量子點標記的夾心免疫檢測法及其診斷試劑盒的製作方法
2023-09-22 02:21:25 1
專利名稱：量子點標記的夾心免疫檢測法及其診斷試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用量子點標記的已知抗體定量檢測相應抗原的方法，特別是公開了一種量子點標記的夾心免疫檢測法及其診斷試劑盒，屬於免疫檢測方法技術領域，
背景技術：
與本發明相近的現有技術是雙抗體夾心酶聯免疫分析法(ELISA)或稱為免疫酶定量分析法(IEMA)。見Larue C，et al.Clin.Chem.1993，39972-979.Cardiac-specific immunoenzymometric assay of troponin I in theearly phase of acute myocardial infarction等文章。這類方法是將抗待測抗原的多克隆或單克隆抗體作為捕捉抗體(第一抗體)，用辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶標記的另一株單克隆抗體作為檢測抗體，最後加入酶的底物，通過酶標儀檢測酶作用於底物引起的顏色變化計算出待測抗原的種類及濃度。所有反應均是在pH7.2-7.4，10mM磷酸鹽緩衝液(PBS)中進行的，這種環境有利於抗原-抗體的特異性結合。該法的靈敏度為0.2-1μg/L不等。
現有技術是加入能夠作用於底物引起顏色變化的酶標第二抗體，即檢測抗體，再加入相應酶的底物，反應一定時間後，用酶標儀測定反應產物在某一特定波長的吸光度值，根據已知標準物質的含量計算或直接顯示樣品中待測抗原的濃度。因此操作煩瑣、費時、檢測周期長、顯色不穩定。
發明內容
本發明的目的就是提供一種量子點標記的夾心免疫檢測法，實現多成分標記同時檢測同一樣品中的多種抗原成分。
本發明的進一步目的是提供了相應的診斷試劑盒。
本發明是以QDs納米粒子作為標記物，應用於抗原抗體特異性夾心反應的一種新型夾心免疫檢測法。由於每種QD具有狹窄對稱的螢光譜峰，選用發射不同光的量子點標記針對不同抗原的抗體可同時檢測同一樣品中的多種待測抗原，為解決一種疾病多致病因素時同時需做多次檢測診斷的問題提供可能。
本發明的技術解決方案如下首先將捕捉抗體直接或間接包被在聚苯乙烯板的微孔中，經捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心發光免疫複合體的形成，螢光強度的檢測等過程完成的。
所說的檢測抗體是指用量子點標記的抗待測抗原的單克隆抗體，如果捕捉抗體也是抗待測抗原的單克隆抗體，這兩株單抗應識別待測抗原分子上不同的抗原表位，即具有互補性，能同時結合到同一抗原分子上；量子點則是指能夠發射螢光的具有核殼結構的納米粒子，其核殼由半導體材料包覆而成，其核心部分為CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS等任何一種發光量子點或稱為半導體納米微晶體，其發光顏色因大小不同而異。
所說的包被是利用常規的方法(如ELISA法)將抗待測抗原的單克隆或多克隆抗體作為捕捉抗體直接或通過親和素-生物素系統間接固定在聚苯乙烯微孔上。
所說的三層夾心發光免疫複合體的形成包括兩種形式第一種是指加入待測樣品後，捕捉抗體-抗原先反應形成二元免疫複合物，加入檢測抗體後，再通過抗原與檢測抗體的特異性結合形成捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心的發光免疫複合體；第二種形式是同時加入生物素化的捕捉抗體、待測樣品和檢測抗體後，一步反應直接形成捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心發光免疫複合體並藉助親和素或鏈黴親和素與生物素的特異性結合將該發光免疫複合體固定到聚苯乙烯板的微孔上；所說的螢光強度的檢測是用螢光酶標儀激發並檢測所形成的捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心發光免疫複合物的螢光強度，發不同光的抗體，選用不同波長的光進行檢測，通常樣品中待測抗原濃度越大，被捕捉抗體捕獲的待測抗原的量越多，與之結合的檢測抗體越多，則測得的螢光強度值越大。
上述的待測抗原可以是任何一種蛋白、肽類或其他小分子抗原，可以是心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、胎兒甲種球蛋白(AFP)、B型肝炎表面抗原(HBsAg)等。相應的捕捉抗體和檢測抗體應為特異性抗每種待測抗原的多克隆或單克隆抗體，它們可以是抗心肌肌鈣蛋白I抗體，抗AFP抗體，抗HBsAg抗體等。使用不同的單克隆或多克隆抗體，就可檢測不同的相應的待測抗原。
一種量子點標記的夾心免疫檢測法診斷試劑盒，組成包括包被有捕捉抗體的聚苯乙烯微孔板或包被有親和素的聚苯乙烯微孔板和生物素化的捕捉抗體；量子點標記的檢測抗體；陽性對照血清；陰性對照血清；pH7.2-7.4磷酸鹽緩衝液。
如果捕捉抗體和標記抗體是抗幾種抗原抗體的混合物，則可同時用該試劑盒檢測同一樣品中相應的幾種抗原。
使用方法將每種試劑按說明書稀釋或溶解後按以下流程操作。
1)發光免疫複合體的形成第一種方法是加入待測樣品，37℃溫浴使捕捉抗體-抗原反應形成二元免疫複合物，加入檢測抗體，37℃溫浴使形成捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心的發光免疫複合體；第二種方法是同時加入生物素化的捕捉抗體、待測樣品和檢測抗體，37℃溫浴一定時間後一步反應直接形成捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心的發光免疫複合體並藉助親和素或鏈黴親和素與生物素的特異性結合將該發光免疫複合體固定到聚苯乙烯板的微孔上；2)螢光強度檢測用螢光酶標儀在特定波長範圍內激發並檢測發光免疫複合體的螢光強度。
本發明與傳統螢光染料標記的免疫螢光分析法相比，具有的以下積極效果具有狹窄對稱的螢光譜峰；發射光譜可調，其發射波長可以是單一的，也可以是多重的；對化學物質和生理代謝的降解有很強的抵抗力，光漂白域值高；螢光強度高，可達傳統螢光染料的4-9倍以上。克服了以往的夾心免疫檢測法顯色單一，在多種待檢物同時檢測方面存在的局限性。本法操作簡單易行，不需進一步的顯色反應，即能直接通過螢光酶標儀檢測結果。
本發明還具有以下優點(1)用不同直徑的QDs標記針對不同抗原的抗體能同時檢測同一樣品中的多種抗原成分；(2)本法操作簡單，不需加顯色物質就能檢測待測抗原的含量，即檢測抗體與抗原結合後，通過檢測捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心免疫複合物的螢光強度，直接檢測樣品中待測抗原的吸光度或濃度值，無論操作還是反應均較背景技術少一步，通常只需1-2步即可完成；(3)本法用於標記檢測抗體的量子點能夠發射較傳統螢光染料更強的螢光，且螢光穩定時間長，而背景技術的顯色產物隨時間延長穩定性降低。
圖1.聚苯乙烯微孔中三層夾心結構的樣品及其形成過程示意圖。
圖2.聚苯乙烯微孔中生物素-親和素連接層及三層夾心結構的樣品及其形成過程示意圖。
圖3.用量子點標記的夾心免疫法檢測cTnI標準曲線。
圖4.用量子點標記的夾心免疫法檢測HBsAg標準曲線。
圖5.用量子點標記的夾心免疫法檢測AFP標準曲線。
本發明的三層夾心結構的樣品及其形成過程可以用圖1和圖2形象地表述，所說的三層夾心結構就是捕捉抗體/抗原/檢測抗體的三層分子的夾心結構。
圖1中，1為QDs標記的檢測抗體，2為待測抗原，3為捕捉抗體，4為聚苯乙烯板的微孔，11是三層夾心免疫複合物的形成。
圖2中5為QDs標記的檢測抗體，6為待測抗原，7為捕捉抗體，8為生物素，9為親和素或鏈黴親和素，10為聚苯乙烯板的微孔，12是三層夾心免疫複合物的形成。三層夾心結構中，第一層為捕捉抗體(一抗)，第二層為待測抗原，第三層為檢測抗體(二抗)。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的待批權利要求範圍之內。
實施例1心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的量子點標記的夾心免疫檢測(一)用發紅光的QD630標記抗cTnI單克隆抗體，製備檢測抗體方法1依靠靜電吸引力連接使生物分子連接到QDs表面包覆的一層帶負電荷的游離基團上。方式有a)在QDs外層包覆一層二氫硫辛酸(dihydrolipoic acid，DHLA)，再連接上親和素，以後根據需要將蛋白、核酸甚至細胞膜生物素化，依靠生物素-親和素之間的高度特異性結合力將QDs標記到目標分子上；b)直接將帶正電荷的蛋白連接到QDs上；c)通過一個帶正電荷的亮氨酸拉鏈蛋白為橋將連接在拉鏈另一端的單抗標記上QDs。
方法2共價偶聯a)將QDs包覆一層聚丙烯酸，然後修飾成疏水性的聚丙烯酸酯，再將抗體、鏈黴親和素、或其他蛋白共價偶聯到QDs上；b)將巰基乙酸連接到QDs的外殼上，游離在外的巰基乙酸使QDs具有良好的水溶性，為生物分子的共價偶聯提供了連接位點，又能減少帶負電的蛋白吸附到粒子身上。
方法3包埋將共吸附肽用聚乙烯乙二醇層包覆到QDs上；或者埋入磷脂封閉的共聚合微束中。
方法4親和素一生物素連接法，(具體過程將量子點連接到親和素上，再與生物素化抗體結合。
(二)捕捉抗體的包被方法1直接將捕捉抗體吸附到聚苯乙烯微孔上用包被緩衝液將捕捉抗體稀釋至1-20μg/mL，每孔50-100μL，4℃冰箱過夜或37℃ 2小時，用磷酸鹽緩衝液(PBS，10mmol/L，pH7.2-7.4，含NaCl8.5g/L)洗3次，按200μL/孔加3％BSA，封閉剩餘的位點。
方法2將親和素或鏈黴親和素吸附到聚苯乙烯微孔上用包被緩衝液將親和素或鏈黴親和素稀釋至1-20μg/mL，每孔50-100μL，4℃冰箱過夜或37℃ 2小時，用PBS(10mmol/L，pH7.2-7.4，含NaCl8.5g/L)洗3次，按200μL/孔加3％BSA，封閉剩餘的位點。以後根據需要將捕捉抗體生物素化，依靠生物素-親和素之間的高度特異性結合力將捕捉抗體-抗原-檢測抗體三元發光免疫複合體結合到聚苯乙烯微孔上。
(三)捕捉抗體-抗原-檢測抗體夾心三元發光免疫複合體的形成檢測抗體是能與捕捉抗體同時結合到同一cTnI分子上的另一株單抗，兩者結合cTnI分子上的不同抗原表位。
在第一種包被方式中，加入待測樣品後，37℃ 1小時，包被在聚苯乙烯微孔上的捕捉抗體與cTnI抗原特異性結合，在聚苯乙烯微孔表面形成捕捉抗體-抗原-二元免疫複合物，用PBS(10mmol/L，pH7.2-7.4，含NaCl 8.5g/L)洗3次，去掉非特異性吸附。加入檢測抗體，37℃1小時，後者通過與cTnI抗原的特異性結合在聚苯乙烯微孔表面形成捕捉抗體-抗原-檢測抗體夾心的三元發光免疫複合體，用PBS(10mmol/L，pH7.2-7.4，含NaCl8.5g/L)洗3次，去掉非特異性吸附；在第二種包被方式中，同時將生物素化的捕捉抗體、待測樣品、檢測抗體加入聚苯乙烯微孔中，37℃ 1小時，所形成的捕捉抗體-抗原-檢測抗體夾心的三元發光免疫複合體通過生物素-親和素之間的高度特異性結合連接到聚苯乙烯微孔上，用PBS(10mmol/L，pH7.2-7.4，含NaCl8.5g/L)洗3次，去掉非特異性吸附。
(四)定量螢光檢測量子點標記的夾心免疫檢測法的測定原理是通過檢測結合到聚苯乙烯微孔上的捕捉抗體-抗原-檢測抗體夾心的三元免疫複合物的螢光強度來實現對待測物質的檢測的。可直接顯示或與標準曲線對比求出樣品中cTnI的濃度。結合到聚苯乙烯微孔上的量子點標記的檢測抗體數量不同，產生的螢光強度不同。通常捕捉抗體捕捉的待測抗原的量越多，與之結合的檢測抗體越多，則測得的濃度或螢光強度值越大。
選用560±27.5nm的激發波長和635±10nm的發射波長可得到該種量子點的最大發射和吸收光譜，發射光為紅色。幾乎所有螢光酶標儀都能直接顯示濃度值，如不能顯示，則需繪製標準曲線將已知cTnI含量的標準溶液配製成由低至高5種不同濃度，用與待測標本相同的方法，即重複第(二)、(三)步驟的操作，測定每種濃度的標準溶液對應的螢光強度，以cTnI濃度為橫坐標，螢光強度為縱坐標，繪製標準曲線，見圖3。
實施例2心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的量子點標記的夾心免疫檢測法的特異性(驗證方法的特異性)為了說明該夾心免疫檢測結果的特異性，用BSA代替cTnI作為待測抗原進行免疫檢測，重複實施例1的全過程。實施例2中，所用的抗cTnI單克隆或多克隆抗體與BSA是非配對抗原抗體或非相關抗體，不具有選擇性的識別作用，因此，不能特異性結合，也不能形成三層夾心的發光免疫複合體，即不能測到螢光，說明待檢樣品中不含有cTnI，實驗結果表明，樣品中的非相關蛋白不會引起非特異性反應，該夾心免疫檢測法具有高度特異性。
實施例3B型肝炎表面抗原(HBsAg)的量子點標記的夾心免疫檢測如同實施例1的各步操作，不同的是捕捉抗體和檢測抗體為抗HBsAg的單克隆抗體或多克隆抗體，待檢抗原只能是HBsAg；所用量子點為發黃光的QD570，螢光酶標儀的激發光波長為460nm，發射光為黃色，發射波長為570±10nm。同樣將含有HBsAg的標本作為待檢樣品，通過檢測螢光強度，直接顯示或與標準曲線對比求出樣品中HBsAg的濃度，見圖4。
實施例4胎兒甲種球蛋白(AFP)的量子點標記的夾心免疫檢測如同實施例1的各步操作，不同的是捕捉抗體和檢測抗體為抗AFP的單克隆或多克隆抗體，待檢抗原只能是AFP；所用量子點為發綠光的QD535，螢光酶標儀的激發光波長為480±20nm，發射光為綠色，發射波長為535±10nm。同樣將含有AFP的標本作為待檢樣品，通過檢測螢光強度，直接顯示或與標準曲線對比求出樣品中AFP的濃度，見圖5。
實施例5一次同時檢測同一樣品中cTnI、HBsAg、AFP的量子點標記的夾心免疫檢測如同實施例1的各步操作，不同的是捕捉抗體是抗cTnI、HBsAg、AFP抗體的混合物；檢測抗體是分別用QD630、QD570、QD535標記的抗cTnI、HBsAg、AFP單克隆抗體的混合物，待檢抗原是TnI、HBsAg、AFP；檢測cTnI時，螢光酶標儀的激發光波長為560nm，發射光為紅色，發射波長為650±10nm；檢測HBsAg時，螢光酶標儀的激發光波長為460nm，發射光為黃色，發射波長為570±10nm；檢測AFP時，螢光酶標儀的激發光波長為480±20nm，發射光為綠色，波長為535±10nm。
同樣將含有cTnI、HBsAg、AFP的標本作為待檢樣品，通過檢測螢光強度，直接顯示或與標準曲線對比求出樣品中cTnI、HBsAg、AFP的濃度。
該實施例所得標準曲線與上述單獨檢測每種單一抗原的結果幾乎完全一致，說明用本法同時檢測同一樣品中的多種抗原時，彼此不會產生幹擾，這裡不再單獨繪製標準曲線。
實施例6心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的量子點標記的夾心免疫檢測試劑盒組成包被有抗cTnI的單克隆或多克隆抗體的聚苯乙烯微孔板(酶標板)，或包被有親和素的聚苯乙烯微孔板和生物素化的抗cTnI的單克隆或多克隆抗體；發綠光的QD630標記的抗cTnI的單克隆抗體；cTnI陽性對照血清；cTnI陰性對照血清；pH7.2-7.4磷酸鹽緩衝液。
試劑盒中每個組分的製備及使用方法、標準曲線的繪製同實施例1。
實施例7一次同時檢測同一樣品中cTnI、HBsAg、AFP的量子點標記的夾心免疫檢測試劑盒組成包被有抗cTnI、HBsAg、AFP的單克隆或多克隆抗體混合物的聚苯乙烯微孔板(酶標板)，或包被有親和素的聚苯乙烯微孔板和生物素化的抗cTnI、HBsAg、AFP的單克隆或多克隆抗體的混合物；分別用QD630、QD570、QD535標記的抗cTnI、HBsAg、AFP單克隆抗體的混合物，；cTnI陽性對照血清；cTnI陰性對照血清；pH7.2-7.4磷酸鹽緩衝液。
試劑盒中每個組分的製備及使用方法、標準曲線的繪製同實施例5。
權利要求
1.一種量子點標記的夾心免疫檢測法，其特徵在於將捕捉抗體直接或間接包被在聚苯乙烯板的微孔，形成三層夾心發光免疫複合體，用螢光酶標儀激發並檢測所形成的捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心發光免疫複合物的螢光強度，通過與標準溶液對比求出待測抗原的濃度。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於三層夾心發光免疫複合體的形成是加入待測樣品後，捕捉抗體-抗原先反應形成二元免疫複合物，加入檢測抗體後，再通過抗原與檢測抗體的特異性結合形成捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心的發光免疫複合體。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於三層夾心發光免疫複合體的形成是同時加入生物素化的捕捉抗體、待測樣品和檢測抗體後，一步反應直接形成捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心發光免疫複合體並藉助親和素或鏈黴親和素與生物素的特異性結合將該發光免疫複合體固定到聚苯乙烯板的微孔上。
4.根據權利要求1或2、3所述的檢測方法，其特徵在於所說的檢測抗體是指用量子點標記的抗待測抗原的單克隆抗體，選用發射不同光的量子點標記針對不同抗原的抗體可同時檢測同一樣品中的多種待測抗原。
5.根據權利要求1或2、3所述的檢測方法，其特徵在於量子點則是指能夠發射螢光的具有核殼結構的納米粒子，其核殼由半導體材料包覆而成，其核心部分為CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS等任何一種發光量子點或稱為半導體納米微晶體，其發光顏色因大小不同而異。
6.根據權利要求1或2、3所述的檢測方法，其特徵在於捕捉抗體也是抗待測抗原的單克隆抗體，這兩株單抗應識別待測抗原分子上不同的抗原表位，即具有互補性，能同時結合到同一抗原分子上。
7.根據權利要求1或2、3所述的檢測方法，其特徵在於所說的用螢光酶標儀激發並檢測所形成的捕捉抗體-抗原-檢測抗體三層夾心發光免疫複合物的螢光強度是指用不同QDs標記的檢測抗體經螢光酶標儀激發後發射出不同顏色的光譜，在每種光譜的最大吸收波長範圍內檢測其螢光強度。
8.根據權利要求1或2、3所述的檢測方法，其特徵在於上述的待測抗原可以是任何一種蛋白、肽類或其他小分子抗原，可以是心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、胎兒甲種球蛋白(AFP)、B型肝炎表面抗原(HBsAg)等；相應的捕捉抗體和檢測抗體應為特異性抗每種待測抗原的多克隆或單克隆抗體，它們可以是抗心肌肌鈣蛋白I抗體，抗AFP抗體，抗HBsAg抗體等；使用不同的單克隆或多克隆抗體，就可檢測不同的相應的待測抗原。
9.一種量子點標記的夾心免疫檢測法診斷試劑盒，其特徵在於組成包括包被有捕捉抗體的聚苯乙烯微孔板或包被有親和素的聚苯乙烯微孔板和生物素化的捕捉抗體、量子點標記的檢測抗體、陽性對照血清、陰性對照血清、pH7.2-7.4磷酸鹽緩衝液。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特徵在於捕捉抗體和標記抗體是抗幾種抗原的抗體混合物，用該試劑盒同時檢測同一樣品中相應的幾種抗原。
全文摘要
本發明公開一種量子點標記的夾心免疫檢測法及診斷試劑盒，是以QDs納米粒子作為標記物，應用於抗原抗體特異性夾心反應的一種新型夾心免疫檢測法。首先將捕捉抗體直接或間接包被在聚苯乙烯板的微孔中，經捕捉抗體－抗原－檢測抗體三層夾心發光免疫複合體的形成，螢光強度的檢測等過程完成的。根據每種QD具有狹窄對稱的螢光譜峰，選用發射不同光的量子點標記針對不同抗原的抗體可同時檢測同一樣品中的多種待測抗原，為解決一種疾病多致病因素時同時需做多次檢測診斷的問題提供可能。本法操作簡單易行，不需進一步的顯色反應，直接通過螢光酶標儀測定檢測結果；所發射的螢光譜峰狹窄，靈敏度高；螢光強度高，穩定時間長。
文檔編號G01N33/577GK1515909SQ0312711
公開日2004年7月28日 申請日期2003年8月27日 優先權日2003年8月27日
發明者魏景豔, 房學迅, 李善玉, 楊柏, 王麗萍 申請人:魏景豔