增加骨的韌性和勁度以及減少骨折的方法

2023-09-22 03:27:45 2

專利名稱：增加骨的韌性和勁度以及減少骨折的方法
技術領域：
本發明涉及一種服用甲狀旁腺素而增加骨的韌性和/或勁度的方法、和/或減少骨折的可能性和/或嚴重性的方法。尤其是，本發明涉及在潛在的或實際的損傷部位中增加骨的韌性或勁度的方法，該損傷部位例如有骨質疏鬆危險性或患有骨質疏鬆的人的髖關節或脊柱。更具體的是，本發明涉及減少脊椎骨折的發生、減少多發性脊椎骨折的發生、減少脊椎骨折的嚴重性、和/或減少非脊椎骨折的發生的方法。
背景技術：
現有的一些試劑諸如雌激素、膦酸二酯、氟化物或降鈣素可預防骨質丟失並通過再充填重建空間而增加3-5％骨質，但是不會明顯刺激淨骨形成。通過阻止骨轉換而保持的骨不能顯著防止已經有明顯骨質丟失的病人患骨折的危險性。通過刺激骨形成而增加骨強度的合成代謝劑優選的是可更好地防止已經患有骨質疏鬆的病人的骨折。
甲狀旁腺素(PTH)是哺乳動物甲狀旁腺分泌的、84胺基酸產物，它通過對包括骨在內的各種組織的作用來控制血清鈣水平。牛和人PTH(PTH(1-34))的N末端34胺基酸在生物學上被認為是與全長激素等價的。現已證實激活PTH/PTHrP受體(PTH1受體)的PTH(例如包括1-31和1-38)、或PTHrP(PTH相關性的肽/蛋白質)、或者兩者中任一或兩者的類似物的其它氨基末端片段對骨質具有相似的生物作用，但這些作用的大小可以不同。
對人體中各種形式PTH的研究已證實了骨具有合成代謝作用，並且對其用於治療骨質疏鬆和相關的骨疾病引起了顯著的興趣。在許多動物模型和人中已證實PTH對骨的顯著合成代謝作用(包括刺激骨形成)可增加骨質和/或骨強度。
通常認為對人和相關動物模型使用PTH對皮質骨具有副作用。事實上，出現在甲狀旁腺機能亢進疾病中的內源性PTH的自然增加可導致皮質骨變薄、並伴有小梁骨的連接性增強和小梁骨質增加。過去的研究提示，當Haversian皮質骨(發現於人和高級哺乳動物)在PTH的影響下重建時，將會出現骨的再分布從而使皮質骨的骨質和強度增加、同時小梁骨的骨質和強度亦增加。例如，在發表的用PTH的臨床研究中，用外源性PTH治療後皮質骨的骨質減少了，這些發現引起了關注，即PTH的治療將導致皮質骨的骨質和強度降低。因這些研究而引起的關注之一是由於皮質骨的丟失將導致總骨骼的骨質的丟失。這在臨床上相應的是在骨質疏鬆中，小梁骨與皮質骨相比丟失更大，意味著機械負荷主要由皮質骨承擔。皮質骨的連續丟失將增加骨折的危險性。因此，骨質疏鬆的治療劑對於保持或增加主要的剩餘皮質骨是很重要的。
已經在非人動物中用Haversian模型進行了有關PTH對皮質骨的影響的調查研究，這些動物例如狗、雪貂、綿羊和猴，但是這些樣本的研究範圍對於數據統計分析的可靠性確實是太小了。由PTH治療導致的變化對這些動物的皮質骨的機械性能的影響仍然是未知的。已發表的對齧齒動物的研究表明，在用PTH期間皮質骨骨質增加了、但停用PTH後此增加又消失了。然而，齧齒動物的皮質骨與Haversian皮質骨具有明顯不同的結構，並且通過表面添附成形和吸收而進行重建、而不是通過骨單位的皮質內重建而重建。而且，當一種試劑例如PTH改變骨的幾何形狀使骨變粗時，對齧齒動物的較短的骨的生物力學測試的工藝限制，使測量產生偽像。這些偽像從推斷大鼠的皮質骨未反應出人或其它動物的皮質骨基本骨單位重建的不安全性。因此，對諸如人的動物進行Haversian重建的現有數據表明，PTH對皮質骨可能具有副作用，從而因皮質骨的耗盡最後引起骨質丟失。
為此，人們普遍認為PTH的作用是患者需要同時或隨後用抗吸收劑治療才能使由PTH所致的骨質丟失達到最少。實際上，此模式已成為對婦女進行臨床研究的基礎。例如，對於子宮內膜異位，三種臨床研究已經在絕經後婦女中使用PTH時同時用降鈣素或雌激素治療，或者在服用GnRH拮抗劑、醋酸那法瑞林的絕經前婦女中使用PTH。雌激素和PTH對皮質骨轉換的反作用使得在用這兩種試劑聯合治療期間僅僅觀察PTH的作用特別困難。
現在仍然需要一種使用PTH使具有Haversian重建的人和其它動物的骨增加韌性和勁度的方法，和減少這些動物發生骨折的方法。而且，還需要一種增加皮質骨的質量和數量的方法。
發明概述本發明包括一種通過使用甲狀旁腺素而增加骨(優選皮質骨)的韌性和/或勁度的方法、和/或減少骨折的發生和/或嚴重性的方法。尤其是，本發明涉及增加骨的潛在或實際的損傷部位的韌性或勁度的方法。對於本領域的技術人員來說，增加骨的韌性和/或勁度可以用已知的許多方法來實現，例如增加骨礦物質密度、增加骨礦物質含量、增加斷裂功，等等。在一個實施方式中，本發明的方法可減少脊椎骨折和/或非脊椎骨折的發生。本發明的方法可用於降低這些骨折的危險性或治療這些骨折。尤其是，本發明的方法可減少脊椎骨折和/或非脊椎骨折的發生、減少脊椎骨折的嚴重性、減少多發性脊椎骨折的發生、提高骨的質量，等等。
該方法可增加潛在損傷部位的韌性或勁度，例如患骨質疏鬆的人的髖關節或脊柱；或者使骨質異常缺乏或差的骨結構的部位增加韌性或勁度。該方法還可增加諸如骨折之類的實際損傷部位的骨韌性或勁度，例如髖關節或脊椎。用本發明方法的優選病人是有骨質疏鬆危險或患有骨質疏鬆的婦女或男子，優選絕經後婦女，並且不依賴於同時使用激素替代療法(HRT)、雌激素或同等療法、或抗吸收劑療法。在一個實施方式中，患者也可接受鈣和/或維生素D的補充治療。
甲狀旁腺素例如重組的人甲狀旁腺素的N末端胺基酸1-34可以周期性或者間歇給藥。周期性給藥方式優選的是包括用PTH的2個或更多個重建周期以及停用PTH一個或更多個重建周期。另外，根據本發明的方法，最後用甲狀旁腺素後，骨的韌性和/勁度的增加可保持數個重建周期、或者直至數年。
附圖的簡要說明

圖1A和1B表示用兩種劑量的PTH治療的動物在股骨中段(皮質骨)(A)和在近端股骨(網狀骨質骨+皮質骨)(B)中的BMD(骨礦物質密度)和BMC(骨礦物質含量)明顯大於對照組。
圖2A和2B表示PTH對股骨中段的皮質骨中的機械強度和截面慣性矩(CSMI)的影響。
圖3表明對照組和治療組中的全身骨礦物質含量的DXA測定的百分比變化。
圖4A-C表明對照組和治療組的脊柱做DXA測定的百分比變化、2-4腰椎骨的面積(A)、骨礦物質含量(B)和骨礦物質密度(C)的百分比變化。
圖5A和5B表明用甲狀旁腺素治療的靈長目的腰椎中的骨質(A)和骨強度(B)的增加。
圖6A和6B表明用甲狀旁腺素治療的靈長目的肱骨骨幹中段的恆定強度(B)和股骨頸的強度(A)的增加。
圖7表明肱骨中段的骨膜表面和骨內膜表面上的骨形成率的活動。
圖8表明PTH治療與對照組相比的腰椎骨中的骨體素密度改變的直方圖分析。注意停用PTH治療後皮質骨腔隙中的密度增加。
圖9表明與用安慰劑治療的對照組相比、通過用PTH20μg/kg/天或PTH40μg/kg/天治療23個月的病人的腰棘BMD的增加。
圖10表明與用安慰劑治療的對照組相比、通過用PTH20μg/kg/天或PTH40μg/kg/天治療24個月的病人的股骨和髖關節頸的BMD的增加。
詳細說明本發明涉及一種使用甲狀旁腺素而增加骨的韌性和/或勁度的方法、和/或減少骨折發生率的方法。本方法可用於增加潛在的損傷部位或實際的損傷部位的骨的韌性或勁度。該損傷一般包括骨折、外科損傷、關節復位、矯形外科方法，等等。增加骨的韌性/或勁度一般包括增加皮質骨的礦物質密度、增加骨的強度、增加抗負荷強度，等等。減少骨折的發生一般包括與未治療的對照人群相比，減少病人骨折的可能性或實際發生。
在本文中，極限壓力是指骨樣品所承受的最大壓力；勁度是指負荷變形曲線的線性部分的斜率；斷裂功是指斷裂前負荷形成曲線下的面積。通過骨研究領域的標準方法可對上述每一項進行測定和計算。這些參數是根據固有物質性能和幾何形狀而確定的結構特性，可根據Turner CH.Burr DB 1993「骨的基本生物力學測定指南(tutorial)」《骨》14595-608所述的方法測定，該文獻為本發明作參考文獻。可使極限壓力、勁度和斷裂功正規化以得到固有物質性能，例如極限應力、彈性模量和韌性，它們不依賴於大小和形狀。在本文中，極限應力是指樣品可承受的最大應力；彈性模量是指物質的固有勁度；韌性是指每單位體積抗骨折的強度。每一項都可以通過本領域已知的方法確定。同前。本文所指的股骨的骨強度通常使用較後部位的三點或四點彎曲、在股骨頸或在股骨體中段進行測量。骨損傷本發明方法有益於可能患有或已經患有一處或多處骨折的患者。該方法可有益於哺乳動物患者，例如人、馬、狗和貓，尤其是人。骨的損傷可能是賽馬和狗的一大問題，也可能是家畜的一個問題。人可因意外、醫療手術、疾病或紊亂而患各種骨損傷。年輕時，骨損傷可能是由於骨折、修復骨折的醫療手術、或修復被損傷的關節或結締組織而致，例如通過運動。骨損傷的其它形式在老年人中最多見，例如由骨質疏鬆、變性性骨疾病(例如關節炎或骨關節炎)、髖關節復位或與其它系統疾病(糖皮質類固醇骨質疏鬆、燒傷或器官移植)的治療相關的繼發性疾病而致的損傷。
優選的患者包括有骨質疏鬆危險性或患有骨質疏鬆的人(優選婦女)。骨質疏鬆的危險因素在本領域是已知的，包括男子和婦女的性腺功能減退性疾病(不論年齡、健康狀況、誘導性腺功能減退的疾病或藥物)、與骨質疏鬆有關的營養因素(最常見鈣或維生素D低下)、吸菸、飲酒、與骨丟失有關的藥物(例如糖皮質類固醇、甲狀腺素肝素鈉、鋰、抗驚厥藥等)、傾向下垂的視力下降、宇宙航行、固定術、長期住院或臥床休息、以及與骨質疏鬆危險性增加有關的其它系統疾病。存在骨質疏鬆的症狀在本領域是已知的，包括至少一種脊椎壓迫骨折的放射跡象、低骨質(特別是至少低於年輕人正常的平均值1個標準差)和/或無創傷骨折。
骨質疏鬆可導致脊椎和/或非脊椎骨折。非脊椎骨折的例子包括髖關節骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。本發明方法可用於減少這些骨折的危險性或治療這些骨折。通過增加骨(例如髖關節、脊柱或該兩者)的強度和/或勁度可降低骨折的危險性並有助於骨折的癒合。代表性的有患骨質疏鬆危險的婦女是絕經後婦女或絕經前婦女、性腺功能減退婦女。優選的患者是絕經後婦女，且與同時進行激素替代法(HRT)、雌激素或等同治療、或抗吸收治療無關。本發明方法對任何階段的骨質疏鬆患者都是有效的，尤其是對早期和晚期階段。
本發明尤其是提供了一種有效預防或降低患有骨質疏鬆或有骨質疏鬆加重危險的患者的骨折的發生。例如，本發明可降低脊椎或非脊椎骨折的發生、減小脊椎骨折的加重、降低多發性脊椎骨折的發生、提高骨的質量，等等。在另一個實施方式中，本發明方法對低骨質的患者或以前有骨折將來有多發性骨折危險的患者有效，例如脊柱骨折可能發展快的患者。
其他患者也可有骨損傷危險，對這樣的患者本發明方法也有效。例如，許多有上述一種或多種骨折的患者可先期進行外科治療骨損傷、或可在異常的低骨質或差的骨結構或礦物質缺乏的骨骼部位的骨進行矯形外科術。例如，外科術後的骨功能可用本發明方法得到恢復，該外科術例如關節復位(如膝或髖關節)或脊柱拉緊、或固定骨或骨骼的其它方法。本發明方法也可幫助在骨質異常缺乏或骨結構差的部位的骨進行手工矯形外科術後的恢復，該手術包括骨的外科切斷，包括切骨術、關節復位，其中骨結構的丟失需要形成髖臼架，並防止修復偏移來進行重建。實施本發明的其他適合的患者包括那些患有甲狀旁腺機能減退或脊柱後凸的患者，他們患有與甲狀旁腺機能減退或進行性脊柱後凸有關或由其引起的損傷。骨的韌性和勁度本發明方法通過增加骨的韌性、勁度或其二者而降低損傷的危險性或幫助損傷恢復。一般說，骨的韌性或勁度是由皮質骨、小梁骨和網狀骨質骨的質量和強度形成的。本發明方法可提供正常人範圍之內或之上的骨韌性、勁度、質量、和/或強度的水平。優選的是，本發明提高了導致損傷或產生損傷危險性的參數水平。與未治療的對照人群相比，增加了韌性、勁度、或兩者，或減少了骨折的危險性或可能性。
當骨的某些特徵增強時，則可增強骨的韌性和/或勁度。這些特徵包括骨礦物質密度(BMD)、骨礦物質含量(BMC)、活化頻率或骨形成率、小梁數、小梁厚度、小梁的連接性和其它連接性、骨膜的和骨內膜的骨形成、皮質孔、截面骨面積和骨質量、抗負荷的強度和/或斷裂功。本發明方法的效果優選是這些特徵中的一種或多種特徵的增強。
骨的某些特徵如髓間隙和彈性模量降低時可增強骨的韌性和/或勁度。年輕人(柔韌和強勁)的骨含有的晶粒通常小於老年人骨的晶粒。因此，一般來說減小骨晶粒的大小可增加骨的韌性和勁度，並降低骨折的發生。另外，骨的晶粒成熟可提供其它所需的特徵(包括增加骨的韌性和勁度)和/或減少骨折的發生。本發明方法的效果優選是增強這些特徵中的一種或多種。
本發明方法可有效地增強幾種骨的韌性和/或勁度。例如，髖關節骨如髂骨、大腿骨如股骨、脊柱如脊椎的骨、或臂骨如遠端前臂骨或近端肱骨。韌性和/或勁度增強可以是整個骨、或局限於骨的某些部分增強。例如，通過增強股骨頸或股骨轉子的韌性和/或勁度可增強股骨的韌性和/或勁度。通過增強髂嵴或髂棘的的韌性和/或勁度可增強髖關節的韌性和/或勁度。通過增強脊椎根、脊椎板或脊椎體的韌性和/或勁度可增強脊椎的韌性和/或勁度。該作用優先產生於脊柱某些部分的脊椎，例如頸椎、胸椎、腰椎、骶椎和/或尾椎。優選的是該作用產生於一個或多個中段胸椎和/或上腰椎。
這種韌性和/或勁度的增強可見於每一類型的骨中，或主要在一種類型骨中。骨的類型包括海綿狀的(網狀骨質的、小梁的或層狀的)骨和緻密的(皮質的或稠密的)骨和骨折骨痂。本發明方法優選通過作用於網狀骨質骨或單獨作用於皮質骨而增強韌性和/勁度。通過本發明方法也可使小梁骨變得柔韌和/或有勁度，該小梁骨附著有結締組織。例如，在附著韌帶、腱和/或肌肉的部位優先具有附加的韌性。
本發明的另一方面，增強韌性或勁度可降低骨折的發生。在這方面，增強韌性或勁度可包括減少脊椎骨折的發生、減少重度骨折的發生、減少中度骨折的發生、減少非脊椎骨折的發生、減少多發性脊椎骨折的發生、或其組合。甲狀旁腺素作為活性成分，組合物或溶液可加入甲狀旁腺素的全長、84胺基酸型，尤其是人的hPTH(1-84)型，可通過重組、肽合成或從人的體液提取得到。例如參見本發明的參考文獻美國專利號5,208,041。Kimura等在《生物化學生物物理研究會》114(2)493中報導了hPTH(1-84)的胺基酸序列。
上述組合物或溶液也可含有作為活性成分的人PTH或具有人PTH活性的大鼠、豬或牛的PTH片段或片段的變體，已由Kimmel等《內分泌學》1993，32(4)1577報導的在卵巢切除的骨質疏鬆大鼠模型中作了測定。
甲狀旁腺素片段需要至少含有第一28N末端殘基，例如PTH(1-28)、PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)和PTH(1-41)。PTH變體的各種形式含有1-5胺基酸取代基，它提高了PTH穩定性和半衰期，例如用亮氨酸或其它疏水胺基酸代替8和/或18位的蛋氨酸殘基可提高PTH抗氧化的穩定性，用胰蛋白酶不敏感的胺基酸如組氨酸或其它胺基酸代替25-27區域內的胺基酸可提高PTH抗蛋白酶的穩定性。PTH的其它適合形式包括PTHrP、PTHrP(1-34)、PTHrP(1-36)和PTH的類似物或激活PTH1受體的PTHrP。這些PTHrP的形式均包含在本文一般所用的術語「甲狀旁腺素」中。該激素可通過已知的重組或合成方法得到，如在美國專利號4,086,196和5,556,940中所述，該文獻為本發明的參考文獻。
優選的激素是人PTH(1-34)，也叫做特立帕肽(teriparatide)。在美國專利申請序列號60/069,075中描述了可用於本發明方法中的人PTH(1-34)的穩定溶液，如重組的人PTH(1-34)(rhPTH(1-34))，該文獻為本發明的參考文獻。在美國專利申請序列號60/069,875中描述了可用於本發明方法中的人PTH(1-34)的晶體形式，該文獻為本發明的參考文獻。使用甲狀旁腺素的方法甲狀旁腺素通常以本領域已知的方法和劑型通過非腸道方式給藥，優選皮下注射。在本發明參考文獻美國專利申請序列號60/069,075中描述了可優先用於本發明方法中的人PTH(1-34)的穩定製劑。該專利申請還描述了可儲藏和使用甲狀旁腺素的許多其它製劑形式。甲狀旁腺素的穩定溶液可含穩定劑、緩衝劑、防腐劑，等等。
用於溶液或組合物中的穩定劑包括多羥基化合物，包括糖類，優選單糖或二糖，例如葡萄糖、海藻糖、棉子糖或蔗糖；糖醇，例如甘露糖醇、山梨糖醇或肌醇；以及多元醇，例如甘油或丙二醇或其混合物。優選的多羥基化合物為甘露糖醇或丙二醇。多羥基化合物的濃度範圍可以是佔總溶液的約1-約20重量份％，優選約3-10％。
用於本發明的溶液或組合物中的緩衝劑可以是藥學上可接受的任何酸或鹽的組合、且可使水溶液的pH保持3-7的範圍，優選3-6。有用的緩衝系統例如有以醋酸鹽、酒石酸鹽或檸檬酸鹽為原料的。優選的緩衝體系是以醋酸鹽或酒石酸鹽為原料的，最好的原料是醋酸鹽。緩衝的濃度可以是約2mM-約500mM的範圍，優選約2mM-100mM。
本發明的穩定溶液或組合物也包括腸道外可接受的防腐劑。這些防腐劑包括例如甲酚、苄醇、苯酚、氯苄烷銨、氯化苄乙氧銨、氯丁醇、苯基乙基醇、羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、乙基汞硫代水楊酸鈉以及硝酸苯汞和乙酸苯汞。優選的防腐劑上甲氧甲酚或苄醇，最佳優選是甲氧甲酚。防腐劑的用量可以佔總溶液的約0.1-約2重量份％，優選約0.3-約1.0重量份％。
因此，穩定的teriparatide溶液可含有甘露糖醇、乙酸鹽和甲氧甲酚，5℃時的預期半衰期大於15天。
如需要，甲狀旁腺素組合物可以是含不多於2％重量水的粉劑形式，這可通過將所選擇的甲狀旁腺素與上述的緩衝劑和穩定劑混合製備成無菌的激素水溶液進行冷凍乾燥而得到。當製備凍乾粉末時特別用作緩衝劑的是以酒石酸鹽為原料的。尤其有用的穩定劑包括甘氨酸、蔗糖、海藻糖和棉子糖。
另外，甲狀旁腺素可以用本領域所用的典型緩衝劑和賦形劑製備以穩定和加溶非腸道給藥的蛋白質。本領域已知的藥物載體及其製劑在Martin「Remington的藥物科學」第15版，Mack出版公司，Easton(1975)中已經有描述。甲狀旁腺素也可經肺、口、鼻、用栓劑或口服製劑給藥。
將甲狀旁腺素配製成給藥有效劑量，即可增加患者一處或多處骨的韌性和/或勁度、和/或減少骨折的可能性和/或嚴重性的劑量。優選的是，有效量能改善皮質骨的結構、質量和/或強度。優選的有效量能減少脊椎骨折的發生、減少多發性脊椎骨折的發生、減少脊椎骨折的嚴重、和/或減少非脊椎骨折的發生。優選的是，一個接受甲狀旁腺素治療的患者也使用有效量的鈣和維生素D，它們可加強激素的作用。甲狀旁腺素的代表性有效量為大於約5μg/kg/天，尤其是用於人時，但該劑量可大到約10-40μg/kg/天，或者更大的劑量尤其是對增加皮質骨的韌性或勁度、或降低骨折的發生是有效的。患有甲狀旁腺機能減退的患者需要附加或較高劑量的甲狀旁腺素；這種患者還需要激素的替代療法。甲狀旁腺機能減退的替代療法所需的劑量在本領域是已知的。在某些情況下，PTH的相對效果可在小於約5μg/kg/天的劑量下觀察到，或者甚至小於約1μg/kg/天。
該激素可按常規給藥(如每天或每周一次或多次)、間歇給藥(如一天或一周內不規則)或周期性給藥(如有規律地幾天或幾周為一周期給藥、然後停藥一周期)。優選的是，對於骨質疏鬆患者，1-7天PTH每天給藥一次，一周期3個月-3年。周期性使用甲狀旁腺素優選的方案是使用至少2個重建周期、再停用至少1個周期。另一個優選的方案包括至少用約12-約24個月、再停用至少6個月。在沒有附加給藥的情況下，數月給藥的效果可維持一年或兩年或更長。甲狀旁腺素製劑的應用本發明還包括含有本發明藥物組合物且根據本發明方法使用的試劑盒。該試劑盒包含一個小瓶，此小瓶含有乾燥或液體形式的本發明製劑和適合的載體。該試劑盒還包括以小瓶上標籤的形式和/或以包含在包裝小瓶的盒子中的插頁的形式的說明書，用以說明化合物的用途和給藥方法。該說明書可印在包裝小瓶的盒子上。說明書包含諸如足夠劑量和用法等有關信息、以便本領域工作者使用該藥物。本領域的工作者包括任何可能使用該藥物的醫生、護士或技術人員。
本發明還涉及一種藥物組合物，該組合物包括一種或多種甲狀旁腺素的製劑，例如人PTH(1-84)或人PTH(1-34)，並且適用於腸道外給藥。本發明的一種或多種甲狀旁腺素(例如人PTH(1-84)或人PTH(1-34))的製劑可用於製備適用於通過腸道外給藥的組合物或藥物。本發明還涉及製備適用於腸道外給藥形式的組合物的方法，該組合物包括一種或多種甲狀旁腺素(例如人PTH(1-84)或人PTH(1-34))的製劑。例如，採用常規技術、可以按幾種方式製備液體或固體製劑。液體製劑可通過以下方法製備即將一種或多種甲狀旁腺素例如人PTH(1-84)或人PTH(1-34)溶解在適當的pH、包括緩衝劑或其它賦形劑在內的適合的溶劑(例如水)中，形成上述的一種穩定溶液。
下面的實施例是對本發明進行舉例說明、而不是限制本發明。
實施例實施例1 通過給兔使用rhPTH(1-34)以增強骨的強度和密度實驗方法將一組最小的動物、接近9個月齡且重3.25-3.75kg的未受損的雌性紐西蘭白兔(HRP Inc.Denver，Pa.)按平均組體重分成3組，每組6隻動物，通過皮質內重建形成骨單位。兩個實驗組接受劑量為10或40μg/ml/kg/天的生物合成PTH(1-34)治療。對照組按1.0ml/kg/天給予含2％熱滅活兔血清的酸化0.9M鹽水。每天一次皮下注射PTH(1-34)或載體，一周5天，共140天。用含0.5％Ca和0.41％P的兔用實驗室食物飼養兔，並自由飲水。
選擇的劑量是根據一系列初步研究，結果表明(1)按100μg/kg單獨注射PTH(1-34)後，血清鈣升高且24小時不回到基線值，而按50μg/kg的劑量單獨注射後，血清鈣在24小時內回到基線值，(2)按20μg/kg重複注射PTH(1-34)導致血清鈣短暫升高、並6-24小時回到基線值，以及(3)按小於5μg/kg注射PTH(1-34)不改變骨表面的組織形態測定。
處死之前，在第55天和第63天按20mg/kg肌內注射一種雙茜素標記物(Sigma，St.Louis)、在第15天和第7天按5mg/kg皮下注射一種雙鈣黃綠素標記物(Sigma，St.Louis)。按隨意順序用CO2麻醉兔，最後一次注射後約3-6小時，通過心臟穿刺然後腹膜內注射苯巴比妥(100mg/kg)處死動物，取血。去除右側肱骨、雙側股骨、腰椎(L3-L5)和右側脛骨。血液化學通過計算機多道血清分析測定血清鈣、磷、鹼性磷酸酶、肌酸和脲氮。組織形態測定在脛骨體中段的皮質骨和L3網狀骨質骨上進行組織形態測定。處死後，從每隻動物中去除這些骨，並在10％中性緩衝福馬林中固定24小時。將組織在分級系列醇(70-100％，在真空下每級改變2，每次4小時)脫水。然後將樣品置於二甲苯中，在真空下以20psi用異丁烯酸甲酯滲濾，2小時/步驟，再在Shandon Hypercenter自動加工器(Shandon Lipshaw，Pittsburgh，PA)中進行24小時滲濾。將樣品包埋在含0.2％引發劑的2％DDK原生質(DelawareDiamond Knives，Wilmington，DE)中。用金剛鋸(Delaware DiamondKnives，Wilmington，DE)切割脛骨的截面80μm厚、再用Goldner三鉻染色。將約80μm厚的未染色截面加工以用於氟鉻標記物的動態組織形態測定。在Reichert-Jung 2050切片機(Magee技術公司，Dexter，MI)上j2L3的sagittal面切割成5μm厚，再用McNeal四鉻染色，或者留下未染色的作動態組織形態測定。
用Nikon螢光顯微鏡(Optiphot，Nikon，Tokyo，Japan)和半自動數字轉換系統(Bioquant IV，R和M Biometrics，Nashville，TN)在150x放大率下進行組織形態測定。通過脛骨骨幹中段的全部截面積測定骨膜、皮質內(endocortical)和內皮質(intracortical)的被膜的骨形成和吸收。對網狀骨質骨的測定是在腰椎中央、距離周圍皮質外殼邊緣0.5mm的6mm2面積內進行的。命名原則是根據ASBMR委員會的組織形態測定命名原則(Parfitt AM，DreznerMK.Florieux FH，Kains JA，Malluche H，Meunier PJ，Ott SM，Recker RR 1987「骨的組織形態測定命名原則、符號和單位的標準化。ASBMR組織形態測定命名原則委員會的報告」。《骨礦物質研究雜誌》2595610)。根據鈣黃綠素標記物測定動態參數。骨質測定採用960A pQCT通過定量計算機斷層X射線照相法(QCT或pQCT)對50％乙醇/鹽水中的股骨中段和第4腰椎進行截面掃描、並用5.1版Dichte軟體(Norland/Stratec，Ft.Atkinson，WI)分析。用148×148×1200μm的三維象素尺寸測定全部組織參數，包括體積骨礦物質密度(vBMD，mg/cm3)、截面積(X面積，mm2)和骨礦物質含量(BMC)。以1.2mm切片厚度乘以X面積計算體積。用外周雙能量吸光測定法(pDEXA，Norland/Stratec)對置於含50％乙醇、鹽水的浴器中的被切除的股骨的整個股骨頸進行掃描。特別是，用0.5×1.0mm的掃描步驟和0.04d的低限測定表面骨礦物質密度(vBMD，mg/cm2)、投影面積(cm2)和骨礦物質含量(BMC，g)。生物力學測試在右側股骨體中段和L5椎體中測定骨的力學性能。切除骨、清除結締組織、用被等滲鹽水浸過的紗布包裹、並在-20℃冷凍直至測試。測試前，將樣品在室溫下融化1-2小時。用MTS 810伺服水壓測試機(MTS公司，Minneapolis，MN)將所有樣品在37℃循環水浴中測試直至斷裂。用HP 7090A測定描繪系統(Hewlett Packard，Camas，WA)記錄負荷形成曲線。用數字轉換器系統(Jandel Scientific，Corte Madera，CA)測定極限壓力(樣品承受的最大應力)、勁度(負荷形成曲線的線性部分的斜度)和斷裂功(斷裂前負荷形成曲線下的面積)。這些參數是根據固有物質的性能和幾何形狀而決定的結構性能。Turner ch，Burr DB 1993「骨的基本生物力學測定論文(tutorial)」《骨》14595-608。規範這些數據得到固有的物質性能，例如極限應力(樣品承受的最大應力)、彈性模量(物質的固有勁度)和不依賴於大小和形狀的韌性(每單位體積抗骨折的強度)。同上。
在股骨體中段用三點彎曲測定股骨的骨強度。將股骨置於面對承載器的前側卡具中。在54mm寬的兩個支架的中點加載。以1mm/秒的速度移動負荷槽直至產生斷裂。使由負荷形成曲線得到的數據標準化，通過下式從極限壓力計算彎曲極限應力σf＝FuLr/8I(1)其中σf為彎曲骨折應力，Fu為極限力，L為支架間的長度，r為前後方向的半徑，I為慣性矩。同上。假定股骨的截面是橢圓形，計算慣性矩的值。
從用一付數字測徑器在股骨截面的四個象限中的每一象限所測定的厚度計算平均皮質厚度，該儀器具有±0.005mm的精密度、精確到0.01mm(Mitutoyo，Japan)。
用下面的等式計算股骨的彈性模量(Ef)Ef＝(勁度)*(L3/48I) (2)用下面的等式計算股骨的韌性(韌性f)韌性f＝3*(斷裂功)*r2/LI (3)對於第5腰椎(L5)的力學測試，用Buehler Isomet慢速鋸(Buehler LTD，Evanston，IL)平行切割椎體的兩個端平面。截斷後，在壓縮中測定L5的機械強度。通過一個轉換臺板糾正椎體表面的不平行排列，以1mm/秒的十字頭速度、以控制衝程來施加壓縮負荷。使由負荷形成曲線得到的數據標準化，並評價不依賴於骨的幾何形狀的固有物質性能，根據由總截面積劃分的極限壓力來計算極限應力。
通過下式計算截面積(CSA)CSA＝πab/4 (4)其中a和b分別是前後方向和中橫方向的寬度。通過下式計算脊椎的彈性模量(Ev)Ev＝(勁度)/(CAS/h) (5)其中h為椎體的顱-尾高度。
用下式計算椎體的韌性(韌性v)韌性v＝(斷裂功)/(CSA*h) (6)聲學顯微術用金剛鋸從右側肱骨骨幹的中段切下500μm厚的截面積。用1μm解析度的測微計(Mitutoyo，Japan)測定每個樣品的精確厚度。用掃描聲學顯微鏡(UH3，Olympus，Japan)、通過前面Hasegawa K，Turner CH，Recker RR，Wu E，Burr DB 1995「通過掃描聲學顯微術測定骨質疏鬆骨的彈性性能」《骨》1658-90所述的方法進行聲速測定。採用這一技術，可以測定所選擇的固定點的詳細的固有力學性能。將50MHz轉換器(V-390，Panametrics，Waltham，MA)用於產生脈衝-回聲模式的聲波。50MHz透鏡產生直徑約60μm的聲束。將樣品固定於充滿恆溫水(22℃)的一個室的底部。用數字示波器(TDS 620，Tekronix，Beaverton，OR)測定從樣品頂部反射的聲波與從樣品的底部反射的聲波之間的延遲時間。在肱骨的前皮質的5個不同的部位測定延遲時間，每個部位相互之間大於300μm。根據樣品的兩倍厚度被平均延遲時間除可計算聲速。用天平(AJ100，Mettler儀器公司，Heightstown，NJ)測量100％乙醇中的溼重(Ww)和浸沒重(Ws)。用Archimedes原理計算溼密度(ρ)ρ＝{Ww/(Ww-Ws)}*ρETOH (7)其中ρETOH為乙醇的密度(0.789g/cm3)。假定骨中的聲波途徑是均一的，用下式計算樣品的代表固有勁度的彈性係數(C)C＝ρ*v2(8)其中ρ為溼密度，v為聲速。統計學分析將Barlett分析用於檢查方差的均一性。當方差均一時，採用post-hoc比較的Fisher’s PLSD試驗的單向ANOVA。當方差不均一時，採用Kruskal-Wallis非參數方差分析，使用Mann-Whitney’s U檢驗的post-hoc分析。統計學上明顯為p＜0.05。結果表示為平均值±SEM。結果體重和生物化學用載體PTH(1-34)按10mg/kg/天進行處理的兔140天後體重稍微增加了。給予PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的體重減量51g，表示實驗期間體重丟失了1.4±1.6％(表1)。雖然觀察到血清鈣和脲氮有少量增加，但血清測定是在兔的正常生理反應範圍內進行的。較高劑量PTH(1-34)時血清鹼性磷酸酶增加了兩倍(表2)。
表1--PTH(1-34)對體重的影響對照組 PTH(1-34) PTH(1-34)10μg/kg/天 40μg/kg/天初始體重(kg)3.43±0.083.42±0.083.42±0.08最終體重(kg)3.70±0.053.51±0.053.37±0.10增重(kg)0.26±0.090.09±0.05-0.05±0.05*每組的6隻兔子的數據以平均值±SEM表示。*與對照組相比P＜0.05。
表2--PTH(1-34)對血清化學的影響對照組 PTH(1-34)PTH(1-34)10μg/kg/天 40μg/kg/天鈣(mg/dl) 12.1±0.312.6±0.213.5±0.3*磷酸鹽(mg/dl) 4.7±0.2 4.7±0.2 5.5±0.3鹼性磷酸酶(iu/l) 24.7±4.141.0±8.149.8±7.1*肌酸酐(mg/dl) 1.9±0.1 1.6±0.1 1.8±0.1脲氮(mg/dl)12.1±0.318.1±0.823.9±1.9每組的6隻兔子的數據以平均值±SEM表示。*與對照組相比P＜0.05。組織形態測定脛骨體中段的骨膜表面的骨形成(Ps.MS/BS)和皮質內表面的骨形成(Ec.MS/BS)在PTH(1-34)治療組中增加了(表3)。高劑量組的Ps.MS/BS明顯大於其它兩組(p＜0.001)，並且高劑量組的Ec.MS/BS明顯大於對照組(p＜0.05)。隨著血清鹼性磷酸酶的持續增加，高劑量組中每一表面(Ps.MS/BS和Ec.MS/BS)的骨形成率明顯大於其它兩組(p＜0.05)。在骨膜的或皮質內膜的礦物質聚集率(MAR)沒有改變。
用PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的吸收部位數(Rs.N/Ct.Ar)在皮質外明顯大於其它兩組7倍(p＜0.05)。用PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的標記骨單位數(L.On.N/Ct.Ar)與其它兩組相比也明顯增加(與對照組相比p＜0.01，與10μg/kg/天組相比p＜0.05)。兩組治療組的MAR明顯大於對照組(p＜0.01)，但PTH治療組之間沒有顯著性差異。兩種劑量的骨形成率(BFR/BV)和激活頻率(Ac.F)都增加了(分別p＜0.05，p＜0.01)。
雖然兩種劑量的骨面積(B.Ar)都增加了，但僅在高劑量組與對照組之間出現了顯著性差異(p＜0.01)。治療後骨髓面積(Ma.Ar)減少了，但三組間沒有顯著性差異。高劑量組的皮質面積(Ct.Ar)明顯大於其它兩組(與對照組相比p＜0.0001，與低劑量組相比p＜0.05)。低劑量組的Ct.Ar也明顯大於對照組(p＜0.05。％Ct.Ar中的結果類似。
用PTH(1-34)10μg/kg/天的兔的皮質孔(Ct.Po)是對照組的兩倍(p＜0.05)，而用PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的Ct.Po是高於對照組6X(p＜0.01)。但是，隨著截面慣性矩的不斷增加，由於PTH也增加皮質骨面積，因此該部位內的皮質內腔隙的孔位置不影響生物力學強度。
表3--PTH(1-34)對脛骨中段的骨膜和皮質內的骨質重建的影響參數縮寫 對照組 PTH(1-34) PTH(1-34)10μg/kg/天40μg/kg/天皮質內類骨質表面Ec.OS/BS(％) 8.8±6.0 13.7±10.5 20.2±5.8皮質內類骨質厚度Ec.O.Th(μm) 7.4±2.4 3.7±2.3 8.1±0.9骨膜礦物質聚集率Ps.MAR(μm/天) 0.33±0.17 0.38±0.08 0.66±0.14皮質內礦物質聚集率 Ec.MAR(μm/天) 1.33±0.22 0.79±0.16 1.32±0.15骨膜礦化表面Ps.MS/BS(％) 3.8±1.9 8.2±2.1 22.3±2.7*↑皮質內礦化表面 Ec.MS/BS(％) 26.4±6.632.6±8.2 57.7±10.4*骨膜骨形成率Ps.BFR/BS(μm3/μm2/yr) 0.02±0.02 0.03±0.01 0.16±0.05*↑皮質內骨形成率 Ec.BFR/BS(μm3/μm2/yr) 0.40±0.10 0.31±0.10 0.72±0.12*↑每組的6隻兔子的數據以平均值±SEM表示。*與對照相比P＜0.05。↑與PTH(1-34)10μg/kg/天相比P＜0.05。表4--PTH(1-34)對脛骨體中段的皮質內的骨重建的影響參數 縮寫 對照組 PTH(1-34) PTH(1-34)10μg/kg/天 10μg/kg/天吸收腔數 Rs.N/Ct.Ar(#/mm2) 0.014±0.0130.013±0.004 0.097±0.036*↑標記的骨單位數 L.On N/Ct.Ar(#/mm2) 0.011±0.0060.027±0.006 0.215±0.094*↑類骨質厚度 O.Th(μm)4.92±0.59 5.42±0.305.16±0.27礦物質聚集率 MAR(μm/天) 1.19±0.20 1.56±0.13*1.60±0.12*骨形成率 BFR/BV(％/yr)0.5±0.38.5±2.9*21.4±3.8*激活頻率 Ac.F(#/mm2/yr) 1.8±1.015.1±5.0*43.8±10.5*↑骨面積 B.Ar(mm2) 29.1±1.3 33.3±1.9 37.8±2.7*骨髓面積 Ma.Ar(mm2) 12.7±0.7 11.9±1.0 10.7±1.0皮質的面積 Ct.Ar(mm2) 16.4±0.9 21.3±1.2*27.1±2.0*↑皮質面積％ ％Ct.Ar(％) 56.4±1.5 64.2±1.6*71.6±1.5*↑每組6隻兔子的數據以平均值±SEM表示。*與對照相比P＜0.05。↑與PTH(1-34)10μg/kg/天相比P＜0.05。表5--PTH(1-34)對第3腰椎的網狀骨質重建的影響參數 縮寫 對照組 PTH(1-34)PTH(1-34)10μg/kg/天 40μg/kg/天骨體積BV/TV(％) 27.5±1.4 30.5±3.427.9±3.2小梁厚度 Tb.Th(μm) 124.8±7.3 147.4±12.7 126.4±13.7被腐蝕的面積 ES/BS(％) 0.5±0.31.4±0.3 2.6±0.7*破骨細胞表面 Oc.S/BS(％)0.4±0.20.9±0.3 1.3±0.3類骨質表面OS/BS(％) 5.2±1.37.2±1.2 27.7±3.8*成骨細胞表面 Ob.S/BS(％)1.4±0.61.3±0.6 15.3±5.6*類骨質厚度O.Th(μm) 5.2±0.55.3±0.5 4.4±0.2類骨質體積OV/TV(％) 0.10±0.02 0.13±0.03 0.46±0.7*礦物質聚集率 MAR(μm/天)1.3±0.21.5±0.1 1.7±0.1礦化表面 MS/BS(％) 4.4±1.47.4±1.9 24.2±1.5*骨形成率 BFR/BS(μm3/μm2/yr) 19.7±5.3 38.5±8.9153.0±15.6*每組6隻兔子的數據以平均值±SEM表示。*與對照組相比P＜0.05。↑與PTH(1-34)10μg/kg/天相比P＜0.05。
在網狀骨質中，用PTH(1-34)治療，大多數的形成參數(OS/BS，Ob.S/BS，OV/TV和MS/BS)增加了(表5)。給PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的那些參數明顯高於其它兩組(所有參數與兩組對照組和10μg/kg/天組相比p＜0.01)。給PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的骨形成率(BFR/BS)與其它兩組相比明顯增加(與兩組對照組和10μg/kg/天組相比p＜0.0001)。雖然兩個PTH(1-34)治療組的吸收(ES/BS和Oc.S/BS)增加了，但僅僅高劑量組的被侵蝕表面(ES/BS)顯著大於對照組(p＜0.001)。三組之間的類骨厚度(O.Th)沒有差異。儘管加速了骨轉動，但PTH(1-34)治療後分段的骨體積(BV/TV)沒有改變。任何組中都沒有觀察到隧道吸收和小梁周圍的纖維變性。骨質測定在40μg/kg/天組中通過pQCT評定的股骨體中段的vBMD和BMC明顯高於其它兩組(與對照組相比vBMD的p＜0.001、BMC的p＜0.0001，與低劑量組相比vBMD的p＜0.05、BMC p＜0.01)(圖1A)。10μg/kg/天組的vBMD和BMC均明顯高於對照組(vBMD和BMC均為p＜0.05)。雖然股骨體中段的骨面積也隨著增加，但僅40μg/kg/天組有顯著的增加p＜0.05)。
通過雙X線吸光測定法(DXA或pDXA)測定的近端股骨的vBMD和BMC隨劑量增加。對照組與10μg/kg/天組之間的vBMD和BMC(p＜0.05)、以及對照組與10μg/kg/天組之間的vBMD和BMC(p＜0.001)均有顯著性差異(圖1B)。三組之間的骨面積沒有顯著性差異。
總的來說，圖1表明在用兩種劑量PTH治療的動物中，其股骨體中段(皮質骨)(A)和近端股骨(網狀骨質+皮質骨)(B)中的BMD(骨礦物質密度)和BMC(骨礦物質含量)明顯大於對照組。用高刺量治療的兔的股骨體中段的皮質骨面積明顯大於對照組。兩組的近端股骨的骨面積之間沒有顯著性差異。數據表示為平均值±SEM。*與對照組相比P＜0.05，↑與PTH 10μg/kg/天相比P＜0.05。
通過pQCT評定三組中vBMD、BMC或腰椎(L4)的骨面積均沒有顯著性差異。生物力學測試股骨體中段的結構性能例如極限壓力、勁度和斷裂功是依賴劑量而增加的(圖2)。圖2表示PTH對股骨體中段的皮質骨中的機械強度和截面慣性矩(CSMI)的作用。高劑量組的結構力學性能(空方條)和CSMI顯著增強，而低劑量組的勁度也顯著增強。固有的物質性能(暗方條)中，僅低劑量組的彈性模量與對照組相比顯著增加了。高劑量組的彈性模量與低劑量組的彈性模量相比明顯降低了。圖2中數據表示為平均值±SEM。*表示與對照組相比P＜0.05；↑表示與10μg/kg/天相比P＜0.05。
此研究結果如圖2所示，給PTH(1-34)40μg/kg/天的兔的所有參數均顯著高於對照組(對於極限壓力和斷裂功p＜0.01，對於勁度p＜0.05)。低劑量組的勁度也明顯高於對照組(p＜0.05)。固有的物質性能中，給40μg/kg/天的兔的彈性模量低於給10μg/kg/天的兔的彈性模量(P＜0.05)。聲學顯微術三組中聲速或彈性係數沒有顯著性差異。討論在未受損的成熟雌性兔的長骨中，皮質骨對生物合成的hPTH(1-34)的骨骼反應包括物質性能的直接調節和生物力學性能的補償調節。PTH(1-34)增加骨轉動和皮質孔，並且在40μg/kg劑量時降低皮質骨的物質彈性模量。但是，降低的彈性模量大於通過增加骨膜表面和皮質內表面的骨質聚集而補償的，結果兔的皮質骨的結構強度、勁度和斷裂功均顯著提高。
在此研究中採用未受損的兔，儘管骨轉換增加，但PTH(1-34)治療後腰椎的網狀骨質的體積沒有改變。前面用一種骨質減少模型來測試間歇使用PTH(1-34)的作用，該模型具有皮質內重建、和短重建期以及兔的快速生長和早期骨骼成熟(6-9個月)等特點，這構成了選擇模型兔的基礎。
雖然兔的血清鈣含量變化很大(10-16mg/dl)，但它不直接受飲食鈣的數量的影響，這是該模型的另一優點。雖然用PTH(1-34)40μg/kg治療的兔的記錄出現了大約1mg/ml的短暫顯著升高，但實際值總是在已知的生理範圍內。
目前的研究中，使用生物合成的hPTH(1-34)140天後可增加皮質內的骨形成率以及骨膜表面和皮質內表面。低劑量組的皮質內Ac.F增加了8X，而高劑量組增加了20X。這就導致低劑量組的脛骨的皮質孔增加了2倍，高劑量組增加了6倍。聲學顯微術的數據顯示肱骨中骨本身的彈性性能沒有受到影響，說明了固有的皮質骨質量是正常的。因此，增加的孔一定是由於彈性模量輕微減少所致，物質的性能測定包括皮質的間隙。
但是，在高劑量組中，增加的皮質孔大於通過顯著增加脛骨體中段的骨膜表面和皮質內表面的MS/BS和BFR/BS而補償的，這樣導致骨面積顯著增加。這將增加截面慣性矩，它與骨的抗彎剛性成比例，這與股骨體中段的結果相同(圖2)。與對照組相比，這些形狀和物質性能的變化結果是增強了股骨骨幹的機械強度和勁度，這樣就抵銷了皮質孔增加的潛在的有害機械作用。結論總之，用PTH(1-34)治療後，骨轉動和皮質孔增加的同時伴有骨膜表面和皮質內表面的骨增加。這些現象合在一起可導致股骨的韌性、極限應力、勁度和斷裂功的增強。
實施例2猴子服用rhPTH(1-34)後骨的強度和密度的增強實驗方法一般方法本研究的猴子生長期是使用體重2.77±0.03kg(平均值±平均值的標準誤差[SEM])的野生、成年(封閉的生長高原(plates))獼猴靈長目(Macacafascicularis)。將猴隔離檢疫3個月，然後開始給食每100g含0.3％鈣、0.3％磷酸鹽和250IU維生素D3，並自由飲用氟化水(1ppm氟)。鈣含量相當於1734mg鈣/2000卡路裡。飼養1個月後，將動物分成21隻組或22隻組，假裝手術或施行卵巢切除術。卵巢切除後24小時開始每天一次皮下注射載體(假手術和卵巢切除對照)或rhPTH(1-34)，按1μg/kg(PTH1)或5μg/kg(PTH5)的劑量。將動物治療18個月(PTH1和PTH5)或12個月後，停止治療(PTH1-W和PTH5-W)。
實驗組按表6所示的劃分。
表6-靈長目研究的實驗組

隔3個月時注射載體或rhPTH(1-34)後24小時取出血清和尿樣品。每個rhPTH(1-34)治療組中5隻猴各抽樣一隻設計藥物動力學實驗，在基線、7、11和17個月進行抽樣(每次測量0-240分鐘)。在0時和隔6個月時，通過雙能量X線吸光測定法(DXA)測定總骨骼和脊柱(L-2至L-4)骨的質量；外周定量計算機X線斷層照相法(pQCT)用於評定橈骨中段和末端、以及近端脛骨的骨質。在6和15個月時做髂骨活檢以進行組織形態測定。18個月後將所有動物處死。
在腰椎L-3至L-4、股骨頸、肱骨體中段和股骨骨幹的皮質骨樣品中進行生物力學試驗(表7定義的測定)。在肱骨體中段、腰椎L-2、股骨頸、股骨體中段、橈骨體中段和末端橈骨中進行常規的靜態和動態組織形態測定(表11所述的測定)。開始的統計分析將所有組與用載體治療的卵巢切除對照組進行比較。該數據適用於檢查劑量依賴性、停藥的影響、結果之間的相互關係和用本領域技術人員已知的方法改變時間的其它探察分析。所有評定都是通過本領域已知的方法實施和決定的。
對於某些實驗項目，肱骨的皮質骨是通過組織形態測定法和極化傅立葉變換紅外線顯微術進行測定的。傅立葉變換紅外線顯微術是採用這種顯微術的已知方法進行的。3D有限單元造型研究這些研究測定了在用18個月研究劑量的PTH的猴脊椎上的3D有限單元造型數據。將從卵巢切除(n＝7)組和PTH(n＝7)組切除的置於50％乙醇/鹽水中的L-5腰椎，通過定量計算機斷層X線照相法(QCT，Norland，Ft，Atkinson，WI)、使用70×70μm象素、在500μm階中進行掃描。對每個500μm截面進行體積骨礦物質密度(BMD，mg/cc)、骨礦物質含量(BMC，mg)、截面積(X-面積)、網狀骨質體積(BV/TV)、小梁厚度(Tb.Th)和連接性(節密度、腫脹(strut)分析)分析。將每系列掃描平均得到490×490×500μm的三維象素。然後堆積這些系列掃描，使用「marching cubes」規則(參見例如LorensenCline1987「Marching cubes，一種高分辨的3D表面構造規則」《計算機製圖法》21，163-169)產生了每個骨的三角形表面網眼。然後將每個平滑形式的表面網眼用於產生3D有限-單元造型中使用的四面體網狀結構。
每個四面體單元的楊氏模量從猴的股骨骨幹研磨的皮質骨幹最初的三維象素密度和物質性能產生。轉動每個四面體網狀結構使每個脊椎的底面排列為平面。然後對每個L-5模型進行線性彈性應力分析，該模型中有100N的分配負荷施於中心的頂表面、與底平面垂直，而底表面固定在負荷方向。評價所得到的軸向變形曲線(與BMD分布相同)，並比較PTH組和卵巢切除組。在此轉變中，每個三維象素的密度是依賴於每個三維象素用與軟組織相對的骨填充的程度。結果本文所述的差異在統計學上是顯著的，p＜0.05。在研究期間所有不治療動物的體重都增加了初始體重的4％-9％。血清和尿測定所有卵巢切除猴在3和18個月時的血清雌二醇水平都低於5pg/mL。當與假性對照組比較鈣的體內平衡測定時，卵巢切除對照組具有較低的血清鈣和磷酸鹽和1，25-二羥基維生素D水平，但最後注射後24小時測定的內源PTH、尿環腺苷酸(cAMP)、尿鈣、尿肌酸或血清脲氮沒有差異。與卵巢切除組比較，用rhPTH(1-34)治療的動物具有較低的血清磷酸鹽、較低的內源PTH、和較高的1，25-二羥基維生素D和尿cAMP。血清骨形成標記測定表明卵巢切除的猴與假性手術者比較，血清總的鹼性磷酸酶(ALP)和骨鈣蛋白低，且rhPTH(1-34)恢復到假性值的水平。與卵巢切除對照組相比，用作骨吸收的生物化學標記的尿C-端肽(交叉重迭(CrossLaps))分泌沒有受rhPTH(1-34)而改變。骨質PTH(1-34)明顯增加了總體骨骼的骨質，表示為全身BMC(圖3)。18個月的卵巢切除對照組的脊柱骨礦物質密度(BMD)保持穩定，而假性對照組增加了大約基線上面的5％(圖4A-4C和5A)。與基線相比(圖4A-4C和5A)，rhPTH(1-34)增加了7％-14％脊柱BMD、全身骨礦物質含量增加達到6％(BMC，圖3)。脊柱骨礦物質含量也增加了(圖5A)。在rhPTH(1-34)治療的靈長目中，這些增加值明顯高於卵巢切除對照組，與假性組相當(PTH1)或超過(PTH5)假性組。rhPTH(1-34)沒有改變橈骨體中段或橈骨末端的BMD。PTH5組的骨體中段的截面積增加了7％。近端脛骨中，截面積未增加，但與卵巢切除對照組相比，rhPTH(1-34)增加了BMC和BMD。停止治療後6個月，脊柱和股骨頸中的BMD和BMC仍然高於卵巢切除對照組，肱骨體皮質中段沒有變化。骨強度rhPTH(1-34)增加脊椎強度(Fy)可達43％(表7和8，圖5B)。rhPTH(1-34)提高股骨頸強度(Fu)可達12％(表7和9，圖6A)。當與卵巢切除對照組比較時，rhPTH(1-34)沒有改變在肱骨體中段的皮質骨幹中的測定值(表7和10)、或股骨骨幹樣品的物質性能(表7和9，圖6B)。在用rhPTH(1-34)治療12個月再停止治療6個月的動物中，骨強度測定值仍然大於卵巢切除對照組(表7-10，圖5B和6A)。
表7 第3和第4腰椎(L-3和L-4)、肱骨體中段、近端股骨頸和股骨幹樣品的可變量

表8 18個月的卵巢切除靈長目的脊柱(腰椎，L-3和L-4組合)強度的生物力學測定

縮寫OVX＝卵巢切除的；PTH1＝使用18個月的1μg rhPTH(1-34)/kg；PTH1-W＝用1μg rhPTH(1-34)1μg/kg治療12個月再停止治療6個月；PTH5＝使用18個月的5μg rhPTH(1-34)/kg；PTH5-W＝用5μg rhPTH(1-34)/kg治療12個月再停止治療6個月。
a參見表4.1有關可變量的說明。
b每組的數據表示為平均值±平均值的標準誤差(SEM)。
o與OVX對照組相比在統計學上是顯著的(p＜0.05)。
s與假性對照組相比在統計學上是顯著的(p＜0.05)。
表9 18個月的卵巢切除靈長目股骨幹相同大小骨幹樣品物質性能的生物力學測定、和股骨頸強度的生物力學測定

縮寫OVX＝卵巢切除的；PTH1＝使用18個月的1μg rhPTH(1-34)/kg；PTH1-W＝用1μg rhPTH(1-34)1μg/kg治療12個月再停止治療；PTH5＝使用18個月的5μg rhPTH(1-34)/kg；PTH5-W＝用5μg rhPTH(1-34)/kg治療12個月再停止治療。
a參見表4.1有關可變量的說明。
b每組的數據表示為平均值±平均值的標準誤差(SEM)。
o與OVX對照組相比在統計學上是顯著的(p＜0.05)。
s與假性對照組相比在統計學上是顯著的(p＜0.05)。
表10 18個月的卵巢切除靈長目肱骨體中段皮質骨的生物力學測定

縮寫OVX＝卵巢切除的；PTH1＝使用18個月的1μg rhPTH(1-34)/kg；PTH1-W＝用1μg rhPTH(1-34)1μg/kg治療12個月再停止治療；PTH5＝使用18個月的5μg rhPTH(1-34)/kg；PTH5-W＝用5μg rhPTH(1-34)/kg治療12個月再停止治療。
a參見表4.1有關可變量的說明。
b每組的數據表示為平均值±平均值的標準誤(SEM)。
o與OVX對照組相比在統計學上是顯著的(p＜0.05)。
s與假性對照組相比在統計學上是顯著的(p＜0.05)。骨組織形態測定雖然卵巢切除組的轉換率大於假性對照組，但髂骨嵴中的骨體積沒有明顯丟失。許多動物中沒有檢測到在6個月時給的四環素標記物，在此時間點僅測定了靜態參數。15個月時的靜態和動態組織形態測定數據表明與卵巢切除組相比，用rhPTH(1-34)治療增加了網狀骨質骨的面積，並在沒有增加高於卵巢切除對照組所側得的骨吸收的情況下增加了骨形成。高劑量rhPTH(1-34)逐漸增加骨形成率。雖然治療12個月再停用rhPTH(1-34)後，與卵巢切除對照組相比網狀骨質骨仍然增加，但骨形成和吸收回復到卵巢切除對照組的水平，骨轉換仍然大於假性對照組。rhPTH(1-34)沒有影響礦化、激活頻率或重建周期。吸收與形成之間基於單個骨多細胞單位(BMU)的骨平衡沒有差異。概括而言，rhPTH(1-34)通過選擇性刺激骨形成而增加網狀皮質骨。
在肱骨的皮質骨中，rhPTH(1-34)沒有顯著改變BMD或骨強度測定，rhPTH(1-34)刺激骨膜、骨內膜和皮質內的腔隙的改變(表11和12)。雖然兩組之間的總面積或髓面積沒有差異，但rhPTH(1-34)增加皮質面積，而PTH5和PTH5-W組明顯具有更多的皮質骨，說明增加了截面慣性矩，它是強度的一種測定值。面積的增加可能是由於骨膜和骨內膜的表面的骨形成均增加所致(圖7)。
與卵巢對照組和其它rhPTH(1-34)治療組相比，假性對照組和PTH5-W組的骨膜礦化表面減少。與假性對照組相比，卵巢切除對照組的皮質內的礦化表面明顯更大，rhPTH(1-34)沒有增加到大於卵巢切除對照組的值。在皮質內重建中，卵巢切除的動物有更多的吸收空間，卵巢切除組、PTH1和PTH5組的激活頻率大於假性對照組或任一停藥組。與假性對照組相比，卵巢切除組的每單位面積明顯具有更多的標記骨單位，rhPTH(1-34)沒有增加到明顯大於卵巢切除對照組的值。
與假性對照組相比，卵巢切除組的皮質內的孔更大，但卵巢切除組和PTH1之間沒有差異。PTH5和PTH5-W增加的孔多於卵巢切除對照組中的孔。兔的研究數據提示了這一假設孔隙度的增加、伴有皮質骨增加，可能是一種結構反應以保持用rhPTH(1-34)治療的骨的生物力學性能。18個月時，卵巢切除組和其它組之間在骨形成周期、類骨質、壁寬度或類骨質成熟方面沒有差異。
概括而言，卵巢切除組和任一劑量的rhPTH(1-34)組之間，其轉換率沒有差異。假性對照組的轉換率較卵巢切除對照組或用rhPTH(1-34)治療的動物低。當停用rhPTH(1-34)6個月時，轉換率顯著下降，但BMD和生物力學強度測定值仍然高於卵巢切除對照組。所有組皮質內的類骨質寬度和成熟時間的正常值表明治療沒有對正常的礦化過程的時間帶來任何缺點。壁寬度的正常值表明在單個BMU水平方面，治療沒有改變吸收與形成之間的正常平衡。
表11 肱骨皮質骨測定的組織形態測定的可變量


a命名原則是1987的骨和礦物質研究雜誌推薦的。
表12 18個月卵巢切除的靈長目肱骨中段皮質組織形態測定(n＝121)

縮寫OVX＝卵巢切除的；PTH1＝使用18個月的1μg rhPTH(1-34)/kg；PTH1-W＝用1μg rhPTH(1-34)1μg/kg治療12個月後再停止治療；PTH5＝使用18個月的5μg rhPTH(1-34)/kg；PTH5-W＝用5μg rhPTH(1-34)/kg治療12個月後再停止治療。
a與OVX對照組相比在統計學上是顯著的(p＜0.05)。
b參見表4.2有關可變量的說明。
c數據表示為平均值±平均值的標準誤差(SEM)。
通過組織形態測定和極化傅立葉變換紅外線顯微術的分析揭示了用PTH治療可用幼小骨(分級微晶物的範圍，傾向於較小的)代替老化骨(大的微晶物)而改善骨質量。而且，對用小劑量的猴停用PTH時的其它好處是基質已最佳礦化且有微晶物成熟。組織形態測定和極化傅立葉變換紅外線顯微術的數據表明，由於最佳礦化產生礦物質相成熟，對改善質骨的骨質量是非常有利的。3D有限單元造型研究L-5的中間500μm切片的實驗表明，與卵巢切除組相比，PTH的BMD增加21％是由於BMC增加了27％而截面積沒有改變。與卵巢切除組相比，對PTH組的椎體的分析顯示BV/TV增加了73％，這是由於Tb.Th增加了30％和Tb.N增大了37％。這一區域的連接性分析顯示PTH脊椎的節密度(節/組織體積)升高了140％、節-節柱(struts)增加了286％。
PTH的骨三維象素密度的直方圖分析表明，與卵巢切除組相比，低密度(0-355mg/cc)的比例減少、中密度(356-880mg/cc)的比例增加、對高密度三維象素(887-1200mg/cc)幾乎無作用。最驚人的是停止治療6個月後皮質骨腔隙中較大骨的三維象素密度的改變(圖8)。
計算落在BMD值的某範圍內的脊椎骨單元(三維象素)的比例。所選擇的BMD範圍如下低BMD，0-300mg/cc；中BMD，300-700mg/cc；高BMD，700-1000mg/cc；和皮質BMD，＞1000mg/cc(表13)。與卵巢對照組相比，用PTH治療明顯降低了低BMD骨的體積並增加了中BMD骨的體積。停用PTH後，中BMD骨降低而高BMD骨升高，表明中等BMD骨變得更加緻密。
表13 根據BMD值分組的L5腰椎體積的百分比(平均值±SEM)

表14 中等水平的L5腰椎的BMC和脊椎的有效應變

*統計學差異(經Fisher’s PLSD檢驗p＜0.05)圖8概括的數據顯示用PTH治療18個月，獼猴的L-5腰椎在骨質、小梁厚度和小梁連接性方面顯著增加，對脊椎的外部大小(X面積)有決定性的作用。對L-5骨單元分布的分析表明，重度礦化骨的一些區域變化最少、沒有產生骨硬化。相反，多孔的小梁骨對PTH的反應最強。BMD的變化導致軸向應變明顯降低，力學性能改善。如PTH和卵巢切除術的BMD的直方圖中清楚地顯示，PTH將低密度骨的三維象素轉化為中密度三維象素、對高密度三維象素沒有顯著作用。
表2概括的數據顯示通過PTH治療顯著增加了脊椎中段的BMC、而停藥6個月後仍然存在PTH的有效作用。通過PTH治療減少了36％脊椎的平均力學應變，而停用PTH後保留了23％、低於OVX。這些研究提示停用PTH治療後6個月沒有導致新形成骨的吸收，但取而代之的是中密度骨有效地重新分布成低和高密度骨。這種再分布導致脊椎的應變連續降低、因而改善了力學功能。討論對靈長目的這種研究表明，在不用其它可能對骨有影響的藥物時，PTH有益於增強皮質骨和小梁骨全部骨骼的骨質。而且，停用PTH時不會明顯失去由PTH治療至少2個重建周期的療效。
替代標記已用在其它試驗中表明骨的活性，並假定此值的變化反映出骨質的改變。雖然有公開的人和靈長目的數據證明了形成和吸收標記增加，但與骨轉換的激活一致(例如在絕經早期或疾病活動期)，高度轉換被認為是骨質丟失的表徵。對青春期人骨骼成熟過程的高度轉換還沒有進行很好的研究，但骨丟失的合成代謝增加。根據當前技術，在骨質疏鬆的藥物治療中這種現象完全是意外的。因此，如本研究的數據所示，骨轉換標記的增加與已知的PTH對增加骨質和強度的合成代謝作用不一致。
從對獼猴的18個月冶療研究的數據證實了下列意外的發現·總的骨骼質量全面顯著增加·股骨頸的骨質和強度顯著增加。
·沒有出現「竊」皮質骨以增加小梁骨。在富有皮質骨(股骨頸)或小梁骨(腰椎)的部位骨質和強度的增加在統計學上是顯著的。在純皮質骨部位(股骨體中段)，與卵巢切除對照組相比，PTH傾向於穩定或稍微增加骨質和強度。
·卵巢切除的猴(和人)的骨標記的改變並不反映出PTH對骨骼的合成代謝作用有益。本研究中使用靈長目的體液可以開發新的和更有效的替代品標記。
·停止治療後骨質和強度的增加保持至少2個重建循環。
這種PTH的靈長目研究不同於已公布的有關對恆河猴和獼猴的研究，它們採用了可提供適當統計能力的大量樣品以檢測在前面少量研究中可能出現的不明顯的差異；對照組包括卵巢切除靈長目(用於公開研究中)和假性手術組兩種，但都是整體的靈長目。在此類型的研究中以前沒有報導過後一個對照組，因此與卵巢切除動物的值比較，對PTH的某些效果，以及假性對照組水平的一些測定值的恢復是第一次進行評價。結論對野生的卵巢切除的已發育獼猴Macaca fascicularis的18個月研究確定了用rhPTH(1-34)治療12個月再停止治療6個月、或用rhPTH(1-34)治療18個月的骨中的效果和安全性。rhPTH(1-34)顯著增加了上面卵巢切除對照組脊柱和股骨頸的骨質和強度，其增加程度等於或大於假性對照組。在用rhPTH(1-34)治療的卵巢切除的猴中，鈣的體內自身平衡(血清鈣、磷酸鹽和1，25-二羥基維生素D)的測定值恢復到假性對照組的水平。用於評價骨轉換的血清、尿和組織形態測定顯示rhPTH(1-34)保持的形成率等於或大於卵巢切除對照組的形成率，而骨吸收的生物化學標記仍然與假性對照組的等同。在所有用rhPTH(1-34)治療達18個月的動物中，藥物動力學測定值不隨時間而改變，沒有出現rhPTH(1-34)蓄積。治療18個月後沒有出現持續的高血鈣或腎病理改變的跡象。礦化或重建期沒有變化。用rhPTH(1-34)所觀察到的骨骼的骨礦物質含量的淨增加可從增加了骨形成率和骨形成表面而對骨吸收作用極小或無作用得到解釋。在諸如脊柱、股骨頸和近端脛骨的臨床相關部位，骨礦物質含量、骨礦物質密度和強度的生物力學測定值，包括韌性和勁度在內均顯著增加。
rhPTH(1-34)增加肱骨體中段和橈骨體中段的皮質骨的轉換率，但與卵巢切除或假性對照組相比，沒有明顯改變骨質或強度的生物力學測定值。然而，皮質寬度和/或皮質骨面積的增加與截面慣性矩、強度和勁度的測定值是一致的。rhPTH(1-34)對皮質骨的固有物質性能沒有顯著影響。由於刺激了皮質內的骨形成，因此皮質寬度和皮質內的孔增加了。似乎孔的這些改變是由於保持了骨的彈性。
這些猴中，用rhPTH(1-34)治療12個月後再停藥6個月，脊柱和股骨頸的骨質和強度出現較小但仍然顯著的增加。停藥後，對肱骨體中段和橈骨體中段的皮質骨沒有顯著影響。骨標記和組織形態測定顯示傾向於回到假性對照組所測得的低轉換值。
齧齒動物的體內力學研究表明與rhPTH(1-34)的合成代謝結果相關的基因在1-6小時內被增量調節，在首次劑量後的24小時內、在未出現可檢測的吸收作用的情況下，可以檢測到骨形成表面的增加。rhPTH(1-34)似乎可補充S相的前期骨源(osteoprogenitor)、並刺激它們分化為成骨細胞，由此快速增加骨形成表面的百分率。可以在1小時期間內注射一次或多次rhPTH(1-34)，以誘導骨的合成代謝作用。但是，當給年幼大鼠在6小時或8小時內多次注射相同劑量時，合成代謝作用消失了，這說明rhPTH(1-34)的簡單、有限的暴露對於誘導合成代謝作用是需要的。
概括而言，rhPTH(1-34)是促進猴和兔的骨合成代謝的，通過選擇性刺激骨形成，增加諸如腰棘和股骨頸的臨床相關部位的骨質和生物力學強度。在皮質部位通過組織形態測定檢測的骨轉換、皮質內表面形成和孔的增加不會改變骨質或改變骨強度的生物力學測定值，但可通過增加皮質骨面積和/或寬度而增加截面慣性矩。
這些研究證實了使用甲狀旁腺素受體激活劑例如重組的人PTH(1-34)可提高治療期間和治療後的骨質量。事實上，用18個月PTH 1次/天，或同樣劑量使用12個月，然後停藥6個月，通過組織形態測定法和極化傅立葉變換紅外線(FTIR)顯微術分析，肱骨皮質骨的質量明顯提高。這一分析揭示了服用PTH通過用幼小骨(分級微晶物的範圍，傾向於較小者)代替老化骨(大的微晶物)而改善骨質量。因此，PTH提高皮質骨質量、改善礦化、以及加速礦化和加速新骨代替老化骨。
而且，對使用低劑量PTH的猴停用後，出現其它有益效果，如骨質發生最佳礦化和微晶物成熟。即在停止治療期間，低劑量PTH可通過增強礦化而產生其它有益效果。這些數據表明用PTH治療後再停藥一段時間這一限制性方案的好處是達到高的效果。骨質量的當前定義不包括增強礦化的這些方面。
在早期研究中PTH治療期後再接著一個非治療期，該治療期少於1個月。以前還沒有對18-24個月長期的但有限的治療期後再接著至少2個重建循環期進行探究。停止治療後靈長目的持續療效與用PTH治療的齧齒動物的結果形成鮮明對照。對大鼠的研究同樣顯示停止治療後骨質迅速丟失。見Gunness-Hey，M.Hock，J.M。(1989)《骨》10447-452；Shen，V等(1993)《臨床調查研究雜誌》912479-2487；Shen，V等(1992)Calcif.TissueInt.50214-220；和Mosekilde，L等(1997)《骨》20429-437。
這種方法增強骨礦化以前沒有觀察到，是出乎意外的，由此開發出了一種用PTH增加骨強度和韌性且預防骨折的新方法。這種新方法包括增強和調節礦化以提供更有韌性、更強勁、更能抗骨折的骨。這些有益效果不止需要新基質形成。這些發現說明PTH對固定骨或骨骼的患者、或對缺乏礦物質的骨骼有好的療效，但還需適當補充鈣和維生素D。
實施例3 人服用rhPTH(1-34)後增強骨的強度和密度並減少骨折患者數rhPTH(1-34)登記1093，完成848。
安慰劑登記544，完成447。
診斷和列入標準30-85歲的婦女、絕經後最少5年、最少有一處中度脊椎骨折或兩處輕度不致外傷的脊椎骨折。
劑量和用法試驗品(不診斷的)rhPTH(1-34)20μg/天，皮下給藥rhPTH(1-34)40μg/天，皮下給藥參考治療(不診斷的)注射用的安慰研究物質治療持續時間rhPTH(1-34)17-23個月(除6個月試治療期)安慰劑17-23個月(除6個月試治療期)評定標準脊柱X線；血清生物指標(鈣、骨-特異鹼性磷酸酶、前膠原I羧基末端前肽)；尿指標(鈣、N-端肽、游離脫氧吡啶啉)；1，25-二羥基維生素D；骨礦物質密度脊柱、髖關節、腕和全身；高度；人群藥物動力學；骨活檢(選擇的研究部位)。
患者特徵


結果本臨床試驗包括共1637名婦女，用重組人甲狀旁腺素(1-34)治療，0、20或40μg rhPTH(1-34)/kg/天，並補充維生素D和鈣，總共治療18-24個月結果如表15-19所示。
表15舉例說明的數據表明用PTH治療降低了脊椎骨折的數量和嚴重性。將所有用PTH治療的患者與安慰劑組患者進行比較，脊椎骨折的患者數減少了67％(p＜0.01)，與安慰劑組相比，20μg PTH/天組減少了65％(p＜0.001)，與安慰劑組相比，40μg PTH/天組減少了69％(表15)。將所有用PTH治療的患者與安慰劑組患者進行比較，多發性脊椎骨折的患者數減少了81％(p＜0.001)；與安慰劑組相比，20μg PTH/天組減少了77％(p＜0.001)；以及與安慰劑組相比，40μg PTH/天組減少了86％。將所有用PTH治療的患者與安慰劑組患者進行比較，中度至重度脊椎骨折的患者數減少了84％(p＜0.001)；與安慰劑組相比，20μg PTH/天組減少了90％(p＜0.001)；以及與安慰劑組相比，40μg PTH/天組減少了78％(表15)。
表15. 用PTH治療對脊椎骨折的數量和嚴重性的影響

*N＝基線和終點x射線的患者數**中度骨折導致脊椎高度下降超過25％(或等同測定)。重度骨折導致脊椎高度下降超過40％(或等同測定)。骨折如Genant等(1993)「採用半定量技術的脊椎骨折評定」；《骨和礦物質研究雜誌》81137-1148所定義。
表16舉例說明了用PTH治療對全身各種非脊椎骨骨折的數量的影響。在髖關節、橈骨、踝、肱骨、肋骨、腳、骨盆、以及其它部位每一處的骨折數顯著下降(表16)。與安慰劑治療的患者相比、觀察到用PTH治療的患者的骨折總數減少，這種減少在統計學上是顯著的。與安慰劑治療的患者相比，用PTH治療的患者的髖關節、橈骨、踝、肱骨、肋骨、腳和骨盆的骨折總數減少時，這種減少更顯著(表16)。
表16. 用PTH治療對非脊椎骨折的數量的影響

*安慰劑(pbo)通過雙能量吸光測定法(DEXA)測定PTH對骨礦物質含量(BMC)、骨礦物質密度(BMD)和骨面積的影響，結果如表17-19所報告。使用PTH明顯增加了患者的腰棘、股骨和髖關節、腕、以及患者全身的MBC(表17)。通過PTH治療顯著增加了患者的腰棘、股骨和髖關節的MBD(表18)。腰棘、股骨和髖關節中的增加在統計學上是顯著的，p＜0.001(表18)。通過用PTH治療患者的腰棘、股骨和髖關節的骨面積顯著增加了(表18)。腰棘和髖關節頸中的增加在統計學上是顯著的(表19)。
PTH對全身骨的數量和質量、BMC的測定的作用尤其重要。這種全身作用表明患者身體的骨質的量在增加。PTH不僅僅使骨質從患者身體的一個部分移動到另一部分。而且，用PTH治療可增加患者身體中骨質的數量和質量。
圖9和10舉例說明了對於PTH治療組和安慰劑對照組的患者，腰棘BMD和股骨/髖關節頸BMD長時間增加。患者的腰棘BMD平穩地增加至少約18個月，隨後的幾個月裡無顯著性增加或增加很少。患者的股骨/髖關節BMD顯著增加至少18個月，且PTH再治療期間可以進一步增加。
表17. PTH對骨礦物質含量的影響，以基線的端點％改變(SD)表示

表18. PTH對骨礦物質密度的影響，以基線的端點％改變(SD)表示

表19. PTH對骨面積的影響，以基線的端點％改變(SD)表示

概括而言，上述數據表明用PTH治療的患者骨折減少了。特別是，用PTH治療使66％以上先前患有脊椎骨折的患者不再患新的脊椎骨折。用PTH治療也使78％以上先前患有脊椎骨折的患者不再患新的多發性脊椎骨折。另外，PTH降低了脊椎骨折的嚴重性，顯著減少了78％患者患中度或重度骨折。接受PTH治療的患者得到的益處是患所有非脊椎骨折(包括髖關節、橈骨、腕、骨盆、腳、肱骨、肋骨或踝的骨折)者顯著減少，其顯著性水平為p＜0.007。骨質量也增加了。先前患有骨折的患者的療效為髖關節、脊柱和全身的骨礦物質含量顯著增加。這些增加表明這些部位的骨折減少早在治療後12個月就可出現。結論骨折的這些數據是用PTH而減少人骨折的第一數據。這些發現證實了骨質量和骨強度提高了，正如上面所報導的臨床前數據。這些結果也顯示了對非脊椎部位的骨質量和強度療效。在臨床或臨床前的研究中，以前沒有觀察到治療18-23個月期間持續的骨折數減少。
PTH是否單獨增強骨的韌性和強度以提高抗骨折性這一問題以前在人體中沒有試驗過。公開的文獻一直建議PTH必須與抗吸收劑或雌激素聯合用藥。以前報導的臨床試驗包括的患者人數太少、無法確定骨折顯著減少。在一項研究中，由於沒有安慰劑對照，因而無法單獨評定PTH的療效。在第二次研究中，採用普遍接受的骨折定義，沒有觀察到骨折減少。
一般認為，PTH對結合的非脊椎部位有相反的作用，在這些部位發現骨折減少尤其意外。常見的教條認為PTH會增加皮質孔、由此而削弱骨，特別是在治療早期。而且，這種理論斷言皮質骨部位有骨折的高度危險、而PTH對減少非脊椎部位的骨折毫無益處。該理論還認為單獨PTH不可能有效、需要同時採用抗吸收治療以阻斷對皮質骨的負作用。本發明的數據證實了PTH給接受維生素D和鈣補充治療的患者服用後具有以前未觀察到的有益效果。意外地發現，PTH使骨強度增加從而減少了有脊柱多發性骨折危險、有附加的非脊椎骨折的危險、有中度或重度附加的脊柱骨折危險等等的患者發生新骨折的次數。
對絕經後婦女的臨床研究顯示了用低劑量(20μg/天)治療患者所產生的特殊效果，由於減少了PTH劑量(高劑量時，一些患者出現副作用)、但保留了預防骨折和減少骨折的效果，這與高劑量(40μg/天)時的效果類似。FT-IR猴的數據提供了一種可能(但不局限)的力學解釋。對猴的研究表明低劑量PTH增加了結晶形成並加速了皮質骨的礦化。另外，使用低劑量的猴由於PTH增加了骨的礦物質含量，停藥後出現另外的有益效果。本發明的數據證實了新的發現，即對接受維生素D和鈣補充治療的患者給予低劑量PTH，可有效預防脊椎骨折和非脊椎骨折。與普遍的認為相反，PTH由於提高礦化和骨的礦物質含量、在非脊椎部位明顯增加骨強度從而預防新的骨折或降低骨折的嚴重性。
以上參考各種特定和優選的實施方式和技術對本發明已進行了描述。但是，應知道在不超出本發明的構思和範圍的同時，可以進行許多變化和改進。本說明書中的所有出版物和專利申請代表本發明所涉及領域的普通技術的水平。
權利要求
1.一種使需要治療的患者增加潛在損傷部位或實際損傷部位的骨韌性或勁度的方法，包括給該患者服用有效量的甲狀旁腺素。
2.權利要求1所述的方法，其中損傷是一種潛在的損傷，包括骨折、外科手術或矯形外科的方法所致的損傷，該方法包括對異常低的骨質部位或差的骨結構部位的骨所施行的手術。
3.權利要求2所述的方法，其中外科手術是指關節復位、脊柱固定、或者它們的組合。
4.權利要求3所述的方法，其中關節復位包括髖關節復位。
5.權利要求2所述的方法，其中骨折包括脊椎骨折、非脊椎骨折、或者它們的組合。
6.權利要求5所述的方法，其中非脊椎骨折包括髖關節骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。
7.權利要求1所述的方法，其中損傷是指潛在的損傷，它包括與甲狀旁腺機能減退或進行性脊柱後突相關的損傷。
8.權利要求1所述的方法，其中損傷是指包括骨折在內的實際損傷。
9.權利要求8所述的方法，其中骨折包括脊椎骨折、非脊椎骨折、或者兩者的組合。
10.權利要求9所述的方法，其中非脊椎骨折包括髖關節骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。
11.權利要求1所述的方法，其中骨包括固定的骨或骨骼、礦物質缺乏的骨或骨骼、或者它們的組合。
12.權利要求1所述的方法，其中骨包括皮質骨、網狀骨質骨、小梁骨、或它們的組合。
13.權利要求12所述的方法，其中骨包括附著韌帶、腱、肌肉、或其組合的部位。
14.權利要求1所述的方法，其中損傷部位是指髖關節、脊柱、或它們的組合。
15.權利要求14所述的方法，其中損傷部位包括股骨頸、股骨轉子、髂骨、或其組合。
16.權利要求15所述的方法，其中損傷部位包括髂骨的網狀骨質骨。
17.權利要求14所述的方法，其中損傷部位包括中段胸椎、上腰椎、或其組合。
18.權利要求1所述的方法，其中患者是指患有骨質疏鬆的婦女。
19.權利要求18所述的方法，其中患者是指絕經後婦女。
20.權利要求19所述的方法，其中婦女是指不依賴於激素替代療法或抗吸收劑的婦女。
21.權利要求1所述的方法，其中患者是指骨質疏鬆早期或骨質疏鬆進行期的婦女。
22.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加韌性和勁度。
23.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括降低骨折的危險和可能性。
24.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加皮質骨和小梁骨的活化頻率或骨形成率。
25.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加骨礦物質含量、增加骨礦物質密度、增加小梁數、增加小梁厚度、減少骨髓空間、增加小梁連接性、增加連接性、增加抗負荷強度、增加骨膜的和骨內膜的骨形成、增加皮質的多孔性、增加橫斷面的骨面積和骨質、增加斷裂功、減少彈性模量、或者上述的組合。
26.權利要求1所述的方法，其中給藥包括皮下給藥。
27.權利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素是周期性給藥或間歇給藥。
28.權利要求27所述的方法，其中周期性給藥包括至少用2個重建周期的甲狀旁腺素並停止使用甲狀旁腺素至少1個重建周期。
29.權利要求27所述的方法，其中周期性給藥包括至少用約12-24個月的甲狀旁腺素並停止使用甲狀旁腺素至少6個月。
30.權利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素是一種選自由PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)和PTH(1-41)組成的組的片段激素。
31.權利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素為人的PTH(1-34)。
32.權利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素為人的PTH(1-84)。
33.權利要求1所述的方法，其中甲狀旁腺素給藥劑量是至少約5μg/kg/天。
34.權利要求33所述的方法，其中該劑量為約10μg/kg/天-約40μg/kg/天。
35.權利要求1所述的方法，它還包括服用鈣、維生素D、或其組合。
36.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加中密度骨的骨礦物質含量。
37.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加低和高密度骨的骨礦物質含量、並降低中密度骨的骨礦物質含量。
38.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加中密度骨的骨礦物質含量，然後增加低和高密度骨的骨礦物質含量、並降低中密度骨的骨礦物質含量。
39.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括減小骨中的微晶物的大小。
40.權利要求39所述的方法，它還包括使骨中的微晶物成熟。
41.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括增加骨的礦化。
42.權利要求1所述的方法，其中增加韌性或勁度包括減少骨折的發生。
43.權利要求42所述的方法，其中增加韌性或勁度包括減少脊椎骨折的發生、減少重度骨折的發生、減少中度骨折的發生、減少非脊椎骨折的發生、減少多發骨折的發生、或其組合。
44.一種對需要治療的患者減少骨折危險性的方法，包括給予該患者服用有效量的甲狀旁腺素。
45.權利要求44所述的方法，其中骨包括髖關節、橈骨、踝、肱骨、肋骨、腳、骨盆、脊柱或其組合。
46.權利要求44所述的方法，其中甲狀旁腺素是一種選自由PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)和PTH(1-41)組成的組的片段激素。
47.權利要求44所述的方法，其中骨折包括脊椎骨折、非脊椎骨折、或者它們的組合。
48.權利要求47所述的方法，其中非脊椎骨折包括髖關節骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。
49.一種製備用於增加潛在或實際損傷部位的骨的韌性或勁度的藥劑的方法，包括將甲狀旁腺素與藥學上可接受的載體結合。
50.權利要求49所述的方法，其中藥劑包括甲狀旁腺素的穩定製劑。
51.權利要求50所述的方法，其中穩定製劑包括治療有效量的甲狀旁腺素；多羥基化合物，例如甘露糖醇或丙二醇；適用於保持組合物的pH在約3-7的範圍內的緩衝劑，例如醋酸鹽或酒石酸鹽原料；以及水。
52.甲狀旁腺素在製備用於減少需要治療的患者的骨折危險性的藥劑中的應用。
53.權利要求52所述的方法，其中骨包括髖關節、橈骨、踝、肱骨、肋骨、腳、骨盆、脊柱或其組合。
54.權利要求52所述的方法，其中甲狀旁腺素是一種選自由PTH(1-31)、PTH(1-34)、PTH(1-37)、PTH(1-38)和PTH(1-41)組成的組的片段激素。
55.權利要求52所述的方法，其中骨折包括脊椎骨折、非脊椎骨折、或者它們的組合。
56.權利要求55所述的方法，其中非脊椎骨折包括髖關節骨折、前臂末梢骨折、近端肱骨骨折、腕骨折、橈骨骨折、踝骨折、肱骨骨折、肋骨骨折、腳骨折、骨盆骨折、或它們的組合。
57.甲狀旁腺素用於製備減少需要治療的患者的骨折危險性的組合物中的應用。
58.甲狀旁腺素在製備用於增加潛在或實際損傷部位的骨的韌性或勁度的藥劑中的應用。
59.甲狀旁腺素用於製備增加潛在或實際損傷部位的骨的韌性或勁度的組合物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種使用甲狀旁腺素而增加骨的韌性和/或勁度的方法、和/或減少骨折的可能性和/或嚴重性的方法。該方法可用於增加潛在的或實際的損傷部位的骨的韌性或勁度,該損傷部位例如有骨質疏鬆危險性或患有骨質疏鬆的人的髖關節或脊柱。本發明的方法可減少脊椎骨折的發生、減少多發性脊椎骨折的發生、減少脊椎骨折的嚴重性、和/或減少非脊椎骨折的發生。
文檔編號A61K9/08GK1308545SQ9980835
公開日2001年8月15日 申請日期1999年8月19日 優先權日1998年8月19日
發明者珍妮特·M·霍克 申請人:伊萊利利公司