大腸桿菌TolC抗原及其抗體與應用的製作方法
2023-10-22 14:22:32
專利名稱：大腸桿菌TolC抗原及其抗體與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種抗大腸桿菌TolC片段的抗體。
背景技術：
近年來細菌耐藥日趨嚴峻，成為醫藥界倍受關注的問題。由於抗生素濫用造成細 菌耐藥性問題尤為突出。我國臨床分離的一些細菌對某些藥物的耐藥性已居世界首位。除 耐青黴素的肺炎鏈球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、腸球菌、真菌等多種耐藥菌外，進 入我國僅20多年的喹諾酮類抗生素的耐藥率已經達60%-70%。據報導，包括廣州在內的 國內一些大城市人群感染的金黃色葡萄球菌中，80%已經產生了對青黴素G的耐藥性。凱 福隆、頭孢三嗪等第三代的頭孢類菌抗生素的應用已日趨普遍，抗生素品種的選用明顯超 前。抗生素的濫用主要是由於抗生素生產和銷售管理薄弱、臨床的誤用和濫用、以及將抗生 素作為生長促進劑在動物養殖中廣泛使用所導致。由於在抗生素使用與病原菌耐藥水平之 間存在著一種宏觀的量化關係，即一定範圍內的抗生素使用可以導致病原菌整體耐藥水平 以及耐藥菌感染率的變化。由此，人和動物的腸道正常菌群暴露於抗生素而普遍產生耐藥 性，並通過糞便直接汙染環境、水、食品，導致耐藥菌不斷增加，也使人體接觸耐藥菌的機會 不斷增加。因此耐藥菌的種類非常廣泛。這樣一來，人體如果再獲得耐藥菌的感染治療起 來就比較困難。因此，控制目前已經廣泛存在的耐藥菌已成為一個重要的社會和科學問題。耐藥菌的防制尚不能完全寄托在新抗生素的發現和發明，因為抗生素的生產與發 展伴隨著細菌耐藥性的不斷發展，一種新的抗生素投入使用後，很快就發現有相應的抗性 菌株出現。在細菌中普遍存在的抗藥性是對抗菌藥物的生產開發及對細菌性疾病防治的一 個巨大挑戰，直接危害食品安全和人類健康。對細菌耐藥機理的深入研究，發現其作用靶點 是解決這一難題的關鍵。業已報導，大腸桿菌外膜蛋白TolC是耐藥關鍵蛋白，是AcrAB-TolC藥物外排系統 中重要組成組分。我們先前證明，採用抗TolC可以負調TolC的耐藥作用，起到靶向抑制耐 藥菌生長的目的，但其作用的靶序列不清楚。我們先前採用的抗TolC的抗體，是針對整個 TolC蛋白。根據生物信息分析，整個TolC蛋白具有線性B細胞表位27個，此外還有非線 性B細胞表位。由於每個表位均能夠刺激機體產生免疫應答，故針對整個TolC蛋白至少可 以產生27個各自表位特異性的抗體。由於各表位胺基酸序列不同，其生物學功能亦具有差 異，抗體作用後產生的效應亦存在差異。此外，抗體也存在一定的交叉反應，可以跨物種進 行反應，即所謂的抗體異嗜性現象。因此，採用針對整個蛋白的特異性抗體，具有靶序列特 異性不明確、副反應不清楚的不足，不利於其有關成藥特性的研究。
發明內容
本發明的目的是在於針對現有技術的不足，提供一種針對TolC耐藥關鍵結構域 的抗體，以克服目前的抗體具有靶序列特異性不明確、副反應不清楚的的缺陷，提高抗體的 有效性和安全性。
本發明通過以下技術方案實現上述目的發明提供了一種大腸桿菌(E. coli) TolC抗原，包括如SEQ ID NO :1(SEQ ID NO: 1 :SNGYRDANGI)所示的序列。本發明也提供了一種抗原，由上述大腸桿菌TolC抗原與血藍蛋白偶連。)同時發明保護了編碼如權利要求1所述大腸桿菌TolC抗原的基因片段，具有SEQ ID NO :2 所不的序歹丨J0 SEQ ID NO :2 :agca acggctaccg cgacgcgaac ggcatc。上述兩種抗原可用於製備抗體，所產生的抗體可以與大腸桿菌外膜蛋白TolC特 異結合，從而抑制細菌的耐藥性。該抗體具有針對SEQ ID NO :1胺基酸序列的多肽，由以下 方法獲得根據NCBI公布的E. coli K-12 TolC胺基酸序列，合成SNGYRDANGI片段(簡稱 TolC-十肽)，合成多肽產物與血藍蛋白偶連以提高免疫原性。將人工合成SNGYRDANGI片段 和血藍蛋白的偶連物與福氏完全佐劑混合均勻形成油包水乳劑，注射免疫動物，注射量100 微克-1毫克/只；其後採用福氏不完全佐劑；每次間隔10-20周，第3-5次免疫後的第7-10 天取血，於低溫下靜置，使血清自然析出。可以優選以下方法製備將人工合成SNGYRDANGI 片段TolC-十肽和血藍蛋白的偶連物與福氏完全佐劑1 1 (ν/ν)混合均勻形成油包水，採 用背部多點注射免疫動物家兔，注射量每千克動物體注射為500 μ g/只；其後採用福氏不 完全佐劑，每次間隔2周，第3次免疫後的第10天，心臟取血，擺成最大斜面後在4°C冰箱中 靜置過夜，使血清自然析出。以未與血藍蛋白偶連的合成多肽產物為抗原，採用Dot-ELISA 技術測定效價為1 4000。本發明提供的抗體，可用於製備抑制細菌耐藥性藥物；所述的 細菌為大腸桿菌、痢疾桿菌、沙門氏菌、克氏檸檬酸桿菌、戴阿利斯特桿菌屬、肺炎克雷伯菌 或鏈黴菌。通過大量的試驗證明，本發明的針對SEQ ID NO :1胺基酸序列的多肽特異性抗體 (即抗TolC-十肽)，可以與大腸桿菌TolC基因編碼蛋白TolC的關鍵耐藥結構域結合，具 有非常特異、穩定的靶向性作用，從而抑制耐藥菌的耐藥性。為了進一步驗證發明的有效性和抗耐藥機理，本發明採用基因突變技術，構建了 大腸桿菌TolC片段SNGYRDANGI的突變體TolCl。通過抑菌試驗，證明該突變體的耐藥功能 較野生型明顯下降。這些結果表明，TolC片段SNGYRDANGI對TolC的耐藥功能至關重要。接著製備了 TolC片段SNGYRDANGI的抗體(命名為抗TolC-十肽)，採用體外抗體 靶向療法，證明抗TolC-十肽能夠在含四環素的培養基中明顯抑制包括耐藥大腸桿菌在內 的該種細菌的生長。經抗TolC-十肽處理後的細菌，其生長被抑制的程度與同條件培養下 抗TolC處理的生長情況一致。此結果說明TolC片段SNGYRDANGI是抗TolC負調TolC耐 藥功能的作用靶點。進一步建立了大腸埃希菌外陰感染小鼠模型，通過抗TolC-十肽配合低濃度慶大 黴素可以明顯抑制小鼠外陰細菌感染的試驗，進一步證明TolC片段SNGYRDANGI是抗TolC 負調TolC作用的靶點。研究結果表明，抗TolC-十肽靶向療法能夠明顯抑制耐藥菌的生長，為耐藥菌抗 體靶向療法提供了一個有效的作用靶點。本發明通過構建TolC片段的突變體TolCl，以及製備針對此片段即SNGYRDANGI的 抗血清，尋找到最為關鍵的TolC抗體靶向抑制耐藥菌生長的作用靶點——SNGYRDANGI，從 而建立針對性強、目標明確的抗體靶向作用提高耐藥菌對抗生素敏感性的技術方法。同時針對該結果，提供了抗TolC-十肽，作為抗大腸桿菌TolC的抗體，該抗體所針對的胺基酸序 列僅為10個胺基酸，經預測不含有B細胞表位。我們製備的針對該序列的特異性抗體可靈 敏而特異地結合到靶向位點上，從而克服了現有技術中的多個B細胞表位容易產生抗體異 嗜性、靶序列特異性不明確、副反應不清楚等缺陷，使用更安全。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果(1)本發明所提供的抗TolC片段SNGYRDANGI的抗體，明確了所作用的靶序列位 點，消除了原有針對整個蛋白質所有位點抗體可能存在的副作用，可以特異而有效地抑制 細菌的耐藥性蛋白的耐藥功能，從而克服細菌耐藥性問題。(2)本發明所提供的抗體，比現有的抗體在作為藥物的應用上，具有更高的安全性 和操作性。
圖1為大腸桿菌K12的tolC基因PCR擴增(A)、重組子雙酶切(B)及其誘導表達 (C)。圖2為大腸桿菌K12 tolCl基因PCR擴增(A、B)、重組子雙酶切(C)及其誘導表 達⑶。圖3為TolC短片段結構域SNGYRDANGI突變體tolCl基因功能研究。圖A和B為 TolCl基因在基因補救菌株(AtolC-pET-28a-tolCl)中的表達研究，A為聚丙烯凝膠電泳 分析，B為Western blotting分析。圖C為最低抑菌濃度分析，圖D為生存率分析。(注 A tolC為tolC基因缺失菌株)圖4為抗TolC-十肽對細菌生長的抑制作用。A，免疫前血清、抗TolC和抗TolC-十 肽分別處理對TC-R，TC-R-0和A tolC在加和不加四環素培養基中生長的影響。B，A的抑 制率比較圖5為抗TolC-十肽對小鼠外陰感染的治療作用。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發 明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1TolC基因的克隆、原核表達、蛋白純化及兔抗血清的製備在該實施例中，將全長的大腸桿菌TolC編碼序列或片段構建入大腸桿菌蛋白質 原核表達載體之中，以達到表達和提純目的蛋白。TolC基因編碼序列如SEQ ID NO 3所示。SEQ ID NO 3 1 atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc61 caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt121 aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta
181ctgccacagctaggtttaggtgcagattacacctatagcaacggctaccgcgacgcgaac
241ggcatcaactctaacgcgaccagtgcgtccttgcagttaactcaatccatttttgatatg
301tcgaaatggcgtgcgttaacgctgcaggaaaaagcagcagggattcaggacgtcacgtat
361cagaccgatcagcaaaccttgatcctcaacaccgcgaccgcttatttcaacgtgttgaat
421gctattgacgttctttcctatacacaggcacaaaaagaagcgatctaccgtcaattagat
481caaaccacccaacgttttaacgtgggcctggtagcgatcaccgacgtgcagaacgcccgc
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TolC胺基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
SEQID NO 4
1mkkllpiliglslsgfsslsqaenlmqvyqqarlsnpelrksaadrdaafekinearspl
61lpqlglgadytysngyrdanginsnatsaslqltqsifdmskwraltlqekaagiqdvty
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1. TolC基因的克隆
根據NCBI公布的大腸桿菌K12的基因序列，設計一對引物。引物序列如下正義引物(SEQ ID NO 5) :5，hCGA GAA TTC ATG CAA ATG AAG AAA-3，，反義引物(SEQ ID NO:
6) :5，-GGT AAG CTT TCA GTT ACG GAA AGG G_3，。為便於克隆和表達載體的構建，在引物 上分別引入限制性內酶位點EcoR I和Hindlll。引物由大連寶生物工程公司合成。以熱變 性法獲得的大腸桿菌K12全基因組為模板，通過PCR反應獲得目的條帶(圖1A，泳道1為
6DNA分子量標準，泳道2為目的條帶)。用限制性內酶EcoR I和Hindlll分別酶切回收的 DNA片斷和pET-His (Novagen)表達載體，參照Takara公司的使用說明書進行連接反應，連 接產物轉化E. coli DH5 a感受態，通過雙酶切(圖1B，泳道1為DNA分子量標準，泳道2為 目的條帶)和序列測定重組子的正確性，結果證明與資料庫公布序列完全一致。2.TolC基因的表達將正確的重組質粒以熱激法轉化大腸桿菌BL21表達菌，37°C培養12_16小時。接 種單菌落於含氨苄青黴素(Amp)的LB液體培養基中，同時接種含有pET-HIS質粒的BL21 作為對照，於30°C培養至0D(600nm)值0.6，加入IPTG 100 u g/mL 35°C誘導2個小時，離心 收集菌體，用SDS-PAGE檢測插入片段是否表達蛋白，以及表達蛋白的分子量大小。接著，進 行蛋白表達產物為可溶組分抑或是不溶組分(包涵體)的鑑定。具體過程如下將離心後 沉澱重懸於1/10體積的PBS或50mmol/L Tris緩衝液(pH8. 0)中；加入溶菌酶至100 u g/ mL，保溫30分鐘；反覆凍融數次以破壞細胞壁，用超聲波處理剪切DNA(超聲波的強度以不 能產生氣泡為適宜；裂解的時間根據實際情況掌握，一般將雲霧狀的細菌懸浮物裂解至比 較清朗即可)；離心(12，OOOrpm) 15分鐘後將培養物分為可溶部分和不溶部分；將15 y L上 清與4yL 4XSDS樣品緩衝液混合，將沉澱物重懸於1XSDS樣品緩衝液；將表達樣品(上 清及沉澱)和非表達對照物進行SDS-PAGE電泳並以考馬斯亮藍染色以便在預計分子量範 圍內觀察表達蛋白帶。經鑑定表達產物為可溶蛋白。表達後的圖譜如圖1C(泳道1為蛋白質分子量標準，泳道2和3分別為pET_28a 和目的基因誘導表達)所示。由圖可見，E. coli K-12 tolC基因確實已經連接到pET-28a 載體上，並能在E. coli BL21中成功表達，其重組蛋白大小約為53. 9kDa，與其實際分子量 相符。3. TolC基因產物的純化大量培育菌體，離心後超聲處理，離心收集上清用Ni-NTA His親和柱純化。採用 pH5. 9 (buffer F)和pH4. 5 (buffer G)兩個不同pH值的緩衝液純化蛋白。用衝洗緩衝液 buffer E(8mol/L 尿素，0. lmol/L NaH2P04，lOmmo 1/LTr is-He l，pH 6. 3)洗滌 5 次，每次 lmL; 用洗脫緩衝液 buffer F(8mol/L 尿素，0. lmol/LNaH2P04,10mmol/LTris-HCl, pH 5.9)洗脫 目的蛋白4次，每次lmL，收集洗脫液；用洗脫緩衝液buffer G(8M尿素，0. lmol/L NaH2P04, 10mmol/LTris-HCl,pH 4. 5)洗脫蛋白4次，每次lmL，收集洗脫液。取收集液進行SDS-PAGE 分析。純化蛋白進行紫外檢測，測定蛋白含量。4.兔抗血清的製備將純化蛋白溶液與福氏完全佐劑1 l(v/v)混合均勻形成油包水，採用背部多點 注射免疫家兔，注射量為500 u g/只；其後採用福氏不完全佐劑，每次間隔2周，第3次免疫 後的第10天，心臟取血，將得到的血擺成最大斜面後在4°C冰箱中靜置過夜，使血清自然析 出。通過Dot-ELISA測定效價為1 8000。分裝，_80°C保存。實施例2TolC片段SNGYRDANGI突變基因(tolCl)的克隆1. TolC片段突變基因tolCl引物的設計以疏水胺基酸替換為其它疏水胺基酸、親水胺基酸替換為其它親水胺基酸為原 則，對TolC胺基酸序列中片段SNGYRDANGI進行胺基酸替換，替換結果為RQCATKFHCL。在
7tolC基因的核苷酸序列中，找到該胺基酸序列相應的核苷酸序列(SEQ ID N0:7) 5' -AGC AAC GGC TAC CGC GAC GCG AACGGC ATC-3』，根據胺基酸的密碼子，該核苷酸序列相應地被 替換為(SEQ IDN0 8) :5，-CGT CAG TGC GCT ACT AAG TTC CAT TGC CTG-3，。因此，根據 tolC基因的核苷酸序列進行短片段突變tolC基因(命名為tolCl)5』端和3』端兩對引物 的設計(表1)，同時分別在5』正向引物及3』端反向引物中引入EcoRI和Hindlll酶切位 點(橫線所示)，以進行融合PCR。tolCl-5』端反向引物的3』端從197位核苷酸處開始， tolCl-3，端正向引物5，端從216位核苷酸處開始，因此tolCl-5，端和tolCl-3，端兩條引 物共有27個核苷酸的重疊，以利於融合PCR的進行。表ltolCl引物序列
權利要求
大腸桿菌TolC抗原，其特徵在於包括如SEQ ID NO1所示的序列。
2.一種抗原，其特徵在於由權利要求1所述的抗原與血藍蛋白偶連。
3.編碼如權利要求1所述大腸桿菌TolC抗原的基因片段。
4.如權利要求3所述的基因片段，其特徵在於具有SEQID NO :2所示的序列。
5.如權利要求1或2所述的抗原在製備抗體方面的應用，所述抗體用於抑制細菌耐藥性。
6.與權利要求1所述的大腸桿菌TolC抗原特異結合的抗體。
7.如權利要求6所述的抗體，其特徵在於由以下方法獲得根據NCBI公布的E.coli K-12TolC胺基酸序列，合成SNGYRDANGI片段，合成多肽產物與血藍蛋白偶連以提高免疫原 性；將人工合成SNGYRDANGI片段和血藍蛋白的偶連物與福氏完全佐劑混合均勻形成油包 水乳劑，注射免疫動物，注射量100微克-1毫克/只；其後採用福氏不完全佐劑；每次間隔 10-20周，第3-5次免疫後的第7-10天取血，於低溫下靜置，使血清自然析出。
8.如權利要求6所述的抗體在製備抑制細菌耐藥性藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於所述的細菌為大腸桿菌、痢疾桿菌、沙門氏 菌、克氏檸檬酸桿菌、戴阿利斯特桿菌屬、肺炎克雷伯菌或鏈黴菌。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種大腸桿菌TolC抗原及抗體，該抗體具有特異性針對SEQ ID NO1所示的序列。本發明同時提供了編碼該大腸桿菌TolC抗原的基因序列；以及該抗體在製備抑制細菌耐藥性藥物中的應用。本發明所提供的抗TolC片段SNGYRDANGI的抗體，提高了細菌對抗生素的敏感度，可以特異而有效地抑制大腸桿菌的耐藥外膜蛋白TolC的功能，從而克服細菌耐藥性問題。本發明所提供的抗體，比現有的抗體在作為抗細菌耐藥性藥物的應用上，具有更高的安全性和操作性。
文檔編號C07K14/795GK101974072SQ20101051322
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者彭宣憲, 李惠 申請人:中山大學