確定螢光標記的位置的方法
2023-10-21 04:16:57 2
專利名稱：確定螢光標記的位置的方法
技術領域：
本發明涉及確定在待研究的試樣中可用輻射激勵的標記的位置的方法，所述方法包括-在試樣中設置標記；-用第一輻射束照射試樣，作為照射的結果在試樣中形成激勵區，激勵區中的標記被激勵；-檢測標記響應激勵而發出的螢光輻射；以及-藉助第二輻射束阻止對部分激勵區中的螢光輻射的檢測。
本發明還涉及實施所述方法的裝置。
背景技術：
從美國專利文本No.6,259,104已知這種方法。
在生物學和組織學中，需要確定生物試樣中某些分子，例如蛋白質，抗體和核苷酸的位置，以便清楚了解在例如生物試樣中某些過程是在何處以及如何發生的。
螢光顯微鏡法(FM)是可以做到這一點的在生物學和組織學中通常採用的方法。為此，將所謂的螢光標記(以下簡稱為」標記」)附著到重要的分子上。這些標記的特點在於它們非常特別地將它們自已附著到例如某些類型的抗體上，而不附著到其它類型的抗體或其它分子上。而且，這些標記的特點在於它們響應激勵(例如光子激勵)而發出螢光輻射。
這樣，通過以下方法確定試樣中例如某種類型抗體的位置的可能性提高熬了將標記附著到這種類型的抗體上，隨後利用標記發出的螢光輻射來確定標記的位置。
應當指出，用於FM的標記可以分類為有機標記和無機標記。
有機標記通常包括芳族環。實例有FITC(異硫氰酸螢光素)，TRITC(四甲基異硫氰酸羅丹明)和DAPI(bisbenzimide)。許多類型的有機標記都有市售，每一種有其自身的附著特性。這種有機標記如今由例如Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregan，USA銷售。
這些有機標記的一個典型特性就是它們的壽命有限在光化學反應的影響下，這種標記的壽命限於例如105個發射的光子。這對於標記可被激勵的時間來說就很重要。這一點以下再作說明。此外，這些標記中的螢光作用會受環境的影響，例如它們所在的試樣中的酸度(pH)、溫度、溶劑的存在等等。
無機標記含有一種無機材料例如CdSe的納米晶體，其直徑從幾個納米到數十納米，這種納米晶體能顯示螢光。將這種納米晶體結合到有機反應基上，有機反應基將標記附著到待加標記的分子(例如蛋白質)上並且確定了標記的具體附著特性。這類無機標記如今由例如Biocrystal Ltd.，Westerville，Ohio，USA銷售。
無機標記的特點是比有機標記的壽命長得多且對環境影響的敏感性較低。
在傳統FM的情況下，標記利用光束(例如聚焦的雷射束)來照射其中存在螢光標記的試樣。在被照射區，即所謂激勵區中的標記因此被激勵，並對此激勵作出響應而發出螢光輻射通量。通過檢測是否對激勵作出響應而發出螢光輻射，就可以確定標記是否位於激勵區。這種方法中的空間解析度由光束焦點的大小確定。一般來說，所述焦點不會小於所採用的光的波長。所採用的波長不能自由選擇，因為只有在給定波段的波長內的光才會激勵某種類型的標記，結果，傳統FM的空間解析度限於大約500nm。
在FM的用戶中，希望繼續降低FM的空間解析度，最好降到分子等級，即幾個納米。
在所述專利文本中，說明了一種方法，相對於傳統FM而言可以提高解析度。
利用第一輻射束短時間地照射試樣，在試樣中形成激勵區，然後第二輻射束阻止對螢光輻射的檢測。第一輻射束是雷射束，具有適合於激勵標記的顏色。第二輻射束由一種或多種雷射束組成，具有將標記去激勵(「猝熄」)的某種不同(更紅些)的顏色。第一輻射束的強度分布應具有中心最大值，而第二輻射束的強度分布應顯示中心最小值。去激勵最好在激勵後數十微微秒內發生。
通過將激勵區的一部分中的標記去激勵，就可以阻止這些標記的螢光輻射通量被檢測，因而可以實現僅僅檢測一部分激勵區中的標記，於是得到較好的空間解析度。
發明內容
本發明旨在提供一種方法，通過這種方法可以利用上述美國專利文本所述的方法來獲得更好的空間解析度。
為此，按照本發明的方法的特徵在於-第二輻射束是在試樣上掃描的聚焦粒子束；-所述粒子束焦點的截面積小於激勵區的截面積；-粒子束中粒子的能量足以由於損壞的結果而降低被粒子衝擊的標記所發出的螢光輻射通量；-在通量降低了至少預定閾值的瞬間記錄下聚焦粒子束相對於試樣的位置。
對激勵作出響應，從試樣中發射出螢光輻射通量。所述通量是由位於激勵區中的一個或多個標記產生的。如果因激勵而產生的通量降低了至少預定的閾值，這必定是因為激勵區中的標記被破壞。
本發明基於以下概念，即，通過有意地造成對標記的破壞，通過測定輻射通量因破壞而降低的瞬間粒子束位於何處，來確定標記的位置。可以通過利用聚焦粒子束射擊標記來實現這種有意的破壞。
聚焦粒子束的產生是已知技術，並且在例如聚焦離子束(FIB)裝置、掃描電子顯微鏡(SEM)裝置和環境掃描電子顯微鏡(ESEM)裝置中都已採用。這些裝置可以將粒子束聚焦到試樣上，粒子束焦點的截面積例如為1nm，並可使所述射束在試樣上掃描。在這些類型的裝置中，粒子束中粒子能量一般可在從小於200eV到大於20keV的範圍內調節。所以，利用這些裝置就有可能產生其能量足以破壞標記的粒子。
應當指出，所需的破壞不僅會通過標記和聚焦粒子束中粒子的相互作用而發生，也會因標記與二次粒子(例如x射線光子和二次電子，系由相互作用區中的聚焦束所引發的)的相互作用而發生。結果，甚至在距聚焦束有一定距離處標記也可能被破壞，導致位置的測定不甚精確。電子顯微鏡領域的專業技術人員已知，通過適當選擇粒子的能量可將相互作用區的尺寸保持在足夠小的範圍內。
在按照本發明的方法的實施例中，激勵是通過光子束產生的。
通過用光子照射試樣，標記被激勵，隨後標記對激勵作出響應發射光子。這種照射可以用雷射束，也可以用具有寬帶頻譜的光束(「白光」)進行。
應當指出，使用白光對於同時檢測數種類型的標記特別有吸引力，因為各種標記不僅它們所附著的分子類型(例如抗體)不同，而且它們可被什麼顏色的光激勵，以及它們所發射的螢光輻射的顏色也都不同。如果試樣中有數種類型的標記，本發明的方法不僅能用來測定標記的位置，也可測定標記的類型。這是因為，當以下述方式實現用於檢測螢光輻射的檢測器時，即，對於每種顏色(或換句話說，每種類型的標記)，檢測器都能測定所述顏色(所述類型的標記)的螢光輻射通量的下降時，就有可能不僅測定標記的位置，也能測定其類型。
在本發明方法的另一實施例中，聚焦粒子束是聚焦電子束。
電子特別在使有機材料發生化學改變方面非常有效。在例如有機標記發生這種化學改變的情況下，標記就會被破壞而不再發射螢光輻射。
在本發明方法的又一實施例中，聚焦粒子束是離子束。
如專業技術人員已知，能量為數keV的離子具有去除它們所碰撞的材料表面的特性(濺射)。這種濺射發生在試樣上，也發生在位於試樣中的標記上。所以在使標記產生所需的破壞方面離子也非常有效。使用離子的一個附帶優點是原先位於試樣深處的標記會緩慢出現在試樣表面，隨後標記被破壞，其位置即可測定。這樣，就有可能對試樣中的標記進行三維位置測定。
在本發明方法的另一實施例中，在利用聚焦粒子束照射時引入氣體，以便能夠進行蝕刻。
將氣體與離子束或電子束結合使用以便從試樣中去除材料是一種已知技術。此技術應用於例如FIB裝置中。在利用聚焦粒子束照射試樣時使用此技術，在粒子束掃描試樣時試樣表面被蝕刻掉。於是，原先位於試樣深處的標記會緩慢出現在試樣表面，隨後標記被破壞，其位置即可測定。這樣，就有可能對試樣中的標記進行三維位置測定。
現將根據附圖對本發明作進一步說明，附圖中圖1示出用於執行本發明方法的裝置的示意圖；圖2A示意地示出在執行本方法時從試樣發射的螢光輻射通量的趨勢；以及圖2B示意地示出其中具有粒子檢測器和光檢測器所產生的信息的圖像。
具體實施例方式
圖1示出執行本發明方法的裝置的示意圖。粒子-光柱(particle-optical column)1，例如離子柱，產生帶電荷粒子的聚焦粒子束3。將粒子束3聚焦到位於試樣託架5上的試樣4上。藉助偏轉單元2使聚焦粒子束3掃描試樣4。
從試樣發射的帶電荷粒子(例如二次電子)由粒子檢測器8(例如Everhardt-Thornley檢測器)檢測。
聚焦粒子束3所需的真空這樣獲得，即，藉助密封裝置6將真空室7密封，然後用真空泵(未示出)將真空室抽空。
應當指出，如果是生物試樣，保持很小的水蒸汽剩餘壓力是有利的，可使試樣不會過於乾燥。此技術是一種已知技術，應用於例如ESEM(環境掃描電子顯微鏡)中。
氣體注入器9可以將蝕刻氣體引入真空室7，在聚焦粒子束3的作用下，可以從試樣上去除材料。
試樣託架5由透明材料例如玻璃構成。為了防止試樣4因聚焦粒子束3的照射而帶電，例如可以在玻璃上塗敷導電材料的透明塗層。
雷射器10產生光束11，光束11經過半透明鏡面12和透鏡13，並經過透明試樣託架5聚焦到試樣4上。聚焦粒子束3和光束11射到試樣上基本相同的位置14。從試樣4中標記發射的螢光輻射通過試樣託架5、透鏡13和半透明鏡面12由檢測器16檢測。為了防止因雷射器10而產生的散射光和反射光也被檢測，在半透明鏡面12和光檢測器16之間設置過濾器15，所述過濾器不允許具有雷射器顏色的光通過，但允許螢光輻射通過。為了儘可能多的檢測到試樣4發射的光，利用鏡面17將沿著離開檢測器16的方向發射的光反射到檢測器16上。
控制單元20發送控制信號到偏轉線圈2，藉助於偏轉線圈2使粒子束掃描試樣4。這樣粒子束的偏轉通常正比於提供到偏轉單元上的控制信號。
在某一瞬間從粒子檢測器發出的信號，是從粒子束3在所述瞬間正射到試樣上的那個位置發出的。現在使光柵中的粒子束3掃描試樣4，同時在監控器21上建立圖像22，其亮度正比於粒子檢測器8的信號，試樣4中被掃描區域的圖像22就在監控器21上可見。圖像的建立也由控制單元20完成。
此外，控制單元20控制雷射器10，從而接通或斷開光束。
控制單元20還接收來自光檢測器16的信號，並根據所述信號確定螢光輻射通量是否在顯著下降。此處」顯著」應理解為是指至少下降了預定閾值。在發生這種顯著下降的瞬間，粒子束3的位置已知，因為這個位置是經由掃描線圈2的驅動而受控的。控制單元20此時可以使一種指示(例如亮點或不同顏色的點)出現在屏幕21的相應位置上。
如果標記存在於射束掃描的區域中，那麼在掃描時這些標記就會受到粒子束的衝擊。結果，標記就會被破壞。
圖2A示意地示出從試樣發射的螢光輻射通量。在掃描開始時，即在T＝T0的瞬間，許多標記都發螢光，此處為6個標記。掃描時，這些標記分別被破壞。由於這種破壞的結果，通量下降。圖2A中示出在40-i瞬間的這種情況，其中i是第i個被破壞的標記。通過在發生這種通量變化的瞬間在圖像22中(圖像22顯示從粒子檢測器8發出的信號)顯示亮點或不同顏色的點，很容易看出標記位於試樣上的什麼地方。
應當指出，利用目前的計算機技術，也可以在圖像22中用另一種形式的符號，例如十字形、矩形等，來指示螢光標記的位置。
圖2B示意地示出具有粒子檢測器8和光檢測器16所產生的信息的圖像。
粒子檢測器8(Everhardt-Thornley檢測器)能夠產生圖像22，圖中產生不同數量二次粒子的區域用不同的亮度來成像(31，32)。在此圖像22中，還示出在粒子束的哪個位置30-i測到通量的顯著降低，或者換句話說，標記位於何處。這樣，就很容易看見標記位於試樣上的什麼地方。
應當指出，這樣的實施例是可能的，按照所些實施例，檢測器16能夠區別並分別處理不同標記發出的以不同螢光顏色為特點的光。
這樣，就有可能同時檢測不同類型的標記，而且例如在圖像22中使用不同顏色的亮點或符號，以便區分不同類型的標記。
還應當指出，如果標記停止發射光子的原因不是由於被帶電粒子束3所破壞，那麼，這會導致在不正確的位置顯示所述標記。這是因為光檢測器16會檢測到螢光輻射在下降，且控制單元20會在圖像22上在所述瞬間粒子束3所對應的位置上顯示所述標記，即使射束位置與所述位置上標記的存在毫無關係。
所以，極其不希望出現標記不是由於被粒子束3轟擊而停止發光的情況。
一些標記，特別是一些有機標記的壽命，例如被限制在發射105個光子。所以需要在標記發射105個光子的時間範圍內掃描整個激勵區。
應當指出，重要的是將激勵區和掃描區互相對中。當這兩個區域互相對中時，它們一般不會很快就偏心。所以這種對中可以作為定期調節進行。可以想出各種方式來確定這種對中。
一種可能的調節方法包括藉助粒子束和粒子檢測器將可滑動膜片上的孔成像，孔的直徑大致等於雷射束焦點的直徑。使膜片滑動，直到它與粒子束掃描的區域對準中心。隨後通過將雷射束導向膜片，並使雷射器有最大量的光通過小孔，這兩個區域就互相對準中心了。檢測通過的光量可以藉助例如真空室中的光檢測器(未示出)進行。
應當指出，雷射束11對試樣4的照射可以是連續照射，但也可由一系列脈衝組成。
還應當指出，雖然在實現本方法的圖示實施例中，粒子束3和光束11從相反方向射到試樣4上，但也可以這樣實現所述裝置，即，射束(3，11)從實際上同一方向射到試樣4上。對於比較厚的試樣，這樣做特別有利，因為激勵雷射束不能穿透整個試樣。
權利要求
1.一種確定在待研究的試樣中可以由輻射激勵的標記的位置的方法，所述方法包括-在所述試樣中設置標記；-用第一輻射束照射所述試樣，作為照射的結果在所述試樣中形成激勵區，在所述激勵區中的標記被激勵；-檢測響應所述激勵作從標記發出的螢光輻射；以及-藉助第二輻射束阻止檢測在部分所述激勵區中的螢光輻射，其特徵在於-所述第二輻射束是在所述試樣上掃描的聚焦粒子束；-所述粒子束的焦點的截面積小於所述激勵區的截面積；-所述粒子束中粒子的能量足以由於損壞的結果而降低被所述粒子衝擊的標記所發出的螢光輻射通量；-在所述通量降低了至少預定閾值的瞬間記錄下所述聚焦粒子束相對於所述試樣的位置。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述激勵區的截面積是所述粒子束的截面積的至少10倍。
3.如上述權利要求中的一項所述的方法，其中所述激勵是利用光子束髮生的。
4.如上述權利要求中的一項所述的方法，其中所述聚焦粒子束是聚焦電子束。
5.如權利要求1-3所述的方法，其中所述聚焦粒子束是聚焦離子束。
6.如上述權利要求中的一項所述的方法，其中利用所述聚焦粒子束照射時引入氣體，以便進行蝕刻。
7.一種配備成執行根據上述權利要求中的一項的方法的裝置，所處裝置包括-用於產生激勵標記的第一輻射束的裝置；-用於檢測從受激勵的標記發射的螢光輻射通量的檢測裝置；-用於產生第二輻射束的裝置；其特徵在於-用於產生所述第二輻射束的所述裝置產生聚焦粒子束，所述粒子束掃描所述試樣，以及-具有記錄裝置，以便根據先前確定的所述檢測的通量的下降來確定所述聚焦粒子束相對於所述試樣的位置。
全文摘要
本發明描述以高空間解析度確定試樣(4)中螢光標記的位置的方法。為此，用激勵光束(11)照射試樣(4)，同時用粒子束(3)掃描試樣(4)。掃描時，標記被粒子束(3)碰撞，並被破壞，這樣被碰撞的標記不再發出螢光輻射。這就導致螢光輻射通量下降。檢測這種下降。由於在標記被破壞的瞬間粒子束(3)相對於試樣的位置是已知的，因此也就可以知道試樣中標記的位置。
文檔編號G01N23/00GK1789982SQ200510124700
公開日2006年6月21日 申請日期2005年11月9日 優先權日2004年11月9日
發明者B·布伊斯塞, R·F·M·亨德裡克斯 申請人:Fei公司, 皇家飛利浦電子股份有限公司