技術已廣泛應用於玉米、水稻等作物的品種純度鑑定，SSR最大的優點在於其擴增產物在進行測序膠電泳分離時具有單鹼基的高解析度，能檢測到很高的多態性，遺傳信息量較大，並具有較好的穩定性和重演性。AFLP(Amplify Fragment length Polymorphism)技術擴增片斷長度多態性是RFLP和RAH)兩項技術的結合，是由荷蘭科學家 Zabean等人發明的一項專利技術。AFLP技術具較好的重複性,但操作複雜,步驟多，對實驗技能和儀器精度要求均很高，難以在作物品種純度鑑定上普及。
康地6號新疆康地種業股份有限公司(康地公司)2001年選育的油用向日葵早熟雜交種，株高160-170釐米，葉色深綠，舌狀花冠黃色，果盤直徑17-19釐米，生育期92天左右。耐高密，抗旱，耐肥水，籽粒容重高，抗向日葵霜黴病，中抗向日葵褐斑病和菌核病。千粒重63克，較康地5號增產20%。雜交油葵康地7號為康地公司2001年選育的油用向日葵早熟雜交種，生長勢強，植株整齊，耐病性強，單株產量高，綜合性狀極優，種康地7號，必將增產增收。畝產可達300公斤左右，耐霜黴病、銹病、菌核病。株形緊湊，花盤傾斜度小，適宜機械收穫。綜上所述，從傳統的形態鑑定、生化指紋檢測發展到分子水平和基因水平檢測雜交向日葵品種純度的檢驗技術經歷了從簡單到複雜而精確的過程，每一種方法都有其各自的優點和不足，因而至今在農作物種子檢驗規程中尚無快速的生化或DNA分子檢測技術標準程序。現有技術中未見報導有關同時鑑定油葵康地6和7號品種純度的方法。
發明內容
針對現有技術中未見報導有關同時鑑定油 葵康地6和7號品種純度的方法的技術現狀，本發明提供一種鑑定油葵康地6和7號品種純度的方法，可有效用於鑑定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真偽，利於油葵雜交種種子高效準確的質量控制，加快油葵商品種子的質量檢測進程，鑑定體系能夠在短時間內對大量樣品進行快速鑑定，結果準確可
O本發明的技術方案通過建立了油葵RAPD技術最佳程序，並確定了 PCR擴增反應各組分的優化組合，以商品油葵品種康地6和7號及其雙親的DNA為模板，進行大量隨機引物分子標記的篩選和重複，獲得了鑑定出能夠同時區分父本、母本和雜交種的隨機引物標記0PB05，這個隨機引物標記可有效用於鑑定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真偽，利於油葵雜交種種子高效準確的質量控制，加快油葵商品種子的質量檢測進程。本發明具體提供一種鑑定油葵康地6和7號品種純度的方法，具體方法步驟如下。(I)油葵DNA提取取培養2周的油葵幼嫩真葉於研缽中，加入液氮迅速研磨使成均勻粉狀，在樣品未融化之前加入65°C預熱的CTAB提取液500 μ I,充分混勻後把樣液移入I. 5 ml離心管中，置65°C水浴50 min,其間顛倒離心管數次；取出樣品冷卻至室溫，分別加入等體積的酚/氯仿和氯仿/異戊醇進行抽提，其中，酚/氯仿按體積比I :1計，氯仿 /異戍醇按24 I計,經4°C 12 000 r/min離心5 min ;取上清液加入O. 6倍體積的異丙醇混勻，於室溫放置5-10 min, 12 000 r/min離心5 min,去上清，用100 μ I 70%乙醇洗滌沉澱，置無菌臺吹乾；用雙蒸水溶解DNA沉澱，4°C保存備用；CTAB提取液為50 mmol/L Tris-HCl pH8, O. 7 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH 8，1% CTAB, 20 mmol/L 2-巰基乙醇。(2)PCR擴增反應及程序反應總體積為20ul，其中含IOX反應緩衝液， I. 25mmoI /T, MgCl2, Iu Taq DNA 聚合酶，O. lmmol/L dNTPs, lumol/L Primer, l_5ng 模板DNA ;擴增程序為94°C預變性4min; 94°C變性20sec，37°C退火50sec，72°C延伸 lmin20sec, 40個循環後再於72°C延伸lOmin。(3)膠板的製備待0. 5%瓊脂糖膠溶液冷卻至50°C左右時，加入最終濃度為0. 5 微克/毫升的EB，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固後，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內，加入Ix電泳緩衝液，電泳緩衝液50 X TAE Buffer配製方法稱量Tris 242g，Na2EDTA · 2H20 37. 2g溶於IL燒杯中，使電泳緩衝液液面剛高出瓊脂糖凝膠面。(4)電泳、觀察和拍照取4ml上述步驟(2)PCR擴增反應液加樣緩衝液1ml，加樣緩衝液為0. 25%溴酚藍，O. 25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至IOOml ;加樣後的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳；電泳完畢，取出凝膠；在波長為254nm的紫外燈下觀察染色後的電泳膠板；DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色螢光條帶，於凝膠成像系統中拍照並保存之。(5)上述步驟以商品油葵品種康地6和7號及其雙親的DNA為模板，進行大量隨機引物分子標記的篩選和重複鑑定，獲得了能夠同時區分康地6和7號父本、母本和雜交種的隨機引物標記0PB05，該引物序列TGCTCCCTTC。本發明中，經以商品油葵品種康地6和7號及其雙親的DNA為模板，進行大量隨機引物分子標記的篩選和重複，獲得了鑑定出能夠同時區分父本、母本和雜交種的隨機引物標記0PB05，這個引物標記0PB05的具體序列與現有技術報到一致，本領域普通技術人員可以參見引物標記0PB05。0PB05引物擴增的康地7號產生的母本特異標記0PB05條帶大小為450bp，產生的父本特異標記0PB 05條帶大小為880bp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特徵譜帶。0PB05引物擴增的康地6號產生的母本特異標記0PB05條帶大小為310bp，產生的父本特異標記0PB05條帶大小為325bp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特徵譜帶。通過實施本發明具體的技術指標，實現本發明內容，可以達到以下有益效果。I.本發明建立油葵DNA提取、RAPD技術最佳程序，並確定了 PCR擴增反應各組分的優化組合，擴增效果穩定。利用上述結果計算出的品種純度與田間檢測結果基本一致。這個0PB05隨機引物標記可有效用於鑑定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真偽，利於油葵雜交種種子高效準確的質量控制，加快油葵商品種子的質量檢測進程，鑑定體系能夠在短時間內對大量樣品進行快速鑑定，結果準確可靠。2.本發明中通過提取康地油葵種子，PCR擴增反應及程序，以及電泳、觀察和拍照僅需2天時間，比常規形態檢測時間大幅縮短。
圖I顯示為康地6號的0PB05弓丨物RAPD擴增結果圖，圖中，I為母本、2為雜種3 為父本、M為DNA標準分子量，SP Ikb DNA Ladder。圖2顯示為康地7號的0PB05引物的擴增結果圖，圖中，I為雜種、2為父本3為母本、M為DNA標準分子量，即Ikb DNA Ladder, a條帶450bp, b條帶880bp。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明並不限於下述的實施例。本發明中涉及到的主要原輔材料和設備有。主要原輔材料康地6和7號油葵種子是由新疆康地種業公司提供,都是2002年以來成熟商品品種，本領域可以通過市場購買獲得；引物標記0PB05在現有技術中可見。主要試劑Tris-HCl，NaCl,EDTA, CTAB, 2_ 巰基乙醇，Taq DNA 聚合酶，dNTPs, Na2EDTA · 2H20,溴酹藍,二甲苯青,鹿糖等。LRH-150-G型光照培養箱，上海儀器廠；醫用高壓蒸汽滅菌鍋，上海醫用核子儀器廠。PCR擴增儀Pcr2700、美國冷凍離心機印pendorf5810、美國分光光度計 NdlOOO、美國可調移液器eppendor、美國純水系統Milib美國。實施例一鑑定油葵康地6和7號品種純度的方法。(I)油葵DNA提取取培養2周的油葵幼嫩真葉於研缽中，加入液氮迅速研磨使成均勻粉狀，在樣品未融化之前加入65°C預熱的CTAB提取液500 μ I,充分混勻後把樣液移入I. 5 ml離心管中，置65°C水浴50 min,其間顛倒離心管數次；取出樣品冷卻至室溫，分別加入等體積的酚/氯仿和氯仿/異戊醇進行抽提，其中，酚/氯仿按體積比I :1計，氯仿 /異戍醇按24 I計,經4°C 12 000 r/min離心5 min ;取上清液加入O. 6倍體積的異丙醇混勻，於室溫放置5-10 min, 12 000 r/min離心5 min,去上清，用100 μ I 70%乙醇洗滌沉澱，置無菌臺吹乾；用雙蒸水溶解DNA沉澱，4°C保存備用；CTAB提取液為50 mmol/L Tris-HCl pH8, 0. 7 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH 8，1% CTAB, 20 mmol/L 2-巰基乙醇。(2)PCR擴增反應及程序反應總體積為20ul，其中含10X反應緩衝液， I. 25mmoI /T, MgCl2, Iu Taq DNA 聚合酶，0. lmmol/L dNTPs, lumol/L Primer 引物 0PB05, l_5ng模板DNA ;擴增程序為94°C預變性4min; 94°C變性20sec，37°C退火50sec， 72°C延伸lmin20sec, 40個循環後再於72°C延伸lOmin。(3)膠板的製備待0. 5%瓊脂糖膠溶液冷卻至50°C左右時，加入最終濃度為0. 5 微克/毫升的EB，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固後，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內，加入Ix電泳緩衝液，電泳緩衝液50 X TAE Buffer配製方法稱量Tris 242g，Na2EDTA · 2H20 37. 2g溶於IL燒杯中，使電泳緩衝液液面剛高出瓊脂糖凝膠面。(4)電泳、觀察和拍照取4ml上述步驟(2)PCR擴增反應液加樣緩衝液1ml，加樣緩衝液為0. 25%溴酚藍，0. 25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至IOOml ;加樣後的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳；電泳完畢，取出凝膠；在波長為254nm的紫外燈下觀察染色後的電泳膠板；DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色螢光條帶，於凝膠成像系統中拍照並保存之。(5)上述步驟以商品油葵品種康地6和7號及其雙親的DNA為模板，進行大量隨機引物分子標記的篩選和重複鑑定，獲得了能夠同時區分康地6和7號父本、母本和雜交種的隨機引物標記0PB05，該引物序列TGCTCCCTTC。本發明中以商品油葵品種康地4號及其雙親的DNA為模板，進行大量隨機引物分子標記的篩選和重複，獲得了鑑定出能夠同時區分父本、母本和雜交種的隨機引物標記 0PB05,這個引物標記0PB05的具體序列序列TGCTCCCTTC與現有技術報到一致，本領域普通技術人員可以參見引物標記0PB05。實施例二鑑定油葵康地6號品種純度的方法。
(I)無菌油葵幼苗獲得取康地6號油葵種子，用70%的酒精溶液浸泡lOmin，無菌水衝洗2遍，用10%的過氧化氫溶液消毒30min，再無菌水衝洗2遍，胚端朝上接種於無激素的1/2MS培養基上，培養室溫度為26°C _28°C，光照時間16h，光強2000LX，生長14天。
(2)向日葵DNA提取取上述培養2周的向日葵幼嫩真葉於研缽中，加入液氮迅速研磨使成均勻粉狀，在樣品未融化之前加入65°C預熱的CTAB提取液(50 mmol/L Tris-HCl pH8, O. 7 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH 8，1% CTAB, 20 mmol/L 2-巰基乙醇)500 μ 1，充分混勻後把樣液移入I. 5 ml離心管中，置65°C水浴50 min,其間顛倒離心管數次。取出樣品冷卻至室溫，分別加入等體積的酚/氯仿(I 1)和氯仿/異戊醇 (24 I)進行抽提，4°C 12 000 r/min離心5 min。取上清液加入O. 6倍體積的異丙醇混勻，於室溫放置5-10 min, 12 000 r/min離心5 min,去上清，用100 μ I 70%乙醇洗漆沉澱，置無菌臺吹乾。用雙蒸水溶解DNA沉澱，4°C保存備用。(3)PCR擴增反應及程序取⑵步l-5ngDNA，10X反應緩衝液，I. 25mmol/L MgCl2, Iu Taq DNA 聚合酶,O. lmmol/L dNTPs, lumol/L Primer (引物 0PB05),反應總體積為20ul。將其放入基因擴增儀擴增，擴增程序為94°C預變性4min; 94°C變性20sec， 37°C退火50sec, 72°C延伸lmin20sec, 40個循環後再於72°C延伸lOmin。(4)膠板的製備待0. 5%瓊脂糖膠溶液冷卻至50°C左右時，加入最終濃度為0. 5 微克/毫升的EB，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固後，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內，加入Ix電泳緩衝液(50XTAE Buffer配製方法稱量Tris 242g，Na2EDTA · 2H20 37. 2g溶於IL燒杯中)，使電泳緩衝液液面剛高出瓊脂糖凝膠面。 (5)電泳、觀察和拍照取第(3)步PCR擴增反應液4ml加樣緩衝液Iml (0. 25%溴酚藍，0.25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml)，加樣後的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳。電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色後的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色螢光條帶。於凝膠成像系統中拍照並保存之。參見附圖1，條帶所示1、2、3、M以此為隨機引物標記擴增康地6 號母本、其雜交種、父本、以及標準帶普的條帶。箭頭所示為0PB05引物擴增的康地6號產生的母本特異標記0PB05條帶大小為310bp，產生的父本特異標記0PB05條帶大小為325bp ； 雜交種的DNA片段中包含父母本的特徵譜帶，因此該引物擴增產物可以區別康地6號母本、 其雜交種、父本，可有效用於鑑定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真偽，可在康地6 號田間制種純度鑑定上進行應用。實施例三鑑定油葵康地7號品種純度的方法。(I)無菌油葵幼苗獲得取康地7號油葵種子，用70%的酒精溶液浸泡lOmin，無菌水衝洗2遍，用10%的過氧化氫溶液消毒30min，再無菌水衝洗2遍，胚端朝上接種於無激素的1/2MS培養基上，培養室溫度為26°C _28°C，光照時間16h，光強2000LX，生長14天。(2)向日葵DNA提取取上述培養2周的向日葵幼嫩真葉於研缽中，加入液氮迅速研磨使成均勻粉狀，在樣品未融化之前加入65°C預熱的CTAB提取液(50 mmol/L Tris-HCl pH8, 0. 7 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH 8，1% CTAB, 20 mmol/L 2-巰基乙醇)500 μ 1，充分混勻後把樣液移入I. 5 ml離心管中，置65°C水浴50 min,其間顛倒離心管數次。取出樣品冷卻至室溫，分別加入等體積的酚/氯仿(I 1)和氯仿/異戊醇 (24 I)進行抽提，4°C 12 000 r/min離心5 min。取上清液加入0. 6倍體積的異丙醇混勻，於室溫放置5 10 min, 12 000 r/min離心5 min,去上清，用100 μ I 70%乙醇洗滌沉澱，置無菌臺吹乾。用雙蒸水溶解DNA沉澱，4°C保存備用。(3) PCR擴增反應及程序取步驟(2) l-5ng DNA，10X反應緩衝液，L 25mmol/LMgCl2, Iu Taq DNA 聚合酶,O. lmmol/L dNTPs, lumol/L Primer (引物 0PB05),反應總體積為20ul。將其放入基因擴增儀擴增，擴增程序為94°C預變性4min; 94°C變性20sec， 37°C退火50sec, 72°C延伸lmin20sec, 40個循環後再於72°C延伸lOmin。(4)膠板的製備待O. 5%瓊脂糖膠溶液冷卻至50°C左右時，加入最終濃度為O. 5 微克/毫升的EB，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固後，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內，加入Ix電泳緩衝液(50XTAE Buffer配製方法稱量Tris 242g，Na2EDTA · 2H20 37. 2g溶於IL燒杯中)，使電泳緩衝液液面剛高出瓊脂糖凝膠面。(5)電泳、觀察和拍照取第(3)步PCR擴增反應液4ml加樣緩衝液Iml (O. 25% 溴酚藍，O. 25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml)，加樣後的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳。電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm 的紫外燈下觀察染色後的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色螢光條帶。於凝膠成像系統中拍照並保存之。參見附圖2，條帶所示1、2、3、M以此為隨機引物標記擴增康地7號其雜交種、母本、父本、以及標準帶普的條帶。箭頭所示為0PB05引物擴增的康地7 號產生的母本特異標記0PB 05條帶大小為450bp，產生的父本特異標記0PB05條帶大小為 880bp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特徵譜帶。因此該引物擴增產物可以區別康地7 號母本、其雜交種、父本，可有效用於鑑定上述油葵雜交種種子的純度，辨別種子的真偽，可在康地6號田間制種純度鑑定上進行應用。
權利要求
1.一種鑑定油葵康地6和7號品種純度的方法，其特徵在於，具體鑑定方法步驟如下(1)油葵DNA提取取培養2周的油葵幼嫩真葉於研缽中，加入液氮迅速研磨使成均勻粉狀，在樣品未融化之前加入65°C預熱的CTAB提取液500 μ I,充分混勻後把樣液移入1.5ml離心管中，置65°C水浴50 min,其間顛倒離心管數次；取出樣品冷卻至室溫，分別加入等體積的酚/氯仿和氯仿/異戊醇進行抽提，其中，酚/氯仿按體積比I :1計，氯仿/ 異戍醇按24 I計,經4°C 12 000 r/min離心5 min ;取上清液加入O. 6倍體積的異丙醇混勻，於室溫放置5-10 min, 12 000 r/min離心5 min,去上清，用100 μ I 70%乙醇洗滌沉澱，置無菌臺吹乾；用雙蒸水溶解DNA沉澱，4°C保存備用；CTAB提取液為50 mmol/L Tris-HCl pH8, O. 7 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH8, 1% CTAB, 20 mmol/L 2-巰基乙醇；(2)PCR擴增反應及程序反應總體積為20ul，其中含IOX反應緩衝液，I. 25mmol/ L MgCl2, Iu Taq DNA 聚合酶，O. lmmol/L dNTPs, lumol/L Primer 引物 0PB05, l_5ng 模板DNA ;擴增程序為94°C預變性4min; 94°C變性20sec，37°C退火50sec，72°C延伸 lmin20sec, 40個循環後再於72°C延伸IOmin ；(3)膠板的製備待0.5%瓊脂糖膠溶液冷卻至50°C左右時，加入最終濃度為0. 5微克 /毫升的EB，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固後，垂直輕拔梳子； 將凝膠放入電泳槽內，加入Ix電泳緩衝液，電泳緩衝液50 X TAE Buffer配製方法稱量 Tris 242g，Na2EDTA · 2H20 37. 2g溶於IL燒杯中，使電泳緩衝液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；(4)電泳、觀察和拍照取4ml上述步驟(2)PCR擴增反應液加樣緩衝液1ml，加樣緩衝液為0. 25%溴酚藍，0. 25% 二甲苯青，40克蔗糖定容至IOOml ;加樣後的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳；電泳完畢，取出凝膠；在波長為254nm的紫外燈下觀察染色後的電泳膠板；DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色螢光條帶，於凝膠成像系統中拍照並保存之；(5)上述步驟以商品油葵品種康地6和7號及其雙親的DNA為模板，進行大量隨機引物分子標記的篩選和重複，獲得了鑑定出能夠同時區分父本、母本和雜交種的隨機引物標記 0PB05，該引物序列 TGCTCCCTTC。
2.如權利要求I所述的鑑定油葵康地6和7號品種純度的方法，其特徵在於，所述的引物0PB05擴增的康地6號產生的母本特異標記0PB05條帶大小為310bp，產生的父本特異標記0PB05條帶大小為325bp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特徵譜帶。
3.如權利要求I所述的鑑定油葵康地6和7號品種純度的方法，其特徵在於，所述的引物0PB05擴增的康地7號產生的母本特異標記0PB05條帶大小為450bp，產生的父本特異標記0PB05條帶大小為880bp ;雜交種的DNA片段中包含父母本的特徵譜帶。
全文摘要
本發明公開了一種鑑定油葵康地6和7號品種純度方法。通過建立了油葵RAPD技術程序，確定PCR擴增反應各組分的優化組合，以油葵品種康地6和7號及其雙親的DNA為模板，獲得能夠同時區分父本、母本和雜交種的引物標記OPB05，擴增的康地7號產生的母本特異標記OPB05條帶大小為450bp，產生的父本特異標記OPB05條帶大小為880bp；雜交種的DNA片段中包含父母本的特徵譜帶；擴增的康地6號產生的母本特異標記OPB05條帶大小為310bp，產生的父本特異標記OPB05條帶大小為325bp；雜交種的DNA片段中包含父母本的特徵譜帶這個引物標記，可有效用於鑑定康地6和7號品種的純度，具有重要應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102690892SQ201210205099
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者李新鵬, 楊勇剛, 段維, 王沛政 申請人:新疆康地種業科技股份有限公司