糖抗原的糖基神經醯胺佐劑的製作方法

2023-10-22 02:56:37 2

專利名稱：糖抗原的糖基神經醯胺佐劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於疫苗佐劑，尤其是用於糖抗原的疫苗佐劑領域。
背景技術：
疫苗常常包含佐劑以增強免疫活性。已知佐劑的例子包括鋁鹽、水包油乳劑、皂苷類、細胞因子、脂質和CpG寡核苷酸。目前，僅有鋁鹽和單磷醯基脂質MF59TM被批准用於人。然而，鋁鹽的安全性受到關注，並且與一些抗原不相容。因此，需要開發其它佐劑。
α-半乳糖基神經醯胺(α-GalCer)是糖脂，更具體說是糖基神經醯胺，最初分離自海綿動物[1]。MHC I類-樣分子CD1d將α-GalCer遞呈到未變異的天然殺傷T細胞上，起初研究α-GalCer誘導天然殺傷T細胞對抗腫瘤細胞的反應的能力[2]。未變異的天然殺傷T細胞也能誘導B細胞活化，增強B細胞增殖和抗體產生[3，4]。近年來證明，α-GalCer能用作各種共同給予的蛋白質抗原的佐劑[5]。已證明，α-GalCer與經輻射的子孢子或表達瘧抗原的重組病毒共同給予能提高小鼠的保護性抗瘧免疫力水平[6]。也證明，α-GalCer可用作編碼HIV-I gag和env基因的DNA疫苗的佐劑[7]。
然而，並非所有疫苗都含有蛋白質抗原。幾種市售疫苗含有糖抗原。例如，PneumovaxTM是含有23種肺炎球菌血清型的糖抗原的疫苗。MencevaxTM和MenomuneTM是含有腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)A、C、Y和W-135的糖抗原的腦膜炎球菌疫苗。因此，需要將α-GalCer的佐劑應用延伸至糖抗原。
儘管α-GalCer成功用作DNA和蛋白質抗原的佐劑，但本發明者驚訝地發現，它不能用作一些糖抗原的佐劑。相反，發現α-GalCer與這些抗原一起給予會導致相對於無佐劑對照抗體滴度顯著降低。本發明的目的是克服存在α-GalCer時抑制抗-糖抗體應答反應的問題。

發明內容
令人驚訝地發現，如果將糖抗原偶聯於運載體可逆轉α-GalCer存在下對抗-糖免疫應答的此種抑制，甚至可以增強對糖抗原的免疫應答。因此，本發明提供了一種組合物，其包含(a)偶聯於運載體的糖抗原；和(b)α-糖基神經醯胺佐劑。
α-糖基神經醯胺佐劑本發明組合物中包含的佐劑可以是本領域已知的任何合適α-糖基神經醯胺。該α-糖基神經醯胺佐劑優選為式(I)化合物 式中，R1代表H或OH，X代表1-30的整數，R2代表選自(a)-(e)的取代基(式中Y代表5-17的整數)；(a)-CH2(CH2)YCH3(b)-CH(OH)(CH2)YCH3(c)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)2(d)-CH＝CH(CH2)YCH3(e)-CH(OH)(CH2)YCH(CH3)CH2CH3，R3代表H、OH、NH2、NHCOCH3或單糖，R4代表OH或單糖，R5代表H、OH或單糖，R6代表H、OH或單糖，和R7代表H、CH3、CH2OH或單糖。
X優選為7-27，更優選為9-24，更優選為13-20。
Y優選為7-15，更優選為9-13。
當R3是單糖時，它優選選自α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。
當R4是單糖時，它優選選自β-D-呋喃半乳糖或N-乙醯α-D-吡喃半乳糖。
當R5是單糖時，它優選選自α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。
當R6是單糖時，它優選選自α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃葡萄糖或β-D-吡喃葡萄糖。
當R7是單糖時，它優選選自甲基α-D-吡喃半乳糖苷、甲基β-D-吡喃半乳糖苷、甲基α-D-吡喃葡糖苷或甲基β-D-吡喃葡糖苷。
優選地，R5和R6不同。優選地，R5和R6中一個是H。
參考文獻2中提供了適合包含於本發明組合物中的α-糖基神經醯胺佐劑的其它例子。
α-糖基神經醯胺佐劑優選為α-半乳糖基神經醯胺(α-GalCer)(即R3＝OH、R4＝OH、R5＝OH、R6＝H和R7＝CH2OH)。本發明組合物中包含的α-GalCer可直接分離自海綿動物，或者可以是化學合成產物。參考文獻8中提供了適合用於本發明組合物的α-半乳糖基神經醯胺的例子。優選的α-半乳糖基神經醯胺是KRN7000，它具有式(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷醯基氨基)-1，3，4-十八烷三醇((2S，3S，4R)-1-O-(α-D-galactopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-1，3，4-octadecanetriol)。參考文獻8中描述了KRN7000的合成。
α-糖基神經醯胺佐劑也可以是α-GalCer的截短類似物，其中與α-GalCer相比脂族醯基鏈和/或鞘氨醇鏈被截短。參考文獻9提供了α-GalCer的截短類似物的例子。α-GalCer的優選截短類似物是′OCH′，其中與優選的α-GalCer相比脂族醯基鏈截短了兩個烴基和鞘氨醇鏈截短了9個烴基(即R1＝H，X＝21，R2＝CH(OH)(CH2)4CH3，R3＝OH，R4＝OH，R5＝OH，R6＝H，R7＝CH2OH)。α-GalCer的其它優選截短類似物包括與α-GalCer相比脂族醯基鏈截短了兩個烴基和鞘氨醇鏈截短了7個或3個烴基的類似物(即R1＝H，X＝21，R3＝OH，R4＝OH，R5＝OH，R6＝H，R7＝CH2OH，R2是CH(OH)(CH2)6CH3或CH(OH)(CH2)10CH3)。
糖抗原優選地，本發明組合物中包含的偶聯於運載體的糖抗原是細菌糖，具體是細菌莢膜糖。
本發明組合物中可以包含的細菌莢膜糖的例子包括來自腦膜炎奈瑟球菌(血清型A、B、C、W135或Y)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)(血清型4、6B、9V、14、18C、19F或23F)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII或VIII型)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)(可分型菌株a、b、c、d、e或f)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等的莢膜糖。本發明組合物可包含的其它糖包括葡聚糖(如真菌葡聚糖，如白念珠菌(Candida albicans)的葡聚糖)和真菌莢膜糖，如來自新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)莢膜的莢膜糖。
腦膜炎奈瑟球菌血清型A(MenA)莢膜是(α1→6)-連接的N-乙醯基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物，在C3和C4位置上部分O-乙醯化。腦膜炎奈瑟球菌血清型B(MenB)莢膜是(α2→8)-連接的唾液酸的均聚物。腦膜炎奈瑟球菌血清型C(MenC)莢膜糖是(α2→9)連接的唾液酸的均聚物，在7位和/或8位上具有可變的O-乙醯化。腦膜炎奈瑟球菌血清型W135糖是由唾液酸-半乳糖二糖單元[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→]組成的聚合物。它在唾液酸的7位和9位上具有可變的O-乙醯化[10]。腦膜炎奈瑟球菌血清型Y糖類似於血清型W135糖，除了該二糖重複單元用葡萄糖代替了半乳糖[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→]。它在唾液酸的7位和9位上也具有可變的O-乙醯化。
B型流感嗜血桿菌莢膜(Hib)糖是核糖、核糖醇和磷酸的聚合物[′PRP′，(聚-3-β-D-核糖-(1，1)-D-核糖醇-5-磷酸)]。
本發明組合物可含有糖抗原偶聯物的混合物。優選地，本發明組合物包含來自一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清型的糖抗原，如，組合物可含有來自血清型A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y等的糖偶聯物。優選組合物包含來自血清型C和Y的糖偶聯物。其它優選組合物包含來自血清型C、W135和Y的糖偶聯物。
當混合物包含來自血清型A的腦膜炎球菌糖和至少一種其它血清型糖時，MenA糖與任何其它血清型糖的比率(w/w)可能大於1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。來自血清型A∶C∶W135∶Y的糖的優選比率(w/w)為1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。
本發明的其它優選組合物包含Hib糖偶聯物和來自至少一種腦膜炎奈瑟球菌血清型，優選來自一種以上腦膜炎奈瑟球菌血清型的糖偶聯物。例如，本發明組合物可包含Hib偶聯物和來自腦膜炎奈瑟球菌血清型A、C、W135和Y的偶聯物。
本發明還包括包含肺炎鏈球菌糖偶聯物的組合物。該組合物優選包含來自一種以上肺炎鏈球菌血清型的糖偶聯物。優選組合物包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯物(7價)。組合物還可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1和5的糖偶聯物(9價)或可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、3和7F的糖偶聯物(11價)。
其它優選的本發明組合物包含肺炎球菌糖偶聯物和來自Hib和/或腦膜炎奈瑟球菌的糖偶聯物。優選地，本發明組合物可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯物和Hib糖偶聯物。優選地，本發明組合物可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯物和來自腦膜炎奈瑟球菌血清型A、C、W135和Y的糖偶聯物。本發明組合物也可包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖偶聯物，Hib糖偶聯物和來自腦膜炎奈瑟球菌血清型A、C、W135和Y的糖偶聯物。
優選的是，組合不會去除單個糖抗原偶聯物的保護功效，儘管可能降低實際免疫原性(如ELISA滴度)。
莢膜糖抗原的製備莢膜糖抗原的製備方法是熟知的。例如，參考文獻11描述了腦膜炎奈瑟球菌的糖抗原的製備。參考文獻12的第14章描述了流感嗜血桿菌的糖抗原的製備。本領域描述了肺炎鏈球菌的糖抗原和偶聯物的製備。例如，PrevenarTM是7-價肺炎球菌偶聯物疫苗。參考文獻13和14中詳細描述了無乳鏈球菌的糖抗原的製備方法。
可化學修飾糖抗原。例如，可修飾它們，以用封端基團取代一個或多個羥基。這尤其可用於腦膜炎球菌血清型A，可用封端基團取代乙醯基以防止水解[15]。這種修飾糖仍然是本發明含義內的血清型A糖。
莢膜糖可以寡糖形式應用。通過純化的莢膜多糖的片段化(如通過水解)方便地形成寡糖，片段化後通常純化所需大小的片段。
優選進行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最終小於30。可通過離子交換色譜或比色測定方便地測定DP[16]。
如果進行水解，通常對水解產物進行篩分，以去除短鏈寡糖[17]。可用各種方式，如超濾後進行離子交換色譜實現此目的。對於血清型A，優選去除聚合程度小於或等於約6的寡糖，對於血清型W135和Y，優選去除聚合程度小於約4的寡糖。
運載體運載體優選蛋白質。本發明組合物中糖抗原偶聯的優選運載體蛋白是細菌毒素，如白喉類毒素或破傷風類毒素。合適的運載體蛋白包括白喉毒素的CRM197突變體[18-20]、白喉類毒素、腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[21]、合成肽[22，23]、熱激蛋白[24，25]、百日咳蛋白[26，27]、細胞因子[28]、淋巴因子[28]、激素[28]、生長因子[28]、包含多個來自各種病原體衍生抗原的人CD4+T細胞表位的人工蛋白[29]如N19蛋白[30]、流感嗜血桿菌的蛋白D[31，32]、肺炎球菌表面蛋白PspA[33]、肺炎鏈球菌溶血素[34]、攝鐵蛋白[35]、艱難梭菌(C.difficile)的毒素A或B[36]等。
優選通過(例如)運載體蛋白中賴氨酸殘基或精氨酸殘基側鏈中的-NH2基團將糖抗原連接於運載體。當糖具有游離醛基時，它可與運載體中的胺反應，通過還原性胺化形成偶聯物。也可通過(例如)半胱氨酸殘基側鏈中的-SH基團進行連接。
當該組合物含有一種以上糖抗原時，可能(例如)採用一種以上運載體，以降低運載體抑制的風險。因此，不同運載體可用於不同糖抗原，如腦膜炎奈瑟球菌血清型A糖可偶聯於CRM197，而C型糖可偶聯於破傷風類毒素。也可能將一種以上運載體用於一種具體糖抗原。糖可分為兩類，一些偶聯於CRM197，另外一些偶聯於破傷風類毒素。然而，通常，優選對所有糖採用相同運載體。
一種運載體蛋白可攜帶一種以上糖抗原[37，38]。例如，一種運載體蛋白偶聯的糖可以來自不同病原體或來自同一病原體的不同血清型。為了實現這個目標，可在偶聯反應前混合不同糖。然而，通常，優選使各血清型形成不同偶聯物，偶聯後混合不同糖。不同偶聯物可基於同一種運載體。
優選糖蛋白比率(w/w)為1∶5(即蛋白質過量)-5∶1(即糖過量)的偶聯物。優選比率為1∶2-5∶1，以及1∶1.25-1∶2.5。
偶聯物可與游離運載體聯用[39]。當給定的運載體蛋白以游離和偶聯形式存在於本發明組合物中時，未偶聯形式優選不多於組合物中運載體蛋白總量的5％，更優選小於2重量％。
偶聯後，可分離游離和偶聯的糖。有許多合適的方法，包括疏水色譜、切向超濾、透析等[也參見參考文獻40和41等]。
可採用任何合適的偶聯反應，需要時使用任何合適接頭。
一般在偶聯之前使糖活化或官能化。活化可包括(例如)氰基化試劑如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[42，43等])。其它合適技術採用碳二亞胺、醯肼、活性酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU(也參見參考文獻44的引言)。
可用任何已知方法，如參考文獻45和46所述的方法通過接頭基團進行連接。一種連接類型包括多糖的還原性胺化，將得到的胺基與己二酸接頭基團的一端偶聯，然後將蛋白質偶聯於該己二酸接頭基團的另一端[47，48]。其它接頭包括B-丙醯胺基[49]、硝基苯基-乙基胺[50]、滷代醯基滷化物[51]、配糖鍵[52]、6-氨基己酸[53]、ADH[54]、C4-C12部分[55]等。作為採用接頭的替代方式，可以採用直接連接。直接連接蛋白質可包括多糖的氧化，然後用蛋白質還原性胺化，如參考文獻56和57所述。
優選包括以下步驟的方法將氨基引入糖(如通過用-NH2取代末端＝O基團)，然後用己二酸二酯(如己二酸N-羥基琥珀醯亞胺基二酯)衍生化，並與運載體蛋白反應。
偶聯後，可分離游離和偶聯的糖。有許多合適的方法，包括疏水色譜、切向超濾、透析等[也參見參考文獻58和59等]。
當本發明組合物包含解聚的糖時，優選在偶聯之前進行解聚。
本發明組合物的其它抗原性組分本發明組合物至少包含一種偶聯於運載體的糖抗原。然而，除上述偶聯於運載體的糖抗原以外，本發明組合物可包含一種或多種以下抗原-腦膜炎奈瑟球菌血清型B的蛋白抗原，如參考文獻60-66所述，尤其優選蛋白′287′(見下)和衍生物(如′ΔG287′)。
-腦膜炎奈瑟球菌血清型B的外膜泡囊(OMV)製劑，如參考文獻67、68、69、70等所述。
-肺炎鏈球菌(如PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130和Sp133，如參考文獻71所述)的蛋白抗原。
-A肝病毒，如失活病毒的抗原[如72、73；參考文獻78的第15章]。
-B肝病毒抗原，如表面和/或核心抗原[如73、74；參考文獻78的第16章]。
-C肝病毒抗原[如75]。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血細胞凝集素(FHA)，也任選地與百日咳桿菌外膜蛋白(pertactin)和/或凝集原2和3聯用[如參考文獻76和77；參考文獻78的第21章]。
-白喉抗原，如白喉類毒素[如參考文獻78的第13章]。
-破傷風抗原，如破傷風類毒素[如參考文獻78的第27章]。
-淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)抗原[如60、61、62]。
-肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)抗原[如79、80、81、82、83、84、85]。
-沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)抗原[如86]。
-牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[如87]。
-脊髓灰質炎抗原[如88，89；參考文獻78的第24章]如IPV。
-狂犬病抗原[如90]如凍幹的失活病毒[如91，RabAvertTM]。
-麻疹、腮腺炎和/或風疹抗原[如參考文獻78的第19、20和26章]。
-幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)抗原如CagA[92-95]、VacA[96、97]、NAP[98、99、100]、HopX[如101]、HopY[如101]和/或脲酶。
-流感抗原[如參考文獻78的第17和18章]，如血細胞凝集素和/或神經氨酸酶表面蛋白。
-黏膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[如102]。
-無乳鏈球菌(B型鏈球菌)的蛋白抗原[如103、104]。
-釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A型鏈球菌)的抗原[如104、105、106]。
-金黃色葡萄球菌抗原[如107]。
-副粘病毒如呼吸道合胞病毒(RSV[108、109])和/或副流感病毒(PIV3[110])的抗原。
-炭疽桿菌(Bacillus anthracis)抗原[如111、112、113]。
-黃病毒屬病毒，如黃熱病病毒、日本腦炎病毒、登革熱病毒的四種血清型、蜱傳播性腦炎病毒、西尼羅河病毒的抗原。
-瘟病毒抗原，如經典的豬熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒和/或邊界病病毒的抗原。
-細小病毒，如細胞病毒B19的抗原。
該混合物可包含一種或多種這些其它抗原，需要時可對它們進行解毒(如用化學和/或遺傳方法使百日咳毒素解毒)。
當該混合物中包含白喉抗原時，也優選包含破傷風抗原和百日咳抗原。相似地，當包含破傷風抗原時，也優選包含白喉和百日咳抗原。相似地，當包含百日咳抗原時，也優選包含白喉和破傷風抗原。
混合物中各抗原的濃度一般是至少1μg/ml。通常，任何給定抗原的濃度將足以引起抗該抗原的免疫應答。
作為混合物中採用蛋白抗原的替代方式，可採用編碼該抗原的核酸。因此，混合物的蛋白質組分可被編碼該蛋白的核酸(優選DNA，如質粒形式)取代。相似地，本發明組合物可包含模擬糖抗原的蛋白質如模擬表位[114]或抗-獨特型抗體。
藥物組合物的製劑本發明偶聯物和α-糖基神經醯胺佐劑尤其適合包含在免疫原性組合物和疫苗中。因此，本發明方法可包括將偶聯物和α-糖基神經醯胺佐劑製成免疫原性組合物或疫苗的步驟。本發明提供了可用此方式獲得的組合物或疫苗。
除偶聯於運載體蛋白的糖抗原和α-糖基神經醯胺佐劑以外，本發明免疫原性組合物和疫苗一般包含′藥學上可接受的運載體′，其包括本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何運載體。合適運載體一般是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚胺基酸、胺基酸共聚物、海藻糖[115]、脂質聚集體(如油滴或脂質體)和失活的病毒顆粒。這些運載體是本領域普通技術人員熟知的。疫苗也可含有稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。此外，可存在輔助性物質，如溼潤劑或乳化劑、pH緩衝性物質等。藥學上可接受的賦形劑的全面討論見參考文獻116。
用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的糖抗原，以及所需的任何其它上述組分。′免疫有效量′指以單劑量或一系列劑量的一部分給予個體的量能有效治療或預防。該量依待治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類組(例如，非人靈長類、靈長類等)、個體免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的製劑、主治醫生對醫學狀況的評價和其它相關因素而不同。預計該量屬於可由常規試驗確定的相對寬的範圍。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案(如包括加強劑量)。
該疫苗可與其它免疫調節劑聯用。在本發明免疫原性組合物中，α-糖基神經醯胺用作佐劑。疫苗可包含其它佐劑。這些佐劑包括但不限於A.含有礦物質的組合物本發明中適合用作佐劑的含有礦物質的組合物包括礦物鹽類，例如鋁鹽和鈣鹽。本發明包括礦物鹽，例如氫氧化物(例如，羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等[例如，參見參考文獻117的第8和9章]，或不同無機化合物的混合物，化合物可採用任何合適的形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優選吸附性化合物。也可將含有礦物質的組合物製成金屬鹽的顆粒[118]。
磷酸鋁佐劑一般是無定形羥基磷酸鋁，PO4/Al摩爾比為0.84-0.92，包括約0.6mgAl3+/ml。可採用低劑量磷酸鋁吸附，如50-100μgAl3+/偶聯物/劑。採用磷酸鋁並且不需要將抗原吸附於佐劑時，在溶液中包含游離的磷酸根離子(如採用磷酸鹽緩衝液)比較有利。
B.油乳劑適合用作發明佐劑的油乳劑組合物包含鯊烯-水乳劑，如MF59[參考文獻117的第10章；也參見參考文獻119](5％鯊烯、0.5％吐溫80和0.5％Span 85，用微流化機製成亞微米顆粒)。也可使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。
C.皂苷製劑[參考文獻117的第22章]皂苷製劑也可用作本發明佐劑。皂苷是在大量植物種類的樹皮、葉、莖幹、根和甚至花中發現的甾醇糖苷和三萜糖苷的異源組合。已廣泛研究了作為佐劑的來自皂樹(Quillaia saponaria)Molina樹皮的皂苷。皂苷也可購自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑製劑包括純化製劑如QS21以及脂質製劑如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。
用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑑定了使用這些技術純化的特定組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷優選是QS21。生成QS21的方法參見參考文獻120。皂苷製劑也可包含甾醇，如膽固醇[121]。
皂苷和膽固醇的組合可用於形成稱為免疫刺激複合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻117的第23章]。ISCOM通常也包括磷脂如磷脂醯乙醇胺或磷脂醯膽鹼。任何已知的皂苷均可用於ISCOM。ISCOM優選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻121-123中進一步描述了ISCOM。任選地，ISCOM可不含其它去汙劑[124]。
開發基於皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻125和126。
D.病毒小體和病毒樣顆粒病毒小體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發明的佐劑。這些結構通常包含一種或多種任選地與磷脂組合或配製入磷脂中的病毒蛋白。它們通常是非病原性、非複製性的，通常不含任何天然病毒基因組。可用重組方法產生或從全病毒分離得到這種病毒蛋白。這些適用於病毒小體或VLP中的病毒蛋白包括來源於流感病毒(例如HA或NA)、B肝病毒(例如核心蛋白或包膜蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、輪狀病毒、口蹄疫病毒、逆轉錄病毒、諾瓦克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV、RNA-噬菌體、Qβ-噬菌體(例如外殼蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty(例如反轉錄轉座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP在參考文獻127-132中有進一步描述。病毒小體在(例如)參考文獻133中有進一步描述。
E.細菌或微生物衍生物適用於本發明的佐劑包括細菌或微生物衍生物，例如腸細菌的脂多糖(LPS)的無毒衍生物、脂質A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物。
LPS的無毒衍生物包括單磷醯脂質A(MPL)和3-O-脫醯MPL(3dMPL)。3dMPL是3脫-O-醯化單磷醯脂質A與4、5或6醯化鏈的混合物。3脫-O-醯化單磷醯脂質A的優選「小顆粒」形式見參考文獻134中所述。3dMPL的這種「小顆粒」小到足以在除菌過濾時通過0.22μm膜[134]。其它無毒LPS衍生物包括單磷醯脂質A模擬物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物如RC-529[135，136]。
脂質A衍生物包括大腸桿菌(Escherichia coli)，如OM-174的脂質A衍生物。(例如)參考文獻137和138中描述了OM-174。
適合用作本發明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過磷酯鍵與鳥嘌呤連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含迴文結構或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激作用。
CpG可包含核苷酸修飾/類似物如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻139、140和141公開了可能的類似取代，例如用2』-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻142-147中進一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。
CpG序列可能導向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[148]。CpG序列可特異性誘導Th1免疫應答，例如CpG-A ODN，或它可更特異地誘導B細胞應答，例如CpG-B ODN。參考文獻149-151中討論了CpG-A和CpG-B ODN。CpG優選為CpG-AODN。
優選地，構建CpG寡核苷酸時使其5』端可為受體所識別。任選將兩個CpG寡核苷酸序列的3』端相連接形成「免疫聚體」。參見例如，參考文獻148和152-154。
細菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本發明的佐劑。優選地，該蛋白獲自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素「LT」)、霍亂(「CT」)或百日咳(「PT」)。參考文獻155中描述了將解毒的ADP-核糖基化毒素用作黏膜佐劑，參考文獻156中描述了將用作胃腸外佐劑。毒素和類毒素優選包括A和B亞單位的全毒素形式。優選地，A亞單位含有解毒突變；B亞單位優選不突變。佐劑優選是解毒的LT突變體如LT-K63、LT-R72和LT-G192。參考文獻157-164中描述了將ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐劑。胺基酸取代基的編號優選根據參考文獻165中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的排列對比，該參考文獻的全部內容被特別納入本文作為參考。
F.人免疫調節劑適合用作本發明佐劑的人免疫調節劑包括細胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[166]等)[167]、幹擾素(例如幹擾素-γ)、巨噬細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。
G.生物粘著劑和黏膜粘著劑生物粘著劑和黏膜粘著劑也可用作本發明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酯化透明質酸微球[168]或黏膜粘著劑如聚(丙烯酸)交聯衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可用作本發明的佐劑[169]。
H.微粒微粒也可用作本發明的佐劑。由可生物降解和無毒材料(例如聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內酯等)，優選聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即直徑約100nm-150μm，更優選直徑約200nm-30μm，最優選直徑約500nm-10μm的微粒)，微粒經任選處理而具有帶負電的表面(例如用SDS處理)或正電荷表面(例如用陽離子去汙劑如CTAB處理)。
I.脂質體(參考文獻117第13和14章)適合用作佐劑的脂質體製劑的例子見參考文獻170-172所述。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯製劑適合用於本發明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[173]。這種製劑還包含聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑和辛苯糖醇[174]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯糖醇[175]的混合物。優選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steoryl ether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)參考文獻176和177中描述了PCPP製劑。
L.胞壁醯肽適合用作本發明佐劑的胞壁醯肽的例子包括N-乙醯基-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異谷醯胺(thr-MDP)、N-乙醯基-正胞壁醯-L-丙氨醯-D-異谷醯胺(正-MDP)和N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺醯-L-丙氨酸-2-(1』-2』-二棕櫚醯-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺MTP-PE)。
M.咪唑喹諾酮(Imidazoquinolone)化合物適合用作本發明佐劑的咪唑喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，″瑞喹莫德3M″)，見參考文獻178和179所述。
本發明也包括一種或多種上述佐劑的組合。例如，本發明中可使用以下佐劑組合物(1)皂苷和水包油乳劑[180]；(2)皂苷(例如QS21)+無毒LPS衍生物(例如3dMPL)[181]；(3)皂苷(例如QS21)+無毒LPS衍生物(例如3dMPL)+膽固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任選地+甾醇)[182]；(5)3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳劑的組合[183]；(6)SAF，含10％角鯊烷、0.4％吐溫80TM、5％普流羅尼嵌段聚合物L121，及thr-MDP，經微流體化成為亞微米乳劑或經渦旋產生粒度較大的乳劑；(7)RibiTM佐劑系統(RAS)，(Ribi Immunochem)含2％角鯊烷、0.2％吐溫80以及單磷醯脂質A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)中一種或多種細菌細胞壁成分，優選MPL+CWS(DetoxTM)；以及(8)一種或多種礦物鹽(例如鋁鹽)+LPS無毒衍生物(例如3dMPL)。
參考文獻117第7章中公開了用作免疫刺激劑的其它物質。
醫學方法和用途配製好後，可將本發明組合物直接給予對象。待治療對象可以是動物；具體說，可治療人類對象。該疫苗尤其可用於接種兒童和青少年。可通過全身和/或黏膜途徑遞送它們。
一般將該免疫原性組合物製備為注射劑，如溶液或懸液；也可製備適合在注射前用液體載體溶解或懸浮的固體形式。也可將該製劑乳化或包裹在脂質體中，以增強佐劑作用。通常通過胃腸道外(如皮下、腹膜內、靜脈內或肌肉內注射，或遞送至組織間隙)直接遞送該組合物。也可將該組合物給予傷口。其它給藥方式包括口服和肺部給藥、栓劑、以及透皮或經皮施用(參見例如參考文獻184)、針頭和無針注射器。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案(如包括加強劑量)。
本發明疫苗優選無菌。它們優選為無熱原。優選將它們緩衝至(例如)pH 6-pH 8，通常約pH 7。當疫苗包含氫氧化鋁鹽時，優選採用組氨酸緩衝液[185]。
本發明疫苗可包含低水平(如＜0.01％)的去汙劑(如吐溫，如吐溫80)。本發明疫苗可包含(如)約15mg/ml的糖醇(如甘露醇)或海藻糖，尤其是在凍幹情況下。
可憑經驗評價單一抗原的最優劑量。然而，通常，將以每劑每種糖0.1-100μg的劑量給予本發明糖抗原，劑量體積一般是0.5ml。劑量一般是每劑每種糖5-20μg。這些值均以糖計。
本發明疫苗可以是預防性(即預防感染)或治療性(即在感染後治療疾病)，但一般是預防性。
本發明提供了藥用的偶聯於運載體蛋白的糖抗原和α-糖基神經醯胺佐劑。
本發明也提供了在患者中產生免疫應答的方法，該方法包括給予患者本發明疫苗。具體說，本發明提供了在患者中產生免疫應答的方法，該方法包括給予患者偶聯於運載體的糖抗原和α-糖基神經醯胺佐劑。所述免疫應答優選為使患者保護性抵抗腦膜炎球菌病、肺炎球菌病或流感嗜血桿菌，可包括體液免疫應答和/或細胞免疫應答。患者可以是成人或兒童。患者年齡可以是0-6月、6-12月、1-5歲、5-15歲、15-55歲或大於55歲。患者優選為兒童。在已經用腦膜炎球菌、肺炎球菌或流感嗜血桿菌初敏的患者中，該方法可產生增強應答。
可同時、連續或分別給予糖抗原偶聯物和α-糖基神經醯胺佐劑。例如，可在給予糖抗原偶聯物之前或給予糖抗原偶聯物之後給予α-糖基神經醯胺佐劑以致敏哺乳動物，加強該哺乳動物對該偶聯物的免疫應答。在給予一種以上糖抗原偶聯物時，可同時給予α-糖基神經醯胺佐劑，其中分別、同時或連續給予α-糖基神經醯胺佐劑與糖抗原偶聯物混合物。
產生免疫應答的方法可包括給予第一劑量的偶聯於運載體的糖抗原和α-糖基神經醯胺佐劑，隨後任選給予無佐劑第二劑量的偶聯於運載體的糖抗原。可同時、連續或分別給予第一劑量的糖抗原偶聯物和α-糖基神經醯胺佐劑。
本發明也提供偶聯於運載體的糖抗原在藥物生產中的應用，所述藥物在患者中產生免疫應答，其中所述藥物與α-糖基神經醯胺佐劑一起給予。
本發明也提供α-糖基神經醯胺佐劑在藥物生產中的應用，所述藥物在患者中產生免疫應答，其中所述藥物與偶聯於運載體的糖抗原一起給予。
本發明也提供偶聯於運載體的糖抗原和α-糖基神經醯胺佐劑在藥物生產中的應用，所述藥物在患者中產生免疫應答。
本發明也提供偶聯於運載體的糖抗原在藥物生產中的應用，所述藥物在患者中產生免疫應答，其中患者經α-糖基神經醯胺佐劑預治療。
本發明還提供α-糖基神經醯胺佐劑在藥物生產中的應用，所述藥物在患者中產生免疫應答，其中患者經偶聯於運載體的糖預治療。
本發明也提供偶聯於運載體的糖抗原在藥物生產中的應用，所述藥物在患者中產生免疫應答，其中所述患者經偶聯於運載體的糖抗原和α-糖基神經醯胺佐劑預治療。
所述藥物優選為免疫原性組合物(如疫苗)。所述藥物優選用於預防和/或治療奈瑟球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血症、淋病等)、流感嗜血桿菌引起的疾病(如中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎、腦膜炎等)或肺炎球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血症、肺炎等)。因此，優選預防和/或治療細菌性腦膜炎。
可用標準動物模型檢測疫苗(參見例如參考文獻186)。
本發明還提供了一種藥盒，其包括a)偶聯於運載體的糖抗原和b)α-糖基神經醯胺佐劑。
定義術語「含有」包括「包含」以及「由...組成」，例如「含有」X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質，例如X+Y。
與數值x相關的術語「約」表示，例如x±10％。
術語「基本上」不排除「完全」，例如「基本上不含」Y的組合物可完全不含Y。「基本上」可視需要從本發明定義中省去。
附圖簡要說明

圖1A)用肺炎鏈球菌多糖與或不與α-GalCer組合的小鼠免疫方案。用1)PBS、2)0.1μg α-GalCer，3)3.5μg-10μg獲自肺炎鏈球菌23種不同血清型的多糖的混合物(Streptopur)或4)3.5μg-10μg Streptopur(SP)和0.1μg α-GalCer，免疫四組六周齡雌性小鼠(C57L/6WT、CD1d+/-、CD1d-/-或JA18-/-)。用50μl體積進行肌肉內免疫。初敏4天、8天和12天後(4dp1、8dp1、12dp1)將小鼠放血，用ELISA測定血液中抗肺炎鏈球菌的抗體水平。初敏10周或12周後，用僅3.5μg-10μg SP的加強劑量免疫所有小鼠。加強4天、8天和12天後(4dp2、8dp2、12dp2)將小鼠放血，用ELISA測定血液中抗肺炎鏈球菌的抗體水平。初敏18-22周後，處死小鼠並用Elispot測定肺炎鏈球菌特異性B細胞的數量。
B)用肺炎鏈球菌多糖與或不與α-GalCer組合的小鼠免疫方案。如圖1A，但免疫採用3.5μgSP的50μl溶液。
C)用單獨的、與蛋白質運載體偶聯或混合的不同多糖，與和不與α-GalCer組合的小鼠免疫方案。在第0天用1)PBS，2)0.1μg與α-GalCer組合，3)10μg MenC多糖，4)20μg CRM蛋白質運載體，5)30μg MenC-CRM偶聯物，6)與CRM蛋白質運載體混合的10μg MenC多糖，或3)-6)和α-GalCer的組合物(第7-10組)，使10組野生型C57BL/6小鼠初敏。初敏2周和4周後，用與初敏所用相同的組合物加強免疫小鼠。初敏2、4和6周後(2wp1、2wp2和2wp3)，將小鼠放血，測定抗MenC多糖和CRM運載體的抗體水平。
圖2與僅用Streptopur初敏的小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏的小鼠肺炎鏈球菌-特異性抗體滴度較低。顯示了僅用3.5μg Streptopur(SP)(黑柱)或用3.5μg Streptopur和0.1μg α-GalCer(白柱)初敏後4天、8天和12天小鼠的肺炎鏈球菌-特異性IgM滴度(幾何平均數)。(*指對僅有SP的p＜0.05，**指對僅有SP的p＜0.01)。
圖3與僅用Streptopur初敏和加強的小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏並用Streptopur加強的小鼠肺炎鏈球菌特異性抗體滴度較低。A)用3.5-11.5μgStreptopur和PBS初敏後8天(黑色)或用3.5-11.5μg Streptopur和0.1μgα-GalCer初敏後8天(灰色)小鼠的肺炎鏈球菌特異性IgM滴度(幾何平均數)的變化。(這些數據來自四次實驗)。B)用3.5-11.5μg Streptopur加強後8天，同一小鼠的肺炎鏈球菌特異性IgM滴度(幾何平均數)的變化。(這些數據來自所進行的實驗18、19和29)。用黑色表示用3.5-11.5μg Streptopur初敏的小鼠的結果，用灰色表示用3.5μg Streptopur和0.1μgα-GalCer初敏的小鼠的結果。
圖4與用PBS初敏並用Streptopur加強的小鼠相比，用α-GalCer初敏並用Streptopur加強的小鼠中每106脾細胞中肺炎鏈球菌特異性B細胞數量較低。在第0天用0.1μg或1.0μg α-GalCer(aGC)初敏兩組小鼠，12周後用11.5μg Streptopur(SP)免疫。在第0天用PBS免疫第三組小鼠，12周後用11.5μg SP 12免疫。在第0天和12周後用PBS免疫第四組小鼠12。初敏22周後，處死小鼠，用Elispot測定每106脾細胞中肺炎鏈球菌特異性B細胞的數量。
圖5α-GalCer增強抗MenC-CRM偶聯物中MenC多糖和CRM蛋白質運載體的特異性抗體應答。用10μg MenC多糖、20μg CRM蛋白質運載體、10μg與CRM蛋白質運載體混合的MenC多糖(MenC+CRM)或30μg MenC-CRM偶聯物，或者含α-GalCer的相同組合物初敏野生型小鼠。初敏後2周和4周，用與初敏所用相同的組合物加強免疫小鼠。該圖上面一排顯示了第二次免疫後1周(1wp2)和第二次免疫後2周(2wp2)用單獨的MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶聯物(黑色)或MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶聯物和α-GalCer(灰色)免疫的小鼠的MenC特異性Ig滴度。該圖的第二排顯示了第二次免疫後2周(2wp2)和第三次免疫後2周(2wp3)用單獨的MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶聯物(黑色)或MenC、CRM、MenC+CRM或MenC-CRM偶聯物和α-GalCer(灰色)免疫的小鼠的CRM-特異性Ig滴度。
圖6α-GalCer增強對Men A-CRM偶聯物的免疫應答。用10μg MenA多糖或MenA-CRM偶聯物與或不與α-GalCer組合免疫小鼠。在初敏後4天、8天和12天測定抗MenA多糖的抗體滴度，α-GalCer增強了對MenA多糖的免疫應答。
圖7用α-GalCer和MenC-CRM偶聯物免疫的小鼠中抗體應答增強。用30μgMenC-CRM偶聯物與PBS(黑色)或α-GalCer的混合物免疫小鼠。各組小鼠免疫三次。在第二次免疫後1周(1wp2)和第三次免疫後1周(1wp3)測定MenC特異性滴度。
圖8α-GalCer誘導對肺炎鏈球菌多糖反應的抑制需要未變異的NKT細胞。在A)野生型小鼠、B)Ja18-/-小鼠、C)mCD1d-/-小鼠和D)mCD1d-/+小鼠中，比較僅用3.5μg SP(灰色標識)或3.5μg SP和0.1μg α-GalCer(黑色標識)初敏小鼠後4天、8天和12天，肺炎鏈球菌特異性抗體的水平。與用Streptopur與α-GalCer組合免疫的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠相比，僅用Streptopur免疫的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠的抗體滴度沒有顯著性差異。
圖9未變異的NKT細胞對肺炎鏈球菌多糖的抗體應答有負調節作用。比較了按照圖1B所示方案僅用Streptopur初敏後4天、8天和12天小鼠的肺炎鏈球菌-特異性抗體(IgM滴度，幾何平均數)水平。圖9A比較了C57野生型小鼠的抗體滴度(方形)與C57mCD1d+/-小鼠的抗體滴度(三角形)。圖9B比較了C57野生型小鼠的抗體滴度(方形)與C57mCD1d-/-小鼠的抗體滴度(三角形)。圖9C比較了C57野生型小鼠的抗體滴度(方形)與C57Ja281-/-小鼠的抗體滴度(圓形)。野生型小鼠的抗體滴度低於Ja18-/-、CD1-/-和CD1+/-小鼠。
圖10在3-8周齡小鼠中，α-GalCer抑制對Streptopur的免疫應答。僅用3.5μgStreptopur(SP)(白色)或用3.5μg Streptopur和0.1μg α-GalCer(黑色)使2周齡(2W)、3周齡(3W)、4周齡(4W)、5周齡(5W)和6-8周齡(6-8W)的小鼠初敏後8天，比較肺炎鏈球菌特異性IgM抗體(幾何平均數)水平。
圖11用α-GalCer和Hib-HSA偶聯物免疫的小鼠中抗體應答增強。用15μgHib-人血清白蛋白(Hib-HSA)偶聯物與PBS(結果太低，以致於不能檢測到)、α-GalCer(陰影)或MF59(灰色)的混合物免疫小鼠。各組小鼠免疫三次。在第二次免疫後1周(1wp2)和第三次免疫後1周(1wp3)測定Hib-特異性滴度。
實施本發明的方式實施例1α-GalCer抑制對糖抗原的免疫應答用1)PBS、2)0.1μg α-GalCer、3)3.5-10μg獲自肺炎鏈球菌的23種不同血清型的23種多糖的混合物(Streptopur)或4)3.5-10μg Streptopur和0.1μg α-GalCer免疫四組(每組五隻)六周齡雌性小鼠(品系C57BL/6)。用100μl體積進行肌肉內免疫。所有四組小鼠在12周後用3.5-10μg Streptopur加強免疫。免疫方案見圖1A。
初敏後4天、8天和12天和加強免疫後4天、8天和12天，將小鼠放血，用ELISA測定血液中肺炎鏈球菌特異性抗體的水平。與僅用Streptopur初敏的小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏的小鼠顯示出肺炎鏈球菌特異性抗體滴度降低(圖2和3)，特別是給予第一個劑量之後(圖3A)，這表明α-GalCer抑制對糖抗原的免疫應答。
18-22周後，處死小鼠並用Elispot測定其脾臟中肺炎鏈球菌特異性B細胞的數量。與用PBS初敏並用Streptopur加強的小鼠脾臟相比，用α-GalCer初敏並用Streptopur加強的小鼠脾臟中肺炎鏈球菌特異性B細胞的含量也較少(圖4)。這些結果都提示，α-GalCer抑制對糖抗原的免疫應答。
進行進一步實驗，以評價在Streptopur和α-GalCer免疫的小鼠中觀察到對肺炎鏈球菌多糖較低的抗體應答是否需要未變異的天然殺傷T細胞。用1)PBS、2)0.1μgα-GalCer、3)3.5μg Streptopur(SP)或4)3.5μg Streptopur和0.1μg α-GalCer，免疫四組六周齡雌性小鼠(C57L/6WT、CD1d+/-、CD1d-/-或JA18-/-)。用50μl體積進行肌肉內免疫。初敏後4天、8天和12天將小鼠放血，用ELISA測定血液中肺炎鏈球菌特異性抗體的水平。免疫方案見圖1B。
與僅用Streptopur初敏的CD57L/6野生型小鼠相比，用Streptopur和α-GalCer初敏的C57L/6野生型小鼠顯示出肺炎鏈球菌特異性抗體滴度降低(圖8A)，這驗證了α-GalCer抑制對肺炎鏈球菌糖抗原的免疫應答。
相反，與僅用Streptopur初敏的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠相比，用Streptopur與α-GalCer初敏的Ja18-/-、CD1d-/-和CD1d-/+小鼠的肺炎鏈球菌-特異性抗體滴度沒有顯著性差異(圖8B-D)。這些結果提示，α-GalCer-誘導的對肺炎鏈球菌糖應答的抑制需要未變異的NKT細胞。
與僅用Streptopur初敏的JA218-/-、CD1d-/-和CD1d-/+的抗體滴度相比，僅用Streptopur而不用α-GalCer初敏的C57L/6野生型小鼠的肺炎鏈球菌-特異性抗體滴度較低(圖9)。這些結果提示，即使在沒有α-GalCer的情況下，未變異的NKT細胞可能對肺炎鏈球菌糖的抗體應答有負面作用，在α-GalCer存在下進一步加強此負面作用。
進一步實驗證明，也在6-8周齡的小鼠中觀察到，α-GalCer抑制對糖抗原的免疫應答(圖10)。
實施例2a-GalCer能增強對糖抗原偶聯物的免疫應答與α-GalCer和肺炎鏈球菌的糖抗原(Streptopur)一起給予時觀察到抗體滴度降低相反，給予α-GalCer增強對偶聯於運載體蛋白的糖抗原的抗體應答。
用Hib-人血清白蛋白偶聯物(Hib-HSA)和α-GalCer免疫的小鼠顯示出的Hib-特異性Ig滴度比用Hib-HSA偶聯物和PBS免疫的小鼠高很多(圖11)。相似地，與用MenC-CRM偶聯物和PBS免疫的小鼠相比，用MenC-CRM偶聯物和α-GalCer免疫顯示出MenC-特異性Ig滴度顯著增加(圖7，按照圖1C方案進行免疫)。
如圖5所示，雖然在僅用MenC免疫的小鼠中未曾觀察到對MenC的抗體應答，但與用MenC-CRM偶聯物和PBS免疫的小鼠相比，用MenC-CRM偶聯物和α-GalCer免疫的小鼠顯示出MenC特異性抗體滴度顯著增加。混合α-GalCer與偶聯物增強了對糖和偶聯物的抗體應答。
用MenA-CRM偶聯物和α-GalCer進行免疫也導致MenA特異性Ig滴度增加(圖6)。然而在同時進行的實驗中，沒有觀察到α-GalCer對未偶聯MenA糖的強烈抑制作用。
總之，雖然α-GalCer可抑制對糖抗原的免疫應答，但這種效果可被逆轉，如果糖抗原偶聯於運載體，可用α-GalCer增強對糖抗原的免疫應答。
應理解，僅以舉例的方式描述本發明，可在不背離本發明構思和範圍的情況下對詳細內容進行修改。
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權利要求
1.一種組合物，其包含(a)偶聯於運載體的糖抗原；和(b)α-糖基神經醯胺佐劑。
2.如權利要求1所述的組合物，其特徵在於，所述α-糖基神經醯胺佐劑是α-半乳糖基神經醯胺。
3.如權利要求2所述的組合物，其特徵在於，所述α-半乳糖基神經醯胺是(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷醯基氨基)-1，3，4-十八烷三醇。
4.如權利要求1-3中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述糖抗原是細菌莢膜糖。
5.如權利要求4所述的組合物，其特徵在於，所述細菌莢膜糖來自腦膜炎奈瑟球菌、流感嗜血桿菌或肺炎鏈球菌。
6.如權利要求1-5中任一項所述的組合物，其包含一種以上糖偶聯物。
7.如權利要求1-6中任一項所述的組合物，其特徵在於，所述運載體是蛋白質。
8.如權利要求6所述的組合物，其特徵在於，所述運載體是細菌毒素如白喉類毒素或破傷風類毒素。
9.用於藥物的偶聯於運載體的糖抗原和α-糖基神經醯胺佐劑。
10.一種在患者中產生免疫應答的方法，其包括給予患者偶聯於運載體的糖抗原和α-糖基神經醯胺佐劑。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，同時、依次或分別給予所述糖抗原偶聯物和α-糖基神經醯胺佐劑。
12.如權利要求10或11所述的方法，其特徵在於，所述免疫應答用於預防和/或治療奈瑟球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血症、淋病等)、流感嗜血桿菌引起的疾病(如中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎、腦膜炎等)或肺炎球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血症、肺炎等)。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述藥物用於預防和/或治療細菌性腦膜炎。
14.偶聯於運載體的糖抗原在製造用於在患者中產生免疫應答的藥物中的應用，其中所述藥物與α-糖基神經醯胺佐劑一起給予。
15.α-糖基神經醯胺佐劑在製造用於在患者中產生免疫應答的藥物中的應用，其中所述藥物與偶聯於運載體的糖抗原一起給予。
16.偶聯於運載體的糖抗原和α-糖基神經醯胺佐劑在製造用於在患者中產生免疫應答的藥物中的應用。
17.偶聯於運載體的糖抗原在製造用於在患者中產生免疫應答的藥物中的應用，其中患者經α-糖基神經醯胺佐劑預治療。
18.α-糖基神經醯胺佐劑在製造用於在患者中產生免疫應答的藥物中的應用，其中患者經偶聯於運載體的糖預治療。
19.如權利要求14-18中任一項所述的應用，其特徵在於，所述藥物用於預防和/或治療奈瑟球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血症、淋病等)、流感嗜血桿菌引起的疾病(如中耳炎、支氣管炎、肺炎、蜂窩織炎、心包炎、腦膜炎等)或肺炎球菌引起的疾病(如腦膜炎、敗血症、肺炎等)。
20.如權利要求19所述的應用，其特徵在於，所述藥物用於預防和/或治療細菌性腦膜炎。
21.一種藥盒，其包含(a)偶聯於運載體的糖抗原；和(b)α-糖基神經醯胺佐劑。
全文摘要
本發明提供了含有以下組分的組合物和藥盒(a)偶聯於運載體的糖抗原；和(b)α－糖基神經醯胺佐劑。本發明還提供了利用該組合物進行治療的方法。已發現，可通過將糖偶聯於運載體逆轉α－糖基神經醯胺對抗－糖免疫應答的抑制。
文檔編號A61K39/39GK101035546SQ200580034409
公開日2007年9月12日 申請日期2005年9月7日 優先權日2004年9月7日
發明者G·蓋利 申請人:啟龍有限公司