葡糖澱粉酶的變體的製作方法

2023-09-22 16:38:10 3

專利名稱：葡糖澱粉酶的變體的製作方法
葡糖澱粉酶的變體序列表所附的還有包含SEQ ID NOs :1-1099的序列表，其在此以其全部通過引用而併入。 發明領域所公開的是親本葡糖澱粉酶的組合變體，其具有改變的特性並適合例如用於釀造和葡萄糖糖漿生產中。還公開了編碼所述變體的DNA構建體以及在宿主細胞中生產所述葡糖澱粉酶變體的方法。
背景技術：
葡糖澱粉酶(葡聚糖1，4-α-葡萄糖水解酶，EC 3.2. 1.3)是澱粉水解性外切作用碳水化合物酶，其催化從澱粉或相關寡糖和多糖分子的非還原末端去除連續的葡萄糖單元。葡糖澱粉酶可水解澱粉(例如，直鏈澱粉和支鏈澱粉)的直鏈和支鏈的糖苷連接。葡糖澱粉酶是由細菌、真菌、酵母和植物的許多株系產生的。特別有趣且商業上重要的葡糖澱粉酶是在細胞外產生的真菌的酶，例如來自下列的菌株麴黴屬(Aspergillus) (Svensson et al. , Carlsberg Res. Commun. 48 :529-544(1983) ；Boel et al. , EMBO J. 3 1097-1102 (1984) ；Hayashida et al.，Agric. Biol. Chem. 53 :923-929 (1989)；美國專利號 5，024，941 ；美國專利號 4，794，175 和 WO 88/09795)；籃狀菌屬(Talaromyces)(美國專利號4，247，637 ；美國專利號6，255，084 ；和美國專利號6，620，924)；根黴屬(Rhizopus) (Ashikari et al. , Agric. Biol. Chem. 50 :957-964(1986) ；Ashikari et al. , App. Microbio. Biotech. 32 :129-133(1989)和美國專利號 4，863，864)；腐質黴屬(Humicola) (W0 05/052148 和美國專利號 4，618，579)；以及毛黴屬(Mucor) (Houghton-Larsen et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol. 62 :210-217 (2003)) 已在酵母、真菌和 / 或細菌細胞中克隆和表達了許多編碼這些酶的基因。商業上，葡糖澱粉酶是非常重要的酶並且被用於需要水解澱粉的廣泛的應用中 (例如，用於由澱粉生產葡萄糖和其它單糖)。葡糖澱粉酶被用於生產高果糖玉米甜味劑， 這構成美國超過50%的甜味劑市場。一般而言，葡糖澱粉酶可以、且通常與α-澱粉酶一起用於澱粉水解過程中以將澱粉水解為糊精，然後水解為葡萄糖。然後葡萄糖可被其它的酶(例如，葡萄糖異構酶)轉化為果糖；被結晶；或用於發酵以產生眾多的終產物(例如乙醇、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、抗壞血酸中間體、穀氨酸、甘油和1，3-丙二醇)。在含有澱粉和/或纖維素的材料的發酵中通過使用葡糖澱粉酶而產生的乙醇可被用作燃料或含酒精消費品的來源。在商業上用於生產高葡萄糖玉米糖漿(HGCQ和高果糖玉米糖漿(HFCS)的高固體濃度時，葡糖澱粉酶通過縮合反應由葡萄糖合成二糖、三糖和四糖。這是由於澱粉中 α-(1-6)-D-糖苷鍵的緩慢水解和由D-葡萄糖形成各種累積的縮合產物(主要是異麥芽糖)而發生的。因此，許多常規方法中的葡萄糖產量不超過理論產量的95%。通過這種方法在全世界生產的糖漿的量非常大，且甚至每噸澱粉的葡萄糖產量上很小的增加也是商業上重要的。
釀造中使用的葡糖澱粉酶主要是為了生產低碳水化合物啤酒。與其它澱粉酶(例如來自麥芽的)相組合，葡糖澱粉酶提供對澱粉非常充分的水解，直至水解為葡萄糖單元。 葡萄糖被酵母容易地轉化為醇，使得釀酒廠有可能由發酵獲得非常高的醇產量並同時獲得殘餘碳水化合物量很低的啤酒。用水將發酵物稀釋至所需的醇％，且最終的啤酒作為「低碳水化合物」出售。雖然葡糖澱粉酶多年被成功地用於商業應用中，仍存在對於具有改變的特性(例如改善的比活性，減少形成縮合產物(例如異麥芽糖)和增加的熱穩定性)的新葡糖澱粉酶的需求。發明概述本申請涉及了葡糖澱粉酶變體用於減少澱粉水解過程中縮合產物的合成的用途。 這些葡糖澱粉酶變體在催化結構域和/或澱粉結合結構域中含有胺基酸取代。所述變體展現出改變的特性，例如改變的比活性、減少形成縮合產物(例如異麥芽糖)和/或改變的熱穩定性。在一個方面，本申請描述了具有澱粉結合結構域和催化結構域的葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途，相對於SEQ ID NO :2的胺基酸序列或等同的親本葡糖澱粉酶，所述變體在互聯環2』、和/或環1、和/或螺旋2、和/或環11、 和/或螺旋12中包含兩個或更多個胺基酸取代。在另一個方面，描述了相對於下述包含兩個或更多個胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途具有SEQ ID NO :2的518位至 543位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的互聯環2』，和/或具有SEQ ID NO 2的21位至51位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環1，和/或具有SEQ ID NO :2的52位至68位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋 2，和/或具有SEQ ID NO :2的396位至420位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環11，和/或具有SEQ ID NO 2的421位至434位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋12。在另一個方面，描述了相對於下述包含兩個或更多個胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途SEQ ID NO 2的518位至543位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO 2的21位至51位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO :2的52位至68位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO 2的396位至420 位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO :2的421位至434 位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列。在另一個方面，描述了葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是相對於下列的具有SEQ ID NO 2的518位至543位的胺基酸序列的互聯環2』，和/ 或具有SEQ ID NO :2的21位至51位的胺基酸序列的環1，和/或具有SEQ ID NO 2的52 位至68位的胺基酸序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO 2的396位至420位的胺基酸序列的環11，和/或具有SEQ ID NO 2的421位至434位的胺基酸序列的螺旋12。在另一個方面，描述了葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體的晶體形式具有這樣的晶體結構在將等同的主鏈原子進行比對後，其主鏈原子的原子坐標與TrGA的等同主鏈原子的原子坐標(如 W02009/067218的表20中所定義的)的均方根偏差小於0. 13nm ；並且所述變體具有連接子區域、澱粉結合結構域以及催化結構域，所述變體相對於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列在澱粉結合結構域的互聯環2』中，和/或催化結構域的螺旋12中、和/或環1中、和/或螺旋2中、和/或環11中包含兩個或更多個胺基酸取代。在一個方面，葡糖澱粉酶變體包含兩個或更多個胺基酸取代，其中一個胺基酸取代在539位且一個胺基酸取代在44位，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置，並且所述序列與親本葡糖澱粉酶具有至少80%的序列同一性，並且其中44位的胺基酸取代不是44C。本公開還涉及編碼如本文所述的葡糖澱粉酶變體的多核苷酸。一方面，涉及包含核酸的質粒。另一方面，涉及包含所述多核苷酸或能夠表達所述葡糖澱粉酶變體的載體。另一方面，涉及包含(例如轉化了)所述質粒或載體的宿主細胞。另一方面，涉及宿主細胞， 其具有穩定整合到染色體中的編碼所述變體葡糖澱粉酶的核酸序列。另一方面，涉及能夠表達所述葡糖澱粉酶變體的細胞。另一方面，涉及表達葡糖澱粉酶變體的方法，所述方法包括獲得宿主細胞或細胞和從所述細胞或宿主細胞表達所述葡糖澱粉酶變體，以及任選地純化所述葡糖澱粉酶變體。本公開的另一方面是包含至少一種本文所述的葡糖澱粉酶變體的酶促組合物，及其用途。本公開的另一方面是將澱粉或部分水解的澱粉轉化為含有葡萄糖的糖漿的方法， 所述方法包括在至少一種本文所述的葡糖澱粉酶變體或酶促組合物的存在下糖化液體澱粉溶液。本公開的另一方面是本文所述的葡糖澱粉酶變體在澱粉轉化過程(例如連續澱粉轉化過程)、在生產寡糖、麥芽糊精或葡萄糖糖漿的過程中以及在生產高果糖玉米糖漿的過程中的用途。另一方面，提供了本文所述的葡糖澱粉酶變體在醇發酵過程中的用途。本公開的另一方面是生產用於釀造的麥芽汁的方法，所述方法包括由谷形成醪液，並使所述醪液與所述葡糖澱粉酶變體或所述酶促組合物相接觸。而本公開的另一方面是用於生產啤酒的方法，所述方法包括a)製備醪液，b)過濾所述醪液以獲得麥芽汁，並發酵所述麥芽汁以獲得啤酒，其中將所述葡糖澱粉酶變體加入步驟(a)和/或步驟(b)和/或步驟(c)。而本公開的另一方面是所述葡糖澱粉酶變體用於增強釀造過程的發酵步驟或澱粉糖化步驟中可發酵糖的產生的用途。而本公開的另一方面是啤酒，其中所述啤酒是通過下述步驟產生的a)製備醪液，b)過濾所述醪液以獲得麥芽汁，C)發酵所述麥芽汁以獲得啤酒，以及d)巴氏滅菌所述啤酒，其中將所述葡糖澱粉酶變體加入步驟(a)和/或步驟(b)和/或步驟(c)。


附圖併入本說明書中並構成本說明書的一部分，以闡釋實施方案實施方案。在附圖中
圖IA描繪了具有632個胺基酸(SEQ ID NO 1)的瑞氏木黴CTrichoderma reesei) 葡糖澱粉酶(TrGA)。信號肽加了下劃線，始於胺基酸殘基SVDDFI (SEQ ID N0:12)且具有 453個胺基酸殘基的催化區域(SEQ ID NO 3)是粗體的；連接子區域為斜體而澱粉結合結構域(SBD)既是斜體的也加了下劃線。TrGA的成熟蛋白(SEQ ID NO 2)包括催化結構域 (SEQ ID NO :3)、連接子區域(SEQ ID NO 10)和澱粉結合結構域(SEQ ID N0:11)。關於 TrGA葡糖澱粉酶分子的SBD編號，在本公開中參照a)成熟TrGA的SEQ ID NO 2中的491 至599位，和/或b) SEQ ID NO :11中的1至109位，其代表成熟iTrGA的分離的SBD序列。 關於TrGA分子的催化結構域編號，參照SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO :3。圖IB描繪了編碼TrGA的cDNA(SEQ ID NO 4)。圖IC描繪了前體和成熟蛋白TrGA結構域。
圖 2 描繪了目標質粒 pDONR-I^rGA，其包括 iTrGA 的 cDNA (SEQ ID NO :4)。圖 3 描繪了質粒 pTTT-Dest。圖4描繪了最終的表達載體pTTT-TrGA。圖5A和5B描繪了來自下列的親本葡糖澱粉酶的催化結構域的比對比較泡盛麴黴(Aspergillus awamori) (AaGA) (SEQ ID NO :5)；黑麴黴(Aspergillus niger) (AnGA) (SEQ ID NO :6)；米麴黴(Aspergillus oryzae) (AoGA) (SEQ ID NO :7)；瑞氏木黴 (Trichoderma reesei) (TrGA) (SEQ ID NO :3)；灰腐質黴(Humicola grisea) (HgGA) (SEQ ID NO 8)；和酒色肉座菌(Hypocrea vinosa) (HvGA) (SEQ ID NO :9)。同一的胺基酸以星號(*)表示。圖5C描繪了籃狀菌屬(Talaromyces)葡糖澱粉酶(TeGA)的成熟蛋白序列 (SEQ ID NO 384) 0圖5D和5E描繪了比較來自下列的親本葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域 (SBD)的比對瑞氏木黴(SEQ ID NO 11)；灰腐質黴(HgGA) (SEQ ID NO :385)；疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus) (ThGA) (SEQ ID NO :386) ■犬森籃狀菌(Talaromyces emersonii) (TeGA) (SEQ ID NO :387)；黑麴黴(AnGA) (SEQ ID NO :388)；泡盛麴黴(AaGA) (SEQ ID NO 389)；和太瑞斯梭孢殼黴(Thielavia terrestris) (TtGA) (SEQ ID NO :390)。圖6描繪了瑞氏木黴葡糖澱粉酶(黑色)(SEQ ID NO 2)和泡盛麴黴葡糖澱粉酶 (灰色)(SEQ ID NO :5)的三維結構側面視圖的比較。參照活性位點測量了所述側面且活性位點入口位於分子的「頂部」。圖7描繪了瑞氏木黴葡糖澱粉酶(黑色)(SEQ ID NO 2)和泡盛麴黴葡糖澱粉酶 (灰色)(SEQ ID NO 5)的三維結構俯視圖的比較。圖8描繪了 TrGA(SEQ ID NO 2)和AnGA(SEQ ID NO 6)的三維結構側面視圖的比對，其顯示出結合位點1和2。圖9描繪了阿卡波糖結合至TrGA晶體結構的模型。圖10描繪了 TLC板，其具有含有不同濃度的葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖的標準以及含有來自用iTrGA和AnGA孵育的葡萄糖的反應產物的樣品。發明詳述葡糖澱粉酶在要求澱粉水解的廣泛應用中是商業上重要的酶。申請人發現了， 通過在親本葡糖澱粉酶胺基酸序列的特定區域中的位置處引入某些改變，降低了形成 α-(1-6)鍵的比率，和/或減少了縮合產物(例如異麥芽糖)的形成。葡糖澱粉酶形成 α-(1-6)鍵的比率相對於其剪切α-(1-4)鍵的比率的降低具有實際的意義。當前的發明人提供了若干親本葡糖澱粉酶的變體，與親本葡糖澱粉酶相比，所述變體在某些實施方案中顯示出減少的縮合和/或減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)。在一些實施方案中，在糖化過程中使用本文所述的葡糖澱粉酶變體產生了具有高葡萄糖百分比的糖漿。在一些實施方案中，使用本文所述的葡糖澱粉酶變體在釀造步驟的發酵步驟和/或澱粉糖化步驟中引起了可發酵糖的生產提高。在一些實施方案中，使用本文所述的葡糖澱粉酶變體產生了提高的實際發酵度。這些改變的特性是通過突變(例如取代)親本葡糖澱粉酶中選定的位置而獲得的。這將在下文中更詳細地描述。因此，在另一個方面中，描述了相對於下述包含兩個或更多個胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途具有SEQ ID N0:2的 518位至543位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的互聯環2』，和/或具有SEQ ID NO :2的21位至51位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環1， 和/或具有SEQ ID NO 2的52位至68位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO :2的396位至420位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環11，和/或具有SEQ ID NO 2的421位至434位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋12。在另一個方面中，描述了相對於下述包含兩個或更多個胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途SEQ ID NO 2的518位至M3 位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO :2的21位至51 位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的，和/或SEQ ID NO 2的52位至 68位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO 2的396位至 420位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO :2的421位至434位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列。因此，在另一個方面中，描述了葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體的晶體形式具有這樣的晶體結構在將等同的主鏈原子進行比對後，其主鏈原子的原子坐標與TrGA的等同主鏈原子的原子坐標(如 W02009/067218的表20中所定義的)的均方根偏差小於0. 13nm ；並且所述變體具有連接子區域、澱粉結合結構域以及催化結構域，所述變體相對於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列在澱粉結合結構域的互聯環2』中，和/或催化結構域的螺旋12中、和/或環1中、和/或螺旋2中、和/或環11中包含兩個或更多個胺基酸取代。在另一個方面中，與TrGA的等同主鏈原子的原子坐標(如W02009/067218的表20中所定義的)的均方根偏差小於0. 12nm，例如小於0. 11或例如小於0. 10。在一個方面，描述了具有澱粉結合結構域和催化結構域的葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途，相對於SEQ ID NO :2的胺基酸序列或等同的親本葡糖澱粉酶，所述變體在互聯環2』、和/或環1、和/或螺旋2、和/或環11、和/或螺旋12中包含兩個或更多個胺基酸取代。在另一個方面中，描述了葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是相對於下列的具有SEQ ID NO 2的518位至543位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的互聯環2』，和/或具有SEQ ID NO :2的21位至51位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環1，和/或具有SEQ ID NO :2的52位至68位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO :2的396位至420位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環11，和/或具有SEQ ID NO 2的421位至434位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋12。在另一個方面中，描述了葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是相對於下列的具有SEQ ID NO :2的518位至543位的胺基酸序列的互聯環2』，和/ 或具有SEQ ID NO :2的21位至51位的胺基酸序列的環1，和/或具有SEQ ID NO 2的52 位至68位的胺基酸序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO 2的396位至420位的胺基酸序列的環11，和/或具有SEQ ID NO 2的421位至434位的胺基酸序列的螺旋12。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代為互聯環2』中的至少一個(例如一個、兩個或三個)胺基酸取代和環1和/或螺旋2和/或環11和/或螺旋12中的至少一個(例如一個、兩個、三個、四個、五個或六個)胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的一個、兩個、三個或四個胺基酸取代以及環1和/或螺旋2和/或環11和/或螺旋12中的一個、兩個、三個或四個胺基酸取代。在另一個方面中，在互聯環2』中有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代。 在另一個方面中，在環1中有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代。在另一個方面中，在螺旋 2中有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代。在另一個方面中，在環11中有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代。在另一個方面中，在螺旋12中有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代。
在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代為互聯環2，中的至少一個胺基酸取代和環1中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代為互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和螺旋2中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代為互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環11中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代為互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和螺旋12中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代為互聯環2』中的至少一個胺基酸取代、環1中的至少一個胺基酸取代和螺旋2中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體在互聯環2，的位置520-543、530_543或 534-543中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體在環1的位置30-50、35-48或40_46的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體在螺旋2的位置50-66、55-64或58_63的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體在環11的位置405-420、410-420或415-420的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體在螺旋12的位置421-434、425-434或428-434的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。 在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶具有至少80 %、85 %、90 %、 95%、98% 或 99. 5% 的序列同一性，例如與 SEQ ID NO :1、2、3、5、6、7、8 或 9 的至少 80%, 85%、90%、95%、98%或99. 5%的序列同一性。在一個方面中，葡糖澱粉酶變體與SEQ ID NO 2具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99. 5%的序列同一性。在另一個方面中，親本葡糖澱粉酶或葡糖澱粉酶變體具有澱粉結合結構域，其與 SEQ ID NO :1、2、11、385、386、387、388、389 或 390 的澱粉結合結構域有至少 96%、97%、 98 %、99 %或99. 5 %的序列同一性。在另一個方面中，親本葡糖澱粉酶或葡糖澱粉酶變體具有催化結構域，其與SEQ ID NO :1、2、3、5、6、7、8或9的催化結構域有至少80%、85%、90%、 95%或99. 5%的序列同一性。在一個方面中，葡糖澱粉酶變體在539位具有胺基酸取代且在選自44、61、417和 431位的位置中具有一個或多個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，葡糖澱粉酶變體在539位具有胺基酸取代且在a)在44位具有胺基酸取代和/或b)在417和431兩個位置均具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，葡糖澱粉酶變體在539位具有胺基酸取代且在44位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，葡糖澱粉酶變體在539 位具有胺基酸取代且在417和431位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID N0:2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，葡糖澱粉酶變體在539位具有胺基酸取代且在44和61位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，葡糖澱粉酶變體在43位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中， 葡糖澱粉酶變體在61位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，539位的胺基酸取代是539R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，44位的胺基酸取代是44R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。 在一個方面中，417位的胺基酸取代是417R/V，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，417位的胺基酸取代是417R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，417位的胺基酸取代是417V，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，431位的胺基酸取代是431L，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，43位的胺基酸取代是43R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，61位的胺基酸取代是611，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，縮合產物為異麥芽糖。在一個方面中，澱粉的水解是在釀造過程中。在例如釀造中，異麥芽糖的形成是不希望的，因為其在發酵中不能被轉化為醇。啤酒傳統地是指源自麥芽(例如源自大麥的麥芽)和任選地附加物(例如穀粒) 的含酒精飲料，並用啤酒花調味。
啤酒可通過基本上相同的過程從各種穀物中製造。所有的穀物澱粉均為葡萄糖均聚物，其中葡萄糖殘基通過α-1，4鍵或α _1，6鍵連接，其中前者是主要的。製造經發酵的麥芽飲料的過程通常被稱作釀造。製造這些飲料所使用的主要原材料為水、啤酒花和麥芽。此外，例如下列附加物可被用作澱粉的來源普通玉米磨粒、精細玉米磨粒、釀酒者研磨酵母、稻、蜀黍、精細玉米澱粉、大麥、大麥澱粉、去殼大麥、小麥、小麥澱粉、烘培的穀物、穀物片、黑麥、燕麥、馬鈴薯、木薯澱粉和糖漿(例如玉米糖漿、甘蔗糖漿、 轉化糖糖漿、大麥和/或小麥糖漿)等。澱粉將最終被轉化為糊精和可發酵的糖。出於數種原因，相信麥芽(其主要由所選擇的大麥品種產生)對於啤酒的總體特徵和質量具有最大的影響。第一，麥芽是啤酒中主要的調味劑。第二，麥芽提供可發酵糖的主要部分。第三，麥芽提供蛋白質，其將促成啤酒的主體(body)和泡沫特徵。第四，麥芽提供澱粉糖化過程中必需的酶促活性。啤酒花也對啤酒的質量(包括風味)有顯著貢獻。特別地，啤酒花(或啤酒花組成物)向啤酒中加入所希望的苦味化物質。此外，啤酒花作為蛋白質沉澱劑起作用，建立防腐劑並幫助泡沫形成和穩定化。製造啤酒的過程是本領域中熟知的，但是簡要地，其涉及五個步驟(a)澱粉糖化和/或附加物的蒸煮(b)麥芽汁分離和提取(c)煮沸麥芽汁並加入啤酒花(d)冷卻、發酵和儲存，以及(e)成熟、加工和包裝。通常，在第一步中，將研磨或壓碎的麥芽與水相混合併在受控的溫度下保持一段時間以允許麥芽中存在的酶將麥芽中存在的澱粉轉化為可發酵的糖。在第二步中，將醪液轉移至「過濾槽」或醪液過濾器，在那裡液體與穀物殘餘物分離。這種甜的液體被稱為「麥芽汁」而剩下的穀物殘餘物被稱作「麥糟」。通常使醪液經受提取，這包括向醪液中加水以從谷糟中回收殘留的可溶性提取物。在第三步中，將麥芽汁劇烈煮沸。這使麥芽汁滅菌並幫助產生顏色、風味和氣味且滅活酶活性。在煮沸過程中的某個時刻加入啤酒花。在第四步中，將麥芽汁冷卻並轉移至發酵罐，所述發酵罐含有酵母或向其中加入酵母。酵母通過發酵將糖轉化為醇和二氧化碳氣體；在發酵的最後，使發酵罐變冷或可使發酵罐變冷以停止發酵。酵母絮凝並被去除。在最後一步中，將啤酒冷卻並儲存一段時間，在所述時間段中，啤酒澄清且其風味產生，並且任何可能損害啤酒的外觀、風味和貨架期的物質都沉澱掉。在包裝之前，使啤酒碳酸化並任選地將其過濾和巴氏滅菌。發酵之後，獲得了這樣的飲料，其通常含有大約2%至大約10%的醇(按重量)。 不可發酵的碳水化合物在發酵過程中不被轉化並且形成最終的啤酒中所溶解的固體的大多數。這種殘餘物的存留是因為麥芽澱粉酶不能夠水解澱粉的α -1，6_連接。不可發酵的碳水化合物貢獻大約50卡路裡/12盎司啤酒。關於常規釀造過程的其它信息、以及將應用於本發明的釀造技術領域中所使用的術語的定義，可在下列中找至IJ 「 Technology Brewing and Malting" by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing,Berlin(VLB), 2nd revised Edition 1999， ISBN3-921690-39-0 或 3rd edition(2004) JSBN 3-921690-49-8。
最近，稱為輕啤酒、卡路裡減少的啤酒或低卡路裡啤酒的釀造飲料被廣泛普及，特別是在美國市場中。如在美國所定義的，這些啤酒與製造商的「普通」啤酒相比，具有大約 30%更少的卡路裡。如本文中所使用的，術語「輕啤酒、卡路裡減少的啤酒或低卡路裡啤酒」是指最近、 廣泛普及的釀造飲料，特別是在美國市場中。如在美國所定義的，這些高度減弱的啤酒與製造商的「普通」啤酒相比，具有大約30%更少的卡路裡。關於常規釀造過程的其它信息可在下列中找至丨J 「 Technology Brewing and Malting" by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 3rd completely updated edition, 2004，ISBN 3-921690-49-8ο本文所公開的是如本文所描述的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與親本葡糖澱粉酶 (例如TrGA)相比，可發酵糖的生產提高了。本文中還公開了如本文所描述的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，在釀造過程的澱粉糖化步驟中可發酵糖的生產提高了。本文所公開的是如本文所描述的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，在釀造過程的發酵步驟中可發酵糖的生產提高了。本文所公開的是如本文所描述的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述的可發酵糖是葡萄糖。能夠以顯著減少的副產物的量產生葡萄糖的葡糖澱粉酶將有很大的商業意義，例如在葡萄糖糖漿的生產中或在釀造中。本文中還公開了如本文所描述的葡糖澱粉酶變體的用途，其中澱粉的水解是在用於生產葡萄糖糖漿的過程中。在一個方面中，與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，所述葡糖澱粉酶顯示出減少的異麥芽糖合成(1 與澱粉水解活性 (SH)之比。在一個方面中，與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，所述葡糖澱粉酶顯示出降低的澱粉水解活性，所述澱粉水解活性降低不超過5%、不超過10%或不超過15%。在一個方面中，與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出提高的實際發酵度。在一個方面中，與由黑麴黴的葡糖澱粉酶(AnGA) (SEQ ID NO 6)形成的縮合產物的量相比，所述葡糖澱粉酶在相當的條件下形成的縮合產物的量更低。在一個方面中，所述葡糖澱粉酶形成的縮合產物的量與相當條件下由黑麴黴的葡糖澱粉酶(AnGA) (SEQ ID NO :6)形成的縮合產物的量相比基本上相同、為不超過5%更高、為不超過8%更高或為不超過10%更高。在一個方面中，基於蛋白質濃度的葡糖澱粉酶劑量是相同的。在一個方面中，基於在活性測定中的活性測量，葡糖澱粉酶的劑量是相同的。本文中所描述的葡糖澱粉酶變體在催化結構域和/或澱粉結合結構域中含有胺基酸取代。所述變體可顯示出改變的特性，例如改善的熱穩定性、縮合產物(例如異麥芽糖)的改變的形成和/或提高的實際發酵度和/或降低的異麥芽糖合成(1 與澱粉水解活性(SH)之比和/或比活性。伴有減少的縮合產物(例如異麥芽糖)形成的變體可顯著提高在例如釀造工業中製造所需產品的能力。1.定義和縮寫1. 1.定義除非另行定義，本文中所使用的所有科技術語都具有與本公開所屬領域中的普通技術人員所通常理解的相同的涵義。Singleton et al. ,Dictionary Of Microbiology And Molecular Biology,2nd ed. , John Wiley and Sons,New York(1994),禾口Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary Of Biology, Harper Perennial, N. Y. (1991)為本令頁域技術人員提供了本文中所使用的許多術語的一般涵義。為了清楚和引用方便，在下文中定義了某些術語。如本文中所使用的，術語「葡糖澱粉酶(EC 3. 2. 1. 3) 」是指催化從澱粉和相關寡糖及多糖的非還原末端釋放D-葡萄糖的酶。術語「親本」或「親本序列」是指宿主細胞中天然的或自然存在的序列。親本葡糖澱粉酶包括但不限於，SEQ ID NOs :1、2、3、5、6、7、8和9中所示的葡糖澱粉酶序列，以及與 SEQ ID NO :2具有至少80%胺基酸序列同一性的葡糖澱粉酶。如本文中所使用的，「等同位置」是指基於所涉及的親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列及所涉及的親本葡糖澱粉酶的三維結構與TrGA參考葡糖澱粉酶的胺基酸序列(SEQ ID NO 2)及三維結構的比對而為兩個親本序列所共有的位置。因此，可使用序列比對或者結構比對來確定等同物。術語「TrGA」是指具有SEQ ID NO 2中所示的成熟蛋白序列的親本瑞氏木黴葡糖澱粉酶序列，其包括具有SEQ ID NO :3中所示序列的催化結構域。TrGA的分離、克隆和表達描述於W02006/060062和美國專利號7，413，887中，二者均在此通過引用而併入。在一些實施方案中，親本序列是指這樣的葡糖澱粉酶序列，其為用於蛋白質工程化的起始點。本文中的葡糖澱粉酶胺基酸編號是基於葡糖澱粉酶與TrGA(SEQ ID N0:2和/或3)的序列比對。用語「蛋白質或多肽的成熟形式」是指蛋白質或多肽的最終有功能的形式。葡糖澱粉酶的成熟形式可例如缺少信號肽。作為示例，TrGA的成熟形式包括催化結構域、連接子區域和澱粉結合結構域，其具有SEQ ID NO 2的胺基酸序列。如本文中所使用的，術語「葡糖澱粉酶變體」和「變體」用於指這樣的葡糖澱粉酶， 其與親本葡糖澱粉酶序列具有一定程度的胺基酸序列同一性。變體與親本序列相似，但是在其胺基酸序列中具有至少一個使得它們在序列上不同於親本葡糖澱粉酶的取代、缺失或插入。在某些情況中，變體被操縱和/或工程化以在其胺基酸序列中包括至少一個使得它們在序列上不同於親本的取代、缺失或插入。此外，葡糖澱粉酶變體可保留親本葡糖澱粉酶的功能特徵，例如維持親本葡糖澱粉酶的葡糖澱粉酶活性的至少約50%，約60%，約70%， 約80%，或約90%。如果是所要選擇的，其也可具有高於100%的活性。當用於比較而進行最佳比對時，「變體」與親本多肽序列可具有至少約45%，約 50 %，約 55 %，約 60 %，約 65 %，約 70 %，約 75 %，約 80 %，約 85 %，約 88 %，約 90 %，約 91%，約 92%，約 93%，約 94%，約 95%，約 96%，約 97%，約 98%，約 99%或約 99. 5%的序列同一性。在一些實施方案中，葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶的催化結構域可具有至少約 45%，約 50%，約 55%，約 60%，約 65%，約 70%，約 75%，約 80%，約 85%，約 88%， 約 90 %，約 91 %，約 92 %，約 93 %，約 94 %，約 95 %，約 96 %，約 97 %，約 98 %，約 99 % 或約99. 5%的序列同一性。在一些實施方案中，葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域可具有至少約45 %，約50 %，約55 %，約60 %，約65 %，約70 %，約75 %，約80 %， 約 85%，約 88%，約 90%，約 91%，約 92%，約 93%，約 94%，約 95%，約 96%，約 97%，約 98%，約99%或約99. 5%的序列同一性。可在親本或變體序列的全長上測量序列同一性。使用本領域中已知的標準技術(見例如，Smith and Waterman, Adv. App 1. Math. 2 :482(1981) ；Needleman and ffunsch, J. Mol. Biol. 48 :443 (1970) ；Pearson andLipman, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(1988) ；Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI)中的程序例如 GAP，BESTHT，FASTA 禾口 TFASTA ；以及 Devereux el al. ,Nucleic Acid Res. , 12 :387-395(1984))來確定序列同一性。「百分比(％ )核酸序列同一性」或「百分比(％ )胺基酸序列同一性」被定義為候選序列中的核苷酸殘基或胺基酸殘基與起始序列(例如，SEQ ID NO 2)的核苷酸殘基或胺基酸殘基所相同的百分比。可在起始序列的全長中測量序列同一性。在本申請中通過序列比對的方法確定「序列同一性」。為了本公開的目的， 比對方法為 BLAST，其由 Altschul 等人所描述(Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215 403-410(1990)；和 Karlin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993))。 特別有用的 BLAST 程序是 WU-BLAST-2 程序(見 Altschul 等人，Meth. Enzymol. 266 460-480(1996))。WU-BLAST-2使用數個搜索參數，其中大多數被設置為默認值。可調節的參數以下列值設置重疊跨越=1，重疊部分=0. 125，詞閾值⑴=11。HSP S和HSP S2 參數是動態的值，並且取決於具體序列的組成和針對其對目的序列進行檢索的具體資料庫的組成而由程序本身確立。然而，可調節所述值以增加靈敏度。胺基酸序列同一性值是由匹配的相同殘基的數目除以比對區域中「更長」序列的殘基總數而確定的。「更長」序列是在比對區域中具有最多實際殘基的序列(忽略通過WU-Blast-2引入以使比對得分最大化的間隙)。術語「最佳比對」是指給出最高百分比同一性評分的比對。如本文中所使用的，術語「催化結構域」是指多肽的結構區域，其含有用於底物水解的活性位點。術語「連接子」是指通常具有3至40個胺基酸殘基的短胺基酸序列，其將包含澱粉結合結構域的胺基酸序列與包含催化結構域的胺基酸序列共價結合。術語「澱粉結合結構域」是指優先結合澱粉底物的胺基酸序列。如本文中所使用的，術語「突變體序列」和「突變體基因」可互換地使用並且是指在存在於宿主細胞的親本序列中的至少一個密碼子中具有改變的多核苷酸序列。突變體序列的表達產物是相對於親本具有改變的胺基酸序列的變體蛋白。表達產物可具有改變的功能性能力(例如，提高的酶促活性)。如本文中所使用的，在多肽的語境中，術語「特性」或其語法上的等同物是指可被選擇或檢測的多肽的任何特徵或屬性。這些特性包括但不限於氧化穩定性、底物特異性、催化活性、熱穩定性、PH活性特徵譜、對蛋白分解降解的抗性、KM、Kcat, Kcat/Km比率、蛋白質摺疊、結合底物的能力和被分泌的能力。如本文中所使用的，在核酸的語境中，術語「特性」或其語法上的等同物是指可被選擇或檢測的核酸的任何特徵或屬性。這些特性包括但不限於，影響基因轉錄(例如，啟動子強度或啟動子識別)的特性、影響RNA加工(例如，RNA剪接和RNA穩定性)的特性、影響翻譯(例如，調節mRNA與核糖體蛋白的結合)的特性。術語「熱穩定的」和「耐熱的」是指下述本公開的葡糖澱粉酶變體其在澱粉底物水解中普遍的條件下(例如暴露於改變的溫度時)、在暴露於溫度給定的時間段後，保留特定量的酶促活性。
在特性(例如熱穩定性)的語境中，術語「提高的穩定性」是指與另一個參考(即親本)葡糖澱粉酶相比，隨時間所保留的更高的澱粉水解活性。在特性(例如熱穩定性)的語境中，術語「減少的穩定性」是指與另一個參照葡糖澱粉酶相比，隨時間所保留的更低的澱粉水解活性。術語「比活性」被定義為每mg葡糖澱粉酶蛋白的活性。在一些實施方案中，葡糖澱粉酶的活性是通過本文所描述的乙醇測定而確定的並被表示為從澱粉底物產生的葡萄糖的量。在一些實施方案中，可使用本文所描述的Caliper測定來確定蛋白質濃度。術語「有活性的」和「有生物學活性的」是指與特定蛋白相關的生物學活性。因此， 給定蛋白的生物學活性是指本領域技術人員通常歸於那種蛋白的任何生物學活性。例如， 與葡糖澱粉酶相關的酶促活性是水解性的，因此有活性的葡糖澱粉酶具有水解活性。術語「多核苷酸」和「核酸」在本文中可互換地使用，是指任何長度的多聚形式的核苷酸，其為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。這些術語包括但不限於，單鏈、雙鏈或三鏈DNA， 基因組DNA，cDNA, RNA, DNA-RNA雜合體，或者包含嘌呤和嘧啶鹼基、或其它天然的、經化學修飾、經生物化學修飾、非天然或衍生的核苷酸鹼基的聚合物。如本文中所使用的，術語「DNA構建體」、「轉化性DNA」和「表達載體」可互換地使用，是指用於將序列弓I入宿主細胞或生物體中的DNA。可通過PCR或本領域技術人員已知的任何其它合適的技術而在體外產生所述DNA。DNA構建體、轉化性DNA或重組表達盒可被整合到質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表達載體、DNA構建體或轉化性DNA的重組表達盒部分包括(在其它序列中)待轉錄的核酸序列和啟動子。在一些實施方案中，表達載體具有整合和在宿主細胞中表達異源DNA片段的能力。如本文中所使用的，術語「載體」是指多核苷酸構建體，其被設計用於將核酸引入一個或多個細胞類型中。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、盒等。如本文中所使用的，在將核酸序列引入細胞中的語境中，術語「引入」是指任何適於將核酸序列轉移到細胞中的方法。此類用於引入的方法包括但不限於原生質體融合、轉染、轉化、綴合和轉導。如本文中所使用的，術語「經轉化的」和「經穩定轉化的」是指具有非天然(異源) 多核苷酸序列的細胞，所述序列被整合到其基因組中或作為被保持至少兩代的游離質粒。如本文中所使用的，術語「可選擇的標記物」和「選擇性標記物」是指能夠在宿主細胞中表達的核酸(例如基因)，其允許容易地選擇含有載體的那些宿主。通常，可選擇的標記物是賦予宿主細胞抗微生物抗性或代謝優勢以允許將含有外源DNA的細胞與在轉化過程中未接受任何外源序列的細胞區分開。如本文中所使用的，術語「啟動子」是指起作用以指導下遊基因的轉錄的核酸序列。啟動子以及其它轉錄和翻譯調控核酸序列(也成為「控制序列」)是表達指定基因所必需的。一般地，轉錄和翻譯調控序列包括但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、以及增強子或活化子序列。當將核酸置於與另一種核酸序列的功能性關係中時，其為「可操作地連接」的。例如，編碼分泌性前導序列(即信號肽)的DNA與多肽的DNA可操作地連接，如果其作為參與多肽的分泌的前蛋白被表達的話。通常，「可操作地連接」是指被連接的DNA序列是連續的， 並且在分泌性前導序列的情形中，其為連續的且在閱讀相中。
如本文中所使用的，術語「基因」是指多核苷酸(例如DNA區段)，其編碼多肽且包括編碼區之前和之後的區域，以及單個編碼區段(外顯子)之間的居間序列(內含子)。如本文中所使用的，「直向同源物」和「直向同源基因」是指通過物種形成而從共同的先祖基因進化而來的不同物種中的基因(即同源性基因)。通常，直向同源物在進化的過程中保留了相同的功能。對直向同源物的鑑別可用於可靠地預測新測序的基因組中的基因功能。如本文中所使用的，「旁系同源物」和「旁系同源基因」是指通過基因組內的複製而相關聯的基因。直向同源物在進化的過程中保留相同的功能，而旁系同源物進化出新的功能，雖然一些功能通常與原始的功能相關。旁系同源基因的實例包括但不限於編碼胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，它們都是絲氨酸蛋白酶並一起存在於相同的物種中。如本文中所使用的，術語「雜交」是指核酸的鏈與互補鏈通過鹼基配對而結合的過程，如本領域中所知的。核酸序列被認為是與參考核酸序列「選擇性可雜交的」，如果所述兩個序列在中等至高嚴緊雜交和洗滌條件下彼此特異性雜交。雜交條件是基於核酸結合複合物或探針的熔解溫度(Tm)。例如，「最大嚴緊性」通常發生在大約Tm-5°c時(探針的Tm以下5°C )；「高嚴緊性」在Tm以下約5-10°C;「中度嚴緊性」在探針的Tm以下約10-20°C;而「低嚴緊性」在Tm 以下約20-25°C。功能上，最大嚴緊性條件可被用於鑑別與雜交探針有嚴格同一性或接近嚴格同一性的序列；而中度或低嚴緊性雜交可被用於鑑別或檢測多核苷酸序列同源物。中等和高嚴緊雜交條件是本領域中熟知的。高嚴緊性條件的實例包括在下列條件下雜交約 42°C、50% 甲醯胺、5XSSC、5XDenhardt' s 溶液、0.5% SDS 和 100 μ g/ml 變性的載體DNA，隨後在室溫下用2 X SSC和0. 5% SDS清洗兩次並於42°C在0. 1 X SSC和0. 5% SDS中再清洗兩次。中等嚴緊條件的實例包括在37°C下、在包含20%甲醯胺、5 XSSC (150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7. 6) ,5 XDenhardt 『 s溶液、10 %硫酸葡聚糖和 20mg/ml變性的剪斷的鮭精DNA的溶液中孵育過夜，隨後在約37_50°C下在IXSSC中清洗濾器。本領域技術人員知道如何按需要調節溫度、離子強度等以適應例如探針長度等因素。如本文中所使用的，「重組的」包括指通過引入異源或同源核酸序列而被修飾的細胞或載體，或是指所述細胞源自經如此修飾的細胞。因此，例如，重組的細胞表達未在細胞的天然(非重組)形式中以相同的形式發現的基因或者表達天然的基因，然而所述天然基因作為人故意幹預的結果而異常表達、表達不足或根本不表達。在本公開的實施方案中，在至少一個密碼子中用位點飽和誘變產生了經突變的 DNA序列。在另一個實施方案中，對於兩個或更多個密碼子進行了位點飽和誘變。在另外的實施方案中，突變體DNA序列與親本序列具有多於約50 %，約55 %，約60 %，約65 %，約 70%，約75%，約80%，約85%，約90%，約95%或約98%的同一性。在備選的實施方案中，使用任何已知的誘變程序(例如輻射、亞硝基胍等)在體內產生了突變體DNA。然後分離所需的DNA序列並將其用於本文所提供的方法中。如本文中所使用的，「異源蛋白」是指在宿主細胞中不天然存在的蛋白或多肽。如果酶以比其在相應野生型細胞中的表達水平更高的水平在宿主細胞中表達，則酶在所述細胞中「過表達」。
術語「蛋白」和「多肽」在本文中可互換地使用。在當前的公開和權利要求中，使用了用於胺基酸殘基的常規一個字母和三個字母密碼。胺基酸的三字母密碼如遵照生物化學命名IUPAC-IUB聯合委員會(JCBN)而定義的。還理解的是，由於遺傳密碼的簡併性，多肽可由多於一個核苷酸序列編碼。本公開的變體通過下列命名法被描述[原始胺基酸殘基/位置/取代的胺基酸殘基]。例如，用亮氨酸取代76位的精氨酸被表示為R76L。當在指定的位置有多於一個胺基酸取代時，取代表示為1) Q172C, Q172D或Q172R ；2) Q172C，D或R，或者3) Q172C/D/R。當在本文中鑑別了適於取代的位置而沒表明具體的胺基酸時，應理解為存在於所述位置的胺基酸殘基可被任何胺基酸殘基取代。當與其它葡糖澱粉酶相比，變體葡糖澱粉酶含有缺失時，所述缺失被表示為「*」。例如，位置R76處的缺失被表示為R76*。兩個或更多個連續胺基酸的缺失被表示為例如(76-78)*。「原序列(prosequence) 」是信號序列與成熟蛋白之間、蛋白分泌所必需的胺基酸序列。原序列的剪切將產生成熟的有活性的蛋白。術語「信號序列，，或「信號肽」是指可參與蛋白的成熟或前體形式的分泌的任何核苷酸和/或胺基酸序列。信號序列的此定義是功能性的定義，意在包括由蛋白基因的N末端部分編碼的所有那些參與蛋白分泌的實行的胺基酸序列。它們通常但不是全體地結合於蛋白的N末端部分或前體蛋白的N末端部分。信號序列可以是內源性的或外源性的。信號序列可以是通常與蛋白(例如葡糖澱粉酶)相關聯的序列，或者可以是來自編碼另一個被分泌的蛋白的基因。術語蛋白或肽的「前體」形式是指具有與蛋白的氨基或羰基末端可操作地連接的原序列的、蛋白的成熟形式。前體也可具有與原序列的氨基末端可操作地連接的「信號」序列。前體還可具有涉及翻譯後活性的額外的多核苷酸(例如，從其上被剪切以留下蛋白或肽的成熟形式的多核苷酸)。「宿主株系」或「宿主細胞」是指用於包含根據本公開的DNA的表達載體的適合的宿主。術語「源自，，和「獲得自，，不僅是指由所涉及的生物體的株系產生或可由其產生的葡糖澱粉酶，還指由分離自此類株系的DNA序列編碼及在含有所述DNA序列的宿主生物體中產生的葡糖澱粉酶。此外，所述術語指由合成和/或cDNA來源的DNA序列編碼且具有所涉及的葡糖澱粉酶的鑑別特徵的葡糖澱粉酶。在此定義範圍內的「衍生物」通常以一定程度保留了在野生型、天然或親本形式中所觀察到的特徵性水解活性，從而所述衍生物可用於與所述野生型、天然或親本形式相似的目的。葡糖澱粉酶的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重組產生的肽或肽片段，其具有本公開的葡糖澱粉酶一般特徵。術語「分離的」是指從自然環境中被去除的物質(如果其天然存在的話)。「純化的」蛋白是指被至少部分地純化至同質的蛋白。在一些實施方案中，經純化的蛋白是超過約 10%純、約20%純或約30%純，如通過SDS-PAGE所確定的。本公開的其它方面包括高度純化形式的蛋白(即超過約40%純、約60%純、約80%純、約90%純、約95%純、約97%純或約99%純)，如通過SDS-PAGE所確定的。如本文中所使用的，術語「組合誘變」是指其中產生了起始序列的變體文庫的方法。在這些文庫中，變體含有一個或數個選自預先確定的突變組的突變。此外，所述方法為引入不是預先確定的突變組成員的隨機突變提供了工具。在一些實施方案中，所述方法包括美國專利號6，582，914中所示的那些，在此通過引用而併入。在備選的實施方案中，組合誘變方法包括商業上可得的試劑盒(例如，QuikChange Multisite，Stratagene，San Diego, CA)0如本文中所使用的，術語「突變體的文庫」是指在其基因組的大部分中同一但是包括一個或多個基因的不同同源物的細胞群。可使用此類文庫來例如鑑別具有改善的特點的基因或操縱子。如本文中所使用的，術語「乾燥固體含量(DS或ds) 」是指在乾重的基礎上以％表示的漿料的總固體。如本文中所使用的，術語「初始命中」是指通過篩選組合共有誘變文庫而鑑別出的變體。在一些實施方案中，與起始基因相比初始命中具有改善的性能特徵。如本文中所使用的，術語「改善的命中」是指通過篩選增強的組合共有誘變文庫而鑑別出的變體。如本文中所使用的，術語「靶特性」是指待改變的起始基因的特性。不意欲將本公開限制為任何特定的靶特性。然而，在一些實施方案中，靶特性是基因產物的穩定性(例如對變性、蛋白分解或其它變質性因素的抗性)，而在其它實施方案中，改變了生產宿主中的生產水平。的確，所料想的是起始基因的任何特性都將可用於本公開中。其它的術語定義可貫穿本說明書而出現。如本文中所使用的，「用於製造啤酒的過程」還可被應用於任何谷(grist)的澱粉糖化中。如本文中所使用的，術語「谷」是指可源自任何植物和植物部分的任何含有澱粉和 /或糖的植物材料，所述植物和植物部分包括根莖(例如馬鈴薯)、根(例如木薯[Manihot esculenta]根)、莖、葉和種子。所述谷可包括穀物，例如來自大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米/ 玉蜀黍、稻、高粱、粟和蜀黍的穀物，例如至少10%、或至少15%、或至少25%、或至少35%， 例如至少50%，至少75%，至少90%或甚至100% (w/w)的麥芽汁的谷源自穀物。在一些實施方案中，所述谷可包含從木薯[Manihot esculenta]根獲得的、含有澱粉和/或糖的植物材料。所述谷可包括含麥芽的穀物，例如大麥麥芽。通常，至少10%，或至少15%，或至少25%，或至少35%，例如至少50%，至少75%，至少90%或甚至100% (w/w)的麥芽汁的谷來自含麥芽的穀物。所述谷可包含附加物，例如至多10%、或至少10%，或至少15%，或至少25 %，或至少35 %，或至少50 %，至少75 %，至少90 %，或甚至100 % (w/w)的麥芽汁的谷是附加物。術語「附加物」被理解為不是大麥麥芽的谷的部分。附加物可以是任何富含碳水化合物的物質。在術語「附加物」中，包括含有澱粉和/或糖的植物材料，例如在「谷」中所定義的。在釀造的情境中，術語「發酵」是指麥芽汁中的糖被釀造酵母中的酶轉化為乙醇和二氧化碳，伴隨其它發酵副產物的形成。如本文中所使用的，術語「麥芽」被理解為任何含麥芽的穀物，例如大麥。如本文中所使用的，術語「麥芽飲料」包括例如下列形成泡沫的經發酵的麥芽飲料全麥啤酒、淡色啤酒、幹啤、淡啤酒、輕啤酒、低醇啤酒、低卡路裡啤酒、porter,巴克啤酒、烈啤酒、麥芽酒、非含醇的麥芽酒等。術語「麥芽飲料」還包括不形成泡沫的啤酒和備選的麥芽飲料，例如水果調味的麥芽飲料，例如柑橘調味的(例如檸檬調味的、橙子調味的、 萊姆調味的或漿果調味的)麥芽飲料、酒調味的麥芽飲料(例如伏特加酒調味的、朗姆酒調味的或龍舌蘭酒調味的麥芽酒)，或咖啡調味的麥芽飲料(例如咖啡因風味的麥芽酒等)。術語「醪液」被理解為水性的澱粉漿料，例如包含壓碎的大麥麥芽、壓碎的大麥和 /或其它附加物或其組合，稍後將其與水相混合以被分離成為麥芽汁+谷糟。如本文中所使用的，術語「麥芽汁」是指在澱粉糖化過程中對谷進行提取後未發酵的酒流出(run-off)。如本文中所使用的，術語「谷糟」是指當對谷進行了提取且將麥芽汁從醪液中分離時餘留的排去了液體的固體。術語「啤酒」中所包括的是任何經發酵的麥芽汁，其通過對含有澱粉的材料進行釀造和發酵而產生，主要源自穀粒，例如含麥芽的大麥。也可使用小麥、玉米和稻。如本文中所使用的，術語麥芽汁中的「提取回收物」被定義為從谷(麥芽和附加物)中提取的可溶性物質的總和，被表達為基於乾物質的百分比。如本文中所使用的，術語「巴氏殺菌」是指通過加熱而殺死水性溶液中的微生物。 在釀造過程中實施巴氏殺菌通常是通過使用閃蒸巴氏滅菌器或隧道式巴氏滅菌器。如本文中所使用的，術語「巴氏滅菌單位或Pu」是指對巴氏滅菌的定量測量。對於啤酒而言的一個巴氏滅菌單位(IPU)被定義為在60攝氏度下保熱一分鐘。所計算的是PU = txl. 393~ (T-60)，其中t=時間(分鐘)，於巴氏滅菌器中在巴氏滅菌溫度下T =溫度(攝氏度)，在巴氏滅菌器中Γ (Τ-60)代表(Τ-60)的指數]取決於啤酒類型、原材料和微生物汙染、發酵者和所感知的對於啤酒風味的影響， 可使用不同的最小Pu。通常，對於啤酒巴氏滅菌，需要14-15PU。取決於巴氏滅菌的設備， 巴氏滅菌溫度通常在64-72攝氏度的範圍內，相應地計算巴氏滅菌時間。可在下述中找到其它的信息"Technology Brewing and Malting" by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin(VLB), 3rd completely updated edition, 2004，ISBN 3-921690-49-8ο如本文中所使用的，術語「非含醇啤酒」或「低醇啤酒」是指含有最多0. 至 3. 5%或0. 至2.5%，例如0. 至0.5%的醇(按體積)的啤酒。非含醇啤酒是通過傳統方法釀造的，但是在釀造過程的最後階段中通過真空蒸發而去除醇，這是通過利用水和醇的不同沸點。如本文中所使用的，術語「低卡路裡啤酒」或「具有低碳水化合物含量的啤酒」被定義為這樣的啤酒其具有的碳水化合物含量為1. 5g/100g或更少且具有的實際發酵度為至少80%。當提供了值的範圍時，所理解的是也具體公開了那個範圍的上限和下限之間每個居間的值，直至下限的單位的十分之一，除非語境中清楚地另有所指。所述範圍中任何所述值或居間值之間的每個更小的範圍以及所述範圍中的任何其它所述值或居間值都被涵蓋在本公開中。這些更小範圍的上限和下限可獨立地被包括或排除在所述範圍中，且本公開中還涵蓋了所述更小範圍中的每個範圍(其包括兩個極值中的任一個，兩個極值都不包括或兩個極值均包括)，除了所述範圍內任何具體排除的極值。當所述範圍包括一個或兩個極值時，排除了那些所包括的極值中的一個或兩個的範圍也包括在本公開中。在更詳細地描述示例性實施方案之前，要理解本公開不局限於所描述的特定實施方案，因為其當然可以變化。雖然與本文中所描述的那些相似或等同的任何方法和材料均可被用於實施或測試本公開，現在描述了示例性的方法和材料。如本文及所附權利要求中所使用的，單數形式「a」、「an」和「the」包括複數的指代，除非語境中清楚地另有所指。因此，例如指代「基因」時包括多個此類候選試劑，且指代 「細胞」包括指代一個或多個細胞及本領域技術人員已知的其等同物，等等。提供本文中所討論的出版物僅僅是為了其中在本申請的遞交日之前所公開的內容。本文中沒有任何部分應被解釋為承認本公開不因為在先發明而有權先於此類出版物。1.2.縮寫
GA葡糖澱粉酶
GAU葡糖澱粉酶單位
Wt % 重量百分比 0C攝氏度
rpm轉數/分鐘H2O水
dH20 去離子水 dIH20 去離子水，Mi Ili-Q過濾 aa或AA 胺基酸 bp鹼基對
kb千減基
kD千道爾頓
g或gm 克微克
mg毫克
μ 和μ 微升 ml和mL 毫升 mm毫米
μπι微米
M摩爾
mM毫摩爾
μΜ微摩爾
U單位
V伏
MW分子量
MWCO 分子量閾值 sec (s)或 s (s) 秒 min(s)或 m(s) 分鐘 hr(s)*h(s) 小時 DO溶解的氧
ABS吸光度
EtOH 乙醇 PSS生理鹽溶液
m/v 質量/體積MTP微量滴定板
N正常
DPl單糖
DP2二糖
DP>3寡糖、具有大於3的聚合度的糖
ppm百萬分率
SBD澱粉結合結構域
CD催化結構域
PCR聚合酶鏈式反應
WT野生型2.親本葡糖澱粉酶在一些實施方案中，本公開提供了葡糖澱粉酶變體。所述葡糖澱粉酶變體是親本葡糖澱粉酶的變體，其可包含催化結構域和澱粉結合結構域。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶包含催化結構域，其具有如SEQ ID N0:l，2，3，5，6，7，8或9中所示的胺基酸序列或具有與SEQ ID NO :1，2，3，5，6，7，8，或9中所示的胺基酸序列的一個或多個顯示出至少約 80 %，約85 %，約90 %，約95 %，約97 %，約99 %或約99. 5 %序列同一性的胺基酸序列。在其它的實施方案中，親本葡糖澱粉酶包含由下列DNA序列編碼的催化結構域其在中、高或嚴緊條件下與編碼具有SEQ ID NO :1、2或3的胺基酸序列之一的葡糖澱粉酶的催化結構域的DNA雜交。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶包含的澱粉結合結構域具有如SEQ ID N01, 2，11，385，386，387，388，389或390中所示的胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO 1,2,11, 385，386，387，388，389或390中所示的胺基酸序列的一個或多個顯示出至少約80 %，約 85 %，約90 %，約95 %，約97 %，約99 %或約99. 5 %序列同一性的胺基酸序列。在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶包含由下列DNA序列編碼的澱粉結合結構域其在中、高或嚴緊條件下與編碼具有SEQ ID NO :1、2或11的胺基酸序列之一的葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域的DNA雜交。葡糖澱粉酶的所預測的結構和已知的序列在真菌物種中是保守的(Coutinho et al.，1994，Protein Eng.，7 :393-400 禾口 Coutinho et al.，1994，Protein Eng.，7 749-760)。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶為絲狀真菌葡糖澱粉酶。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶是從下列獲得的木黴屬(Trichoderma)菌株(例如瑞氏木黴、 長枝木黴(T. longibrachiatum)、T. strictipilis、棘抱木黴(T. asperellum)、康寧木黴(T. konilangbra)和哈茨木黴(T. hazianum))，麴黴屬(Aspergillus)菌株(例如黑麴黴、構巢麴黴(A. nidulans)、白麴黴(A. kawachi)、泡盛麴黴(A. awamori)禾口米麴黴 (A.orzyae))，籃狀菌屬(Talaromyces)菌株(例如埃默森籃狀菌(T. emersonii)、嗜熱棲熱菌(T. thermophilus)和T. duponti)，肉座菌屬(Hypocrea)菌株(例如膠質肉座菌 (H. gelatinosa)、東方肉座菌(H. orientalis)、酒色肉座菌(H. vinosa)禾口 H.citrina),鍵刀菌屬(Fusarium)菌株(例如尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)、粉紅鐮刀菌(F. roseum)和鐮孢黴(F. venenatum))，鏈孢黴屬(Neurospora)菌株(例如粗糙鏈孢黴(N. crassa))和腐質黴屬(Humicola)菌株(例如，灰腐質黴(H. grisea)、特異腐質黴(H. insolens)和疏綿狀腐質黴(H. Ianuginose))，青黴屬(Penicillium)菌株(例如點青黴(P. notatum)或產黃青黴(P. chrysogenum))或者酵母樣菌(Saccharomycopsis)菌株(例如扣囊復膜孢酵母 (S. fibuligera))。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶可以是細菌葡糖澱粉酶。例如，多肽可從革蘭氏陽性細菌菌株中獲得，例如芽孢桿菌屬(Bacillus)(例如嗜鹼芽孢桿菌 (B. alkalophilus)、解澱粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)、遲緩芽孢桿菌(B. Ientus)、 地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和蘇雲金芽孢桿菌(B. thuringiensis))或鏈黴菌屬(Sti^ptomyces) 菌株(例如變鉛青鏈黴菌(S. Iividans)) 0在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含催化結構域，其與SEQ ID NO :3的 TrGA胺基酸序列的催化結構域具有至少約80 %，約85 %，約90 %，約93 %，約95 %，約 97 %，約98 %或約99 %的序列同一性。在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含催化結構域，其與SEQ ID NO :5或SEQ ID NO 6的麴黴屬親本葡糖澱粉酶的催化結構域具有至少約90 %，約93 %，約95 %，約 96 %，約97 %，約98 %或約99 %的序列同一性。在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含催化結構域，其與SEQ ID NO :8的灰腐質黴(HgGA)親本葡糖澱粉酶的催化結構域具有至少約90%，約95%，約97%或約99%的序列同一性。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :1、2 或11的TrGA胺基酸序列的澱粉結合結構域具有至少約80 %，約85 %，約90 %，約95 %，約 97%或約98%的序列同一性。在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :385 的灰腐質黴(HgGA)葡糖澱粉酶的催化結構域具有至少約90%，約95%，約97%或約99% 的序列同一性。在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :390 的太瑞斯梭孢殼黴(TtGA)葡糖澱粉酶的催化結構域具有至少約90%，約95%，約97%或約 99%的序列同一性。在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :386 的疏棉狀嗜熱絲孢菌(ThGA)葡糖澱粉酶的催化結構域具有至少約90%，約95%，約97%或約99%的序列同一性。在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :387 的埃默森籃狀菌(TeGA)葡糖澱粉酶的催化結構域具有至少約90%，約95%，約97%或約 99%的序列同一性。在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :388 或389的麴黴屬親本葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域具有至少約90%，約93 %，約95 %，約 96 %，約97 %，約98 %或約99 %的序列同一性。
在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶將與SEQ ID NO 1或2的TrGA胺基酸序列將具有至少約80%，約85%，約88%，約90%，約93%，約95%，約96%，約97%，約98%或約 99%的序列同一性。在其它實施方案中，將從木黴屬或肉座菌屬菌株中獲得木黴屬葡糖澱粉酶同源物。一些典型的木黴屬葡糖澱粉酶同源物被描述於美國專利號7，413，887中，特別涉及所述參考文獻中SEQ ID NOs 17-22和43-47中所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶是包含SEQ ID NO 2的胺基酸序列的TrGA或與 iTrGA 序列(SEQ ID NO 2)具有至少約 80%，約 85%，約 88%，約 90%，約 93%，約 95%， 約96%，約97%，約98%或約99%序列同一性的木黴屬葡糖澱粉酶同源物。可使用標準重組DNA技術分離和/或鑑別出親本葡糖澱粉酶。可使用本領域技術人員所知曉的任何標準技術。例如，可使用特異於葡糖澱粉酶的保守區域的探針和/或引物來鑑別細菌或真菌細胞中的同源物(催化結構域，活性位點等)。備選地，可使用退化性 PCR來鑑別細菌或真菌細胞中的同源物。在一些情形中，可就與已知葡糖澱粉酶(包括SEQ ID NO 2)之一或已知澱粉結合結構域(包括SEQ ID NO=Il)的序列和/或結構同一性分析已知的序列(例如資料庫中的序列)。也可使用功能性測定來鑑別細菌或真菌細胞中的葡糖澱粉酶活性。可分離具有葡糖澱粉酶活性的蛋白並逆向測序以分離相應的DNA序列。 此類方法是本領域技術人員已知的。3.葡糖澱粉酶結構同源性分子生物學的中心法則是編碼特定酶的基因的DNA序列決定蛋白的胺基酸序列， 此序列轉而決定酶的三維摺疊。這種摺疊使不同的殘基到一起而產生催化中心和底物結合表面，並且這產生了所涉及的酶的高特異性和活性。葡糖澱粉酶由多如三個的不同結構域組成，即約450個殘基的催化結構域(其在所有的葡糖澱粉酶中是結構上保守的)，一般繼以由30至80個殘基組成的連接子區域， 其與約100個殘基的澱粉結合結構域相連。本文中以1.8埃的解析度確定了所有三個區域均完整的瑞氏木黴葡糖澱粉酶的結構(見W02009/067218 (Danisco US Inc. , Genencor Division)中第94-216頁的表20，在此通過引用將其併入；以及W02009/067218 (Danisco US Inc. ,Genencor Division)中第89-93頁的實施例11，在此通過引用將其併入)。使用坐標(見 W02009/067218 (Danisco US Inc. ,Genencor Division)中第 94-216 頁的表 20，在此通過引用將其併入)，將此結構與來自泡盛麴黴菌株X100的葡糖澱粉酶的催化結構域的 ^fe ( ^|i|llJ^W,Aleshin,A. Ε. ,Hoffman, C. ,Firsov,L. Μ. ,and Honzatko,R. B. Refined crystal structures of glucoamylase from Aspergillus awamori var. X100. J. Mol. Biol. 238 :575-591(1994))進行比對。泡盛麴黴晶體結構僅包括催化結構域。如在圖6_7 中所見的，催化結構域的結構很近地重疊，並且有可能基於此結構重迭而鑑別出等同的殘基。相信所有的葡糖澱粉酶均享有圖6-7中所示的基本結構。TrGA的催化結構域因此具有大約450個殘基(例如1TrGA SEQ ID NO 2的殘基 1-453)並且是12個螺旋的雙桶結構域。可關於具有SEQ ID NO :2的TrGA的、形成螺旋和環的殘基來定義催化結構域的所述螺旋和環螺旋1殘基2-20，環1 殘基 21-51，0193]螺旋2殘基52-68，
0194]環2 殘基 69-71，
0195]螺旋3殘基72-90，
0196]環3 殘基 91-125，
0197]螺旋4 殘基 126-145，
0198]環4 殘基 146，
0199]螺旋5 殘基 147-169，
0200]螺旋6 殘基 186-206，
0201]環6 殘基 207-210，
0202]螺旋7 殘基 211-227，
0203]環7 殘基 211-227，
0204]螺旋8 殘基 250-275，
0205]環8 殘基 260-275，
0206]螺旋9 殘基 276192，
0207]環9 殘基 293-321，
0208]螺旋10 殘基 322-；342，
0209]環10 殘基 343-371，
0210]螺旋11 殘基 372-395，
0211]環11 殘基 396-420，
0212]螺旋12 殘基 421-434，
0213]環12 殘基 435-443，
0214]螺旋13 殘基 444-447，
0215]環13 殘基 448-453
0216]連接子結構域具有30至80個殘基(例如具有SEQ ID NO 2的TrGA的殘基 454-490)。TrGA的澱粉結合結構域具有大約100個殘基(例如具有SEQ ID NO 2的TrGA的殘基496-596)，其由β夾心(由兩個扭曲的三鏈片構成)組成。可關於具有SEQ ID NO 2的TrGA的、形成片、螺旋和環的殘基來定義澱粉結合結構域的所述片、螺旋和環片1'殘基 496-504，
環1'殘基 505-511,
片2'殘基 512-517，
互聯環2'殘基 518443，
片3'殘基 544-552，
環3'殘基553，
片4'殘基 554-565，
環4'殘基 566-567，
片5'殘基 568-572，
片間區段殘基573-577，
片如『殘基 578-582，
環5' 殘基 583-589，片6' 殘基 590-596，有可能基於結構重迭而鑑別出其它葡糖澱粉酶中的等同殘基，如下文中所進一步詳述的。圖6是SEQ ID NO 2瑞氏木黴葡糖澱粉酶(黑色)與泡盛麴黴葡糖澱粉酶(灰色)的三維結構比較的側面視圖。在此視圖中，可看到催化結構域、連接子區域以及澱粉結合結構域之間的關係。圖7是SEQ ID NO 2的瑞氏木黴葡糖澱粉酶(黑色)與泡盛麴黴葡糖澱粉酶(灰色)的三維結構比較的俯視圖。本文所示的葡糖澱粉酶(以及迄今所有已知的葡糖澱粉酶)享有這種結構同源性。對於所有的葡糖澱粉酶而言，結構的保守性與活性的保守性以及保守的作用機制相關。鑑於此高同源性，由木黴屬葡糖澱粉酶的位點特異性變體(其引起改變的功能)產生的改變在其它葡糖澱粉酶中也將具有相似的結構性以及功能性影響。 因此，關於什麼變體產生所需的益處的教導可被應用於其它葡糖澱粉酶。對於澱粉結合結構域(SBD)，使用W02009/067218 (Danisco US Inc. , Genencor Division)中第94-216頁的表20(在此通過引用而併入)的坐標來產生進一步的晶體結構。將TrGA的SBD與黑麴黴的SBD進行比對。如圖8中所示的，黑麴黴和TrGA的SBD的結構非常近地重疊。相信所有的澱粉結合結構域至少共享圖8中所示的某些基本結構，但一些SBD在結構上比其它的更相似。例如，TrGA SBD可被歸類為在CAZY資料庫(cazy.org) 內的碳水化合物結合模塊20家族中。CAZY資料庫描述了結構上相關的、降解、修飾或產生糖苷鍵的酶的催化性和碳水化合物結合模塊(或功能性結構域)家族。鑑於高的結構同源性，引起功能改變的TrGA SBD的位點特異性變體對於具有與所述TrGA SBD的結構有相似結構的SBD的其它葡糖澱粉酶(特別是被歸類在碳水化合物結合模塊20家族中的那些) 也將有相似的結構以及功能性影響。因此，關於什麼變體產生所需的益處的教導可被應用於具有結構相似性的其它SBD。因此，本文中所討論的胺基酸位置編號是指對於圖1中所示的成熟瑞氏木黴葡糖澱粉酶序列(SEQ ID NO 2)所指定的那些。然而，本公開不限於木黴屬葡糖澱粉酶的變體， 而是延伸至在「等同於」在瑞氏木黴葡糖澱粉酶(SEQ ID NO 2)中所特別鑑定的殘基的位置處含有胺基酸殘基的葡糖澱粉酶。在本公開的一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶是籃狀菌屬GA並且在籃狀菌屬葡糖澱粉酶(見例如SEQ ID NO 12)中等同的胺基酸殘基位置處進行取代，如本文中所描述的那些。在其它的實施方案中，親本葡糖澱粉酶包含SEQ ID NOs 5-9(見圖5A和5B)。在其它的實施方案中，親本葡糖澱粉酶是青黴屬葡糖澱粉酶，例如產黃青黴(見例如SEQ ID NO 13)。「結構同一性」決定胺基酸殘基是否是等同的。結構同一性是指當將兩個結構(三維和胺基酸結構)進行比對時，一對一的拓撲等同。葡糖澱粉酶的殘基(胺基酸)位置「等同」於瑞氏木黴葡糖澱粉酶的殘基，如果其與瑞氏木黴葡糖澱粉酶中的特定殘基或那個殘基的部分同源(即在一級或三級結構中在位置上相對應)或類似(具有相同或相似的功能性能力以結合、反應或在化學上相互作用)。為了確立與一級結構的同一性，可將葡糖澱粉酶的胺基酸序列與瑞氏木黴葡糖澱粉酶的一級序列直接進行比較，特別是與在序列已知的葡糖澱粉酶中已知不變的殘基組進行比較。例如，本文中的圖5A和5B顯示了葡糖澱粉酶之間的保守殘基。圖5D和5E顯示了來自各種葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域的比對。在比對了保守殘基之後，允許必要的插入和缺失以維持比對(即避免通過恣意的缺失和插入而去除保守的殘基)，確定與瑞氏木黴葡糖澱粉酶一級序列中的特定胺基酸等同的殘基。保守殘基的比對通常應當保存100% 的此類殘基。然而，超過約75%或少至約50%的保守殘基的比對也足以確定等同的殘基。 此外，可將結構同一性與序列同一性相結合而用於鑑別等同的殘基。例如，在圖5A和5B中，將來自六種生物體的葡糖澱粉酶的催化結構域進行比對以提供胺基酸序列間最大量的同源性。這些序列的比較顯示出每個序列中都含有許多保守的殘基，如用星號所表示的。因此，這些保守的殘基可被用於在其它葡糖澱粉酶(例如來自黑麴黴的葡糖澱粉酶)中確定瑞氏木黴葡糖澱粉酶的相應的等同胺基酸殘基。類似地，圖5D 和5E顯示了來自七種生物體的葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域，將其進行比對以鑑別出等同的殘基。結構同一性涉及鑑別兩個結構之間等同的殘基。對於通過X射線晶體學確定了三級結構的酶，可通過確定三級結構水平上的同源性(結構同一性)來定義「等同的殘基」。等同的殘基被定義如下其中比對之後，對其而言，瑞氏木黴葡糖澱粉酶特定胺基酸殘基的兩個或更多個主鏈原子(N對N、CA對CA、C對C以及0對0)的原子坐標在0. 13nm和任選地 0. Inm之內。在一個方面中，比對之後，四個可能的主鏈原子中的至少2個或3個在0. Inm 之內。比對是在最佳的模型被定向和定位以提供所涉及的葡糖澱粉酶的非氫蛋白質原子與瑞氏木黴葡糖澱粉酶的原子坐標的最大重疊之後完成的。最佳模型是對於可獲得的最高解析度下的實驗衍射數據給出最低R因子的晶體模型。
R 因子 _^ZJ^Wl^功能上類似於瑞氏木黴葡糖澱粉酶特定殘基的等同殘基被定義為酶的這些胺基酸其可採取某種構象，從而使得它們以確定且歸因於瑞氏木黴葡糖澱粉酶特定殘基的方式改變、修飾或促成蛋白質的結構、底物結合或催化作用。此外，它們是酶(已通過X射線晶體學獲得了其三級結構)的下述這些殘基，其以如下程度佔據類似的位置即雖然給定殘基的主鏈原子可能不滿足基於佔據同源位置的等同標準，所述殘基的至少兩個側鏈原子的原子坐標位於瑞氏木黴葡糖澱粉酶相應側鏈原子的0. 13nm處。瑞氏木黴葡糖澱粉酶三維結構的坐標如 W02009/067218 (Danisco US Inc. ,Genencor Division)中第 94-216 頁的表20所示(在此通過引用而併入)，並可如上文所述被用於在三級結構水平上確定等同的殘基。一些被鑑別用於取代的殘基是保守的殘基，而其它的不是。在殘基不保守的情形中，對於一個或多個胺基酸的取代被限於產生下述變體的取代所述變體具有的胺基酸序列不相應於在自然中所找到的胺基酸序列。在保守殘基的情形中，此類取代不應產生天然存在的序列。4.葡糖澱粉酶變體根據本公開的變體在親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列中包括至少一個取代、缺失或插入而使得所述變體在序列上不同於所述親本葡糖澱粉酶。在一些實施方案中，本公開的變體將具有至少約20%，約40%，約50%，約60%，約70%，約80%，約85%，約90%， 約95%，約97%或約100%的、TrGA (SEQ ID NO 2)的葡糖澱粉酶活性，親本葡糖澱粉酶與 TrGA(SEQ ID NO 2)具有至少80%的序列同一性。在一些實施方案中，根據本公開的變體將在親本TrGA(SEQ ID NO : 的至少一個胺基酸位置中或另一個親本葡糖澱粉酶序列的等同位置中包含取代、缺失或插入，所述另一個親本葡糖澱粉酶序列與TrGA序列(SEQ ID NO 2)具有至少約80 %，約85 %，約90 %，約95 %，約97 %，約98 %或約99 %的序列同一性。在其它實施方案中，根據本公開的變體將在親本TrGA片段的至少一個胺基酸位置中、或包含親本葡糖澱粉酶催化結構域的片段的等同位置中包含取代、缺失或插入，其中所述親本TrGA片段包含TrGA序列的催化結構域(SEQ ID NO :3)，所述包含親本葡糖澱粉酶催化結構域的片段與SEQ ID NO :3、5、6、7、8或9的含有催化結構域的片段具有至少約 80 %，約85 %，約90 %，約95 %，約97 %，約98 %或約99 %的序列同一性。在一些實施方案中，所述片段將包含iTrGA催化結構域(SEQ ID NO 3)的至少約400，約425，約450或約500 個胺基酸殘基。在其它實施方案中，根據本公開的變體將在親本TrGA片段的至少一個胺基酸位置中、或包含親本葡糖澱粉酶澱粉結合結構域的片段的等同位置中包含取代、缺失或插入， 其中所述親本TrGA片段包含TrGA序列的澱粉結合結構域(SEQ ID NO :11)，所述包含親本葡糖澱粉酶澱粉結合結構域的片段與SEQ ID NO :11、385、386、387、388、389和390的包含澱粉結合結構域的片段具有至少約80 %，約85 %，約90 %，約95 %，約97 %，約98 %或約 99%的序列同一性。在一些實施方案中，所述片段將包含TrGA澱粉結合結構域(SEQ ID NO 11)的至少約40，約50，約60，約70，約80，約90，約100或約109個胺基酸殘基。在一些實施方案中，當親本葡糖澱粉酶包括催化結構域、連接子區域和澱粉結合結構域時，變體將在包含部分連接子區域的片段的至少一個胺基酸位置中包含取代、缺失或插入。在一些實施方案中，變體將在TrGA序列(SEQ ID NO 2)的片段的胺基酸序列中包含取代、缺失或插入。關於胺基酸取代的結構同一性是指取代發生在同源葡糖澱粉酶或親本葡糖澱粉酶的等同胺基酸位置處。術語等同位置是指基於所涉及的親本葡糖澱粉酶胺基酸序列以及所涉及的親本葡糖澱粉酶的三維結構與TrGA參考葡糖澱粉酶胺基酸序列和三維序列的比對，而在兩個親本序列中共有的位置。例如，參考圖5A，TrGA(SEQ ID NO :2或3)中的位置對是024，對於黑麴黴(SEQ ID NO 6)的等同位置是位置D25，而對於米麴黴(SEQ ID NO: 7)的等同位置是位置D26。對於三維序列的示例性比對，見圖6和7。因此，在一個方面中，描述了葡糖澱粉酶變體，所述葡糖澱粉酶變體的晶體形式具有這樣的晶體結構在將等同的主鏈原子進行比對後，其主鏈原子的原子坐標與TrGA的等同主鏈原子的原子坐標(如W02009/067218的表20中所定義的)的均方根偏差小於 0. 13nm ；並且所述變體具有連接子區域、澱粉結合結構域以及催化結構域，所述變體相對於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列在澱粉結合結構域的互聯環2』中，和/或催化結構域的螺旋 12中、和/或環1中、和/或螺旋2中、和/或環11中包含兩個或更多個胺基酸取代。在另一個方面中，與iTrGA的等同主鏈原子的原子坐標(如W02009/067218的表20中所定義的)的均方根偏差小於0. 12nm，例如小於0. 11或例如小於0. 10。在一個方面中，描述了葡糖澱粉酶變體，所述葡糖澱粉酶變體包含澱粉結合結構域和催化結構域，所述變體相對於SEQ ID NO :2的胺基酸序列或等同的親本葡糖澱粉酶在互聯環2』，和/或環1，和/或螺旋2，和/或環11，和/或螺旋12中包含兩個或更多個胺基酸取代，用於在澱粉水解過程中減少縮合產物的合成。在另一個方面中，描述了葡糖澱粉酶變體，所述葡糖澱粉酶變體包含相對於下列的兩個或更多個胺基酸取代具有SEQ ID NO 2的518位至543位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的互聯環2』，和/或具有SEQ ID NO :2的21位至51位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環1，和/或具有SEQ ID NO :2的52位至68 位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO 2 的396位至420位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環11，和/或具有 SEQ ID NO :2的421位至434位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋 12。在另一個方面中，描述了葡糖澱粉酶變體，所述葡糖澱粉酶變體包含相對於下列的兩個或更多個胺基酸取代SEQ ID NO :2的518位至543位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO 2的21位至51位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO :2的52位至68位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO 2的396位至420位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列，和/或SEQ ID NO :2的421位至434位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列。在一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代是相對於下列的具有SEQ ID NO 2的518位至543位的胺基酸序列的互聯環2，(例如在位置518、519、520、521、522、523、 524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542 和 /或543中的一個或多個中)，和/或具有SEQ ID NO 2的21位至51位的胺基酸序列的環 1(例如在位置 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50 和 / 或 51 的一個或多個中)，和 / 或具有 SEQ ID NO :2 的 52 至68位的胺基酸序列的螺旋2 (例如在位置52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、 65、66、67和/或68的一個或多個中)，和/或具有SEQ ID NO 2的396位至420位的胺基酸序列的環 11 (例如在位置 396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、 409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419 和 / 或 420 的一個或多個中)，和 / 或具有SEQ ID NO :2的421位至434位的胺基酸序列的螺旋12(例如在位置421、422、423、424、 425、426、427、428、429、430、431、432、433 和 / 或 534 的一個或多個中)。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環1和/或螺旋2和/或環11和/或螺旋12中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的1、2、3或4個胺基酸取代和環1和 /或螺旋2和/或環11和/或螺旋12中的1、2、3或4個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環1中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和螺旋2中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環11中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和螺旋12中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環1中的至少一個胺基酸取代，以及螺旋2中的至少一個胺基酸取代。在另一個方面中，所述葡糖澱粉酶變體在互聯環2』的位置520-543、530-543或534443中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，所述葡糖澱粉酶變體在環1的位置30-50、35-48或40-46的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，所述葡糖澱粉酶變體在螺旋2的位置50-66、55-64或58-63的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，所述葡糖澱粉酶變體在環11的位置405-420、410-420或415-420的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，所述葡糖澱粉酶變體在螺旋12的位置421-434、425-434 或428-434的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在一個方面中，葡糖澱粉酶變體包含兩個或更多個胺基酸取代，其中一個胺基酸取代在539位且一個胺基酸取代在44位，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置，且所述序列與親本葡糖澱粉酶具有至少80%的序列同一性，其中44位的胺基酸取代不是44C。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體包含兩個或更多個胺基酸取代，其中一個胺基酸取代在539位且一個胺基酸取代是44R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體在61位包含胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中， 539位的胺基酸取代是539R，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，44位的胺基酸取代是44R，所述位置相應於SEQ ID NO 2 中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，61位的胺基酸取代是611， 所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體包含下列胺基酸取代a)D44R和A539R;或b) D44R、N61I和A539R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體由SEQ ID NO :2組成且具有下列胺基酸取代 a)D44R和A539R;或b)D44R、N61I和A539R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體具有澱粉結合結構域，其與SEQ ID N0:l、2、ll、 385、386、387、388、389或390的澱粉結合結構域具有至少96%、97%、98%、99%或99. 5% 的序列同一性。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體具有催化結構域，其與SEQ ID NO :1,2, 3、5、6、7、8或9的催化結構域具有至少80%、85%、90%、95%或99. 5%的序列同一性。在另一個方面中，親本葡糖澱粉酶為真菌葡糖澱粉酶。在另一個方面中，親本葡糖澱粉酶選自從下述獲得的葡糖澱粉酶木黴屬的種、麴黴屬的種、腐質黴屬的種、青黴屬的種、籃狀菌屬的種或裂殖酵母屬(Schizosaccharmyces) 的種。
在另一個方面中，親本葡糖澱粉酶是從木黴屬的種或麴黴屬的種獲得的。在另一個方面中，葡糖澱粉酶經過了純化。可通過本領域中已知的各種程序從培養基中回收或純化本公開的葡糖澱粉酶，所述程序包括離心、過濾、提取、沉澱等。在一些實施方案中，葡糖澱粉酶變體將在親本的胺基酸序列中包括至少兩個取代。在其它實施方案中，所述變體可具有多於兩個取代。例如，與相應的親本葡糖澱粉酶相比，變體可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個胺基酸取代，缺失或插入。在一些實施方案中，葡糖澱粉酶變體在相應於圖5A、5B、5D和5E中所示的非保守胺基酸區域的位置的至少一個胺基酸位置中包含取代、缺失或插入(通常為取代)(例如， 相應於圖5A、5B、5D和5E中未標記為「*」的那些位置的胺基酸位置)。雖然變體可在成熟蛋白序列(SEQ ID NO 2)的任何位置具有取代，在一些實施方案中，葡糖澱粉酶變體在SEQ ID NO :2中所示胺基酸序列的下列位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包含兩個或更多個取代:23、42、43、44、59、60、61、65、67、68、410、417、418、430、 431、433、518、519、520、527、531、535、536、537或539。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體在 SEQ ID NO :2中所示胺基酸序列的下列位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包含一個或多個其它的取代10、14、15、72、73、97、98、99、102、110、113、114、133、140、144、145、147、152、 153、164、182、204、205、214、216、219、228、229、230、231、236、239、241、242、263、264、265、 268、269、276、284、291、294、300、301、303、311、338、342、344、346、349、359、361、364、375、 379、382、390、391、393、394、436、442、444、448、451、493、494、495、502、503、508、511、563 或 577。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶將與SEQ ID NO :2具有至少約50%，約60%，約 70 %，約80 %，約90 %，約95 %，約96 %，約97 %，約98 %或約99 %的序列同一性。在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶將是木黴屬葡糖澱粉酶同源物。在一些實施方案中，變體將具有改變的特性。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶與SEQ ID NO :2的葡糖澱粉酶將具有結構同一性。在一些實施方案中，葡糖澱粉酶變體在SEQ ID NO 2中所示胺基酸序列的下列位置或親本葡糖澱粉酶(例如木黴屬葡糖澱粉酶同源物)的等同位置中包含兩個或更多個取代P23、T42、143、D44、P45、D46、F59、K60、N61、T67、E68、R408、S410、S415、L417、H418、 T430、A431、R433、N518、A519、A520、T527、V531、A535、V536、N537 和 A539。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體在SEQ ID NO :2中所示胺基酸序列的下列位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包含一個或多個取代T10、L14、Ν15、Α72、G73、S97、L98、Α99、S102、Κ108、Ε110、 L113、K114、R122、Q124、R125、I133、K140、N144、N145、Y147、S152、N153、N164、F175、N182、 A204、T205、S214、V216、Q219、W228、V229、S230、S231、D236、1239、N240、T241、N242、G244、 N263、L264、G265、A268、G269、D276、V284、S291、G294、P300、A301、A303、Y310、A311、D313、 Y316、V338、T342、S344、T346、A349、V359、G361、A364、T375、N379、S382、S390、E391、A393、 K394、1436、A442、N443、S444、T448、S451、T493、P494、T495、H502、E503、Q508、Q511、N563 和N577。在一些實施方案中，與親本葡糖澱粉酶相比，變體將具有改變的特性。在一些實施方案中，葡糖澱粉酶變體可僅在特定的位置區別於親本葡糖澱粉酶。在其它實施方案中，葡糖澱粉酶親本的變體在SEQ ID NO 2中所示胺基酸序列的下列位置中包含至少兩個下列取代T42V、I43Q/R、D44R/C、N61I、T67M、E68C/M、L417K/R/ V、T430A/K、A431I/L/Q、R433C/E/G/L/N/S/V/Y、A519I/K/R/Y、A520C/L/P、V531L、A535K/N/P/R、V536M或A539E/R/S或包含親本葡糖澱粉酶等同位置中的取代。在另一個方面中，葡糖澱粉酶變體在SEQ ID NO :2中所示胺基酸序列的下列位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包含一個或多個取代T10S、A72Y、G73F/W、S97N、S102A/M/R、K114M/Q、I133T/V、N145I, N153A/D/E/M/S/V、T205Q、Q219S、W228A/F/H/M/V,V229I/L,S230C/F/G/L/N/Q/R、S231L/V、 D236R、I239V/Y、N263P、L264D/K、A268C/D/G/K、S291A/F/H/M/T, g294c、A301P/R、V338I/ N/Q、T342V、S344M/P/Q/R/V、G361D/E/F/1/L/M/P/S/ff/Y, A364D/E/F/G/K/L/M/R/S/T/V/W、 T375N、K394S、I436H、T451K、T495K/M/S、E503A/C/V、Q508R、Q511H、N563C/E/I/K/K/Q/T/V 或 N577K/P/R。在其它實施方案中，葡糖澱粉酶變體在SEQ ID NO 2的相關位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包含下列取代組之一N61I/L417V/A431L/A539R ；I43Q/N61I/L417V/A431L/A539R ；N61I/L417V/A431L/A535R/A539RI43Q/L417V/A431L/A535R/A539R ；I43Q/N61I/L417V/A431L/A535R/A539R ；I43Q/N61I/L417V/T430A/A431L/A535R/A539R ；I43Q/L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I ；N61I/L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I ；I43Q/N61I/L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I ；I43R/N61I/L417V/A431L/A539R ；I43R/N61I/L417V/T430A/A431L/A535R/A539R ；G73F/L417R/E503V/A539R/N563K ；I43R/G73F/L417R/E503V/A539R/N563K ；禾口I43R/G73F/E503V/Q511H/N563K。在其它實施方案中，葡糖澱粉酶變體在SEQ ID NO 2的位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包含下列取代組之一L417V/A431L/A539R ；I43Q/L417V/A431L/A539R ；L417V/A431L/A535R/A539RI43R/L417V/A431L/A539R ；L417R/A431L/A539R ；或L417G/A431L/A539R ；其中葡糖澱粉酶變體相對於親本葡糖澱粉酶不具有任何其它的取代，並且其中親本葡糖澱粉酶具有催化結構域，其與SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8或9具有至少80%的序列同一性。因此，親本葡糖澱粉酶可以是別處所描述的那些中的任何葡糖澱粉酶。親本葡糖澱粉酶可包含澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :1、2、11、385、386、387、 388、389或390具有至少95%的序列同一性。親本葡糖澱粉酶可與SEQ ID NO :1或2具有至少80%的序列同一性；例如其可包含SEQ ID N0:1或2。任選地，親本葡糖澱粉酶可由 SEQ ID NO :1 或 2 組成。
本公開的葡糖澱粉酶變體也可包括嵌合或雜合的葡糖澱粉酶，其具有例如來自一種葡糖澱粉酶的澱粉結合結構域(SBD)和來自另一種的催化結構域和連接子。例如，雜合葡糖澱粉酶可通過將來自AnGA (SEQ ID NO 6)的SBD與來自TrGA (SEQ ID NO 2)的SBD進行交換而製備，從而產生具有AnGA SBD和TrGA催化結構域及連接子的雜合體。備選地，可將AnGA的SBD和連接子與TrGA的SBD和連接子進行交換。在某些方面，與親本葡糖澱粉酶相比，變體葡糖澱粉酶顯示出改變的熱穩定性。在一些方面，所述改變的熱穩定性可以是與親本葡糖澱粉酶相比增加的熱穩定性。在一些實施方案中，所述改變的特性是與親本葡糖澱粉酶相比改變的比活性。在一些實施方案中，所述改變的比活性可以是與親本葡糖澱粉酶相比增加的比活性。在一些實施方案中，改變的特性是與親本葡糖澱粉酶相比，在更低的溫度下增加的熱穩定性。在一些實施方案中，改變
、生是與親本葡糖澱粉酶相比增加的比活性和增加的熱穩定性。
在一個實施方案中，一些變體可包括SEQ ID NO :2的下列位置或親本葡糖澱粉酶 (特別是木黴屬葡糖澱粉酶同源物)的等同位置中的取代 D44R/N61I/A539R ； D44R/A539R ；
I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R ； I43Q/L417V/E503A/Q511H/A539R ； I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ； I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ； I43R/L417V/E503A/Q511H/A539R ； I43R/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ； I43R/L417R/E503A/A539R ； I43R/N61I/L417R/E503A/Q511H/A539R ； G73F/T430A/Q511H ； I43R/G73F/T430A ； G73F/T430A/E503V/Q51IH ； D44C/G73F/N563K ； D44C/G73F/E503V/Q51IH ； D44C/G73F/N563K ； D44C/G73F/L417R/N563K ； D44C/G73F/N563K ； I43R/T430A ； I43Q/T430A ； I43Q/T430A/Q511H ； D44C/L417R/N563K ；
L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I ； L417V/T430A/A431Q/Q511H/A535R/A539R/N563I ； L417V/T430A/Q511H/A535R/N563I ； L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I ；
G294C/L417R/A431L ；G294C/L417V/A431Q ；G294C/L417V/A431L/Q511H ；G294C/L417R/A431Q/Q511H ；L417R/A431L/Q511H ；L417V/A431Q/Q511H ；I43Q/T430A/Q511H/N61I ；I43Q/T430A/Q511H/L417V ；I43Q/T430A/Q511H/A431L ；I43Q/T430A/Q511H/E503A ；I43Q/T430A/Q511H/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/A431L/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/A431L/E503A ；I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R/A431L ；I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R/A431L ；I43Q/Q511H/N61I ；I43Q/Q511H/L417V ；I43Q/Q511H/A431L ；I43Q/Q511H/A539R ；I43Q/Q511H/A539R/N61I ；I43Q/Q511H/A539R/E503A ；I43Q/Q511H/A539R/T430M ；I43Q/Q511H/A539R/T430M/N611 ；I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I/L417V ；I43R/T430A/E503V/A535R/N563K ；D44R/E503A/Q511H/N563I ；E503A/N563I ；I43R/T430A/E503A/Q511H/N563K ；D44R/T430A/Q511H/A535R ；L417V/A431L/A539R ；L417V/A431L/A539R/I43Q ；L417V/A431L/A539R/N611 ；L417V/A431L/A539R/A535R ；L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I ；L417V/A431L/A539R/N61I/A535R ；L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q ；L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R ；
L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R/T430A ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/N61I ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I ；L417V/A431L/A539R/I43R ；L417V/A431L/A539R/I43R/N61I ；L417V/A431L/A539R/I43R/N61I/A535R/T430A ；L417R/A431L/A539R ；L417G/A431L/A539R ；G73F/E503V/N563K/L417R/A539R ；G73F/E503V/N563K/I43R/L417R/A539R ；禾口G73F/E503V/N563K/I43R/Q511H。在其它實施方案中，一些變體可包括SEQ ID NO 2的下列位置或親本葡糖澱粉酶 (特別是木黴屬葡糖澱粉酶同源物)的等同位置中的取代D44R/N61I/A539R ；D44R/A539R ；I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43Q/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43R/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43R/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43R/L417R/E503A/A539R ；I43R/N61I/L417R/E503A/Q511H/A539R ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I ；L417V/T430A/A431Q/Q511H/A535R/A539R/N563I ；L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I ；I43Q/T430A/Q511H/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R ；I 43Q/T430A/Q511H/A431L/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R/A431L ；I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R/A431L ；I43Q/Q511H/A539R ；I43Q/Q511H/A539R/N61I ；I43Q/Q511H/A539R/E503A ；I43Q/Q511H/A539R/T430M ；I43Q/Q511H/A539R/T430M/N611 ；I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I/L417V ；
L417V/A431L/A539R ；L417V/A431L/A539R/I43Q ；L417V/A431L/A539R/N611 ；L417V/A431L/A539R/A535R ；L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I ；L417V/A431L/A539R/N61I/A535R ；L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q ；L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R ；L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R/T430A ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/N61I ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I ；L417V/A431L/A539R/I43R ；L417V/A431L/A539R/I43R/N61I ；L417V/A431L/A539R/I43R/N61I/A535R/T430A ；L417R/A431L/A539R ；L417G/A431L/A539R ；G73F/E503V/N563K/L417R/A539R ；禾口G73F/E503V/N563K/I43R/L417R/A539R。在其它實施方案中，一些變體可包括SEQ ID NO 2的下列位置或親本葡糖澱粉酶 (特別是木黴屬葡糖澱粉酶同源物)的等同位置中的取代D44R/N61I/A539R ；D44R/A539R ；I43Q/D44C/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43Q/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43Q/D44C/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43Q/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43R/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43R/N61I/L417V/E503A/Q511H/A539R ；I43R/L417R/E503A/A539R ；I43R/N61I/L417R/E503A/Q511H/A539R ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I ；L417V/T430A/A431Q/Q511H/A535R/A539R/N563I ；L417V/T430A/Q511H/A539R/N563I ；I43Q/T430A/Q511H/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/A431L/A539R ；I43Q/T430A/Q511H/N61I/A539R/A431L ；
I43Q/T430A/Q511H/L417V/A539R/A431L ；I43Q/Q511H/A539R ；I43Q/Q511H/A539R/N61I ；I43Q/Q511H/A539R/E503A ；I43Q/Q511H/A539R/T430M ；I43Q/Q511H/A539R/T430M/N611 ；I43Q/Q511H/A539R/T430M/N61I/L417V ；L417V/A431L/A539R ；L417V/A431L/A539R/I43Q ；L417V/A431L/A539R/N611 ；L417V/A431L/A539R/A535R ；L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I ；L417V/A431L/A539R/N61I/A535R ；L417V/A431L/A539R/A535R/I43Q ；L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R ；L417V/A431L/A539R/I43Q/N61I/A535R/T430A ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/N61I ；L417V/T430A/A431L/Q511H/A535R/A539R/N563I/I43Q/N61I ；L417V/A431L/A539R/I43R ；L417V/A431L/A539R/I43R/N61I ；L417V/A431L/A539R/I43R/N61I/A535R/T430A ；L417R/A431L/A539R ；L417G/A431L/A539R ；G73F/E503V/N563K/L417R/A539R ；禾口G73F/E503V/N563K/I43R/L417R/A539R。在其它實施方案中，一些變體可包括SEQ ID NO 2的下列位置或親本葡糖澱粉酶 (特別是木黴屬葡糖澱粉酶同源物)的等同位置中的取代D44R/N61I/A539R ；D44R/A539R ；L417V/A431L/A539R ；L417V/A431L/A539R/I43Q ；L417V/A431L/A539R/N61I。在其它實施方案中，一些變體可包括SEQ ID NO 2的下列位置或親本葡糖澱粉酶 (特別是木黴屬葡糖澱粉酶同源物)的等同位置中的取代D44R/N61I/A539R ；D44R/A539R。在其它實施方案中，一些變體具有SEQ ID NO 2的下列取代D44R/N61I/A539R或 D44R/A539R。
在其它實施方案中，變體包含SEQ ID NO :1098。在其它實施方案中，變體由SEQ ID NO :1098組成。在其它實施方案中，變體包含SEQ ID NO :1099。在其它實施方案中，變體由 SEQ ID NO 1099 組成。將若干親本葡糖澱粉酶與TrGA的胺基酸序列進行了比對。圖5包括下列親本葡糖澱粉酶的催化結構域泡盛麴黴(AaGA) (SEQ ID NO 5)；黑麴黴(AnGA) (SEQ ID NO 6)； 米麴黴(AoGA) (SEQ IDNO 7)；灰腐質黴(HgGA) (SEQ ID NO 8)和酒色肉座菌屬(HvGA) (SEQ ID NO :9)。下面的表1中呈現了催化結構域的％同一性。表1 各種真菌葡糖澱粉酶之間的序列同源性
AaGAAnGAAoGAHgGAHvGATrGAAaGA1009558535756AnGA10059535756AoGA100555656HgGA1006163HvGA10091TrGA100在一些實施方案中，例如，變體葡糖澱粉酶將源自下列的親本葡糖澱粉酶麴黴屬葡糖澱粉酶、腐質黴屬葡糖澱粉酶或肉座菌屬葡糖澱粉酶。5.對變體葡糖澱粉酶的表徵本公開還提供與親本葡糖澱粉酶(特別是TrGA)相比具有至少一個改變的特性 (例如改善的特性)的葡糖澱粉酶變體。在一些實施方案中，所述至少一個改變的特性(例如改善的特性)選自IS/SH-比率、澱粉水解活性、實際發酵度、減少形成縮合產物、酸穩定性、熱穩定性以及比活性。通常，改變的特性是減少的IS/SH-比率、提高的實際發酵度、減少形成縮合產物、增加的熱穩定性和/或增加的比活性。增加的熱穩定性通常是在更高的溫度下。在一個實施方案中，增加的PH穩定性是在高pH下。在其它實施方案中，增加的pH 穩定性是在低PH下。與親本葡糖澱粉酶相比，本公開的葡糖澱粉酶變體也可提供在低底物濃度下更高的澱粉水解速度。當在相同的條件下測試時，變體可具有比親本葡糖澱粉酶更高的Vmax或更低的Km。例如，在約25°C至約70°C (例如，約25°C至約35°C ；約30°C至約35°C ；約40°C 至約50°C ；約50°C至約55°C或約55°C至約62°C )的溫度範圍中，變體葡糖澱粉酶可具有更高的Vmax。使用標準的已知過程可容易地測定米氏常數、Kn^nvmax值。另一方面，葡糖澱粉酶也可顯示出降低的澱粉水解活性，其與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比降低不超過 5%，不超過10%或不超過15%。5. 1.具有改變的熱穩定性的變體葡糖澱粉酶在某些方面，本公開涉及與親本(野生型)相比具有改變的熱穩定性的變體葡糖澱粉酶。改變的熱穩定性可以是在增加的溫度下或在降低的溫度下。以在NaAc緩衝液(pH 4.5)中、在64°C下孵育1小時後的％殘餘活性來測量熱穩定性。在這些條件下，與孵育前的起始活性相比，TrGA具有約15%至44%的殘餘活性(由於逐日的變化)。因此，在一些實施方案中，與孵育前的起始活性相比，具有增加的熱穩定性的變體具有的殘餘活性相較於親本多至少約到至少約50% (在NaAc緩衝液(pH4. 5)中在64°C下孵育一小時之後)，這包括約2%，約3%，約4%，約5%，約6%，約7%，約8%，約9%，約10%，約11%， 約 12 %，約 13 %，約 14 %，約 15 %，約 16 %，約 17 %，約 18 %，約 19 %，約 20 %，約 21 %， 約22 %，約23 %，約M %，約25 %，約洸％，約27 %，約沘％，約四％，約30 %，約31 %， 約 32%，約 33%，約；34%，約 35%，約 36%，約 37%，約 38%，約 39%，約 40%，約 41%，約 42%，約43%，約44%，約45%，約46%，約47%，約48%，約49%和約50%。例如，當親本的殘餘活性為15%時，具有增加的熱穩定性的變體可具有的殘餘活性為約16%至約75%。 在一些實施方案中，葡糖澱粉酶變體將具有改善的熱穩定性，例如在給定的時間段(例如至少約60分鐘、約120分鐘、約180分鐘、約240分鐘或約300分鐘)中暴露於改變的溫度後，保留至少約50%，約60%，約70%，約75%，約80%，約85%，約90%，約92%，約95%， 約96 %，約97 %，約98 %或約99 %的酶促活性。在一些實施方案中，在約40 V至約80 V的範圍內、約50°C至約75°C的範圍內，和約60°C至約70°C範圍內的選定的溫度下，和在約4. 0 至約6. 0的pH範圍中，變體與親本葡糖澱粉酶相比具有增加的熱穩定性。在一些實施方案中，如在測定和方法中所描述的，測定熱穩定性。可調整所述方法而使其適合在其它的溫度下用於測量熱穩定性。備選地，可如所述方法中所描述的，在64°C下測定熱穩定性。在一些實施方案中，在約20°C至約50°C、包括約35°C至約45°C和約30°C至約40°C的範圍中選定的溫度下，變體在更低的溫度下具有相較於親本葡糖澱粉酶增加的熱穩定性。
在一些實施方案中，具有熱穩定性改善的變體在SEQ ID NO :2中所示胺基酸序列的下列位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包括一個或多個缺失、取代或插入(特別是取代)10、42、43、44、59、61、68、72、73、97、98、99、102、114、133、140、144、152、153、182、 204、205、214、216、228、229、230、231、236、241、242、263、264、265、268、269、276、284、291、 294300、301、303、311、338、342、344、346、349、359、361、364、375、379、382、390、391、393、 394、410、417、430、431、433、436、442、444、448、451、493、495、503、508、511、518、519、520、 527、531、535、536、537、539、563或577。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶將是木黴屬葡糖澱粉酶同源物，而在其它實施方案中，親本葡糖澱粉酶與SEQ ID NO :2將具有至少約 50 %，約60 %，約70 %，約80 %，約90 %，約95 %或約98 %的序列同一性。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶與SEQ ID NO :2還將具有結構同一性。在一些實施方案中，具有增加的熱穩定性的變體在SEQ ID NO 2的至少一個下列位置中具有取代T10S、T42V、I43Q、I43R、 D44C、D44R、E68C、E68M、G73F、G73W、K114M、K114Q、I133V、N153A、N153E、N153M、N153S、 N153V、W228V、V229I、V229L、S230Q, S231V、D236R、L264D、L264K、A268D、S291A、S291F、 S291H、S291M、S291T、G294C、A301P、A301R、V338I、V338N、V338Q、S344M、S344P、S344Q、 S344R、S344V、G361D、G361E、G361F、G361I、G361L、G361M、G361P、G361S、G361W、G361Y、 A364D、A364E、A364F、A364G、A364K、A364L、A364M、A364R、A364S、A364T、A364V、A364W、 T375N、L417K、L417R、R433C、R433E、R433G、R433L、R433N、R433S、R433V、I436H、T495K、 T495S、E503A、E503C、E503V、Q508R、Q511H、A519K、A519R、A519Y、V531L、A535K、A535N、
41A535P、A535R、A539E、A539R、A539S、N563C、N563E、N563I、N563K、N563L、N563Q, N563T、 N563V、N577K、N577P 或 N577R。5.2.具有改變的比活性的變體葡糖澱粉酶如本文中所使用的，比活性是每毫克蛋白的葡糖澱粉酶活性。活性是使用乙醇測定來確定的。篩選鑑別出與親本TrGA PI相比具有性能指標(PI) > 1. 0的變體。PI是由野生型(WT)和變體酶的比活性(活性/mg酶)計算的。其為「變體-比活性/WT-比活性」 之商且可以是變體比活性增加的度量。約2的PI應為WT的約2倍更好。在一些方面，本公開涉及與親本或野生型葡糖澱粉酶相比具有改變的比活性的變體葡糖澱粉酶。在一些實施方案中，所述改變的比活性為增加的比活性。增加的比活性可被定義為大於或等於約1 的增加的性能指標，包括大於或等於約1.1，約1.2，約1.3，約1.4，約1.5，約1.6，約1.7，約 1.8，約1.9以及約2。在一些實施方案中，增加的比活性為約1.0至約5.0，包括約1. 1，約
1.2，約 1. 3，約 1. 4，約 1. 5，約 1. 6，約 1. 7，約 1. 8，約 1. 9，約 2. 0，約 2. 1，約 2. 2.，約 2. 3，約
2.4，約 2. 5，約 2. 6，約 2. 7，約 2. 8，約 2. 9，約 3. 0，約 3. 1，約 3. 2，約 3. 3，約 3. 4，約 3. 5，約
3.6，約 3. 7，約 3. 8，約 3. 9，約 4. 0，約 4. 1，約 4. 2，約 4. 3，約 4. 4，約 4. 5，約 4. 6，約 4. 7，約
4.8和約4. 9。在一些實施方案中，與親本葡糖澱粉酶相比，變體具有至少約1. 0倍更高的比活性，這包括至少約1. 1倍，約1. 2倍，約1. 3倍，約1. 4倍，約1. 5倍，約1. 6倍，約1. 7 倍，約1. 8倍，約1. 9倍，約2. 0倍，約2. 2倍，約2. 5倍，約2. 7倍，約2. 9倍，約3. 0倍，約 4. 0倍和約5. 0倍。在一些實施方案中，具有比活性改善的變體在SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的下列位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包括一個或多個缺失、取代或插入10、14、15、23、 59、60、61、65、67、68、72、73、97、98、99、102、110、113、133、140、144、145、147、152、153、164、 182、204、205、214、216、219、228、229、230、231、236、239、241、242、263、264、265、268、269、 276、284、291、300、301、303、311、338、342、344、346、349、359、361、364、375、379、382、390、 391、393、394、410、417、418、430、431、433、442、444、448、451、493、494、495、502、503、508、 511、518、519、520、531、535、536、539或563。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶將包含與 SEQ IDNO 2的序列具有至少約50%，約60%，約70%，約80%，約90%或約95%序列同一性的序列。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶與SEQ ID NO :2還將具有結構同一性。在一些實施方案中，具有改善的比活性的本公開的變體在SEQ ID NO :2所示胺基酸序列的下列位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包括取代I43Q、I43R、D44C、D44R、N061I、T067M、 A072Y、S097N、S102A、S102M、S102R、I133T、N145I、N153D、T205Q、Q219S、W228A、W228F、 W228H、W228M、S230C、S230F、S230G、S230L、S230N、S230Q, S230R、S231L、I239V、I239Y、 N263P、A268C、A268G、A268K、S291A、G294C、T342V、K394S、L417R、L417V、T430K、A431I、 A431L、A431Q、R433Y、T451K、T495M、A519I、A520C、A520L、A520P、A535R、V536M、A539R、N563K 或N563I。在一些實施方案中，如在測定和方法中所描述地測定與變體相比的親本的比活性。5.3.具有改變的熱穩定性和改變的比活性的變體葡糖澱粉酶在一些方面，本公開涉及與親本(例如野生型)相比具有改變的熱穩定性和改變的比活性的變體葡糖澱粉酶。在一些實施方案中，改變的比活性為增加的比活性。在一些實施方案中，改變的熱穩定性為在高溫下(例如，在超過80°C的溫度下)與親本葡糖澱粉酶相比增加的熱穩定性。在一些實施方案中，具有增加的熱穩定性和增加的比活性的變體在SEQ ID NO 2 所示胺基酸序列的下列位置或親本葡糖澱粉酶的等同位置中包括一個或多個缺失、取代或插入和取代10、15、43、44、59、61、68、72、73、97、99、102、140、153、182、204、205、214、228、 229、230、231、236、241、242、264、265、268、276、284、291、294、300、301、303、311、338、344、 346、349、359、361、364、375、379、382、391、393、394、410、430、433、444、448、451、495、503、 511、520、531、535、536、539或563。在一些實施方案中，親本葡糖澱粉酶將是木黴屬葡糖澱粉酶同源物而在其它的實施方案中，親本葡糖澱粉酶將與SEQ ID NO :2具有至少約50%， 約60 %，約70 %，約80 %，約90 %，約95 %或約98 %的序列同一性。在一些實施方案中， 親本葡糖澱粉酶與SEQ IDNO :2還將具有結構同一性。在一些實施方案中，具有增加的熱穩定性和比活性的變體在SEQ ID NO 2的至少一個下列位置中具有取代I43Q/R、D44C/R、 W228F/H/M、S230C/F/G/N/Q/R、S231L、A268C/D/G/K、S291A、G294C、R433Y、S451K、E503C、 Q511H、A520C/L/P 或 A535N/P/R。5.4.產生可發酵糖的變體葡糖澱粉酶在另一個方面中，與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出可發酵糖產生的提高。在另一個方面中，與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出在釀造過程的澱粉糖化步驟中可發酵糖產生的提高。在另一個方面中，與親本葡糖澱粉酶 (例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出在釀造過程的發酵步驟中可發酵糖產生的提高。在另一個方面中，所述可發酵糖為葡萄糖。本領域技術人員可通過例如HPLC技術來確定可發酵糖的產生。5. 5具有改變的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)的變體葡糖澱粉酶在另一個方面中，與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)。在另一個方面中，與親本葡糖澱粉酶 (例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出的澱粉水解活性降低不超過5%、不超過10%或不超過 15%。在一個方面中，提供了用於鑑別在澱粉水解過程中具有減少的縮合產物合成的葡糖澱粉酶變體的篩選方法以及通過所述方法獲得的葡糖澱粉酶變體，所述方法包括下列步驟測量異麥芽糖合成和葡糖澱粉酶變體的澱粉水解活性，以及選擇與親本葡糖澱粉酶相比澱粉水解活性降低不超過5%，不超過10%或不超過15%且與親本葡糖澱粉酶相比具有減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)的變體。在一些實施方案中，就與親本葡糖澱粉酶相比具有減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)而選擇葡糖澱粉酶變體。在一些實施方案中，就下述而選擇葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶相比具有相同或增加的澱粉水解活性和減少的異麥芽糖合成(與親本葡糖澱粉酶相比減少不超過 5%、不超過10%或不超過15% )並從而具有減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比 (IS/SH 比率)。在另一個方面中，與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出提高的實際發酵度。
5. 5具有改變的縮合產物形成的變體葡糖澱粉酶在一個方面中，與由黑麴黴(AnGA) (SEQ ID NO 6)形成的縮合產物的量相比，葡糖澱粉酶在相同的條件下形成的縮合產物的量更低。在另一個方面中，所述葡糖澱粉酶在相同的條件下形成的縮合產物的量與由黑麴黴(AnGA) (SEQ ID NO :6)形成的縮合產物的量基本上相同、為不超過5%更高、不超過8%更高或不超過10%更高。在另一個方面中，基於蛋白質濃度的葡糖澱粉酶的劑量相同。在另一個方面中，基於在活性測定中(例如本文中所描述的GAU活性測定或如本文中所描述的澱粉水解活性測定)對活性的測量，葡糖澱粉酶的劑量相同。6.編碼葡糖澱粉酶的多核苷酸本公開還涉及編碼變體葡糖澱粉酶的分離的多核苷酸。所述多核苷酸可通過本領域中已知的確立的技術而製備。可合成地製備所述多核苷酸，例如通過自動化DNA合成儀。DNA序列可以是通過將片段連接在一起而製備的、混合的基因組(或cDNA)和合成來源的。還可使用特定的引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)來製備多核苷酸。一般地，參考 Minshull J. et al. ,Methods 32(4) :416-427 Q004)。還可由許多商業公司(例如 Geneart AG, Regensburg，德國)來合成 DNA。本公開還提供包含下列核苷酸序列的分離的多核苷酸(i)與SEQ ID NO :4具有至少約50 %的同一性，這包括至少約60 %，約70 %，約80 %，約90 %，約95 %和約99 %，或
(ii)在中等至高嚴緊性的條件下能夠與源自SEQID NO :4所示核苷酸序列的探針雜交，或
(iii)與和SEQID NO :4所示序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列互補。根據本公開可使用的探針可包括SEQ ID NO 4的至少約50，約100，約150，約200，約250，約300 或更多的連續核苷酸。在一些實施方案中，所編碼的多肽還與SEQ ID NO :2具有結構同一性。本公開還提供了編碼變體葡糖澱粉酶的分離的多核苷酸，所述變體葡糖澱粉酶包含的胺基酸序列含有與SEQ ID NO :2至少約50%，約60%，約70%，約80%，約90%，約 93 %，約95 %，約97 %，約98 %或約99 %的胺基酸序列同一性。此外，本公開提供了包含任何上文所提供的多核苷酸的表達載體。本公開還提供了編碼本文所提供的變體葡糖澱粉酶的DNA的片段(即部分)。這些片段可用於獲得部分長度的DNA片段，其能夠被用於從絲狀真菌細胞(例如，木黴屬、麴黴屬、鐮孢菌屬、青黴屬和腐質黴屬)中分離或鑑別編碼本文所述的成熟葡糖澱粉酶的多核苷酸或具有葡糖澱粉酶活性的其片段。在一些實施方案中，DNA 片段可包含至少約50，約100，約150，約200，約250，約300或更多的連續核苷酸。在一些實施方案中，SEQ ID NO :4中所提供的DNA的部分可被用於從其它物種(例如編碼葡糖澱粉酶的絲狀真菌)中獲得親本葡糖澱粉酶(特別是木黴屬葡糖澱粉酶同源物)。7.葡糖澱粉酶的產生7. 1. DNA構建體和載體根據本公開的一個實施方案，組裝包含上文所述的、編碼本公開所涵蓋的變體葡糖澱粉酶且與啟動子序列可操作連接的多核苷酸的DNA構建體以將其轉移到宿主細胞中。 在一個方面中，提供了編碼如本文中所公開的葡糖澱粉酶變體的多核苷酸。可使用載體而將DNA構建體引入宿主細胞中。在一個方面，提供了包含根據權利要求75的多核苷酸或能夠表達如本文所公開的葡糖澱粉酶變體的載體。所述載體可以是當引入宿主細胞時被穩定引入的任何載體。在一些實施方案中，載體被整合到宿主細胞基因組中並被複製。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌體顆粒、盒等。在一些實施方案中，載體為包含與葡糖澱粉酶編碼序列可操作地連接的調控序列的表達載體。合適的表達和/或整合載體的實例在下列中提供Sambrook et al. (1989) (見上)，和 Ausubel (1987)(見上)，和 van den Hondel 等人(1"1)在 Bennett and Lasure(Eds.)More Gene Manipulations In Fungi, Academic Press pp. 396-428 中禾口美國專利號5，874，276。還參考真菌遺傳學庫存中心菌種目錄(TOSC，http//www. fgsc. net) 的載體列表。特別有用的載體包括從例如hvitrogen和!Iomega獲得的載體。用於細菌細胞的合適的質粒包括允許在大腸桿菌中複製的PBR322和pUC19和例如允許在芽孢桿菌中複製的PE194。其它適用於大腸桿菌宿主細胞的具體載體包括例如下列載體pFB6、pBR322、pUC18、pUClOO、pD0NR 201、10pD0NR 221、pENTR 、pGEM 3Z 和 pGEM 4Z。適用於真菌細胞的具體載體包括pRAX(可用於麴黴屬的通用表達載體)，含有 glaA啟動子的pRAX，以及在肉座菌屬/木黴屬中包括含有cbhl啟動子的pTrex3g。在一些實施方案中，在細菌或真菌宿主細胞中顯示出轉錄活性的啟動子可以源自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白的基因。啟動子可以是突變體、截短的和/或雜合啟動子。上文提及的啟動子是本領域中已知的。可用於真菌細胞(特別是絲狀真菌細胞，例如木黴屬或麴黴屬細胞)中的合適的啟動子的實例包括，例如下列示例性的啟動子瑞氏木黴啟動子cbhl、CWi2、egll、egl2、eg5、Xlnl和xln2。有用的啟動子的其它實例包括來自泡盛麴黴和黑麴黴葡糖澱粉酶基因(glaA)的啟動子(見Nunberg et al. ,Mol. Cell Biol. 4 2306-2315(1984)和 Boel et al.，EMBO J. 3 1581-1585 (1984))，米麴黴 TAKA 澱粉酶啟動子，來自酵母(S. cerevisiae)的TPI (磷酸丙糖異構酶)啟動子，來自構巢麴黴乙醯胺酶基因和米黑根毛黴(Miizomucor miehei)脂肪酶基因的啟動子。可用於細菌細胞的合適啟動子的實例包括從下列獲得的那些大腸桿菌乳糖操縱子；地衣芽孢桿菌α -澱粉酶基因 (amyL)，嗜熱芽胞桿菌澱粉酶基因(amyQ ；枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，β -內醯胺酶基因，以及tac啟動子。在一些實施方案中，啟動子是宿主細胞的天然啟動子。例如，當瑞氏木黴是宿主時，啟動子是天然的瑞氏木黴啟動子。在其它實施方案中，啟動子是對於真菌宿主細胞為異源性的啟動子。在一些實施方案中，啟動子將是親本葡糖澱粉酶的啟動子(例如，TrGA啟動子)。在一些實施方案中，DNA構建體包括編碼信號序列的核酸，即與多肽的氨基末端相連接的胺基酸序列，其指導經編碼的多肽進入細胞的分泌通路。核酸序列編碼序列的5』末端可天然地包括信號肽編碼區域，其天然地在翻譯閱讀框中與編碼分泌的葡糖澱粉酶的葡糖澱粉酶編碼序列的區段相連，或者核酸序列編碼序列的5』末端可包括外源於編碼序列的信號肽。在一些實施方案中，DNA構建體包括與從中獲得了變體葡糖澱粉酶的親本葡糖澱粉酶基因天然地連接的信號序列。在一些實施方案中，信號序列將是SEQ ID N0:1中所示的序列或者與其具有至少約90%，約94或約98%的序列同一性的序列。有效的信號序列可包括從其它絲狀真菌酶獲得的信號序列例如來自木黴屬(瑞氏木黴葡糖澱粉酶，纖維二糖水解酶I，纖維二糖水解酶II，內切葡聚糖酶I，內切葡聚糖酶II，內切葡聚糖酶II或分泌的蛋白酶，例如天冬氨酸蛋白酶)，腐質黴屬(特異腐質酶纖維二糖水解酶或內切葡聚糖酶或灰腐質黴葡糖澱粉酶)或麴黴屬(黑麴黴葡糖澱粉酶和米麴黴TAKA澱粉酶)。在其它實施方案中，包含信號序列的DNA構建體或載體和待被引入宿主細胞中的啟動子序列源自相同的來源。在一些實施方案中，可使用木黴屬葡糖澱粉酶同源物的天然葡糖澱粉酶信號序列，例如來自肉座菌屬菌株的信號序列。在一些實施方案中，表達載體還包括終止序列。在本公開中可使用在宿主細胞中有功能的任何終止序列。在一些實施方案中，終止序列和啟動子序列源自相同的來源。在另一個實施方案中，終止序列是與宿主細胞同源的。有用的終止序列包括從下列獲得的終止序列瑞氏木黴cbll的基因；黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(Nunberg et al. (1984)(見上)JPBoel et al.，(1984)(見上))，構巢麴黴鄰氨基苯甲酸合酶，米麴黴TAKA澱粉酶或構巢麴黴 trpC(Punt et al.，Gene 56 :117-124(1987)) 在一些實施方案中，表達載體包括可選擇的標記物。可選擇標記物的實例包括賦予抗微生物抗性的那些(例如，潮黴素和腐草黴素)。營養性選擇性標記物也可用於本公開，這包括本領域中已知的那些標記物，例如amdS(乙醯胺酶)、argB (鳥氨酸氨甲醯轉移酶)和pyrG(乳清苷-5』磷酸脫羧酶)。可用於轉化木黴屬的載體系統中的標記物是本領域中己知的(見例如，Finkelstein，Biotechnology Of Filamentous Fungi, Finkelstein et al. (1992)Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA,第 6 章；Kinghorn et al. (1992)Applied Molecular Genetics Of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London ；Berges and Barreau, Curr. Genet. 19 359-365(1991)；以及 van Hartingsveldt et al.，Mol. Gen. Genet. 206 :71-75 (1987))。在一些實施方案中，選擇性標記物是amdS基因，其編碼乙醯胺酶，這允許經轉化的細胞以乙醯胺作為氮源而生長。使用構巢麴黴amdS基因作為選擇性標記物被描述於Kelley et al., EMBO J. 4 :475-479(1985)和 Penttila et al.，Gene 61 :155-164(1987)中。用於連接包含編碼變體葡糖澱粉酶的核酸序列、啟動子、終止序列和其它序列的 DNA構建體的方法，以及將它們插入合適的載體中的方法是本領域中熟知的。連接通常是通過在方便的限制性位點連接而實現的。如果不存在此類位點，則根據常規的操作使用合成的寡核苷酸連接子(見 Sambrook et al. (1989)(見上)和 Bennett and Lasure, More Gene Manipulations In Fungi, Academic Press, San Diego (1991) pp 70-76·)。此夕卜，可使用已知的重組技術(例如 Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology)來構建載體。7. 2.宿主細胞和宿主細胞的轉化1.本公開還涉及包含編碼本公開的變體葡糖澱粉酶的多核苷酸的宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞選自細菌、真菌、植物和酵母細胞。術語宿主細胞包括用於產生根據本公開的變體葡糖澱粉酶的細胞、細胞的後代和由細胞產生的原生質體。在一個方面中， 公開了包括(優選被轉化以)載體的宿主細胞。在另一個方面中，提供了能夠表達葡糖澱粉酶變體的細胞。在另一個方面中，所述宿主細胞為蛋白酶缺陷性和/或木聚糖酶缺陷性和/或葡聚糖酶缺陷性的宿主細胞。蛋白酶缺陷性和/或木聚糖酶缺陷性和/或天然葡聚糖酶缺陷性的宿主細胞可以通過刪除或沉默編碼所提及的酶的基因而獲得。因此，含有所述GA變體的宿主細胞不表達所提及的酶。在一些實施方案中，宿主細胞是真菌細胞且任選地為絲狀真菌宿主細胞。術語「絲狀真菌」是指真菌亞門(subdivision Eumycotina)的所有絲狀形式(見Alexopoulos， C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley,New York)。這些真菌的特徵在於含有細胞壁的營養菌絲體，所述細胞壁由幾丁質、纖維素和其它複合多糖構成。本公開的絲狀真菌在形態學上、生理學上和遺傳學上與酵母相區別。絲狀真菌的營養生長是通過菌絲伸長，且碳分解代謝是嚴格好氧的。在本公開中，絲狀真菌親本細胞可以是但不限於下列物種的細胞木黴屬(例如，瑞氏木黴，紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的無性變形，之前被歸類為長枝木黴、綠色木黴(Trichoderma viride)、康寧木黴、哈茨木黴)(Sheir-Neirs et al.，Αρρ1· Microbiol. Biotechnol. 20 :46-53 (1984) ；ATCC No. 56765 和 ATCC No. 26921)，青黴屬的種，腐質黴屬的種(例如特異腐質黴、疏綿狀腐質黴和灰腐質黴)，金孢屬(Chrysosporium) 的種(例如，C. Iucknowense)，粘帚黴(Gliocladium)的種，麴黴屬的種(例如，米麴黴、黑麴黴、醬油麴黴(Asojae)、日本麴黴(A. japonicus)、構巢麴黴和泡盛麴黴)(Ward et al.， Appl. Microbiol. Biotechnol. 39 :738-743 (1993)禾口 Goedegebuur et al. , Curr. Genet. 41 89-98(2002))，鐮孢菌屬的種(例如，粉紅鐮孢菌、禾赤鐮孢菌(F. graminum)、禾穀鐮孢菌(F. cerealis)、尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)和鐮孢黴(F. venenatum))，鏈孢黴屬的種 (粗糙鏈孢黴)，肉座菌屬的種、毛黴菌屬(Mucor)的種(米黑毛黴(M.miehei))，根黴屬 (Rhizopus)的種，和四脊裸胞殼(Emericella)的種(還見 hnis et al.，Science 228 21-26(1985))。術語「木黴屬」或「木黴屬的種」或「木黴屬種」是指之前或目前被歸類為木黴屬的任何真菌屬。在一些實施方案中，宿主細胞將是革蘭氏陽性的細菌細胞。非限制性的實例包括鏈黴菌屬的菌株(例如變鉛青鏈黴菌，天藍色鏈黴菌(S. coelicolor)和灰色鏈黴菌(S.griseus))和芽孢桿菌屬的菌株。如本文中所使用的，「芽孢桿菌屬」包括「芽孢桿菌」屬中的所有種，如本領域技術人員所知的，這包括但不限於枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(B. lentus)、短芽孢桿菌(B. brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (B. stearothermophiIus)、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)、鹼芽孢桿菌(B. halodurans)、巨大芽孢桿菌(B. megaterium)、凝結芽孢桿菌(B. coagulans)、環狀芽孢桿菌(B. circulans)、燦爛芽孢桿菌(B. Iautus)和蘇雲金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。所認可的是，芽孢桿菌屬繼續經歷著分類學上的重構。 因此，意欲的是所述屬包括被重新歸類的種，這包括但不限於例如嗜熱脂肪芽孢桿菌的生物體，其現在被命名為嗜熱脂肪芽孢桿菌(GecAacillus tearothermophilus) 0在一些實施方案中，所述宿主細胞為革蘭氏陰性細菌菌株，例如大腸桿菌或假單胞菌屬(I^eudomonas)的種。在其它實施方案中，宿主細胞可以是酵母細胞，例如酵母菌屬(Saccharomyces)白勺禾中、(Schizosaccharomyces)白勺禾中、^(Pichia) 的種或假絲酵母菌屬(Candida)種。在其它實施方案中，宿主細胞將是經遺傳學工程化的宿主細胞，其中天然的基因被滅活了(例如通過在細菌或真菌細胞中的缺失)。當希望獲得含有一個或多個滅活基因的真菌宿主細胞時，可使用已知的方法(例如，美國專利號 5，246, 853、美國專利號5，475，101和WO 92/06209中所公開的方法)。可通過完全或部分缺失、插入滅活或使得基因對於其所欲的目的而言無功能(從而防止基因表達有功能的蛋白)的任何其它方式而實現基因滅活。在一些實施方案中，當宿主細胞為木黴屬細胞(特別是瑞氏木黴宿主細胞)時，cbhU cbh2, egll和egl2基因將被滅活和/或缺失。具有四重缺失的蛋白的示例性瑞氏木黴宿主細胞如在美國專利號5，847，276和WO 05/001036中所示和所描述的。在其它實施方案中，宿主細胞為蛋白酶缺陷性或無蛋白酶的株系。將DNA構建體或載體引入宿主細胞中包括例如下列技術轉化、電穿孔、核顯微注射、轉導、轉染(例如，脂轉染介導的和DEAE-糊精介導的轉染)、用磷酸鈣DNA沉澱物孵育、 用塗覆了 DNA的微粒高速轟擊、以及原生質體融合。一般性的轉化技術是本領域中已知的 (見例如，Ausubel et al. (1987)(見上)，第九章；和 Sambrook et al. (1989)(見上)，以及 Campbell et al.，Curr. Genet. 16 :53-56 (1989))。用於芽孢桿菌的轉化方法在許多參考文獻中被公開了，這包括Anagnostopoulos C. and J. Spizizen, J. Bacteriol. 81 :741-746(1961)以及 WO 02/14490。用於麴黴屬的轉化方法被描述於Yelton et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :1470-1474(1984) ；Berka et al. , (1991)的 Applications of Enzyme Biotechnology,Eds. Kelly and Baldwin,Plenum Press(NY) ；Cao et al. ,Protein Sci. 9 991-1001(2000) ；Campbell et al.，Curr. Genet. 16 :53-56 (1989)和 EP 238 023 中。在木黴屬中表達異源蛋白被描述於美國專利號6，022，725、美國專利號6，268, 328、Harkki et al. Enzyme Microb. Technol. 13 :227-233(1991)、Harkki et al., BioTechnol. 7 596-603(1989)、EP 244, 234,EP 215，594JPNevalainen et al. ,"The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes，，，Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong 禾口 Berka, Marcel Dekker Inc. , NY (1992) pp. 129-148)。對於轉化鐮孢菌屬的菌株，還參考W096/00787和 Bajar et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :8202-8212 (1991)。在一個具體的實施方案中，用於轉化而製備木黴屬的種涉及由真菌菌絲體製備原生質體(見 Campbell et al. , Curr. Genet. 16 :53-56(1989) ；Pentilla et al.，Gene 61 155-164(1987))。根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的對絲狀真菌的轉化是已知的(lde Groot et al.，Nat. Biotechnol. 16 :839-842 (1998))。對於以絲狀真菌宿主進行的轉化程序，還參考美國專利號6，022，725和美國專利號6，268, 328。在一些實施方案中，通常用下述載體系統構建遺傳學上穩定的轉化體，在所述載體系統中編碼變體葡糖澱粉酶的核酸被穩定地整合到宿主菌株的染色體中。然後通過已知的技術純化轉化體。在一些其它實施方案中，宿主細胞為植物細胞，例如來自單子葉植物(例如玉米、 小麥和蜀黍)的細胞或來自雙子葉植物(例如大豆)的細胞。用於製造可用來轉化植物的DNA構建體的方法以及用於植物轉化的方法是已知的。這種方法中的一些包括根癌土壤桿菌介導的基因轉移、微粒轟擊、PEG介導的原生質體的轉化、電穿孔等。參考美國專利號 6，803，499，美國專利號 6，777，589 ;Fromm et al. , BioTechnol. 8 :833-839(1990)； Potrykus et al. , Mol. Gen. Genet. 199:169-177(1985)。7. 3.葡糖澱粉酶的產生本公開還涉及用於產生變體葡糖澱粉酶的方法，其包括用包含編碼根據本公開的變體葡糖澱粉酶的多核苷酸的表達載體轉化宿主細胞，在適於表達和產生變體葡糖澱粉酶的條件下培養所述宿主細胞，以及任選地回收所述變體葡糖澱粉酶。在一個方面中，提供了表達根據本公開的變體葡糖澱粉酶的方法、所述方法包括獲得如本文中所公開的宿主細胞或細胞、從所述細胞或宿主細胞表達葡糖澱粉酶變體以及任選地純化所述葡糖澱粉酶變體。在一個方面中，純化了所述葡糖澱粉酶變體。在本公開的表達和生產方法中，在合適的條件下、在下述中培養宿主細胞搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續、批量和批量給料發酵)、在實驗室或工業發酵罐中，用含有生理學的鹽和營養物的合適的培養基進行(見例如Pourquie，J. et al. ,Biochemistry And Genetics Of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al. , Academic Press, pp. 71-86，1988 和 Ilmen，M.et al. , Appl. Environ. Microbiol. 63 :1298-1306 (1997))。常見的商業上製備的培養基(例如，酵母麥芽提取物(YM)培養液、Luria Bertani (LB)培養液和沙氏葡萄糖(SD)培養液)可用於本公開中。用於細菌和絲狀真菌細胞的培養條件是本領域中已知的並且可在科學文獻中找到和/或可從真菌來源(例如美國典型培養物和真菌遺傳學菌種保藏中心)獲得。在葡糖澱粉酶編碼序列在可誘導啟動子的控制下的情形中， 以有效誘導葡糖澱粉酶表達的濃度將誘導劑(例如糖、金屬鹽或抗微生物劑)加入培養基中。在一些實施方案中，本公開涉及在植物宿主中產生變體葡糖澱粉酶的方法，所述方法包括用包含編碼根據本公開的葡糖澱粉酶變體的多核苷酸的載體轉化植物細胞和在適於所述變體的表達和生產的條件下生長所述植物細胞。在一些實施方案中，進行測定以評估以編碼本公開所涵蓋的變體葡糖澱粉酶的多核苷酸轉化的細胞系對變體葡糖澱粉酶的表達。可在蛋白水平、RNA水平和/或通過使用特定於葡糖澱粉酶活性和/或產生的功能性生物測定來進行所述測定。這種測定中的一些包括RNA印跡法、點印跡法(DNA或RNA分析)、RT-PCR (逆轉錄酶聚合酶鏈式反應)、使用經恰當標記的探針(基於核酸編碼序列)進行的原位雜交和常規的Southern印跡法以及放射自顯影術。此外，可在樣品中直接測量變體葡糖澱粉酶的產生和/或表達，例如通過直接測量培養基中的還原糖(例如葡萄糖)的測定以及通過用於測量葡糖澱粉酶活性、表達和/ 或產生的測定。特別地，可通過3，5-二硝基水楊酸(DNS)法(見Goto et al.，Biosci. Biotechnol. Biochem. 58 =49-54(1994))來測定葡糖澱粉酶活性。在其它的實施方案中，通過免疫學方法(例如細胞、組織切片的免疫組織化學染色或組織培養基的免疫測定(例如通過蛋白質印跡或ELISA)來評價蛋白表達。此類免疫測定可用於定性和定量地評價葡糖澱粉酶的表達。此類方法的細節是本領域技術人員已知的並且用於實施此類方法的許多試劑都是商業上可獲得的。可通過本領域中已知的各種程序(包括離心、過濾、提取、沉澱等)從培養基中回收或純化本公開的葡糖澱粉酶。8.組合物和用途在一個方面中，提供了本文所述的葡糖澱粉酶變體用於製備酶促組合物的用途。本公開的變體葡糖澱粉酶可用於酶組合物中，這包括但不限於澱粉水解性和糖化組合物，清潔和去汙劑組合物(例如衣物清潔劑、碗碟清洗劑和硬表面清潔組合物)，醇發酵組合物，和動物飼料組合物。此外，變體葡糖澱粉酶可用於，例如釀造、保健、織物、環境廢物轉化過程、生物紙漿加工和生物質轉化應用。本公開的變體葡糖澱粉酶可用於酶組合物中，這包括澱粉水解組合物、糖化組合物、去汙劑、醇發酵酶促組合物和動物飼料。在一個方面中，所述組合物是澱粉水解組合物。在一些實施方案中，包含本公開所涵蓋的變體葡糖澱粉酶的酶組合物將任選地與下列酶中的任一種或其組合相結合而使用α-澱粉酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、環糊精葡糖轉移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質酶、木聚糖酶、顆粒澱粉水解酶和其它葡糖澱粉酶。在一些實施方案中，包含本公開所涵蓋的變體葡糖澱粉酶的酶組合物將任選地與下列酶中的任一種或其組合相結合而使用澱粉酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶和其它葡糖澱粉酶。在一些實施方案中，包含本公開所涵蓋的變體葡糖澱粉酶的酶組合物將任選地與下列酶中的任一種或其組合相結合而使用澱粉酶、支鏈澱粉酶和其它葡糖澱粉酶。在一些實施方案中，包含本公開所涵蓋的變體葡糖澱粉酶的酶組合物將任選地與下列酶中的任一種或其組合相結合而使用澱粉酶和支鏈澱粉酶。在另一個方面中，所述澱粉酶為α-澱粉酶和/或異澱粉酶。在另一個方面中，葡聚糖酶是外切葡聚糖酶和/或內切葡聚糖酶。在一些實施方案中，酶組合物將包括α -澱粉酶，例如真菌α -澱粉酶(例如麴黴屬的種)或細菌α-澱粉酶(例如芽孢桿菌屬的種，例如嗜熱脂肪芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)及其變體和雜合體。在一些實施方案中，α-澱粉酶是酸穩定的α-澱粉酶。在一些實施方案中，α -澱粉酶白麴黴α -澱粉酶(AkAA)，見美國專利號7，037，704。 構想用於本公開的組合物的商業上可獲得的α-澱粉酶是已知的並且包括GZYME G997、 SPEZYME FRED、SPEZYME XTRA (Danisco US, Inc，Genencor Division)、TERMAMYL 120-L 禾口SUPRA (Novozymes, A/S)。在一些實施方案中，酶組合物將包括酸性真菌蛋白酶。在其它實施方案中， 所述酸性真菌蛋白酶源自木黴屬的種並且可以是美國專利號7，563，607(公開為US 2006/0154353，2006年7月13日)中所公開的蛋白酶中的任何一種，所述美國專利在此通過引用而併入。在其它實施方案中，酶組合物將包括來自Buttiauxiella屬的種的植酸酶 (例如，BP-17，也見PCT專利公開WO 2006/043178中公開的變體)。在其它實施方案中，本公開的變體葡糖澱粉酶可與其它葡糖澱粉酶相組合。在一些實施方案中，本公開的葡糖澱粉酶將與下列相組合源自麴黴屬菌株的一種或多種葡糖澱粉酶或其變體，所述麴黴屬菌株為例如米麴黴、黑麴黴、白麴黴和泡盛麴黴；源自腐質黴屬菌株(特別是源自灰腐質黴)的葡糖澱粉酶或其變體，例如與WO 05/052148中所公開的 SEQ ID NO :3具有至少約90%，約93%，約95%，約96%，約97%，約98%或約99%序列同一性的葡糖澱粉酶；源自籃狀菌屬菌株(特別是埃默森藍狀菌)的葡糖澱粉酶或其變體； 源自阿太菌(Athelia)菌株(特別是羅耳阿太菌(A.rolfsii))的葡糖澱粉酶；源自青黴屬菌株(特別是產黃青黴)的葡糖澱粉酶。特別地，變體葡糖澱粉酶可被用於澱粉轉化過程，特別是在用於果糖糖漿、特性糖的葡萄糖的生產中，以及用於由發酵含澱粉的底物而生產醇和其它終產物(例如有機酸、抗壞血酸禾口氛基酸)(G.M. A. van Beynum et al. , Eds. (1985) Starch Conversion Technology, Marcel Dekker Inc. NY) 0使用本公開的變體葡糖澱粉酶組合物生產的糊精可產生至少80 %，至少85 %，至少90 %和至少95 %的葡萄糖產量。使用本公開所涵蓋的葡糖澱粉酶而由澱粉底物的發酵來產生乙醇可包括產生燃料醇或可飲用的醇。在一些實施方案中，當在與親本葡糖澱粉酶相同的條件下使用變體葡糖澱粉酶時，醇的生產將更多。在一些實施方案中，醇的生產將為約0. 5%至2. 5%更好，這包括但不限於與親本葡糖澱粉酶相比，約 0.6%，約 0.7%，約 0.8%，約 0.9%，約 1.0%，約 1. 1 %，約 1. 2%，約 1. 3%，約 1. 4%， 約 1. 5%，約 1. 6% .約 1. 7%，約 1. 8%，約 1. 9%，約 2. 0%，約 2. 1%，約 2. 2%，約 2. 3%和約2. 4%更多的醇。在一些實施方案中，本公開的變體葡糖澱粉酶將可用於澱粉的水解，所述澱粉來自用於醇生產的各種基於植物的底物。在一些實施方案中，所述基於植物的底物將包括玉米、小麥、大麥、黑麥、蜀黍、稻、甘蔗、馬鈴薯及其組合。在一些實施方案中，所述基於植物的底物將為經分級的植物材料，例如穀物(如玉米)，其被分級為例如下述組分纖維、胚、蛋白質和澱粉(胚乳)(美國專利號6，254，914和美國專利號6，899，910)。醇發酵的方法被描述於 The Alcohol Textbook, K. A. Jacques et al. , Eds. 2003, Nottingham University Press, UK 中。在某些實施方案中，所述醇將為乙醇。特別地，醇發酵生產過程被表徵為溼磨或幹磨過程。在一些實施方案中，變體葡糖澱粉酶將被用於溼磨發酵過程中而在其它實施方案中，變體葡糖澱粉酶將可用於幹磨過程中。幹谷研磨涉及若干基本步驟，這通常包括碾磨、蒸煮、液化、糖化、發酵和將液體與固體分離以產生醇和其它副產物。碾磨植物材料，特別是全穀物，例如玉米、小麥或黑麥。 在一些情形中，可將穀物首先分級為組成部分。可研磨經碾磨的植物材料以獲得粗顆粒或細顆粒。在漿料槽中將經碾磨的植物材料與液體(例如，水和/或酒糟水)相混合。使漿料在噴射式蒸煮鍋中與液化酶(例如，α-澱粉酶)一起經受高溫(例如，約90°C至約105°C 或更高)以將穀物中的澱粉溶解並水解為糊精。使混合物冷卻並用糖化酶(例如本公開所涵蓋的葡糖澱粉酶)進一步處理，以產生葡萄糖。然後，在發酵微生物(例如產生乙醇的微生物、特別是酵母(酵母屬的種))的存在下，可發酵含有葡萄糖的醪液大約M至120小時。 將醪液中的固體與液相分離，並獲得醇(例如乙醇)和有用的副產物(例如酒糟)。在一些實施方案中，將糖化步驟與發酵步驟相結合且所述過程被稱為同時糖化和發酵或同時糖化、酵母增殖和發酵。在其它實施方案中，變體葡糖澱粉酶用於澱粉水解的過程中，其中所述過程的溫度為約30°C至約75°C，在一些實施方案中，為約40°C至約65°C。在一些實施方案中，變體葡糖澱粉酶用於澱粉水解的過程中，其中PH為約3. 0至約6. 5。一些實施方案中的發酵過程包括研磨穀物或分級穀物，以及將經碾磨的穀物與液體相結合以形成漿料，然後在單一的容器中將所述漿料與根據本公開的變體葡糖澱粉酶和任選地其它的酶以及酵母相混合以生產乙醇和其它副產物(見例如，美國專利號4，514，496、W0 04/081193和WO 04/080923)， 所述其它的酶為例如但不限於α-澱粉酶、其它葡糖澱粉酶、植酸酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、 異澱粉酶或具有粒狀澱粉水解活性的其它酶。在一些實施方案中，本公開涉及糖化液體澱粉溶液的方法，所述方法包括使用本公開的變體葡糖澱粉酶的酶促糖化步驟。可通過將澱粉溶解在水或水性緩衝液中、和任選地加熱以膠凝所述澱粉而產生液體澱粉溶液。可應用通過澱粉酶來進一步部分地降解澱粉。本發明提供了使用本發明的葡糖澱粉酶變體來從澱粉產生葡萄糖等的方法。通常，所述方法包括下列步驟在α-澱粉酶的存在下部分水解前體澱粉，然後在葡糖澱粉酶的存在下通過剪切α-(1-4)和α-(1-6)糖苷鍵而進一步水解，從澱粉或相關寡糖和多糖分子的非還原末端釋放D-葡萄糖。利用α-澱粉酶對前體澱粉的部分水解通過水解內部 α-(1-4)-連接而提供了澱粉分子的初始降解。在商業應用中，使用α-澱粉酶的初始水解在約105°C的溫度下進行。非常高的澱粉濃度被加工，這通常為30%至40%的固體。在此升高的溫度下，初始水解通常進行五分鐘。然後將經部分水解的澱粉轉移到第二個槽中並在85°C至90°C的溫度下孵育大約一小時以獲得10至15的糖化率(D. E.)。在葡糖澱粉酶的存在下進一步水解，從澱粉或相關寡糖和多糖分子的非還原末端釋放D-葡萄糖的步驟通常是在30°C至60°C的降低的溫度下、在單獨的槽中進行的。通常，底物液體的溫度降至55°C至60°C。溶液的pH從6至6. 5降到3至5. 5的範圍。通常，溶液的pH為4至4. 5。 將葡糖澱粉酶加入溶液中並使反應進行M-72小時，例如36-48小時。其中可使用本發明的葡糖澱粉酶變體的糖化過程的實例包括JP3-224493、JP 1-191693、JP 62-27四87和EP 452，238中所描述的過程。本文所描述的葡糖澱粉酶變體可與僅水解含有至少四個葡萄糖基殘基的分子中的α-(1-6)-糖苷鍵的酶組合使用。優選地，葡糖澱粉酶變體可與支鏈澱粉酶或α-澱粉酶組合使用。α-澱粉酶和支鏈澱粉酶用於脫支的用途、酶的分子特性和所述酶與葡糖澱粉酶的潛在應用如G. Μ. A. van Beynum et al. , Starch Conversion Technology, Marcel Dekker, New York, 1985,101-142 中所不。在一個實施方案中，提供了本文所描述的葡糖澱粉酶變體用於澱粉轉化過程(例如在連續糖化步驟中)的用途。本文中所述的葡糖澱粉酶變體還可以固定的形式使用。這適於並通常用於產生麥芽糊精或葡萄糖糖漿或特性糖漿(例如麥芽糖糖漿)並且還用於與果糖糖漿的生產相關聯的寡糖殘液流。當所需的最終糖產物為例如高果糖糖漿時，葡萄糖糖漿可被轉化為果糖。糖化過程之後，PH被增加至6-8範圍中的值，例如pH 7. 5，並通過離子交換來去除鈣。然後，使用例如經固定的葡萄糖異構酶(例如SweetZymeTMIT)將葡萄糖糖漿轉化為高果糖糖漿。在其它實施方案中，變體葡糖澱粉酶用於啤酒釀造的過程中。釀造過程是本領域中熟知的，並且通常涉及下列步驟麥芽製造、澱粉糖化和發酵。澱粉糖化是將來自經研磨的大麥麥芽和固體附加物的澱粉轉化為可發酵的和不可發酵的糖以產生麥芽汁的過程。傳統的澱粉糖化涉及在設定的溫度和體積下，將經研磨的大麥麥芽和附加物與水相混合以繼續在麥芽製造過程中起始的生物化學變化。在各種溫度下，在一段時間中進行澱粉糖化過程，以活化促成蛋白和碳水化合物的降解的內源性酶。澱粉糖化之後，將麥芽汁與固體(谷糟)分離。在麥芽汁分離之後，可用釀酒酵母發酵麥芽汁以產生啤酒。可通過加入外源性酶(例如特別是葡糖澱粉酶和/或α-澱粉酶，β -澱粉酶和支鏈澱粉酶)而進一步水解在澱粉糖化過程中形成的短分支葡萄糖寡聚物。可就這樣使用麥芽汁或這可將其濃縮和/ 或乾燥。經濃縮和/或乾燥的麥芽汁可作為釀造提取物，作為麥芽提取物調味劑而用於非含醇麥芽飲料、麥芽醋、早餐穀物，用於糖果等。將麥芽汁發酵以產生含醇的飲料，通常是啤酒，例如，淡色啤酒、強的淡色啤酒、苦啤酒、烈啤酒、porter、淡啤酒、出口啤酒、麥芽酒、大麥葡萄酒、發泡酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低卡路裡啤酒或輕啤酒。在另一個典型實施方案中，將麥芽汁發酵以生產可飲用的乙醇。在一些實施方案中，本公開涉及水解和糖化在釀造中使用的、經膠凝化和液化(通常地)的谷澱粉的方法，其中使用了包含一種或多種如本文中所涉及的葡糖澱粉酶的酶促組合物，以增加從澱粉獲得的釀酒酵母可發酵糖的量。使用釀造過程來產生可飲用的產品啤酒，其中通過用釀酒酵母發酵而使可發酵糖轉化為乙醇和C02。可發酵糖傳統地源自穀物中的澱粉，任選地被補充以例如下列的可發酵糖源葡萄糖和麥芽糖糖漿，以及蔗糖。 簡要地，本領域中熟知的啤酒生產通常包括下列步驟麥芽製造、澱粉糖化和發酵。歷史上，啤酒生產的第一步是麥芽製造-浸漬、萌發和穀物(例如大麥)的乾燥。 在麥芽製造的過程中，在穀物(例如大麥)核的萌發中產生酶並且其化學組成中有某些改變(已知為修飾)，這包括澱粉、蛋白質和葡聚糖的一些降解。研磨含麥芽的穀物以提供谷，可將其與經研磨的附加物(例如非萌發的穀物)混合以提供混合的谷。將所述谷與水混合併使其經受澱粉糖化；可向醪液中加入之前經蒸煮 (膠凝化和液化)的附加物。在各種溫度下，在一段時間中進行澱粉糖化過程，以水解穀物蛋白、降解葡聚糖並溶解和水解澱粉。在傳統的澱粉糖化中，對麥芽和附加物中谷澱粉的水解是由內源於含麥芽的大麥的兩種主要的酶催化的。α-澱粉酶隨機剪切澱粉分子內部的α-1，4鍵而將其片段化為更小的糊精。澱粉酶從這些糊精的非還原末端順次剪切 α _1，4鍵，從而主要產生麥芽糖。α-和β-澱粉酶都不能水解α_1，6鍵(其形成澱粉分子中澱粉鏈的分支點)，這引起醪液中有限糊精的累積。麥芽確實含有酶(有限糊精酶)，其催化α-1，6鍵的水解但是由於其不耐熱性，其在澱粉糖化溫度下僅顯示出弱的活性。在澱粉糖化之後，將液體提取物(麥芽汁)與谷糟固體(即形成谷的部分的不可溶穀物和殼材料)分離。麥芽汁分離的目的包括眷獲得良好的提取物回收，眷獲得良好的過濾性，以及 產生澄清的麥芽汁。麥芽汁的提取物回收和過濾性在釀造過程的經濟性方面是重要的。麥芽汁的組成取決於原材料、澱粉糖化過程和特徵以及其它變量。典型的麥芽汁包含65-80%的可發酵糖(葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖)，以及20-35%的非可發酵有限糊精(具有比麥芽三糖更高的聚合度的糖)。當以高水平的、附加的不含麥芽的穀物釀造時， 可產生澱粉糖化過程中澱粉水解酶的不足。因此需要外源性酶的來源，所述外源性酶能夠在澱粉糖化的過程中產生可發酵的糖。此外，也需要此類外源性酶以降低麥芽汁中非可發酵糖的水平，並伴有可發酵糖的相應增加，以釀造具有低碳水化合物含量的高度稀釋的啤酒。本文中公開的是用於澱粉水解的酶組合物，其包含至少一種本文中所涉及的葡糖澱粉酶，其可被加入醪液中或用於釀造過程的澱粉糖化步驟中，從而剪切澱粉谷中的α-1，4鍵和/或α -1，6鍵並從而增加麥芽汁中的可發酵糖含量和減少完成的啤酒中的非可發酵糖殘餘。此外，可乾燥(通過例如噴霧乾燥)或濃縮(例如煮沸和蒸發)如此產生的麥芽汁以提供糖漿或粉末。如本文中所涉及的谷可包含任何含有澱粉和/或糖的植物材料，其可源自任何植物和植物部分，這包括根莖、根、莖、葉和種子。通常谷包含穀物，例如來自大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、稻、高粱、粟和蜀黍的穀物，並且更優選地至少10%或更優選地至少15%， 甚至更優選地至少25%或最優選地至少35%，例如至少50%，至少75%，至少90%或甚至 100% (w/w)的麥芽汁的谷源自穀物。最優選地，所述谷包含含麥芽的穀物，例如大麥麥芽。 優選地，至少10%或更優選至少15%、甚至更優選至少25%或最優選至少35% (例如至少50%、至少75%、至少90%或甚至100% (w/w))的麥芽汁的谷源自含麥芽的穀物。優選地，所述谷包含附加物，例如來自大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、稻、高粱、粟和蜀黍的不含麥芽的穀物，且更優選地，至少10%或更優選至少15%，甚至更優選至少25%或最優選至少 35% (例如至少50%，至少75%，至少90%或甚至100% (w/w))的所述麥芽汁的谷源自不含麥芽的穀物或其它附加物。可在本發明的澱粉糖化過程之前、之中或之後將包含易於發酵的碳水化合物(例如糖或糖漿)的附加物加入麥芽醪液，但是優選在澱粉糖化過程之後加入。在加入到醪液中之前，可用α-澱粉酶，和/或內切性肽酶(蛋白酶)和/或內切葡聚糖酶處理附加物的一部分，和/或對其進行熱處理。如本文中所涉及的酶組合物可包括其它的酶，優選選自下列的酶α-澱粉酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶(例如外切葡聚糖酶或內切葡聚糖酶)、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶和葡糖澱粉酶。在澱粉糖化的過程中，將從谷中提取的澱粉逐漸水解為可發酵糖和更小的糊精。優選地，在麥芽汁分離之前，醪液對於碘測試是澱粉陰性的。在釀造過程的第三步(發酵)之前，通常將麥芽汁轉移到釀造罐中並劇烈煮沸 50-60分鐘。在麥芽汁沸騰的過程中發生若干重要的過程(可在下述中找到進一步的信息,Technology Brewing and Malting，，by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing,Berlin(VLB), 3rd completely updated edition,2004, ISBN3-921690-49-8)，這包括滅活內源性麥芽酶和加入到醪液或附加物中的任何外源性酶。然後冷卻經煮沸的麥芽汁，投入釀酒酵母並在通常為8-16°C範圍內的溫度下發酵以將可發酵糖轉化為乙醇。可通過選擇性去除醇的真空蒸發過程而從最終的啤酒產生低醇啤酒。在備選的實施方案中，本公開涉及使用包含如本文中所涉及的一種或多種葡糖澱粉酶(例如不耐熱的葡糖澱粉酶)的酶促組合物來提高麥芽汁中可發酵糖的量的方法，其中在麥芽汁被煮沸後將所述酶促組合物加入麥芽汁中，從而所述一種或多種葡糖澱粉酶在發酵步驟中是有活性的。可在將釀酒酵母投入麥芽汁中之前、與其同時地或在之後將酶促組合物加入經煮沸的麥芽汁中。在發酵和成熟步驟的最後，將啤酒(其可任選地經受真空蒸發以產生低醇啤酒)巴氏滅菌。此方法的內在優勢在於發酵過程的持續時間為約6-15 天(取決於投放比率，發酵，溫度等)，與短的澱粉糖化步驟的持續時間)相比，這允許有更多的時間來酶促剪切非可發酵糖。此方法的其它優勢在於實現所希望的非可發酵糖的減少(和可發酵糖的增加)所需的酶促組合物的量，與實現非可發酵糖的類似減少而將需要向醪液中加入的相比，其相應於顯著更低數目的酶促活性單位(例如葡糖澱粉酶活性的單位)。此外，其去除了當在醪液中加入高劑量比率的葡糖澱粉酶時，在麥芽汁分離(特別是通過過濾)過程中通常所見的困難。本公開還提供包含至少一種本公開所涵蓋的變體葡糖澱粉酶的動物飼料組合物或製劑。W003/049550(在此以其全部通過引用而併入)中提供了使用葡糖澱粉酶來生產包含澱粉的飼料的方法。簡要地，將葡糖澱粉酶變體與包含澱粉的飼料相混合。葡糖澱粉酶能夠降解抗性澱粉而供動物利用。在一些實施方案中，本文所描述的葡糖澱粉酶變體被用於基於澱粉原料而產生燃料的過程中。本公開的其它目的和優勢從本說明書來看是顯然的。根據本發明的其它實施方案1.相對於下述包含兩個或更多個胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途具有SEQ ID NO 2的518位至543位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的互聯環2』，和/或具有SEQ ID NO :2的21位至51 位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環1，和/或具有SEQ ID N0:2的 52位至68位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO 2的396位至420位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環11，和 /或具有SEQ ID NO :2的421位至434位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋12。2.葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體的晶體形式具有這樣的晶體結構在將等同的主鏈原子進行比對後，其主鏈原子的原子坐標與iTrGA的等同主鏈原子的原子坐標(如W02009/067218的表20中所定義的)的均方根偏差小於0. 13nm ；並且所述變體具有連接子區域、澱粉結合結構域以及催化結構域，所述變體相對於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列在澱粉結合結構域的互聯環2』 中，和/或催化結構域的螺旋12中、和/或環1中、和/或螺旋2中、和/或環11中包含兩個或更多個胺基酸取代。3.根據實施方案1-2中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是相對於下述的具有SEQ ID NO 2的518位至543位的胺基酸序列的互聯環 2，，和/或具有SEQ ID NO :2的21位至51位的胺基酸序列的環1，和/或具有SEQ ID NO: 2的52位至68位的胺基酸序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO 2的396位至420位的胺基酸序列的環11，和/或具有SEQ ID NO 2的421位至434位的胺基酸序列的螺旋12。4.根據實施方案1-3中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環1和/或螺旋2和/或環11和/或螺旋12中的至少一個胺基酸取代。5.根據實施方案1-4中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的1、2、3或4個胺基酸取代和環1和/或螺旋2和/或環11和 /或螺旋12中的1、2、3或4個胺基酸取代。6.根據實施方案1-5中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環1中的至少一個胺基酸取代。7.根據實施方案1-6中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和螺旋2中的至少一個胺基酸取代。8.根據實施方案1-7中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環11中的至少一個胺基酸取代。9.根據實施方案1-8中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和螺旋12中的至少一個胺基酸取代。10.根據實施方案1-9中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環1中的至少一個胺基酸取代以及螺旋2中的至少一個胺基酸取代。11.根據實施方案1-10中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體在互聯環2，的520-543、530-543或534-543位中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。12.根據實施方案1-11中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體在環1的30-50、35-48或40-46位的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。13.根據實施方案1-12中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體在螺旋2的50-66,55-64或58-63位的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。14.根據實施方案1-13中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體在環11的405-420、410-420或415-420位的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代， 所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。15.根據實施方案1-14中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體在螺旋12的421-434、425-434或428-434位的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。16.根據實施方案1-15中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶具有至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %或99. 5 %的序列同一性。17.根據實施方案1-16中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體與 SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8或9具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99.5%的序列同一性。18.根據實施方案1-17中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體具有澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :1、2、11、385、386、387、388、389或390的澱粉結合結構域具有至少96 %、97 %、98 %、99 %或99. 5 %的序列同一性。19.根據實施方案1-18中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體具有催化結構域，其與SEQ ID N0:l、2、3、5、6、7、8或9的催化結構域具有至少80%、 85%、90%、95%或99. 5%的序列同一性。20.根據實施方案1-19中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體與SEQ ID NO :2具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99. 5%的序列同一性。21.根據實施方案1-20中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述縮合產物為
異麥芽糖。22.根據實施方案1-21中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中澱粉的水解是在釀造過程中。23.根據實施方案1-22中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，所述葡糖澱粉酶顯示出可發酵糖的產生提高。24.根據實施方案1-23中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，所述葡糖澱粉酶顯示出釀造過程的澱粉糖化步驟中可發酵糖的產生提尚。25.根據實施方案I-M中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出釀造過程的發酵步驟中可發酵糖的產生提高。26.根據實施方案1-25中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述可發酵糖為
葡萄糖。27.根據實施方案146中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中澱粉的水解是在用於生產葡萄糖糖漿的過程中。
28.根據實施方案1-27中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，所述葡糖澱粉酶顯示出減少的異麥芽糖合成(IS)與澱粉水解活性 (SH)之比。29.根據實施方案1- 中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出降低的澱粉水解活性，其降低不超過5%、不超過 10%或不超過15%。30.根據實施方案1- 中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，葡糖澱粉酶顯示出提高的實際發酵度。31.根據實施方案1-30中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中與由黑麴黴 (AnGA) (SEQ ID NO 6)形成的縮合產物的量相比，所述葡糖澱粉酶在相當條件下形成的縮合產物的量更低。32.根據實施方案1-31中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶在相當的條件下形成的縮合產物的量與由黑麴黴(AnGA) (SEQ ID NO :6)形成的縮合產物的量基本上相同、為不超過5%更高、不超過8%更高或不超過10%更高。33.根據實施方案31-32中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中基於蛋白濃度的葡糖澱粉酶劑量是相同的。34.根據實施方案31-33中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中基於活性測定中的活性測量，葡糖澱粉酶的劑量是相同的。35.根據實施方案1-34中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，所述葡糖澱粉酶變體在539位具有胺基酸取代，在選自位置44、61、417和431的位置中具有一個或多個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。36.根據實施方案1-35中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，所述葡糖澱粉酶變體在539位具有胺基酸取代，且a)在44位具有胺基酸取代和/或b)在417和431位均具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。37.根據實施方案1-36中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，所述葡糖澱粉酶變體在539位具有胺基酸取代且在44位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID N0:2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。38.根據實施方案1-37中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，所述葡糖澱粉酶變體在539位具有胺基酸取代，且在417和431位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。39.根據實施方案1-38中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，所述葡糖澱粉酶變體在539位具有胺基酸取代且在44和61位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO 2 中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。40.根據實施方案1-39中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，所述葡糖澱粉酶變體在43位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。41.根據實施方案1-40中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，所述葡糖澱粉酶變體在61位具有胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。
42.根據實施方案1-41中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中539位的胺基酸取代是539R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。43.根據實施方案1-42中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中44位的胺基酸取代是44R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。44.根據實施方案1-43中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中417位的胺基酸取代是417R/V，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。45.根據實施方案1-44中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中417位的胺基酸取代是417R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。46.根據實施方案1-45中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中417位的胺基酸取代是417V，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。47.根據實施方案1-46中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中431位的胺基酸取代是431L，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。48.根據實施方案1-47中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中43位的胺基酸取代是43R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。49.根據實施方案1-48中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中61位的胺基酸取代是611，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。50.如實施方案1-49中的任一項中所定義的葡糖澱粉酶變體。51.包含兩個或更多個胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體，其中一個胺基酸取代在 539位且一個胺基酸取代在44位，所述位置相應於SEQ IDNO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置，且所述序列與親本葡糖澱粉酶序列具有至少80%的序列同一性，其中44 位的胺基酸取代不是44C。52.根據實施方案51的包含兩個或更多個胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體，其中一個胺基酸取代在539位且一個胺基酸取代為44R，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。53.根據實施方案51-52中任一項的葡糖澱粉酶變體，其在61位包含胺基酸取代， 所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。54.根據實施方案51-53中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶具有至少85 %、90 %、95 %、98 %或99. 5 %的序列同一性。55.根據實施方案51-M中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體與 SEQ ID NO :1、2、3、5、6、7、8 或 9 具有至少 85%、90%、95%、98%或 99. 5% 的序列同一性。56.根據實施方案51-55中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體與SEQ ID N0:2具有至少85%、90%、95%、98%或99.5%的序列同一性。57.根據實施方案51-56中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中539位的胺基酸取代是 539R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。58.根據實施方案51-57中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中44位的胺基酸取代是 44R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。59.根據實施方案51-58中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中61位的胺基酸取代是611，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。60.根據實施方案51-59中任一項的葡糖澱粉酶變體，其包含下列胺基酸取代a. D44R 和 A539R ；或b. D44R、N611 禾口 A539R，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。61.根據實施方案51-60中任一項的葡糖澱粉酶變體，其由SEQ ID NO 2組成且具有下列胺基酸取代a. D44R 和 A539R ；或b. D44R、N61I 和 A539R，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置。62.根據實施方案51-61中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體具有澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :1、2、11、385、386、387、388、389或390的澱粉結合結構域具有至少96 %、97 %、98 %、99 %或99. 5 %的序列同一性。63.根據實施方案51-62中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體具有催化結構域，其與SEQ ID NO :1、2、3、5、6、7、8或9的催化結構域具有至少80%、85%、 90%、95%或99. 5%的序列同一性。64.根據實施方案50-63中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述親本葡糖澱粉酶選自獲得自下列的葡糖澱粉酶木黴屬的種、麴黴屬的種、腐質黴屬的種、青黴屬的種、籃狀菌屬的種或裂殖酵母屬的種。65.根據實施方案50-64中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述親本葡糖澱粉酶獲得自木黴屬的種或麴黴屬的種。66.根據實施方案50-65中任一項的葡糖澱粉酶變體，與親本葡糖澱粉酶(例如 TrGA)相比，所述葡糖澱粉酶顯示出可發酵糖的生產提高。67.根據實施方案50-66中任一項的葡糖澱粉酶變體，與親本葡糖澱粉酶(例如 TrGA)相比所述葡糖澱粉酶顯示出釀造過程的澱粉糖化步驟中可發酵糖的生產提高。68.根據實施方案50-67中任一項的葡糖澱粉酶變體，與親本葡糖澱粉酶(例如 TrGA)相比所述葡糖澱粉酶顯示出釀造過程的發酵步驟中可發酵糖的生產提高。69.根據實施方案68的葡糖澱粉酶變體，其中所述可發酵糖為葡萄糖。70.根據實施方案50-69中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，所述葡糖澱粉酶顯示出減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)。71.根據實施方案50-70中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中與親本葡糖澱粉酶 (例如TrGA)相比，所述葡糖澱粉酶顯示出降低的澱粉水解活性，其降低不超過5%、不超過 10%或不超過15%。72.根據實施方案50-71中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中與親本葡糖澱粉酶(例如TrGA)相比，所述葡糖澱粉酶顯示出提高的實際發酵度。73.根據實施方案50-72中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中與由黑麴黴(AnGA)的葡糖澱粉酶(SEQ ID NO 6)形成的縮合產物的量相比，所述葡糖澱粉酶在相同條件下形成的縮合產物的量更低。
74.根據實施方案50-73中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶形成的縮合產物的量與相同條件下由黑麴黴(AnGA) (SEQ ID NO :6)形成的縮合產物的量基本上相同、為不超過5%更高、不超過8%更高或不超過10%更高。75.根據實施方案73-74中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中基於蛋白濃度的葡糖澱粉酶劑量相同。76.根據實施方案73-74中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中基於在活性測定中的活性測量，葡糖澱粉酶的劑量相同。77.根據實施方案50-76中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶是經純化的。78.多核苷酸，其編碼根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體。79.載體，其包含根據實施方案78的多核苷酸，或者能夠表達根據實施方案50_77 中任一項的葡糖澱粉酶變體。80.宿主細胞，其包含根據實施方案79的載體。81.宿主細胞，其中在其染色體中穩定整合了編碼根據實施方案50-80中任一項的變體葡糖澱粉酶的核酸。82.能夠表達根據實施方案50-76中任一項的葡糖澱粉酶變體的細胞。83.根據實施方案78-81中任一項的宿主細胞或根據實施方案81的細胞，其為細菌、真菌、或酵母細胞。84.根據實施方案83的宿主細胞，其為木黴屬的種，例如瑞氏木黴。85.根據實施方案83-84中任一項的宿主細胞，其為蛋白酶缺陷性和/或木聚糖酶缺陷性和/或天然葡聚糖酶缺陷性宿主細胞。86.表達葡糖澱粉酶變體的方法，所述方法包括獲得根據實施方案80-85中任一項的宿主細胞或細胞和從所述細胞或宿主細胞表達葡糖澱粉酶變體，以及任選地純化葡糖澱粉酶變體。87.根據實施方案86的方法，包括純化所述葡糖澱粉酶變體。88.根據實施方案50-76中任一項的葡糖澱粉酶變體用於製備酶促組合物的用途。89.酶促組合物，其包含至少一種根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體。90.根據實施方案89的酶促組合物，其包含至少一種根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述組合物選自澱粉水解組合物、糖化組合物、去汙劑、醇發酵酶促組合物和動物飼料。91.根據實施方案90的酶促組合物，其為澱粉水解組合物。92.根據實施方案89-91中任一項的酶促組合物，其包含至少一種選自下列的其它的酶澱粉酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶和其它葡糖澱粉酶。93.根據實施方案89-92中任一項的酶促組合物，其中所述至少一中其它的酶選自澱粉酶、支鏈澱粉酶和其它葡糖澱粉酶。94.根據實施方案89-93中任一項的酶促組合物，其中所述至少一種其它的酶選自澱粉酶和支鏈澱粉酶。95.根據實施方案89-94中任一項的酶促組合物，其中所述澱粉酶選自α -澱粉酶和異澱粉酶。96.將澱粉或經部分水解的澱粉轉化為含有葡萄糖的糖漿的方法，所述方法包括在至少一種根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體或根據實施方案89-95中任一項的酶促組合物的存在下糖化液體澱粉溶液。97.根據實施方案96的糖化液體澱粉溶液的方法，其包括利用根據實施方案 50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體或根據實施方案89-95中任一項的酶促組合物的酶促糖
化步驟。98.根據實施方案96-97中任一項的方法，還包括使所述液體澱粉溶液與至少一種其它的酶相接觸。99.根據實施方案98的方法，其中所述其它的酶選自澱粉酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶和葡糖澱粉酶。100.根據實施方案96-99的方法，其中所述其它的酶為澱粉酶和支鏈澱粉酶。101.根據實施方案96-100中任一實施方案的方法，其中所述澱粉酶選自α-澱粉酶和異澱粉酶。102.根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體在澱粉轉化過程、例如連續澱粉轉化過程中的用途。103.根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體在用於生產寡糖、麥芽糊精或葡萄糖糖漿的過程中的用途。104.根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體在用於生產高果糖玉米糖漿的過程中的用途。105.產生用於釀造的麥芽汁的方法，包括從谷形成醪液、和使所述醪液與根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體或根據實施方案89-95中任一項的酶促組合物接觸。106.實施方案105的方法，還包括使醪液與一種或多種其它的酶相接觸。107.根據實施方案106的方法，其中所述一種或多種酶選自澱粉酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶和葡糖澱粉酶。108.根據實施方案107的方法，其中所述一種或多種酶是澱粉酶和/或支鏈澱粉酶。109.根據實施方案107-108中的任一實施方案的方法，其中所述澱粉酶是α -澱粉酶和/或異澱粉酶。110.根據實施方案105-109中任一項的方法，其中所述谷包含一種或多種含麥芽的穀物、不含麥芽的穀物、附加物及其任意組合。111.根據實施方案105-110中任一項的方法，還包括發酵麥芽汁以獲得經發酵的飲料。112.根據實施方案105-111中任一項的方法，還包括發酵麥芽汁以獲得啤酒。
113.用於生產啤酒的方法，其包括a.製備醪液，b.過濾醪液以獲得麥芽汁，和c.發酵麥芽汁以獲得啤酒，其中將根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體加入步驟(a)和/或步驟(b)和/或步驟(C)。114.實施方案113的方法，其中使啤酒經受巴氏滅菌步驟。115.根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體用於提高釀造過程的發酵步驟或澱粉糖化步驟中的可發酵糖生產的用途。116.啤酒，其中所述啤酒是通過下列步驟產生的a.製備醪液，b.過濾所述醪液以獲得麥芽汁，c.發酵所述麥芽汁以獲得啤酒，和d.巴氏滅菌所述啤酒，其中將根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體加入步驟(a)和/或步驟(b)和/或步驟(C)。117.實施方案116的啤酒，其中經巴氏滅菌的啤酒被進一步表徵為a.基本上沒有葡糖澱粉酶活性；和/或b.低卡路裡啤酒和/或低醇啤酒。118.根據實施方案50-77中任一項的葡糖澱粉酶變體在醇發酵過程中的用途。119.用於鑑別與親本葡糖澱粉酶相比具有減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)的葡糖澱粉酶變體的篩選方法。120.用於鑑別下列葡糖澱粉酶變體的篩選方法，所述葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶相比，具有相同或增加的澱粉水解活性和減少的異麥芽糖合成，並具有減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)，其中所述異麥芽糖合成與親本葡糖澱粉酶相比減少不超過5%、不超過10%或不超過15%。121.用於鑑別澱粉水解過程中具有減少的縮合產物合成的葡糖澱粉酶變體的篩選方法，所述方法包括下列步驟測量異麥芽糖合成和葡糖澱粉酶變體的澱粉水解活性，以及選擇與親本葡糖澱粉酶相比具有降低的澱粉水解活性且與親本葡糖澱粉酶相比具有減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)的變體，所述澱粉水解活性與親本葡糖澱粉酶相比降低不超過5 %、不超過10 %或不超過15 %。122.根據實施方案119-121中任一項的方法獲得的葡糖澱粉酶變體。
實施例測定和方法下列測定和方法用於下文中所提供的實施例中。下面描述了用於提供變體的方法。然而，應注意的是可使用不同的方法來提供親本酶的變體且本發明不限於實施例中所使用的方法。所意欲的是可使用任何適合的手段來製造變體和選擇變體。用於96孔微量滴定板的pNPG葡糖澱粉酶活性測定
試劑溶液是=NaAc緩衝液200mM乙酸鈉緩衝液pH 4. 5 ；底物=NaAc緩衝液 (0. 3g/20ml)中的50mM ρ-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma N-1377)以及終止溶液 SOOmM甘氨酸-NaOH緩衝液pH 10。將30 μ 1經過濾的上清液置於新鮮的96孔平底微量滴定板(MTP)中。向每個孔中加入50 μ 1 NaAc緩衝液和120 μ 1底物並在50°C下孵育30分鐘(Thermolab systems iEMS Incubator/shaker HT)。通過力口入 100 μ 1 終止溶液而使反應終止。在 MTP-讀數儀(Molecular Devices Spectramax 384plus)中、在 405nm 處測量吸光度並使用0. 011 μ M/cm的摩爾消光係數來計算活性。熱穩定性測定1以150ppm純化的酶的儲存稀釋液(在50mM NaAc pH 4. 0中)，通過將6 μ 1加入 294 μ 1 50mM NaAc緩衝液(pH 4.5)中而製成3ppm的稀釋液。將經稀釋的樣品平等地分到2個MTP中。將一個MTP (初始板)在4°C下孵育Ihr而將另一個MTP (餘留板)在64°C 下(Thermolabsystems iEMS Incubator/Shaker HT)孵育 lhr。使所述餘留板在冰上冷卻 IOmin0將60 μ 1的初始板和餘留板二者加入120 μ 1 4%的可溶性玉米澱粉(pH 3. 7)並在 2個單獨的MTP 中於 32°C、900rpm下孵育 2hrs (Thermolabsystems iEMS Incubator/Shaker HT)。使用下文中描述的乙醇應用測定，在己糖激酶活性測定中測量兩個板的活性。將熱穩定性如下計算為％殘餘活性
JM4O餘留-空白 WA^3㈨初始-空白 °己糖激酶活性測定己糖激酶混合物在使用前10-15分鐘，將90ml水加入BoatIL容器葡萄糖HK Rl 中(IL測試葡萄糖(HK)試劑盒，Instrument Laboratory#182507-40)並輕柔混合。將 100 μ 1己糖激酶混合物加入85μ dH20中。將15 μ 1的樣品加入混合物中並在室溫下、在黑暗中孵育10分鐘。10分鐘後，在MTP讀數儀中、在340nm處讀取吸光度。根據葡萄糖 (0-1. 6mg/ml)標準曲線計算葡萄糖濃度。乙醇應用一從玉米澱粉釋放葡萄糖8%儲液在室溫下，將8g可溶性玉米澱粉(Sigma#S4180)懸浮於40ml dH20中。 在250ml搖瓶中，將漿料以部分加入50ml沸騰的dH20中並蒸煮5分鐘。在攪拌中使澱粉溶液冷卻至25°C並用剩餘的10ml dH20調節體積。終止溶液800mM甘氨酸-NaOH緩衝液，pH 10。4% (m/v)可溶性澱粉工作溶液用IOOmM乙酸鈉緩衝液(pH 4.0)稀釋(1 1)儲液。在平底96孔MTP中用四4 μ 1 50mM NaAc緩衝液(pH 4. 0)稀釋6 μ 1的150ppm純化的酶。將60 μ 1的此稀釋液加入120 μ 1 4%的可溶性玉米澱粉(pH 4.0)中，並在32°C、 900rpm(Thermolabsystems iEMS Incubator/Shaker HT)下鮮育 2hrs。通過力口入 90 μ 1 4°C -冷的終止溶液而使反應停止。將樣品置於冰上20分鐘。在10°C下、以IllSXg將澱粉離心(SIGMA 6K15) 5分鐘，並將15 μ 1上清液用於上文所描述的己糖激酶活性的測定中以確定葡萄糖含量。數據分析和計算乙醇篩選測定的性能指標
使用微流電泳設備(CaliperLife Sciences，Hopkinton，MA，USA)來測量蛋白水平。根據生產商的指導(LabChip(R)HT Protein Express,Ρ/Ν 760301)而製備微流晶片和蛋白質樣品。製備培養物上清液並在-20°C下存儲於96-孔微量滴定板中直至使用，使用時通過在37°C溫箱中溫熱30分鐘而使其融化。簡短搖動後，將2μ 1的每種培養物樣品轉移到 96 孔 PCR 板(Bi o-Rad, Hercules, CA, USA)中(其中含有 7 μ 1 樣品緩衝液(Caliper)), 隨後在恆溫控制的平板加熱器上將平板加熱至90°C 5分鐘。允許平板冷卻，然後向每個樣品中加入40μ1水。然後將所述平板與由生產商提供並校準的蛋白標準一起置於設備中。 當蛋白移動通過晶片中的焦點時，記錄螢光信號並通過相對於由經校準的蛋白標準組產生的信號對信號進行定量而測定蛋白濃度。在Caliper蛋白測定之後，以下述方式處理數據。就峰模式的正確性檢查校準階梯。如果與運行(rim)相關的校準階梯不足的話， 用鄰近運行的校準階梯替代它。對於峰的檢測，使用caliper軟體的整體峰尋找選擇的默認設置。在75kDA+/-10%下選擇目標峰。將結果輸出到電子數據表程序中並使峰區域與乙醇篩選測定中的相應活性(ABS340-空白測量)相關聯。以12個野生型樣品的面積和活性數字、使用程序Grafit Version 5(Erithacus Software, Horley, UK)的「酶動力學」方程與非線性匹配函數相結合而製成校準線。使用默認的設置來計算Km和Vmax參數。基於這兩個參數，製成米氏參考線並計算每種變體的比活性。基於所述比活性來計算性能指標(PI)。變體的PI是「變體-比活性/WT-比活性」 的商。WT的PI是1. 0而PI > 1. 0的變體所具有的比活性大於WT的比活性。TrGA變體的純化在一個步驟中，使用AKTA explorer 100 FPLC 系統(Amersham Biosciences, Piscataway,NJ)通過親和層析來純化經表達的TrGA變體的培養物上清液。將β -環糊精 (Sigma-Aldrich, Zwi jndrecht, TheNetherlands ；85. 608-8)與經環氧活化的瓊脂糖珠(GE Healthcare, Diegem, Belgium ； 17-0480-01)偶聯並將其用於純化。用25mM乙酸鈉緩衝液 (pH 4.3)平衡柱子，隨後應用經濃縮的酶樣品。用含有IOmMa-環糊精(Sigma，28705)的 25mM乙酸鈉緩衝液(pH 4. 3)從柱子上洗脫所結合的變體。使用十二烷基硫酸鈉_聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來分析經純化的樣品。純化的TrGA變體的蛋白定量使用AKTA explorer 100FPLC系統、通過陰離子交換色譜測定純化的TrGA變體的蛋白濃度。將經純化的樣品注射到ResourceQ_lml柱(GE Healthcare)上並施以0至500mM NaCl (在25mM乙酸鈉緩衝液pH4.3中)的線性梯度以洗脫所結合的蛋白。確定了峰區域並相對於濃度已知的TrGA標準來計算蛋白濃度。液化物測定在來自於當地乙醇生產者的玉米醪液液化物上、在6孔板中確定變體的葡萄糖釋放。用6g液化物(pH 4. 3)填充板的每個孔。隨後，加入300ppm酶和400ppm尿素，並在於32°C孵育2、4和6hr後收集250μ 1樣品。在14. 000 X g下將樣品離心5分鐘， 並將50 μ 1上清液轉移到含有50 μ 1殺傷溶液(1. IN硫酸)的印pendorf管中，允許其保持5分鐘。向所述管中加入250 μ 1水，然後用0. 22 μ m的過濾板過濾，並如下文所述注射到HPX-87H柱上。評價TrGA變體在乙醇發酵中的性能從當地乙醇生產者獲得了玉米醪液液化物樣品並在一些情形中使用酒糟水將其稀釋至26% DS。使用4N硫酸將漿料的pH調節至pH 4. 3。將IOOg或50g等份的醪液放入125ml搖瓶中並將其置於32°C溫箱中，且允許其平衡。加入100 μ 1 400ppm尿素後，向搖瓶中加入Iml所欲濃度的純化的變體或2種不同濃度的純化的TrGA。最後，向每個樣品中加入 333 μ 1 的 Red Star Red 酵母(15g，在 45ml DI 水中水合了 30 分鐘；Lesaffre yeast Corp. Milwaukee, WI)溶液。在 5、21、28、48 和 52 小時時收集樣品並使用 Aminex HPX-87H 柱(Bio-Rad)通過HPLC (Agilent 1200系列)進行分析。乙醇和碳水化合物確定用發酵罐啤酒填充aiil的印pendorf離心管並在冰上冷卻10分鐘。將樣品在 14. OOOXg下離心3分鐘，並將500 μ 1上清液轉移至含有50 μ 1殺傷溶液(1. IN硫酸)的測試管中，且允許其保持5分鐘。向測試管中加入5. Oml水然後過濾到0. 22 μ m過濾板 (multiscreen，Millipore，Amsterdam，荷蘭)中，且在 HPLC 上運行。柱溫度:60°C;運動相 0. OlN硫酸；流速0. 6ml/min ；檢測器RI ；注射體積20μ 1。柱子基於電荷和分子量而將分子分離；DPI (單糖)；DP2 ( 二糖)；DP3 (三糖)；DP > 3 (具有大於3的聚合度的寡糖)；琥珀酸；乳酸；甘油；甲醇；乙醇。確定GAU活性底物新鮮製備了 ρ-硝基苯基-β-麥芽糖苷(4mM)，以及熱穩定的β -葡糖苷酶 (5U/ml)(來自測定 R-AMGR 305/04 ；Megazyme International Wicklow，愛爾蘭)。緩衝液200mM乙酸鈉緩衝液(pH 4. 5)。在96孔板中、用乙酸鈉緩衝液將酶樣品稀釋至少10倍將20 μ L底物與20 μ L酶溶液相混合併在40°C下伴隨攪拌孵育10分鐘。加入300yL 2%的氨基丁三醇鹼以終止反應並顯色。相對於試劑空白而測量400nm處的吸光度。通過向20 μ L底物中加入300 μ L氨基丁三醇鹼溶液(2% )(伴隨劇烈攪拌)，隨後加入酶溶液(20 μ L)而製備空白。如下計算活性
權利要求
1.相對於下述包含兩個或更多個胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途具有SEQ ID NO 2的518位至543位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的互聯環2』，和/或具有SEQ ID NO :2的21位至51位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環1，和/或具有SEQ ID NO 2的52位至68位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO 2的396位至420位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的環11，和/或具有SEQ ID NO :2的421位至434位的胺基酸序列或親本葡糖澱粉酶中等同的殘基序列的螺旋12。
2.根據權利要求1的葡糖澱粉酶變體用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體的晶體形式具有這樣的晶體結構在將等同的主鏈原子進行比對後，其主鏈原子的原子坐標與TrGA的等同主鏈原子的原子坐標(如 W02009/067218的表20中所定義的)的均方根偏差小於0. 13nm ；並且所述變體具有連接子區域、澱粉結合結構域以及催化結構域，所述變體相對於親本葡糖澱粉酶的胺基酸序列在澱粉結合結構域的互聯環2』中，和/或催化結構域的螺旋12中、和/或環1中、和/或螺旋2中、和/或環11中包含兩個或更多個胺基酸取代。
3.根據權利要求1-2中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是相對於下述的具有SEQ ID NO 2的518位至543位的胺基酸序列的互聯環2』， 和/或具有SEQ ID NO :2的21位至51位的胺基酸序列的環1，和/或具有SEQ ID NO 2 的52位至68位的胺基酸序列的螺旋2，和/或具有SEQ ID NO 2的396位至420位的胺基酸序列的環11，和/或具有SEQ ID NO 2的421位至434位的胺基酸序列的螺旋12。
4.根據權利要求1-3中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環1和/或螺旋2和/或環11和/或螺旋 12中的至少一個胺基酸取代。
5.根據權利要求1-4中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的1、2、3或4個胺基酸取代和環1和/或螺旋2和/或環11和/或螺旋12中的1、2、3或4個胺基酸取代。
6.根據權利要求1-5中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環1中的至少一個胺基酸取代，和/或其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和螺旋2中的至少一個胺基酸取代，或其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環11中的至少一個胺基酸取代，或其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和螺旋12中的至少一個胺基酸取代，其中所述兩個或更多個胺基酸取代是互聯環2』中的至少一個胺基酸取代和環1中的至少一個胺基酸取代以及螺旋2中的至少一個胺基酸取代。
7.根據權利要求1-6中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，其中所述葡糖澱粉酶變體在互聯環2，的520443、530-543或534-543位中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於 SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置，和/或其中所述葡糖澱粉酶變體在環1的30-50、35-48或40-46位的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置，和/或其中所述葡糖澱粉酶變體在螺旋2的50-66,55-64或58-63位的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代， 所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置，和/或其中所述葡糖澱粉酶變體在環11的405-420、410-420或415-420位的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置， 和/或其中所述葡糖澱粉酶變體在螺旋12的421-434、425-434或428-434位的胺基酸序列中具有至少一個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。
8.根據權利要求1-7中任一項的葡糖澱粉酶變體的用途，所述葡糖澱粉酶變體在539 位具有胺基酸取代，在選自位置44、61、417和431的位置中具有一個或多個胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。
9.如權利要求1-8中任一項所定義的葡糖澱粉酶變體。
10.包含兩個或更多個胺基酸取代的葡糖澱粉酶變體，其中一個胺基酸取代在539位且一個胺基酸取代在44位，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置，且所述序列與親本葡糖澱粉酶序列具有至少80%的序列同一性，且其中44位的胺基酸取代不是44C。
11.根據權利要求9-10中的任一項的葡糖澱粉酶變體，其中一個胺基酸取代在539位且一個胺基酸取代為44R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。
12.根據權利要求9-11中任一項的葡糖澱粉酶變體，其在61位包含胺基酸取代，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。
13.根據權利要求9-12中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體與親本葡糖澱粉酶具有至少85 %、90 %、95 %、98 %或99. 5 %的序列同一性。
14.根據權利要求9-13中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體與SEQ ID NO :1、2、3、5、6、7、8 或 9 具有至少 85%,90%,95%,98%^； 99. 5%的序列同一性。
15.根據權利要求9-14中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體與SEQ ID NO 2具有至少85%、90%、95%、98%或99. 5%的序列同一性。
16.根據權利要求9-15中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中539位的胺基酸取代是 539R，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。
17.根據權利要求9-16中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中44位的胺基酸取代是44R， 所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。
18.根據權利要求9-17中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中61位的胺基酸取代是611， 所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。
19.根據權利要求9-18中任一項的葡糖澱粉酶變體，其包含下列胺基酸取代a.D44R 和 A539R ；或b.D44R、N61I 和 A539R，所述位置相應於SEQ ID NO :2中的各位置或親本葡糖澱粉酶中的等同位置。
20.根據權利要求9-19中任一項的葡糖澱粉酶變體，其由SEQIDNO :2組成且具有下列胺基酸取代a. D44R 和 A539R ；或b. D44R、N61I 和 A539R，所述位置相應於SEQ ID NO 2中的各位置。
21.根據權利要求9-20中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體具有澱粉結合結構域，其與SEQ ID NO :1、2、11、385、386、387、388、389或390的澱粉結合結構域具有至少96 %、97 %、98 %、99 %或99. 5 %的序列同一性。
22.根據權利要求9-21中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述葡糖澱粉酶變體具有催化結構域，其與SEQ ID而1、2、3、5、6、7、8或9的催化結構域具有至少80%、85%、90%、 95%或99. 5%的序列同一性。
23.根據權利要求9-22中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述親本葡糖澱粉酶選自獲得自下列的葡糖澱粉酶木黴屬(Trichoderma)的種、麴黴屬(Aspergillus)的種、腐質黴屬(Humicola)的種、青黴屬(Penicillium)的種、籃狀菌(Talaromycese)屬的種或裂殖酵母屬(Schizosaccharmyces)的禾中。
24.根據權利要求913中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述親本葡糖澱粉酶獲得自木黴屬的種或麴黴屬的種。
25.根據權利要求9-M中任一項的葡糖澱粉酶變體，與親本葡糖澱粉酶相比，所述葡糖澱粉酶顯示出可發酵糖的生產提高。
26.根據權利要求9-25中任一項的葡糖澱粉酶變體，與親本葡糖澱粉酶相比，所述葡糖澱粉酶顯示出釀造過程的澱粉糖化步驟中可發酵糖的生產提高。
27.根據權利要求916中任一項的葡糖澱粉酶變體，與親本葡糖澱粉酶相比，所述葡糖澱粉酶顯示出釀造過程的發酵步驟中可發酵糖的生產提高。
28.根據權利要求27的葡糖澱粉酶變體，其中所述可發酵糖為葡萄糖。
29.根據權利要求9- 中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中與親本葡糖澱粉酶相比，所述葡糖澱粉酶顯示出減少的異麥芽糖合成與澱粉水解活性之比(IS/SH比率)。
30.根據權利要求9- 中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中與親本葡糖澱粉酶例如TrGA 相比，所述葡糖澱粉酶顯示出降低的澱粉水解活性，所述澱粉水解活性降低不超過5%、不超過10%或不超過15%。
31.根據權利要求9-30中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中與親本葡糖澱粉酶例如TrGA 相比，所述葡糖澱粉酶顯示出提高的實際發酵度。
32.根據權利要求9-31中任一項的葡糖澱粉酶變體，所述葡糖澱粉酶是經純化的。
33.多核苷酸，其編碼根據權利要求9-32中任一項的葡糖澱粉酶變體。
34.載體，其包含根據權利要求33的多核苷酸，或者能夠表達根據權利要求9-32中任一項的葡糖澱粉酶變體。
35.宿主細胞，其包含根據權利要求34的載體。
36.宿主細胞，其中在染色體中穩定整合了編碼根據權利要求9-32中任一項的變體葡糖澱粉酶的核酸。
37.能夠表達根據權利要求9-32中任一項的葡糖澱粉酶變體的細胞。
38.根據權利要求35-36中任一項的宿主細胞或根據權利要求37的細胞，其為細菌、真菌、或酵母細胞。
39.根據權利要求38的宿主細胞，其為木黴屬的種，例如瑞氏木黴(Trichodermareseii)。
40.根據權利要求38-39中任一項的宿主細胞，其為蛋白酶缺陷性和/或木聚糖酶缺陷性和/或天然葡聚糖酶缺陷性宿主細胞。
41.表達葡糖澱粉酶變體的方法，所述方法包括獲得根據權利要求35-40中任一項的宿主細胞或細胞和從所述細胞或宿主細胞表達葡糖澱粉酶變體，以及任選地純化葡糖澱粉酶變體。
42.根據權利要求41的方法，包括純化所述葡糖澱粉酶變體。
43.根據權利要求9-32中任一項的葡糖澱粉酶變體用於製備酶促組合物的用途。
44.酶促組合物，其包含至少一種根據權利要求9-32中任一項的葡糖澱粉酶變體。
45.根據權利要求44的酶促組合物，其包含至少一種根據權利要求9-32中任一項的葡糖澱粉酶變體，其中所述組合物選自澱粉水解組合物、糖化組合物、去汙劑、醇發酵酶促組合物和動物飼料。
46.根據權利要求44-45中任一項的酶促組合物，其包含至少一種選自下列的其它的酶澱粉酶、支鏈澱粉酶和其它葡糖澱粉酶。為什麼刪除了所有其它的活性？
47.用於產生用於釀造的麥芽汁的方法，所述方法包括由谷形成醪液，以及使所述醪液與根據權利要求9-32中任一項的葡糖澱粉酶變體或根據權利要求44-46中任一項的酶促組合物接觸。
全文摘要
本發明涉及具有改變的特性的、親本葡糖澱粉酶的組合變體，其用於在澱粉水解的過程中減少縮合產物的合成。因此，親本葡糖澱粉酶的變體適合，例如在釀造和葡萄糖糖漿生產中使用。還公開了編碼所述變體的DNA構建體以及在宿主細胞中產生葡糖澱粉酶變體的方法。
文檔編號C12N9/34GK102575239SQ201080042420
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月18日 優先權日2009年8月19日
發明者C·W·弗洛曼, M·S·謝弗斯, P·E·狄格恩, R·波特, W·埃勒 申請人:丹尼斯科公司, 丹尼斯科美國公司