CEACAMl蛋白磁粒的製備方法和應用的製作方法
2023-10-22 05:42:52 1
專利名稱：CEACAMl蛋白磁粒的製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種人癌胚抗原相關細胞黏附分子l(CEACAMl)細胞外特定結構域融合蛋白的表達、純化的方法和應用，屬於分子生物學和應用微生物學領域。
背景技術：
癌胚抗原相關細胞粘附分子1(CEACAM1，NCBI GenBank:NM_001712)是廣泛表達於中性粒細胞、巨噬細胞、上皮細胞及淋巴細胞表面的跨膜糖蛋白，屬癌胚抗原家族免疫球蛋白超家族粘附分子，其生物學功能包括促進血管的形成，調節血管的重塑，參與細胞凋亡的調控、促進腺體管腔的形成及調控胰島素的清除以維持細胞對胰島素的敏感性，同時CEACAM1也是致病微生物的粘著受體。淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)和腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides, NM)通過其細胞膜表面的Opa(colonyopacity-associated)蛋白與黏膜上皮和內皮細胞的CEACAM1受體結合，使其粘附並侵入細胞，以利於吞噬細胞吞噬。Opa蛋白是存在於NG和NM細胞壁上的膜蛋白，是這兩種致病微生物的主要侵襲蛋白。微納米磁粒是通過化學反應產生的以Fe304為核心的超磁性顆粒，其大小為200ηπΓ μ m，具有無磁記憶性，表面積大的特點，可在其表面包裹自由羧基、羥基等基團，再通過偶聯劑與蛋白質等生物大分子結合，目前被用於核酸、蛋白質、細胞的分離純化，腫瘤的定向靶診斷與治療。目前的研究已經克隆表達了CEACAM1細胞外的部分結構域，並獲得純度較高的蛋白，但還沒有相應製備CEACAM1蛋白磁粒複合物，用於淋病奈瑟氏菌的快速分離，以提高臨床診斷的敏感性和特異性的相關技術報導，也沒有CEACAM1與水體藍藻相互作用的報導。
微納米磁粒是後基因組時代生物大分子和細胞分離純化的有力武器，具有快速、特異性高、無毒、無汙染、有利於機械自動化大樣本處理的新技術材料，可在其表面包被帶正電荷的娃、金屬鎳、及不同的蛋白質如蛋白A等,可應用於DNA、RNA> mRNA、抗體、蛋白質、細胞、病毒和細菌的分離純化1-3。但該技術僅國外少數幾個公司(如挪威的Dynabeads)擁有且保密，售價很高，普及受限。CEACAM1屬I型膜蛋白，廣泛存在於白細胞、內皮細胞和上皮細胞的細胞膜上4_6，該蛋白具有許多重要的生物學功能，如能抑制腫瘤及上皮細胞的生長和增殖7』8，抑制T細胞和NK細胞的細胞毒性效應9』1(1，延遲粒細胞和單核細胞的凋亡n，通過調控胰島素的清除而維持細胞對胰島素的敏感性12』13。該蛋白分子量51KDa，由細胞外、跨膜區、胞質內三個結構域組成，胞外結構域與細胞間的同質粘附(homotypic adhesion)和異質粘附(heterotypic adhesion)有關1446,該結構域通過剪切可激活caspase-Ι和_3參與細胞凋亡的調控17。胞內結構域由C端的12 14個胺基酸組成，與細胞生長和信號傳導有關18。CEACAM1在表達時有不同的剪切體，它們的差異主要在胞內結構域，據此分為長短兩型，而胞外結構域是較保守的19』2°。奈瑟氏菌常寄生於動物黏膜表層，Opa是這該類革藍氏染色陰性細菌細胞壁上的粘附蛋白，在細菌粘著及侵入黏膜上皮和內皮細胞中起重要作用，同時它也是中性粒細胞、巨噬細胞及⑶4+T淋巴細胞的免疫調節劑9』14，是該類細菌的主要抗原。Opa蛋白雖然像其它細菌抗原一樣，為逃避宿主免疫，其基因和胺基酸序列會發生突變，但在體外的研究中發現，在絕大部分突變體中，Opa蛋白仍能與CEACAM1結合21_24，其突變區域與其它受體的結合有關，這說明Opa蛋白具有與宿主細胞膜多種受體結合的潛力，但無論怎樣突變，它仍然保持其與CEACAM1結合的最基本的功能。淋病奈瑟氏菌是性傳播疾病淋病的主要病原體。淋病在我國各種法定傳染病中發病率僅次於瘧疾和肝炎居第3位25。大多起病急，傳染性強，近年來其感染率略有下降，但在很多地區仍是優勢病種，及時、準確的診斷，對於淋病的防治具有重要意義。目前臨床對淋病奈瑟氏菌實驗室檢測方法有四種，革蘭氏染色鏡檢；PCR檢測法；細菌培養；試紙法。其中最具臨床價值的是細菌培養，是淋病診斷的「金標準」，但需要2-3天，陽性率20-30%，並且僅在較少部分醫院開展，採用傳統的取樣塗片方法其敏感性僅為10%左右，PCR檢測法雖然敏感性較高，但特異性較低26'27。本發明擬採用自行研發的CEACAM1蛋白磁粒複合物開展淋病奈瑟氏菌的快速分離檢測方法的研究，具有較高的臨床應用及研究價值。 藍藻(bluealgae)又名藍細菌(Cyanobacteria)、藍綠藻(blue-green algae),主要特徵是是原核，不具載色體，色素主要為葉綠素a，貯藏物質主要是藍藻澱粉，細胞壁主要成分為粘肽，革蘭氏陰性，能進行產氧性光合作用。滇池是雲南高原上面積最大的淡水湖泊，素有「高原明珠」之稱。但自20世紀80年代以來，入湖汙染物不斷增力口，導致湖內藍藻大量繁殖，在藻類生長的高峰季節，會形成嚴重的藍藻「水華」現象，現已屬重富營養化水體。2002年的一項調查中共鑑定出浮遊植物106種及變種，隸屬於綠藻門(Chlorophyta)、娃藻門(Bacillariophyta)、藍藻門(Cyanophata)、隱藻門(Cryptophyta)、甲藻門(Pyrrophyta)和裸藻門(Euglenophyta)等6個門。在浮遊植物數量上佔絕對優勢的是藍藻門的微囊藻屬(Mi crocystis Kutz.),尤以銅綠微囊藻(M. aerginosaKutz.)最多，其次是惠氏微囊藻(M. weissenbergi i (Kom.)Kom.1n Kondr.)28 目前，國內外去除藍藻的方法主要有生物法、化學法和物理法三種29。生物法除藻具有綜合效益，但見效慢、周期長。化學藥劑法除藻工藝簡單，操作方便，但是會造成二次汙染，現已較少使用。物理法除藻主要有機械清除、人工打撈、活性炭吸附等方法。其中，機械清除法除藻效果好、處理量大，但成本高；人工打撈、超聲波和電磁波除藻處理量小，只適合小範圍除藻；活性炭吸附對藻類的去除效果很好，但活性炭再生比較困難，因此，處理成本很聞。
發明內容
本發明的目的是提供一種CEACAM1蛋白磁粒複合物，並成功用此複合物對淋病奈瑟氏菌及水體藍藻進行了分離，為淋病奈瑟氏菌的臨床檢測及水體藍藻的分離去除提供一種高效、快捷無汙染的方法。本發明的技術方案是以人體肝細胞cDNA文庫為模板，擴增目的基因人體CEACAM1，通過異源表達技術在大腸桿菌(E. coli BL21)中表達CEACAM1細胞外特定結構域蛋白；通過對該蛋白質進行變復性及凝膠過濾層析，得到可溶的CEACAM1融合蛋白；以Fe3O4為載體，經矽酸包衣，在酸性環境中與矽烷反應、在鹼性環境中與戌二酸酐反應，製成CEACAM1蛋白磁粒。本發明的具體技術步驟為以人體肝細胞cDNA文庫為模板，通過PCR擴增目的基因人體 CEACAM1，所用的一對弓丨物序列為 Ceacaml-F: 5』 -AAAGGATCCATGAGCTGGTACAAAGGGGA-3』 ， Ceacaml-R:5』-GAAACTCGAGTTAGGTGTCTGAAGGGGAAATG-3』 ，將經 BamHI/XhoI 處理過的人體CEACAM1編碼區序列和pET-28a(+)連接構建表達載體；把構建好的表達載體轉化E. coli BL21 (DE3)，經IPTG誘導後，E. coliBL21 (DE3)大量表達包涵體形式的人體CEACAM1 ;包涵體洗滌及重懸浮後，依次經過變性、凝膠過濾層析、復性和二次凝膠過濾層析，獲得可溶的人體CEACAM1 ；以Fe3O4為載體，經矽酸包衣後，先後在酸性環境中與矽烷反應、在鹼性環境中與戌二酸酐反應，製成表面帶有活性羧基的磁性微球；羧化磁珠經結合液清洗並重懸後，加入CEACAM1融合蛋白及偶聯劑，室溫振搖2(Γ24小時，即成為CEACAM1蛋白磁粒複合物。通過此方法製備的CEACAM1蛋白磁粒複合物，核心部分為表面帶有活性羧基的磁性微球，外層為以共價鍵與羧基結合的CEACAM1融合蛋白，整個複合物表面直徑約200nm lumo通過此方法製備的CEACAM1蛋白磁粒複合物可應用於製備分離檢測淋病奈瑟氏菌的複合物中。通過此方法製備的CEACAM1蛋白磁粒複合物可應用於製備分離檢測水體藍藻的複合物中。 本發明的有益技術效果是製備出的CEACAM1蛋白磁粒複合物是表面包被有CEACAM1融合蛋白的磁性微粒，直徑約200nnTlum，具有較大的比表面積，增加了與微生物的結合能力，特異性高，可高效、特異、快速、方便地應用於淋病奈瑟氏菌及藍藻的微生物分離。該方法的技術優點有；構建的pET_28a(+)CEACAMl表達質粒在大腸桿菌中以包涵體的形式表達目的蛋白，經過尿素變復性、凝膠過濾層析可獲得電泳純的有功能的目的蛋白，產量高，生產成本低；CEACAM1蛋白磁粒的製備方法簡單，生產成本較低，對環境無汙染。應用CEACAM1蛋白磁粒分離淋病奈瑟氏菌及藍藻，方法高效、特異、快速、方便，所使用的化學試劑均無毒，並且對環境無汙染；CEACAM1蛋白磁粒可再生使用。
具體實施例方式以人體肝細胞cDNA文庫為模板，通過PCR擴增目的基因人體CEACAMI (NCBIAccessionNo. :NM_001712)，所用引物序列為 Ceacaml-F:5，-GAAAGGATCC ATGAGCTGGTACAAAGGGGA-3，，Ceacaml-R:5，-GAAACTCGAG TTAGGTGTCTGAAGGGGAAATG-3』。將經BamHI/XhoI處理過的人體CEACAMI編碼區序列和pET_28a(+)連接構建表達載體。把構建好的表達載體轉化E. coli BL21(DE3)，經IPTG誘導後，E. coli BL21(DE3)大量表達包涵體形式的人體CEACAMI。包涵體洗滌及重懸浮後，依次經過變性、凝膠過濾層析、復性和二次凝膠過濾層析，獲得較高純度的人體CEACAMI。以Fe3O4為載體，經矽酸包衣後，先後在高溫酸性環境中與矽烷反應、在常溫鹼性環境中與戌二酸酐反應，製成表面帶有活性羧基的磁性微球。羧化磁珠經結合液清洗並重懸後，加入CEACAMI融合蛋白及偶聯劑，室溫振搖20~24小時，即成為CEACAMI蛋白磁粒複合物。往懸浮於結合液中的CEACAMI蛋白磁粒複合物中加入樣本(人體尿道分泌物或者富營養化汙水)，室溫下輕輕振搖1(Γ15分鐘，磁力吸附2分鐘後，棄上清，洗脫液重懸磁粒，取上清檢測。具體步驟如下1.人體CEACAMI編碼區序列的獲得I) PCR擴增體系在PCR反應管中按下列組成配製反應液
權利要求
1.一種CEACAM1蛋白磁粒的製備方法，其特徵是以人體肝細胞cDNA文庫為模板，擴增目的基因人體CEACAM1，通過異源表達技術在大腸桿菌(E. coli BL21)中表達CEACAM1細胞外特定結構域蛋白；通過對該蛋白質進行變復性及凝膠過濾層析，得到可溶的CEACAM1融合蛋白；以Fe3O4為載體，經矽酸包衣，在酸性環境中與矽烷反應、在鹼性環境中與戌二酸酐反應，製成CEACAM1蛋白磁粒。
2.按權利要求1所述的CEACAM1蛋白磁粒的製備方法，其特徵及具體步驟為以人體肝細胞cDNA文庫為模板，通過PCR擴增目的基因人體CEACAM1，所用的一對引物序列為Ceacaml-F:5』-AAAGGATCCATGAGCTGGTACAAAGGGGA-3』 ， Ceacaml-R:5』- GAAACTCGAGTTAGGTGTCTGAAGGGGAAATG-3』，將經BamHI/XhoI處理過的人體CEACAM1編碼區序列和pET_28a(+)連接構建表達載體；把構建好的表達載體轉化萬.coli BL21 (DE3)，經IPTG誘導後，E. coliBL21 (DE3)大量表達包涵體形式的人體CEACAM1 ;包涵體洗滌及重懸浮後，依次經過變性、凝膠過濾層析、復性和二次凝膠過濾層析，獲得可溶的人體CEACAM1 ；以Fe3O4為載體，經矽酸包衣後，先後在酸性環境中與矽烷反應、在鹼性環境中與戌二酸酐反應，製成表面帶有活性羧基的磁性微球；羧化磁珠經結合液清洗並重懸後，加入CEACAM1融合蛋白及偶聯劑，室溫振搖20 24小時，即成為CEACAM1蛋白磁粒複合物。
3.按權利要求1所述的CEACAM1蛋白磁粒的製備方法，其特徵是通過此方法製備的CEACAM1蛋白磁粒複合物，核心部分為表面帶有活性羧基的磁性微球，外層為以共價鍵與羧基結合的CEACAM1融合蛋白，整個複合物表面直徑約200nm lum。
4.一種權利要求1、2或3所述的方法在製備分離檢測淋病奈瑟氏菌的CEACAM1蛋白磁粒複合物中的應用。
5.一種權利要求1、2或3所述的方法在製備分離檢測水體藍藻的CEACAM1蛋白磁粒複合物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種人癌胚抗原相關細胞黏附分子1(CEACAMl)細胞外特定結構域融合蛋白的表達、純化的方法和應用。本發明以人體肝細胞cDNA文庫為模板，擴增目的基因人體CEACAM1，通過異源表達技術在大腸桿菌(E.coliBL21)中表達CEACAM1細胞外特定結構域蛋白；通過對該蛋白質進行變復性及凝膠過濾層析，得到可溶的CEACAMl融合蛋白；以Fe3O4為載體，經矽酸包衣，在酸性環境中與矽烷反應、在鹼性環境中與戌二酸酐反應，製成CEACAMl蛋白磁粒。本發明能大量生產較高純度的人癌胚抗原相關細胞黏附分子1(CEACAMl)細胞外特定結構域，並且以其為基本成分製備了一種微納米磁粒-CEACAM1複合物。現階段研究表明，該複合物可以用於淋病奈瑟氏菌和藍藻的快速分離檢測，具有良好的應用前景。
文檔編號C12R1/89GK103060361SQ201310030348
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月25日 優先權日2013年1月25日
發明者孟照輝, 謝月輝, 李玉葉, 葉秋芳 申請人:昆明醫科大學第一附屬醫院