優化的牛凝乳酶原基因及其分泌表達方法和應用的製作方法

2023-10-22 02:20:52 1

優化的牛凝乳酶原基因及其分泌表達方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了優化的牛凝乳酶原基因及其分泌表達方法和應用。本發明綜合考慮密碼子使用頻率、GC含量的調整、不穩定序列的刪除、mRNA二級結構及密碼子分布不同而引起的蛋白翻譯速率之間的差異等影響因素，按照畢赤酵母的偏愛密碼子對牛凝乳酶原基因進行改造分別獲得SEQ?ID?NO.1、2、3所示的優化的牛凝乳酶原基因。本發明還提供了一種重組牛凝乳酶原的生產方法，包括：將含有優化的牛凝乳酶原基因的重組表達載體轉化宿主細胞，得到重組菌株；培養重組菌株，誘導重組牛凝乳酶原的表達，回收並純化所表達的產物。相比原始牛凝乳酶原基因，優化後的牛凝乳酶原基因在畢赤酵母中的分泌表達量以及酶活均有顯著提升。
【專利說明】優化的牛凝乳酶原基因及其分泌表達方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及優化的凝乳酶原基因，尤其涉及將來源於牛凝乳酶原基因進行密碼子優化後所得到的凝乳酶原基因，本發明還涉及優化的凝乳酶原基因在生產凝乳酶中的應用，屬於重組凝乳酶的製備領域。
【背景技術】
[0002]乾酪營養豐富，味道鮮美，貯存期長且種類繁多，是世界食品中的重要組成部分，素有「乳製品之王」之稱。在乾酪的生產工藝過程中，凝乳是影響乾酪產率和品質的關鍵性工藝。凝乳酶(chymoSin，EC3.4.23.4)是製造乾酪的凝乳過程中起凝乳作用的關鍵性酶，它是天冬氨酸蛋白酶中的一種，能夠專一性裂解k-酪蛋白中的Pheici5Jfetltl6肽鍵，弓丨起乳蛋白凝聚，在乳製品特別是乾酪加工中具有重要作用，同時凝乳酶對乾酪的質構和特有風味的形成起著非常重要的作用。
[0003]傳統的凝乳酶主要是通過宰殺未斷奶小牛從其皺胃中提取，凝乳酶在小牛皺胃中以含381個胺基酸的前體聚肽一凝乳酶原前體的形式合成，在分泌過程中，會去掉16個信號肽形成含有365個胺基酸的凝乳酶原，大小為40.SkDa0凝乳酶原無活性，在酸性條件下會自動催化，去掉N端42個胺基酸形成有活性的凝乳酶，該酶含有323個胺基酸，大小為35.6kDa。隨著乾酪產業的劇增，小牛皺胃提取的凝乳酶無法滿足需求。目前使用較多的代替品主要是羊、豬和雞的胃蛋白酶，但是這些酶都具有較強的蛋白分解能力，單獨製作的乾酪都會存在出現苦味、凝乳時間長、質地較軟，出品率低等問題。近年來，一些研究者也從水生動物中提取到了凝乳酶，如鱉魚胃粘液中發現具有凝乳活性的酸性蛋白酶，Kristinsson等人從海豹的胃和胃粘液中提取出一種在PH值為6.0-6.8範圍內有很好凝乳活性的蛋白酶，用該蛋白酶製造出的乾酪風味正常，適合商業化生產，是牛皺胃酶的潛力替代品。
[0004]儘管研究人員發現了一些動物源的牛凝乳酶替代品，但動物資源仍不如植物和微生物豐富，因此，各國學者紛紛將研究目標轉向植物和微生物源凝乳酶。許多植物蛋白酶都具有凝乳的功能，主要分布在植物的果實、葉、莖和根等部位。世界凝乳酶中這類酶用量約佔1%左右。目前已報導的植物來源凝乳酶主要為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、合歡樹蛋白酶等。由於動物和植物來源凝乳酶的局限性，微生物凝乳酶逐漸被人們所關注和研究。微生物源的凝乳酶具有來源廣泛、生長周期短，產量大、便於提取、利於工業化大規模生產等優勢。迄今未止，已有40多種微生物可產生具有一定凝乳活力的蛋白酶，主要是細菌、放線菌和真菌。目前應用最多的微生物來源凝乳酶是由微小毛黴(Mucor pusillus)產生的，該酶的蛋白分解能力比牛凝乳酶強，但比其它來源的蛋白酶弱。其它常見的用於產凝乳酶的微生物有米根黴(Rhizopus oryzae)、寄生內坐殼菌(Endothaparasitisa)、根毛黴屬(Rhizomucor)等。與植物來源凝乳酶相比,微生物來源的凝乳酶製作的乾酪的質量和品質都有所提高，但在正常巴氏殺菌條件下，因其較高的耐熱性，會造成乳清中蛋白酶活性較高，影響後期工作。與牛凝乳酶比較後，其凝乳酶活性與蛋白酶活性比值(c/p)仍然偏低，乾酪質量較差，且成熟乾酪風味也有所改變，還會伴隨苦味。[0005]隨著基因工程的飛速發展，利用DNA重組技術實現動物凝乳酶在微生物宿主中表達逐漸成為生產凝乳酶的一個新的有效途徑。基因工程凝乳酶主要是將動物性的凝乳酶基因導入微生物宿主細胞中進行表達，從而緩解天然凝乳酶緊缺的狀況，滿足奶酪工業的生產。目前，已有多種動物來源凝乳酶在不同的微生物表達系統中進行了表達。1980年，Uchiyama等首次在體外成功翻譯出牛凝乳酶mRNA並嘗試在大腸桿菌中生產凝乳酶。之後Nishimori等構建了用於表達牛凝乳酶原cDNA的表達質粒pCR301，並成功表達在宿主細胞的細胞漿中。Beppu等人利用凝乳酶原cDNA在大腸桿菌中表達，表達產物最終以包涵體的形式在細胞內積累。雖然用原核表達系統生產凝乳酶已經取得了許多進展，但是表達產物多以包涵體的形式存在，給後續工作帶來困難，同時還會引起細胞膜脆弱、細胞呼吸能力和繁殖能力喪失等問題。真核表達系統具有不產生內毒素、能夠進行翻譯後修飾、下遊提取方便和易被消費者接受等優點，被越來越多的應用於外源蛋白的生產當中。常用的真核表達系統主要是酵母表達系統和絲狀真菌表達系統。Ward等利用泡盛麴黴作為表達宿主，構建了一個牛凝乳酶原基因與葡萄糖澱粉酶基因(glaA)融合的表達載體，重組質粒轉移到麴黴中，得到大量凝乳酶並分泌到胞外。2004年，Vega-Hemandez MC等成功克隆了公山羊的凝乳酶原基因於酵母中並表達，經過乳品凝集試驗證明獲得了有活性的凝乳酶。2008年，Vallejo等構建了牛凝乳酶前體、牛凝乳酶原和牛凝乳酶三種表達載體並轉化至畢赤酵母，通過誘導測定，只有凝乳酶原形式的表達載體能夠產生有活性的牛凝乳酶。馮鎮等成功的構建了凝乳酶原酵母分泌型表達載體，並在乳酸克魯維酵母GG799中得到了分泌表達。2009年，張莉等將牛凝乳酶原基因插入到酵母表達載體pPICZaA a，構建的表達質粒線性化後電轉化畢赤酵母GS115菌株，在甲醇誘導下進行凝乳酶的表達，培養基上清液中凝乳酶的活性為12.2SU/mL。該研究為國內首次應用畢赤酵母表達牛凝乳酶。2010年，袁偉等人通過對牛凝乳酶原進行密碼子優化改造後轉入乳酸克魯維酵母GG799菌株中，培養96h後，從上清檢測到凝乳活力最高可達到99.67SU/mL，為國內外首次對經密碼子優化的牛凝乳酶原基因在乳酸克魯維酵母中獲得表達(袁偉等，牛凝乳酶原基因的合成及其在乳酸克魯維酵母中的表達?生物工程學報，2010年9月25 ;26 (9): 1281-1286)。
[0006]綜上所述，牛凝乳酶原基因乃至文獻中公開的優化的牛凝乳酶原基因在畢赤酵母中的表達均存在分泌表達量低`、所表達的重組牛凝乳酶酶酶活較低等缺陷，有待改進。

【發明內容】

[0007]本發明主要目的是針對原始的牛凝乳酶原基因或文獻中公開的優化的牛凝乳酶原基因在酵母菌株中表達時所存在的分泌表達量較低、酶活不高的問題，提供一種新的密碼子經過改造且mRNA 二級結構穩定性好的優化的牛凝乳酶原基因，該牛凝乳酶原優化基因在酵母菌株中分泌表達量高，所表達的重組牛凝乳酶酶活有顯著提升；
[0008]本發明目的之二是提供含有該優化的牛凝乳酶原基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的重組宿主細胞；
[0009]本發明目的之三是利用所述的優化的牛凝乳酶原基因生產重組牛凝乳酶原；
[0010]本發明的目的之四是提供一種提高原始的牛凝乳酶原基因或優化的牛凝乳酶原基因在畢赤酵母中分泌表達量的方法。
[0011]為實現上述目的，本發明首先將牛凝乳酶原原始基因進行密碼子優化等修飾改造得到三條不同的優化的牛凝乳酶原基因，分別命名為pcm, pcm-1,和pcm-2,其中，pcm的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示、pcm-1的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示、pcm_2的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。
[0012]本發明為克服由於牛凝乳酶原原始基因和畢赤酵母在密碼子使用頻率上的差異所帶來的低水平表達的問題，根據畢赤酵母密碼子的偏愛性對牛凝乳酶原原始基因(PCW)(SEQ ID N0.4所示)在不改變其蛋白質胺基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率、GC含量的調整、不穩定序列的刪除、mRNA 二級結構等影響因素，按照巴斯德畢赤酵母的偏愛密碼子首先對牛凝乳酶原原始基因(pew)進行修飾改造，進而考慮到在mRNA翻譯過程中，密碼子使用頻率越高，其翻譯速率越快，反之則越慢。但活性蛋白的表達量除了與密碼子整體使用頻率相關外，還與密碼子的分布情況相關。在密碼子優化過程中，並不能將所有的區段都改造為較快翻譯速率的密碼子，而是需要進行合理搭配，這樣才能保證翻譯速率和蛋白質摺疊速率向匹配。因此，設計了三個密碼子使用頻率相同但分布情況不同(蛋白翻譯速率不同)的三條序列(pcm，pcm-1, pcm-2)，三條序列所示的優化後的牛凝乳酶原基因分別為SEQ ID N0.USEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，這三條優化的序列與原始基因相比，均改變218個鹼基，佔鹼基總數的19.8% ;涉及187個胺基酸，佔胺基酸總數的51.2%。優化後的基因的GC含量由57.4降為47.3% ;此外，相比原始基因，優化後牛凝乳酶原基因的mRNA二級結構自由能也得到了較大幅度的提高，降低了轉錄能量屏障，提高了轉錄效率，最終有效提高了在畢赤酵母中的分泌表達量和酶活。
[0013]本發明另一目的是提供含有所述優化的牛凝乳酶原基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的重組宿主細胞；
[0014]優選的，所述重組表達載體是重組真核表達載體，更優選為重組酵母表達載體，最優選為重組畢赤酵母(Pichia pastoris)表達載體。
[0015]所述的重組宿主細胞優選為重組酵母細胞，更優選為重組畢赤酵母(Pichiapastoris)細胞。
[0016]將優化的牛凝乳酶原基因可操作的與酵母的表達調控序列相連就可得到在酵母細胞中分泌表達牛凝乳酶原的重組酵母表達載體；為了達到更好的分泌表達效果，本發明將優化的牛凝乳酶原基因可操作的與畢赤酵母的表達調控序列相連得到在畢赤酵母細胞中分泌表達重組牛凝乳酶原的重組畢赤酵母表達載體。
[0017]本發明所述的酵母細胞包括能夠表達優化的牛凝乳酶原基因的各種酵母中的任何一種酵母細胞。選擇用於表達重組牛凝乳酶原的合適酵母是在所屬領域的普通技術人員的能力範圍之內。在選擇用於表達的酵母宿主中，合適的宿主可包括具有例如良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好的可溶蛋白產生和總體穩固等特性的酵母。這些酵母包括但不限於產子囊酵母(內孢黴目(Endomycetales)、擔孢子酵母和屬於半知菌(芽孢綱(Blastomycetes))類的酵母。所述產子囊酵母分為兩科，即:蝕精黴科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。後者包含四個亞科，Schizosaccharomycoideae (例如裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces))> Nadsonioideae>Lipomycoideae和Saccharomycoideae (例如畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和酵母屬(Saccharomyces)。擔抱子酵母包括 Leucosporidium 屬、紅冬抱酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、Filobasidium屬和線黑粉菌屬(Filobasidiella)0
[0018]優選的,本發明所述的酵母為畢赤酵母(Pichia pastoris)。
[0019]用於酵母表達載體的表達調控序列對於所屬領域的普通技術人員是眾所周知的，包括但不限於來自諸如以下基因的啟動子區域:
[0020]醇脫氫酶(ADH)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、磷酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸變位酶和丙酮酸激酶(PYK)。其它用於酵母宿主的合適啟動子序列包括用於3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.(1980)255:2073)及其它諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構酶和磷酸葡糖異構酶的糖解酶的啟動子(Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900 ；Hess et al., J.Adv.ENZYMEREG.(1968)7:149)。酵母增強子也可與酵母啟動子一起使用。此外，合成啟動子也可起到酵母啟動子的作用。酵母啟動子可包括具有結合酵母RNA聚合酶和起始轉錄的能力的天然產生的非酵母來源的啟動子，可包含部分酵母表達載體的其它控制元件包括例如來自 GAPDH或烯醇化酶基因的終止子(Holland et al.，J.Biol.Chem.(1981)256:1385)。用於酵母中的合適選擇基因是存在於酵母質粒中的trpl基因，所述trpl基因提供用於缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株的選擇標記。
[0021]進一步的，本發明提供了一種生產重組牛凝乳酶的方法，包括^fSEQID N0.USEQID N0.2或SEQ ID N0.3所示的優化的牛凝乳酶原基因可操作性的與表達載體相連接得到重組表達載體；將所述重組表達載體轉化宿主細胞，得到重組菌株；培養重組菌株，誘導重組牛凝乳酶的表達，回收並純化所表達的重組牛凝乳酶，即得。
[0022]上述生產重組牛凝乳酶的方法中，所述的重組表達載體優選為重組真核表達載體，進一步優選為重組酵母表達載體，更優選為重組畢赤酵母表達載體；所述的宿主細胞優選為酵母細胞，更優選為畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
[0023]將優化的牛凝乳酶原 基因轉化到酵母宿主中的方法對所屬領域的普通技術人員是眾所周知的。舉例而言，酵母轉化可根據以下文獻中描述的方法進行:Hsial et al.，P.Natl.Acad.SC1.USA(1979) 76:3829 和 Van Solingen et al., J.Bact.(1977) 130:946 ;也可按照通常在 SAMBR00K et al., Molecular Cloning:A Lab Manual (2001)中所述的方法進行轉化，諸如通過核注射、電穿孔或原生質體融合等方式，將牛凝乳酶原優化基因引入到酵母細胞中；只要構建了重組宿主細胞菌株(即將重組酵母表達載體引入酵母細胞中並分離具有合適表達載體的重組酵母宿主細胞)，則在適於產生重組牛凝乳酶原的條件下培養重組宿主細胞菌株，培養重組宿主細胞菌株的方法依賴於所用表達載體的性質和宿主細胞的特性，這對所屬領域的普通技術人員來說屬於常規的技術手段，其包括但不限於發酵罐、振蕩燒瓶、流化床生物反應器、空心纖維生物反應器、轉瓶培養系統和攪拌槽生物反應器系統等方法，這些方法的每一種都可以採用分批、補料或連續模式等方法進行，同時以分批或連續型式採集細胞或採集培養物上清液。在含有碳、氮和無機鹽的可吸收源和視情況含有維生素、胺基酸、生長因子及其它眾所周知的蛋白培養補充物的液體培養基中培養重組宿主細胞。用於培養宿主細胞的液體培養基可視情況含有抗生素或抗真菌劑以防止不希望的微生物生長和/或含有包括但不限於抗生素的化合物以選擇含有表達載體的宿主細胞。
[0024]用於在酵母宿主細胞中表達異源蛋白的其它方法對所屬領域的普通技術人員是眾所周知的。可在擴增階段使用所屬領域的普通技術人員眾所周知的標準補料發酵法(standard feed batch fermentation method)使酵母宿主菌株在發酵罐內生長。所述發酵法可經調適以解決特定酵母宿主的碳利用路徑或表達控制模式中的差異。舉例而言，酵母屬酵母宿主的發酵可能需要單個葡萄糖、複合氮源(例如酪蛋白水解產物)和多種維生素補充。通常為碳的生長限制營養素可在擴增階段加入發酵罐中以允許最大生長。另外，發酵法通常應用設計為含有足夠量的碳、氮、基本鹽、磷及其它次要營養素(例如維生素、微量礦物質和鹽等)的發酵培養基。[0025]除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0026]術語「酵母宿主」或「酵母宿主細胞」包括可用作或者已經用作重組載體或其他轉移DNA的接受體的酵母。所述術語包括已經接收重組載體或其它轉移DNA的原始酵母宿主細胞的後代。由於偶然或有意的突變，單個親本細胞的後代可不必在形態上或與原始親本互補的基因組或總DNA上完全一致。
[0027]術語「重組宿主細胞」或「宿主細胞」意指包括外源性多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉導、f?配對或所屬領域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持為例如質粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。
[0028]術語「多核苷酸」意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似於參考核酸的結合特性並以類似於天然產生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷醯胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限於)簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡併密碼子取代(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081(1991) ; Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Cassol et al., (1992);Rossolini et al., Mol Cell.Probes8:91-98(1994))。
[0029]術語「多肽」、「肽」和「蛋白」在本文中互換使用以意指胺基酸殘基的聚合物。SP，針對多肽的描述同樣適用於描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述術語適用於天然產生胺基酸聚合物以及其中一個或一個以上胺基酸殘基為非天然編碼胺基酸的胺基酸聚合物。如本文中所使用，所述術語涵蓋任何長度的胺基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中胺基酸殘基經由共價肽鍵連接。
[0030]術語「表達」指外源基因在宿主細胞中的轉錄和/或翻譯。
[0031]術語「轉化」指將外源基因引入到宿主細胞中的方法。
[0032]術語「外源基因」指對特定的宿主細胞而言，該基因序列是屬於外來的來源，或是來自相同的來源但其原始序列進行了修飾或改造。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1牛凝乳酶原原始基因(pew)的密碼子使用頻率。
[0034]圖2優化的牛凝乳酶原基因(pcm、pcm_l、pcm_2)的密碼子使用頻率。[0035]圖3牛凝乳酶原原始基因(pew)和優化基因(pcm、pcm_l、pcm-2)翻譯速率的比較。
[0036]圖4酵母重組表達質粒pPIC9_pcw(pcm、pcm-1、pcm-2)的構建示意圖。
[0037]圖5轉優化基因pcm-1酵母重組子的復篩凝乳酶酶活結果。
[0038]圖6轉優化基因pcm-2酵母重組子的復篩凝乳酶酶活結果。
[0039]圖7轉優化基因pcm酵母重組子的復篩凝乳酶酶活結果。
[0040] 圖 8 轉 pew (pcw_105#)、轉 pcm_l (pcml_220#)、轉 pcm_2 (pcm2_116#)、轉pcm(pcm-4#)的酵母菌株3升發酵罐中牛凝乳酶原酶活結果。
[0041]圖9pcm-4#酵母菌株在3升發酵罐中牛凝乳酶原經甲醇誘導不同時間內的表達量的SDS-PAGE ；M:蛋白分子量marker。
【具體實施方式】
[0042]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0043]說明:以下具體實施例中所用到重組遺傳學技術均為本領域中的常規技術。在以下實施例中未作詳細介紹的技術，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關章節或部分來進行，包括:Sambrook et al, Molecular Cloning, ALaboratory Manual (第 3 版? 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression:ALaboratory Manual(1990) ；CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al, 1994)。
[0044]實施例1凝乳酶原始基因的優化
[0045]1.1凝乳酶原原始基因的優化
[0046]選用了牛來源的凝乳酶原基因pew (GenBank Accession N0.FJ768675.1)為原始基因序列。凝乳酶原原始基因(pew)全長1098bp(SEQ IDN0.4)，編碼365個胺基酸和一個終止密碼子。通過對牛凝乳酶原原始基因序列特徵的分析，按照不改變蛋白質胺基酸序列的原則，綜合考慮密碼子使用頻率，GC含量，常用酶切位點，酵母不穩定序列ATTTA、AACCAA、AATAA，翻譯起始區mRNA 二級結構等多種影響因素，按照巴斯德畢赤酵母密碼子的偏愛性對牛凝乳酶原基因序列進行初步改造。共改變218個鹼基，佔鹼基總數的19.8% ;涉及187個胺基酸，佔胺基酸總數的51.2%。改造前後密碼子使用頻率如圖1和圖2。修飾改造後獲得優化的牛凝乳酶原基因分別為pcm、pcm-1、pcm-2，其核苷酸序列分別為SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3所示，其GC含量由57.4降為47.3%(表1);優化後的基因(pcm、pcm-1、pcm-2)通過軟體預測(RNA structure4.5),其mRNA 二級結構自由能相比pew (SEQID N0.4)得到了較大幅度的提高，這樣有利於降低轉錄能量屏障，提高轉錄效率，進而提高蛋白表達量(表2)。同時，優化前後基因的mRNA的二級結構也發生了很大的改變，優化基因的mRNA 二級結構減少了髮夾結構，更加簡單，有利於基因的轉錄。此外，3條優化基因雖然密碼子的使用頻率相同但由於在序列中的位置有差異，所以造成蛋白翻譯速率間有差異(圖3)。這三條優化序列人工合成後連接在通用載體上,構建質粒pGH-pcm-l,pGH-pcm-2,pGH—pcm。[0047]表1凝乳酶原基因優化前後的鹼基組成比較
【權利要求】
1.優化的牛凝乳酶原基因，其特徵在於:其核苷酸序列為SEQID N0.1、SEQ ID N0.2或 SEQ ID N0.3 所示。
2.含有權利要求1所述優化的牛凝乳酶原基因的重組表達載體。
3.按照權利要求2所述的重組表達載體，其特徵在於:所述的重組表達載體是重組真核表達載體。
4.按照權利要求3所述的重組表達載體，其特徵在於:所述的重組真核表達載體是重組酵母表達載體，優選為重組畢赤酵母(Pichia pastoris)表達載體。
5.含有權利要求2-4任何一項所述重組表達載體的重組宿主細胞。
6.按照權利要求5所述的重組宿主細胞，其特徵在於:所述重組宿主細胞是重組酵母細胞，優選為重組畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
7.—種重組牛凝乳酶的生產方法，包括:將權利要求1所述的優化的牛凝乳酶原基因可操作性的與表達載體相連接得到重組表達載體；將所述重組表達載體轉化宿主細胞，得到重組菌株；培養重組菌株，誘導重組牛凝乳酶的表達，回收並純化所表達的重組牛凝乳酶，即得。
8.按照權利要求7所述的方法，其特徵在於:所述的重組表達載體優選為重組真核表達載體，優選為重組酵母表達載體，更優選為重組畢赤酵母表達載體。
9.按照權利要求7所述的方法，其特徵在於:所述的宿主細胞為酵母細胞，優選為畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
【文檔編號】C12N9/64GK103484488SQ201310421943
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月16日 優先權日:2013年9月16日
【發明者】張偉, 張宇宏, 劉波, 張豔麗 申請人:中國農業科學院生物技術研究所