長效胰島素衍生物及其方法

2023-10-22 11:54:42

專利名稱：長效胰島素衍生物及其方法
技術領域：
本發明涉及長效胰島素衍生物。更具體地，所述胰島素衍生物包括胰島素分子和與其連接的活性基團，活性基團用於與血液成分共價結合從而產生長效胰島素衍生物。
(b)背景技術胰島素為重要的內分泌激素，其結合於細胞表面受體，引起事件的級聯，最終從血液吸收葡萄糖。胰島素水平變差導致嚴重的病症如I型和II型糖尿病。I型糖尿病為危急生命的疾病，患者必須每天自我給藥多劑量胰島素以維持生存。II型糖尿病也是嚴重的醫學疾病，由於患者形成的對胰島素內源性水平的耐受性而使胰島素的內源性水平不再能保持恰當的血糖水平。為了減少長期後果的發作，在生活方式改變失敗之後或當常規的血糖控制藥物無效時，用胰島素治療變得必要。
控制血糖病症的成功性與要治療的患者的順從性高度相關，並且期望降低所需的注射頻率。為此，非常期望有新型的長效胰島素衍生物。

發明內容
根據本發明，提供了胰島素衍生物，其包括胰島素分子和用於與血液成分共價結合的活性基團。
在本發明的優選實施方案中，胰島素分子為式I
並且活性基團與胰島素分子的胺基酸在選自位置Gly A1、Phe B1和Lys B29的位置連接。
在本發明的優選實施方案中，活性基團選自麥可(Michael)受體(α，β不飽和羰基部分)含琥珀醯亞胺基的基團和含馬來醯亞胺基的基團的組中，更優選MPA(3-馬來醯亞胺基丙酸)。
在本發明的優選實施方案中，活性基團通過連接體(linker)與胰島素分子的胺基酸連接，所述連接體例如但不限於(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、乙二胺(EDA)、氨基乙氧基乙氧基琥珀酸(AEES)、AEES-AEES、2-[2-(2-氨基)乙氧基]]乙氧基乙酸(AEEA)、AEEA-AEEA、-NH2-(CH2)n-COOH(其中n為1到20的整數)、和其中可以包括氧、氮、或硫原子的烷基鏈(C1-C10)飽和或不飽和基元(motif)，例如但不限於甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(OA)和4-氨基苯甲酸(APhA)、及其組合。
在本發明的優選實施方案中，血液成分為血液蛋白，更優選為血清白蛋白。
根據本發明，提供了胰島素結合物(conjugate)，其包括本發明的胰島素衍生物和血液成分，其中活性基團和血液成分通過在所述活性基團與所述血液成分之間形成的共價鍵結合。這種結合物在體內或體外形成。
根據本發明，提供了藥學組合物，其包括與可藥用載體結合的本發明的胰島素衍生物。
根據本發明，提供了藥學組合物，其包括與可藥用載體結合的本發明的胰島素結合物。
根據本發明，提供治療患有與血糖有關的疾病或病症的主體中的所述與血糖有關的疾病或病症的方法，其包括對主體給用本發明的胰島素衍生物、本發明的結合物和本發明的藥物組合物中的至少一種。
本文中的所有參考文獻都被併入本文作為參考。


圖1說明來源於天然人胰島素的實施例I到實施例VIII；圖2說明胰島素、胰島素衍生物、和胰島素衍生物的結合物對wistar大鼠的肝細胞膜(liver membrane)的競爭性結合；圖3說明胰島素、胰島素衍生物、和胰島素衍生物的結合物對wistar大鼠的肝細胞膜的競爭性結合；圖4A、4B、4C、5A、5B、6A、6B表示3T3 L1脂肪細胞分化階段的不同時期；圖7說明胰島素、實施例III和IV及其相應的結合物在3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖轉運；圖8說明胰島素、實施例III和VI及其相應結合物在附睪脂肪細胞中從wistar大鼠脂肪細胞的葡萄糖轉運；圖9說明用3.6mg/kg胰島素處理的動物中Δ血糖隨時間變化的函數；圖10說明在用3.6mg/kg的實施例I、II和III的胰島素衍生物處理的動物中Δ血糖隨時間變化的函數；圖11說明在用17.9mg/kg的實施例I、II和III的胰島素衍生物處理的動物中Δ血糖隨時間變化的函數；圖12說明在用3.6mg/kg的胰島素、3.6mg/kg的實施例I的胰島素衍生物和17.9mg/kg的實施例I的胰島素衍生物處理的動物中Δ血糖隨時間變化的函數；圖13說明用3.6mg/kg的胰島素、3.6mg/kg的實施例II的胰島素衍生物和17.9mg/kg的實施例II的胰島素衍生物處理的動物中Δ血糖隨時間變化的函數；圖14說明用3.6mg/kg的胰島素、3.6mg/kg的實施例III的胰島素衍生物和17.9mg/kg的實施例III的胰島素衍生物處理的動物中Δ血糖隨時間變化的函數；圖15說明皮下注射和靜脈內注射天然胰島素的藥代動力學曲線；圖16說明皮下注射和靜脈內注射實施例III的結合物的藥代動力學曲線；圖17說明皮下注射和靜脈內注射實施例III的藥代動力學曲線；圖18說明皮下注射胰島素、實施例III和實施例III的結合物的藥代動力學曲線比較；圖19說明靜脈內注射胰島素、實施例III和實施例III的結合物的藥代動力學曲線比較；圖20說明在鏈脲黴素誘導的糖尿病大鼠中皮下注射胰島素、實施例I到IV和介質後的藥效曲線比較；圖21說明在鏈脲黴素誘導的糖尿病大鼠中皮下注射胰島素、實施例I到IV的結合物和介質後的藥效曲線比較；圖22說明重複皮下注射實施例III(第一天、第六天、第十二天、和對照)的藥效曲線比較；和圖23說明重複皮下注射實施例III的結合物(第一天、第六天、第十二天、和對照)的藥效曲線比較。
發明詳述本發明提供長效胰島素衍生物。更具體地，胰島素衍生物包括胰島素分子和與其連接的活性基團，所述活性基團用於與血液成分共價結合。在本申請中，共價結合是指在給用本發明的胰島素衍生物時在體內形成結合物胰島素-活性基團-血液成分。還是指通過使本發明的胰島素衍生物與白蛋白源接觸在體外發生共價結合，白蛋白源可為重組白蛋白，或從主體血漿提取、或通過本領域技術人員已知的任何其它適當的來源提供。
胰島素分子可為天然人胰島素(參見以下式I所示的天然人胰島素的序列)或其類似物如具有胺基酸取代、胺基酸刪除、或胺基酸加入的胰島素分子。以下列舉的是可用於本發明中的胰島素類似物的例子，其不以任何方式限制本發明的類似物得自Aventis Pharmaceuticals Inc.的稱為Lantus的胰島素glargine，其在位置A21被甘氨酸取代和在鏈B的C末端加入兩個精氨酸殘基；得自Novo Nordisk A/S的稱為Levemir的胰島素detemir，其為天然人胰島素，其中位置B30的蘇氨酸被刪除，和在賴氨酸B29的側鏈上加入十四烷醯基；得自EliLilly的稱為Humalog的胰島素lispro，其為Lys B28、Pro B29的人胰島素；得自Novo Nordisk A/S的稱為NovoLog的胰島素aspart，其為Asp B28人胰島素；和得自Aventis的稱為Apidra的胰島素glulisine，其為Lys B3、Glu B29的人胰島素。
活性基團可與胰島素分子或其類似物上的不同官能度連接。優選地，活性基團與胰島素分子可獲得的氨基連接，如鏈A和B的N-末端胺基酸的α-氨基，或Lys B29的ε-氨基。根據本發明，包含取代的和/或加入的胺基酸的胰島素類似物可包含另外的氨基用於連接活性基團；或包含其它適合於與活性基團連接的官能度。能夠在體內或體外與血液成分共價結合的優選活性基團為麥可受體(α，β不飽和羰基部分)含琥珀醯亞胺基的基團和含馬來醯亞胺基的基團。更優選的活性基團為含馬來醯亞胺基的基團，更優選為MPA(3-馬來醯亞胺基丙酸)。
選擇性地，活性基團選擇性地通過連接體連接於胰島素分子。優選連接體選自下組中羥乙基基元，如(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、乙二胺(EDA)、氨基乙氧基乙氧基琥珀酸(AEES)、2-[2-(2-氨基)乙氧基]]乙氧基乙酸(AEEA)、AEEA-AEEA、-NH2-(CH2)n-COOH(其中n為1到20的整數)；一種或多種其中可包括氧、氮、或硫原子的飽和或不飽和烷基鏈(C1-C10)基元，如甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(OA)、4-氨基苯甲酸(APhA)。連接體的組合的例子包括但不限於AEEA-EDA、AEEA-AEEA、AEA-AEEA、AEES-AEES等。優選的連接體為8-氨基辛酸(AOA)或沒有連接體而使用活性基團MPA連接。本領域技術人員應該容易地知道何種類型的連接體適合於本發明的目的。
本發明還涉及胰島素結合物。該結合物包括胰島素衍生物，其中胰島素衍生物的活性基團已經在體內或體外與血液成分反應形成共價鍵。因此，可通過給用胰島素衍生物在體內形成結合物，或通過使胰島素衍生物與血液溶液或純化的血液成分在允許形成共價鍵的條件下在體外形成結合物。可通過自血液樣品提取和純化提供、或通過重組技術生產純化的血液成分。優選的血液成分為血液蛋白，更優選血清白蛋白。
本發明另外涉及治療與血糖相關的疾病或病症的方法，該方法包括給用胰島素衍生物或胰島素結合物。與血糖相關的疾病或病症包括I型和II型糖尿病、以及妊娠糖尿病。另外，還可以通過給用本發明的胰島素衍生物或胰島素結合物治療囊性纖維化、多囊卵巢綜合症、胰腺炎和其它與胰腺有關的疾病。胰島素又已知為生長因子，因此本發明的胰島素衍生物或胰島素結合物可用於局部給藥用於創傷癒合和其它相關的適應症。
以下實施例只是用於進一步說明上述的本發明，其不是用於限制本發明的範圍。
實施例圖1說明與以下實施例一起提到的胰島素分子和Gly A1、Phe B1和Lys B29位置。
實施例I(Gly A1)-MPA-胰島素的合成將胰島素(100mg)溶解於DMF(二甲基甲醯胺)(2mL)和TFA(100μL)中。向該溶液中加入NMM(4-甲基嗎啉，200μL)和MPA-OSu(N-琥珀醯亞胺基3-馬來醯亞胺基丙酸酯，9.2mg，2.5當量)並攪拌反應2小時。通過加入水猝滅反應並用AcOH(乙酸)調節到pH4。加入乙腈溶解沉澱物，並且水/乙腈(3∶1)的總體積為2mL。將溶液注射到半製備HPLC中。Phenomenex Luna 10 m phenyl-hexyl 21 mm X 250mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶劑A)和TFA的乙腈溶液(乙腈中的0.1％TFA，溶劑B)平衡。通過以9.5mL/min在120分鐘內從27到31％B梯度洗脫。通過214和254nm的UV吸光度檢測含肽級分。以9.5mL等分收集級分。通過直接注射到LC/MS上後的質量檢測鑑定含所需產物數據的級分。收集Rt＝36-46分鐘的純級分，合併並凍幹，得到白色粉末(40mg)，以及23mg回收的胰島素。
計算的質量為5958.5g/mol，通過LC-MS測量的質量為5958.0g/mol。
表1表示為了證實A-鏈N末端被封端和B鏈N末端(苯丙氨酸)仍然游離而進行的胺基酸序列分析(使用異硫氰酸苯酯的Edman降解法)。
表1

表1表示通過實施例I到IV的Edman降解法進行結構說明實施例II(Phe B1)-MPA-胰島素的合成用超聲處理將胰島素(100mg)溶解於DMSO(二甲基亞碸)(4mL)和Et3N(三乙胺)(100μL)中。向該溶液中加入Boc2O(二碳酸二叔丁酯)(9.3mg，2.5當量)並在環境溫度下攪拌30分鐘。通過加入水(15mL)和乙腈(5mL)猝滅反應並用AcOH調節溶液到pH4。將溶液注射到半製備HPLC中。Phenomenex Luna 10 m phenyl-hexyl 21 mm X 250 mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶劑A)和TFA的乙腈溶液(乙腈中的0.1％TFA，溶劑B)平衡。通過以9.5mL/min在120分鐘內從27到40％B梯度洗脫。通過214和254nm的UV吸光度檢測含肽級分。以9.5mL等分收集級分。通過直接注射到LC/MS上之後的質量檢測鑑定含所需產物數據的級分。分離三個產物(Boc-胰島素、Gly A1Lys B29-雙Boc-胰島素和三Boc-胰島素)，將所需的(GIyA1 Lys B29)-雙Boc-胰島素的級分合併並凍幹，得到白色粉末(72mg)。
使DMF(3mL)中的(Gly A1 Lys B29)-雙Boc-胰島素(51mg)與MPA-OSu(36mg)在Et3N(30μL)的存在下反應。在環境溫度下攪拌反應2小時。在真空下蒸發DMF。將殘餘物用TFA(2mL)處理10分鐘，然後將TFA蒸發。將粗產物溶解於水/乙腈(3∶1)中並將溶液注射到半製備HPLC中。Phenomenex Luna 10 m phenyl-hexyl 21 mm X 250 mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶劑A)和TFA的乙腈溶液(CH3CN中的0.1％TFA，溶劑B)平衡。通過以9.5mL/min在120分鐘內從27到32％B梯度洗脫。通過214和254nm的UV吸光度檢測含肽級分。以9.5mL等分收集級分。通過直接注射到LC/MS上之後的質量檢測鑑定含所需產物數據的級分。將純級分合併並凍幹，得到白色粉末(29mg)。
計算的質量為5958.5g/mol，通過LC-MS測量的質量為5958.4g/mol。
使用胺基酸序列分析(使用異硫氰酸苯酯的Edman降解法)證實B-鏈N末端被封端和A鏈N末端(甘氨酸)仍然為游離的(參見表1)。
實施例III(B1)-MPA-OA-胰島素的合成使DMF(3mL)和Et3N(30μL)中的(Gly A1 Lys B29)-雙Boc-胰島素(39mg)與MPA-OA-OSu([N-琥珀醯亞胺基8-N-(3-馬來醯亞胺基丙醯基)氨基辛酸酯]25mg)反應4小時。蒸發DMF並用TFA處理殘餘物10分鐘。在蒸發TFA之後，將殘餘物溶解於水/乙腈(1∶3)中。將溶液注射到半製備HPLC中。Phenomenex Luna 10 mphenyl-hexyl 21 mm X250mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶劑A)和TFA的乙腈溶液(乙腈中的0.1％TFA，溶劑B)平衡。通過以9.5mL/min在120分鐘內從27到36％B梯度洗脫通過214和254nm的UV吸光度檢測含肽的級分。以9.5mL等分收集級分。通過直接注射到LC/MS上之後的質量檢測鑑定含所需產物數據的級分。將純級分合併並凍幹，得到白色粉末(21mg)。
計算的質量為6099.5g/mol，通過LC-MS測量的質量為6099.6g/mol。
實施例IV(Lys B29)-MPA-胰島素的合成將胰島素(74mg)溶解於DMSO(2mL)和乙酸(46μL)中。向該溶液中加入Boc2O(6.9mg，2.5當量)並在室溫下攪拌反應5小時。加入水(15mL)和乙腈(5mL)並將溶液注射到半製備HPLC柱(C18phenyl-hexyl)中，在120分鐘內以9.5mL/min的流速和27-40％的梯度洗脫。將43分鐘的級分合併並凍幹，得到(Gly A1 Phe B1)-Boc2-胰島素(30mg)。
使DMF(2mL)和NMM(4-甲基嗎啉，100μL)中的(Gly A1 PheB1)-Boc2-胰島素(30mg)與MPA-OSu(10mg)反應60分鐘。蒸發DMF並用TFA處理殘餘物10分鐘。將殘餘物溶解於水/乙腈(3∶1)中並將溶液注射到半製備HPLC中。Phenomenex Luna 10 mphenyl-hexyl 21 mm X250mm柱，用TFA水溶液(H2O中的0.1％TFA，溶劑A)和TFA的乙腈溶液(乙腈中的0.1％TFA，溶劑B)平衡。通過以9.5mL/min在120分鐘內從27到32％B的梯度進行洗脫。通過214和254nm的UV吸光度檢測含肽級分。以9.5mL等分收集級分。通過直接注射到LC/MS上之後的質量檢測鑑定含所需產物數據的級分。將純級分合併並凍幹，得到白色粉末(22.2mg)。
計算的質量為5958.5g/mol，通過LC-MS調整的質量為5958.0g/mol。
使用胺基酸序列分析(使用異硫氰酸苯酯的Edman降解法)證實B-鏈(苯丙氨酸)和A鏈(甘氨酸)的N-末端都是游離的(參見表1)。
實施例VMPA-(AEES)2-COOH連接體的合成使用Biotage「40i急驟層析」模塊化系統進行急驟柱色譜法。在Waters「Breeze」系統1500系列上進行半製備HPLC純化，使用Phenomexluna(RP-18，10 u phenyl-hexyl 250×21.2mm)柱，流動相流速為9.5mL/min。使用Gilson 690系統進行製備級的純化，使用Phenomexluna(RP-18，10 u phenyl-hexyl 250×50.0mm)柱，流動相流速為50mL/分鐘。使用Gilson 690系統用於製備規模的純化，使用Phenomexluna(RP-18，10 uphenyl-hexyl 250×50.0mm)柱，流動相流速為50mL/min。使用乙腈(CH3CN)(含0.1％TFA)在水(含0.1％TFA)中梯度洗脫，更多細節在每個化合物的合成過程中指出。使用具有ES1電噴射源的Agilent 1100系列LC-MSD單四極質譜儀進行LC-MS。
MPA-(AEES)2-COOH連接體的合成
實施例VI(Phe B1)-MPA-(AEES)2-胰島素的合成使甲醇(150mL)中的2-(2-氨基乙氧基)乙醇(50.0g)與Boc2O(93.4g)反應30分鐘。在真空中蒸發甲醇並將殘餘物溶解在乙酸乙酯中，用水、鹽水洗並用硫酸鈉乾燥。在蒸發溶劑之後，粗產物用於下一步。MS m/z 205。
在Et3N(66mL)的存在下將保護的醇溶解於N，N-二甲基甲醯胺(500mL)中。在0下在30分鐘內滴加MsCl(甲磺醯氯)(33.4mL)，然後在環境溫度下攪拌1小時。然後向反應混合物中加入NaN3(127.6g)，隨後加入NMM(N-甲基嗎啉，215mL)並在40-50攪拌反應16小時。將反應混合物傾入到乙酸乙酯(2L)中並用水洗。將水層用乙酸乙酯(2L)反萃取並將合併的乙酸乙酯層用水、鹽水洗並乾燥。在蒸發溶劑之後，粗產物用於下一步(101.4g，含一些DMF)。MS m/z 231。
將粗產物(62.4g)溶解於甲醇(300mL)中，隨後加入Pd(OAc)2(3.0g)和甲酸(96％，62g)。在反應完成之後，通過硅藻土過濾除去Pd物質。真空除去甲醇並在真空下進一步乾燥。粗產物用於下一步。
將粗產物溶解於二氯甲烷中並用Et3N中和，直到為鹼性的。一次性加入琥珀酸酐(32.3g)。反應在環境溫度下攪拌1小時。真空除去溶劑並通過1N的HCl將殘餘物酸化到pH3。用乙酸乙酯萃取產物。使乙酸乙酯層通過矽膠短柱(1kg)。然後矽膠用含2-4％甲醇的乙酸乙酯洗。將純級分(通過薄層色譜法判斷)合併並真空除去溶劑，得到Boc-AEES，為油狀殘餘物(36g，44％)。MS m/z 305。
將Boc-AEES(5.5g)用二氯甲烷(30mL)中的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS，4.57g)和乙基-(二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，7.62g)處理2小時。將NHS酯傾入到乙酸乙酯(500mL)中，用0.1N HCl洗並用硫酸鈉乾燥。真空除去溶劑並將殘餘物直接用於下一步。
將Boc-AEES(6.05g)用三氟乙酸(TFA，10mL)處理10分鐘。真空除去TFA並真空下進一步乾燥。將(AEES)胺基酸溶解於N，N-二甲基甲醯胺(20mL)中並用過量的NMM鹼化。然後加入得自實施例V的粗產物並將反應在環境溫度下攪拌1小時。減壓蒸發溶劑並將殘餘物注射到製備HPLC中，在60分鐘內使用5-40％的梯度洗脫。除去溶劑並將殘餘物在真空下乾燥，得到Boc-(AEES)2-COOH，為油狀物(5，64g，84％)。MS m/z 478。
將Boc-(AEES)2-COOH(3.60g)用三氟乙酸(TFA，10mL)處理10分鐘。真空除去TFA並在真空下進一步乾燥。將(AEES)2胺基酸溶解於N，N-二甲基甲醯胺中並用NMM鹼化。加入MPA-OSu(2.94g)並攪拌混合物30分鐘。在真空下除去N，N-二甲基甲醯胺。將殘餘物溶解於水並注射到製備HPLC中，在60分鐘內使用5-40％的梯度洗脫。將純級分合併並除去溶劑，得到MPA-(AEES)2-COOH，為灰白色固體(3.8g，95％)。MS m/z 542.2。
在NMM(1.13mL)的存在下將MPA-(AEES)2-COOH(3.04g)溶解於N，N-二甲基甲醯胺(20mL)中並用對硝基氯甲酸苯酯(1.13g)處理。反應混合物在環境溫度下攪拌2小時。在真空下除去N，N-二甲基甲醯胺。使用Biotage系統將殘餘物通過急驟色譜法純化。將柱用乙酸乙酯(500mL)衝洗，隨後用10％甲醇的乙酸乙酯混合液(1L)衝洗。將純級分合併並除去溶劑，得到MPA-(AEES)2-CO2PNP，為固體(1.39g，37％)。MS m/z 663。
在環境溫度下在NMM(200μL)的存在下使N，N-二甲基甲醯胺(10mL)中的Gly A1、Lys B29-雙Boc-胰島素(200mg)與得自實施例VIII的MPA-(AEES)2-CO2PNP(200mg)偶聯16小時。在真空下除去N，N-二甲基甲醯胺並將殘餘物用TFA處理10分鐘。真空除去TFA，將殘餘物溶解於水中並注射到HPLC中，在120分鐘內使用27-32％梯度洗脫。將純級分合併並凍幹溶劑，得到(Phe B1)-MPA-(AEES)2-胰島素，為白色粉末(95.0mg，43.7％)。MS m/z 6330.4。
實施例VII(B29)-MPA(AEES)2-胰島素的合成在環境溫度下在NMM(200μL)的存在下使N，N-二甲基甲醯胺(10mL)中的Gly A1、Phe B1-雙Boc-胰島素(200mg)與實施例VI的MPA-(AEES)2-CO2PNP(200mg)偶聯16小時。在真空下除去N，N-二甲基甲醯胺並將殘餘物用TFA處理10分鐘。真空除去TFA之後，將殘餘物溶解於水中並注射到HPLC中，在120分鐘內使用27-32％梯度洗脫。將純級分合併並凍幹溶劑，得到(Lys B29)-MPA-(AEES)2-胰島素，為白色粉末(56.3mg，25.9％)。MS m/z 6328.8。
實施例VIII(B29)-MPA(OA)-胰島素的合成在環境溫度下在NMM(20μL)的存在下使N，N-二甲基甲醯胺(10mL)中的Gly A1、Phe B1-雙Boc-胰島素(205mg)與MPA-OA-CO2Su(139mg)偶聯16小時。在真空下除去溶劑並將殘餘物用TFA處理10分鐘。真空除去TFA之後，將殘餘物溶解於水中並注射到HPLC中，在120分鐘內使用27-36％梯度洗脫。將純級分合併並凍幹溶劑，得到(LysB29)-MPA-(OA)-胰島素，為白色粉末(64.2mg，31％)。MS m/z 6098.8。
實施例IX體外結合試驗將Wistar大鼠的肝細胞膜用[125I]胰島素和高濃度的胰島素、DAC如圖1中所述的胰島素及其相應的結合物在4下培養16小時。將膜過濾並洗滌3次，將濾液計數以測定特異性結合的[125I]胰島素。使用GraphPad Prism軟體計算IC50。
IC50的結果在表2中說明。
表2

圖2和圖3說明根據抑制率％作為本發明的胰島素衍生物濃度的函數確定的結合到肝細胞膜中的胰島素。
實施例X體外生物活性使用脂肪細胞中的葡萄糖攝取評價體外活性。將鼠科成纖維細胞系3T3-L1細胞分化為脂肪細胞用於生物測定。將3T3-L1細胞塗板並在DMEM和10％FBS中生長到鋪滿，隨後培養兩天。通過加入地塞米松和胰島素誘導分化(D0)。到第七天，超過90％的細胞表現出脂肪細胞表型，即，脂類小滴積聚。圖4A-4C表示前成脂肪細胞，3天後的細胞和第七天的脂肪細胞。圖5A和5B表示在第四天的脂肪細胞和第七天的脂肪細胞的油紅o染色。圖6A和6B表示在第四天的脂肪細胞和第七天的脂肪細胞的油紅o和亞甲基藍染色。
將3T3-L1脂肪細胞在包含5mM葡萄糖和0.5％FBS的DMEM中飢餓(starved)過夜。將細胞在包含1％BSA的Kreb′s-Ringer-Hepes緩衝液中漂洗並在37下在高濃度的胰島素、DAC胰島素衍生物及其相應的結合物下培養20分鐘，並在加入[14C]-2-脫氧-D-葡萄糖(1μCi/孔)後再培養20分鐘。將細胞溶解並測量放射性。根據胰島素對照計算葡萄糖攝取率(％)並使用GraphPad PrismTM軟體計算EC50。
表3表示測試的化合物的EC50結果，圖7說明葡萄糖相對於對照的攝取率％隨化合物濃度(M)的變化的函數。
表3

實施例XI另外，使用在其它脂肪細胞源中的葡萄糖攝取率評價體外活性。使用從Wistar雄性大鼠得到的稱重為175±25g的附睪脂肪。在37下將組織(0.03g/ml)在pH7.4的改性HEPES溶液中用膠原酶降解。將受試化合物和/或介質以500μL等分在pH7.4的改性HEPES緩衝液中培養，然後加入D-[3-3H]葡萄糖(2.5μCi/ml)培養2小時。受試化合物誘導的相對於對照2 nM胰島素應答的超過50％或更多(50％)的葡萄糖結合增加表明可能的胰島素受體激動劑活性。受試化合物抑制胰島素誘導的葡萄糖結合應答超過50％則表明了胰島素受體拮抗劑活性。在10、1、0.1、0.01、和0.001μM篩選化合物。
表4表示受試化合物的EC50結果，圖8說明葡萄糖相對於對照的攝取率％隨化合物濃度(M)改變的函數。
表4

實施例XII體內實驗比較了對糖尿病雌性db/db小鼠皮下給用重組人胰島素和本發明的胰島素衍生物的血糖降低效果的評價。
通過單次皮下彈丸(bolus)注射，對重量為24.3到33.3g的5-6周大的雌性db/db小鼠給用受試化合物。劑量注射的溶液的平均體積為0.35mL/小鼠(12.5mL/kg)。
通過ICNTM以28IU/mg的濃度提供重組(大腸桿菌)人胰島素(以下在本文中稱為「rH胰島素」)。
通過用酸化水(～pH2)將合成的胰島素衍生物重組，製備14.29mg/mL(～400IU/mL)的胰島素衍生物的儲備液。隨後用0.9％NaCl稀釋儲備液並通過0.22μm過濾(Millex GV)，得到表5中所示的劑量溶液。第一組接受0.9％NaCl USP作為對照溶液。
表5

分組和治療總結在表6中。
表6

*基於供應商的估測，rH胰島素的效價為28IU/mg。
通過尾部末端進行採血(一滴)並使用手持糖度計(型號One TouchUltraTM，Lifescan Canada)測定葡萄糖水平。在給藥之前(劑量給藥前)，劑量給藥後1、2、3、4、6、24、30、48和72小時對所有動物測定血糖水平。
體內結果所有動物在給用受試化合物之前表現為正常。劑量給藥後約一小時，第2組用100IU/kg重組人胰島素(rH胰島素)處理的動物表現出輕微活動減少和步態不協調。其它經處理的動物在整個實驗過程中表現為正常。在用17.9mg/kg
的實施例III處理的動物中觀察到輕微的攝食量減少。
表7表示在單次給藥rH胰島素和胰島素衍生物之後的攝食量(總重量/籠(g))。
表7攝食量總重量/籠(g)

表8表示在單次給藥rH胰島素和胰島素衍生物之後相對於對照的攝食量(總重量/籠(g))。
表8相對於對照組的攝食量％

從每隻小鼠的劑量後葡萄糖水平的血糖水平相對於劑量前葡萄糖水平的血糖水平計算Δ血糖，並報告在圖9、10、11、12、13、和14中。通常，胰島素衍生物(實施例I、實施例II和實施例III)能夠以劑量依賴的方式降低血糖濃度，而只試驗了一個劑量水平(100IU/kg)的重組胰島素活性持續2小時。在3.6mg/kg，實施例2在第一個2小時過程中同胰島素一樣具有活性，而實施例I和實施例III只觀察到邊緣效應。rH胰島素的降低作用在17.9mg/kg時更明顯，因為觀察到其持續高達24小時。雖然總體上傾向於表明胰島素衍生物的活性持續高達24小時(與對照組比較)，重要的是要指出的是，葡萄糖水平在劑量給藥後1-2小時時降低，然後在3-4小時時升高，並在6小時時再次降低。這種「起伏的」應答可能表明小鼠的進食習慣和代謝是可影響藥效的重要參數。
重要的是要提及的是，db/db小鼠隨年齡形成胰島素耐受性，其可以說明必須要注射非常高劑量的胰島素以觀察葡萄糖降低作用。
實施例XIII在正常大鼠中的藥代動力學曲線以36nmol/kg皮下(sc)或12nmol/kg靜脈內(iV)對7-8周齡雄性CD大鼠給用Rh胰島素、實施例III的胰島素衍生物和實施例III的胰島素衍生物的結合物。收集血樣直到72小時(rh胰島素處理的動物只收集到3小時)。使用人胰島素ELISA試劑盒(Linco)測定藥物水平。使用WinNonlin軟體通過非區隔分析(non-compartmental analysis)計算藥代動力學參數，對於每種給藥途徑的每個化合物，N＝4隻大鼠。圖15為其中以36nmol/kg sc和12nmol/kg iv給用胰島素的正常SD大鼠中的胰島素的藥代動力學曲線。圖16為其中以36nmol/kg sc和12nmol/kgiv給用實施例III的結合物的正常SD大鼠中的結合物的藥代動力學曲線。圖17為其中以36nmol/kg sc和12nmol/kg iv給用實施例III的胰島素衍生物的正常SD大鼠中的胰島素衍生物的藥代動力學曲線。圖18為皮下給用胰島素、實施例III的胰島素衍生物和實施例III的胰島素衍生物的結合物的PK曲線。圖19為靜脈內給用胰島素、實施例III的胰島素衍生物和實施例III的胰島素衍生物的結合物的PK曲線。
實施例XIV糖尿病大鼠中的單劑量藥效通過單次i.v.注射鏈脲佐菌素(60mg/kg)在雄性CD大鼠中誘導糖尿病。兩天後，大鼠接受單次皮下注射120nmol/kg的DACTM胰島素衍生物、300nmol/kg的預形成的結合物、20U/kg(120nmol/kg)的rh胰島素、或介質。用手持糖度計對每組5隻大鼠(除了介質組為每組3隻大鼠外)測量剛好注射前和劑量給藥後1、2、3、4、6、8、10、11、24、30和48小時的血糖水平。正常大鼠的血糖為5.2到7.6mmol/L。
圖20表示給藥120nmol/kg的實施例I到IV之後大鼠的血糖水平。圖21表示以300nmol/kg給用本發明的實施例I到IV的相應的結合物之後大鼠的血糖水平。
實施例XV在重複皮下給用DAC胰島素衍生物及其相應的預形成的結合物後的效價的評價進行該試驗是要評價在成年雄性CD大鼠中重複皮下注射實施例III的胰島素衍生物及其結合物相對於游離的人重組胰島素的效價。
在研究的第1天通過單次靜脈內(i.v.)注射鏈脲佐菌素(60mg/kg，pH4.5)在雄性CD大鼠中誘導I型糖尿病。監測受試血液的血糖確認為高血糖。在研究的第3-14天通過皮下注射(s.c.)以1mL/kg體重每天一次給用受試化合物。在每天即將劑量給藥之前和給藥後2、8和18小時檢查血糖水平。每天監控進食量和飲水量。在研究的第1、3、6、9、12、15和17天收集體重數據。
圖22說明實施例III的胰島素衍生物在第1、6和12天每天的血糖曲線，圖23說明實施例III的胰島素衍生物的結合物在第1、6和12天每天的血糖曲線。
雖然已經參考本發明的具體實施方案描述了本發明，但是應該理解，其能夠被進一步改進，並且本申請包括通常根據本發明原理對本發明所作的任何變體、應用和改進，並且包括在本發明所述領域中已知的或慣例的實踐範圍內的和可能適用於在上文中所述基本特徵的、和在權利要求範圍內的從本發明的公開的這種偏離。
權利要求
1.胰島素衍生物，包括胰島素分子和用於與血液成分共價結合的活性基團。
2.權利要求1的胰島素衍生物，其中胰島素分子為下式I 並且活性基團與胰島素分子的胺基酸在選自位置Gly A1、Phe B1和Lys B29的位置連接。
3.權利要求1或2的胰島素衍生物，其中活性基團選自麥可受體、含琥珀醯亞胺基的基團和含馬來醯亞胺基的基團的組中。
4.權利要求3的胰島素衍生物，其中麥可受體為α，β不飽和羰基部分。
5.權利要求1或2的胰島素衍生物，其中活性基團為含馬來醯亞胺基的基團。
6.權利要求1或2的胰島素衍生物，其中活性基團為3-馬來醯亞胺基丙酸(MPA)。
7.權利要求1到6中任一項的胰島素衍生物，其中活性基團通過連接體與胰島素分子的胺基酸連接。
8.權利要求7的胰島素衍生物，其中所述連接體選自(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)，乙二胺(EDA)，氨基乙氧基乙氧基琥珀酸(AEES)，AEES-AEES，2-[2-(2-氨基)乙氧基]]乙氧基乙酸(AEEA)，AEEA-AEEA，-NH2-(CH2)n-COOH，其中n為1到20的整數，和烷基鏈(C1-C10)基元，及其組合的組中。
9.權利要求8的胰島素衍生物，其中所述烷基鏈(C1-C10)基元為一種或多種可包括氧、氮或硫原子的飽和或不飽和的烷基鏈(C1-C10)。
10.權利要求9的胰島素衍生物，其中所述烷基鏈選自甘氨酸、3-氨基丙酸(APA)、8-氨基辛酸(AOA)和4-氨基苯甲酸(APhA)的組中。
11.權利要求8的胰島素衍生物，其中所述組合選自AEEA-EDA、AEEA-AEEA和AEA-AEEA的組中。
12.權利要求6的胰島素衍生物，其中所述連接體為-NH2-(CH2)7-COOH。
13.權利要求1的胰島素衍生物，其具有下式
14.權利要求1的胰島素衍生物，其具有下式
15.權利要求1的胰島素衍生物，其具有下式
16.權利要求1的胰島素衍生物，其中所述血液成分為血液蛋白。
17.權利要求16的胰島素衍生物，其中所述血液蛋白為血清白蛋白。
18.胰島素結合物，包括權利要求1到17中任一項的胰島素衍生物和血液成分，其中活性基團和血液成分通過在所述活性基團與所述血液成分之間形成的共價鍵結合。
19.權利要求18的胰島素結合物，其中血液成分為血液蛋白。
20.權利要求19的胰島素結合物，其中血液蛋白為血清白蛋白。
21.權利要求18的胰島素結合物，其中所述結合物在體外形成。
22.藥學組合物，包括與可藥用載體結合的權利要求1到17中任一項的胰島素衍生物。
23.藥學組合物，包括與可藥用載體結合的權利要求18到21中任一項的胰島素結合物。
24.治療患有與血糖有關的疾病或病症的主體的與血糖有關的疾病或病症的方法，包括對所述主體給用權利要求1到17中任一項的胰島素衍生物。
25.權利要求24的方法，其中所述與血糖有關的疾病選自I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、囊性纖維化、多囊卵巢綜合症、和胰腺炎的組中。
26.權利要求24的方法，其中與血糖有關的疾病選自I型糖尿病和II型糖尿病的組中。
27.治療與血糖有關的疾病或病症的方法，包括給用權利要求18到21中任一項的胰島素結合物。
28.權利要求27的方法，其中所述與血糖有關的疾病選自I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、囊性纖維化、多囊卵巢綜合症、和胰腺炎的組中。
29.權利要求27的方法，其中與血糖有關的疾病選自I型糖尿病和II型糖尿病的組中。
30.治療與血糖有關的疾病或病症的方法，包括給用權利要求22和23中任一項的藥學組合物。
31.權利要求30的方法，其中所述與血糖有關的疾病選自I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、囊性纖維化、多囊卵巢綜合症、和胰腺炎的組中。
32.權利要求30的方法，其中與血糖有關的疾病選自I型糖尿病和II型糖尿病的組中。
33.權利要求1到17中任一項的衍生物在製備用於治療與血糖有關的疾病或病症的藥物中的應用。
34.權利要求33的應用，其中所述與血糖有關的疾病選自I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、囊性纖維化、多囊卵巢綜合症、和胰腺炎的組中
35.權利要求33的應用，其中與血糖有關的疾病選自I型糖尿病和II型糖尿病的組中
36.權利要求18到19中任一項的結合物在製備用於治療與血糖有關的疾病或病症的藥物中的應用。
37.權利要求36的應用，其中所述與血糖有關的疾病選自I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、囊性纖維化、多囊卵巢綜合症、和胰腺炎的組中。
38.權利要求37的應用，其中與血糖有關的疾病選自I型糖尿病和II型糖尿病的組中。
全文摘要
本發明涉及胰島素衍生物，其包括胰島素分子和用於與血液成分共價結合的活性基團，其中優選胰島素分子為人天然胰島素分子，並且活性基團與胰島素分子的胺基酸在選自位置Gly A1、Phe B1和LysB29的位置連接。
文檔編號A61P3/10GK1964989SQ200480021270
公開日2007年5月16日 申請日期2004年7月26日 優先權日2003年7月25日
發明者多米尼克·P·布裡東, 吉恩-保羅·卡斯泰涅, 黃喜材, 羅格·萊格爾, 馬丁·羅比塔耶 申請人:康久化學生物技術公司