一種篩選金黴素產生菌的新方法
2023-10-22 17:41:22 2
專利名稱：一種篩選金黴素產生菌的新方法
技術領域：
本發明屬於抗生素髮酵領域，涉及一種指示金黴素產生菌發酵液中金黴素含量高低的方法，特別是涉及一種通過簡單操作快速比較不同金黴素產生菌發酵液中金黴素含量相對高低的方法。
背景技術：
金黴素(Chlortetracycline)，又稱氯四環素，屬四環素類中衍生物的一種。化學名:6~ 甲基 ~4~ _■甲氣基 _3,6,10,12,12a-五輕基-1，11- _-氧代 ~7~ 氣-1,4,4a, 5, 5a, 6，11，12a-八氫-2-並四苯甲醯胺。分子量:478.8 ;分子式=C22H23ClN2O8。金黴素抗菌譜廣，對陽性菌、陰性菌、螺旋體、立克次氏體、支原體、衣原體、某些原蟲等均可產生抑制作用。金黴素的抗菌作用主要在於抑制細菌的生長，在其較高濃度時具有殺菌作用，其作用機制是幹擾蛋白質的合成。適用於雞白痢、傷寒、豬細菌性腸炎以及禽類副傷寒、霍亂等疾病。同時，作為理想的飼料添加劑它還具有預防 潛在感染、改善消化代謝、抑制腸道內有害微生物，促進有益微生物生長、提高飼料效能等。在全球範圍內，金黴素是所有飼料藥物添加劑中使用量最大的品種，是國際上重要的獸用抗生素之一。菌種是發酵的根本。每一發酵產品的生產水平跨越式提高都與菌種技術進步密不可分。為了提高金黴素發酵的工業生產水平，對金黴素工業產生菌進行選育，以期獲得高產、遺傳穩定的菌株，始終是金黴素研究工作中的一個熱點。而菌種篩選技術是獲得高產菌株的關鍵。要想得到優良的工業生產菌株，無法繞開大量煩瑣的菌株篩選工作。從當前生物技術產業來看，高產的工業生產菌種的獲得還是離不開包括自然選育、誘變育種和以原生質體融合為代表的雜交育種技術，篩選工作量大，費時費力。這是因為產量性狀受多基因決定，一次誘變和篩選很難有大幅度提高，需要多輪誘變篩選才能獲得穩定、高產的單菌落培養物(菌株)，每輪都有一個大量篩選過程，這一點不同於以發現化合物為目標的菌種篩選。因此，隨機篩選的盲目性特點就對篩選量提出了很高的要求。高通量菌種篩選是獲得高效菌種的必要手段。在傳統的金黴素產生菌的篩選中，為評價不同菌種產抗能力的高低，必須對不同菌種的發酵液效價進行測定，一般採用化學測定法。即利用金黴素在酸性溶液中經加熱後能脫去一分子水，生成黃色的脫水金黴素，其色度與含量呈正比。此性質符合郎伯一比耳定律，故可利用比色法來測定其效價。具體做法為金黴素發酵液經草酸酸化過濾後，吸ImL濾液於9mL蒸餾水中，分別吸取ImL稀釋濾液於2隻50mL裝有5mL的2mol/L鹽酸的容量瓶中，一隻用作對照，另一隻於沸水中煮沸5分鐘，冷卻後加水定容至刻度，搖勻後用分光光度儀(波長440nm)測定。這種方法工作量大，效率較低，實驗過程難以達到高通量篩選的要求。
發明內容
為了解決上面提到的金黴素發酵液的金黴素含量檢測中遇到的傳統化學法工作量大、效率低下的問題，本發明提供了一種有針對性的新型檢測方法，可以降低高通量菌種篩選過程中金黴素發酵液效價檢測的工作量，同時保證篩選結果的準確度，以較低的工作量達到同樣的工作目的。本發明的目的通過以下技術手段實現:在金黴素生產菌的菌種選育過程中，在菌株進行搖瓶發酵培養後的產抗生素能力比較時，不直接測定其化學效價，而是預先製備直徑3_的圓形濾紙片，蘸取發酵液的稀釋液，在管壁上浙幹，在預先製備的金黃色葡萄球菌雙碟上均勻放置，每皿可放4-6片，倒置培養。培養後可形成可見抑菌圈，然後使用專門的微生物自動測量分析儀測量不同菌株產生的抑菌圈的大小值，以該值大小作為判斷各個菌株產抗能力高低的依據。本發明的優點和有益效果為:1.這一措施的優點在於不必經過繁雜的處理過程，大為提高工作效率。2.這一發明在應用於高通量初篩時，不必測定準確的發酵液效價值，從抑菌圈的直徑大小來判定產抗水平的高低，直觀、便捷、有效。
附圖是用來提供對本發明的進一步理解，並且構成說明書的一部分，與下面的具體實施方式
一起用於解釋本發明，但並不構成對本發明的限制。在附圖中:圖1是本發明的篩選金黴素產生菌的一種實施方式的示意圖。
具體實施例方式本發明的目的是提供一種篩選金黴素產生菌的新方法，通過判斷金黴素產生菌的發酵液中金黴素含量高低來篩選菌種，具體包含以下步驟:(I)完成培養的搖瓶發酵液加入適量草酸，放到搖瓶機上振蕩酸化至pH在1.5-1.8 之間。(2)將酸化後的發酵液用濾紙過濾於乾燥試管內，適當稀釋。(3)用預先製備的直徑3mm的圓形濾紙片，蘸取以上稀釋液，在管壁上浙幹，保證無多餘液體。(4)將蘸取稀釋液的濾紙片在預先製備的金黃色葡萄球菌雙碟上均勻放置，每皿可放4-6片。(5)製備完成的雙碟在35°C條件下倒置培養。(6)培養後形成的抑菌圈平板，使用專用抑菌圈測量儀直接讀取抑菌圈大小值。(7)根據抑菌圈大小判斷該菌株產抗能力高低。下面結合具體實施例，對本發明的可行性和實際應用效果做進一步說明。實施例1:在本實施例中，以對所擬定方法進行模擬為主:(I)以金黴素標準品分別配製濃度為100 μ /mL和10 μ /mL的標準溶液。(2)用預先製備的直徑3mm的圓形濾紙片，分別蘸取以上標準溶液、純水，在管壁上浙幹，保證無多餘液體。 (3)將上述濾紙片及未蘸取任何液體的濾紙片在預先製備的金黃色葡萄球菌雙碟上均勻放置，共計4片。(4)製備完成的雙碟在35°C條件下倒置培養。(5)培養後形成抑菌圈平板。所形成抑菌圈平板的典型效果如圖1所示。由圖1可以看出，蘸取不同濃度的金黴素溶液的濾紙片可以形成大小明顯不同的抑菌圈，不含金黴素的濾紙片則不會形成抑菌圈。實施例2:在本實施例中，以對所擬定方法進行驗證為主:(I)選取生長狀態不同的菌株的發酵液，分別加入適量草酸，放到搖瓶機上振蕩酸化至pH在1.5-1.8之間。(2)將酸化後的發酵液用濾紙過濾於乾燥試管內，等比例稀釋。(3)用預先製備的直徑3_的圓形濾紙片，分別蘸取各稀釋液，在管壁上浙幹，保證無多餘液體。(4)將上述濾紙片在預先製備的金黃色葡萄球菌雙碟上均勻放置，每皿4片。(5)製備完成的雙碟在35°C條件下倒置培養。
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(6)培養後形成的抑菌圈平板，使用專用抑菌圈測量儀直接讀取抑菌圈大小值。(7)根據抑菌圈大小判斷該菌`株產抗能力高低，並採用傳統的化學效價法進行結果比對。通過上述方法對幾株差異化的金黴素產生菌進行產抗能力測定，結果如表一所示，
權利要求
1.一種篩選金黴素產生菌的新方法，應用於金黴素生產菌的菌種選育過程中，其特徵在於:在菌株進行搖瓶發酵培養後的產抗生素能力比較時，用圓形濾紙片，蘸取發酵液的稀釋液，在預先製備的金黃色葡萄球菌雙碟上均勻放置，倒置培養，培養後可形成可見抑菌圈，以抑菌圈大小作為判斷各個菌株產抗能力高低的依據。
2.根據權利要求1所述的一種篩選金黴素產生菌的新方法，其特徵在於:用預先製備的直徑3mm的圓形濾紙片，蘸取預先製備的稀釋液，在管壁上浙幹，保證無多餘液體。
3.根據權利要求1所述的一種篩選金黴素產生菌的新方法，其特徵在於:將蘸取稀釋液的濾紙片在預先製備的金黃色葡萄球菌雙碟上均勻放置，每皿可放4-6片。
4.根據權利要求1所述的一種篩選金黴素產生菌的新方法，其特徵在於:培養後形成的抑菌圈平板，使用專用抑菌圈測量儀直接讀取抑菌圈大小值，並以此值作為判斷該菌株產抗能力高低的標準。
全文摘要
本發明涉及一種篩選金黴素產生菌的新方法，包括(1)將金黴素產生菌發酵液處理後稀釋，用預先製備的直徑3mm的圓形濾紙片，蘸取預先製備的稀釋液；(2)將蘸取稀釋液的濾紙片在預先製備的金黃色葡萄球菌雙碟上均勻放置，每皿可放4-6片；(3)培養後形成的抑菌圈平板，使用專用抑菌圈測量儀直接讀取抑菌圈大小值，並以此值作為判斷該菌株產抗能力高低的標準。本發明通過上述措施的採用，代替了傳統的化學效價法，優點在於省去繁雜的處理過程，大為提高篩選效率；尤其在高通量初篩時，不必測定準確的發酵液效價值，從抑菌圈的直徑大小來判定產抗水平的高低，直觀、便捷、有效。
文檔編號C12R1/445GK103074412SQ20121029926
公開日2013年5月1日 申請日期2012年8月22日 優先權日2012年8月22日
發明者李書至, 李冰, 朱曉麗, 張雪崢 申請人:駐馬店華中正大有限公司