一種新的人蛋白質及其編碼序列,及製法和用途的製作方法

2023-10-22 15:23:52 1

專利名稱：一種新的人蛋白質及其編碼序列,及製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種新的人蛋白質及其核苷酸編碼序列。更具體地說，本發明涉及人ARL5的cDNA序列，該蛋白是鼠ARL5的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
ADP核糖基化因子(ADP ribosylation factor，簡稱為「ARF」)是分子量為20KD左右的鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(Trends Biochem.Sci.1995，20，147-150；Cell.Signal.1992.4.367-399；Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.1993，45，47-65；Nature1994，372，704-708)。哺乳動物的ARF家族至少有六個成員，即ARF1至ARF6，而在酵母中則至少已發現了三個成員。另外ARF家族還包括了一些與ARF高度同源，但缺乏霍亂毒素輔助因子活性的蛋白；此外，與ARF不同的是，這些蛋白在與GTP結合時依賴於鎂離子與磷脂，因此這些蛋白被統稱為ARL蛋白(ARF樣蛋白，ARF-like protein)。另外，ARF蛋白的氨基端能被肉豆蔻醯基化，ARF豆蔻醇化被認為有利於ARF作用，而在ARL中則沒有發現這一特點。
哺乳動物中的ARF高度保守，廣譜表達於各組織。根據胺基酸順序、大小和基因結構可分為三類一，ARF1-3；二，ARF4和ARF5；三，ARF6。ARF家族的成員通常被歸入RAS超家族(Biochemestry，1991，30，4637-4648)，然而它們一般與RAS家族其它成員僅有輕微的同源性，並且與其它Ras家族成員不同的是，它們的羧基端缺少半胱氨酸殘基，從而無法成為異戊二烯化的底物。
ARF1最初被發現時，是作為一種對霍亂毒素的ADP核糖基轉移酶的活性有協同作用的激活劑，並因此而得名。Kahn，R，A和Gilman，A，G分別於1984年和1986年從兔肝臟和牛腦膜中提取出ARF因子(J.Biol.Chem1984，259，6228-6234 J.Biol.Chem 1986，261，7906-7911)。1987年和1988年，Tsai等又從牛腦中提取出一種膜ARF(mARF)和兩種可溶性ARF(sARF1，2)(Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.1987，84，5139-5142 J.B.C.1988，263，1768-1772)。此後科學家相繼通過雜交進行ARF cDNA克隆，並用寡核苷酸作為探針，發現了不同動物的不同ARF。1988年，Sewell，J，L等從牛腎上腺中克隆bARF1(bovineARF1)，並從酵母基因庫中克隆到了yARF2(yeast ARF2)(Pro.Natl.Acad.Sci.USA1988，85，4620-4624)。同年，Price等在牛視網膜中克隆得到bARF2(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85，5488-5491)。1989年，Peng，Z，Calver等得到了 hARF(human ARF1)(Biofactor 1989，2，45-49)。同時，Bobak等也從人腦庫中獲得了hARF1和另一個因子hARF3(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6101-6105)。1990年，Stearn，T等得到了yARF1(Mol.Cell.Biol，1994，138(1-2)，157-166)。1991年，Kahn，R，A等克隆得到hARF4(J.Biol.Chem.1991，266，2606-2614)。同年，Price，Tsai等得到了家族中最後兩個因子ARF5，6(J.Biol.Chem.1991，266，2772-2777)。
近年來，從不同物種中相繼克隆了一些編碼與ARF同源的蛋白的cDNA，並被命名為ARL-like或ARL。它們包括果蠅的ARL1和ARL2，人的ARL1、ARL2、ARL3、ARL4*和ARL5*、大鼠的ARL1、ARL3、ARL4、ARL5，小鼠的ARL4*(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88，3120-3124；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90，8952-8956；J.Biol.Chem.，1994，269，15683-15688；J.Biol.Chem.，1994，269，18937-18942；J.Biol.Chem.，1995，270，21-24；J.Cell.Sci.，1996，109，209-220；標「*」者在申請之前尚未公開報導)，儘管已有一些ARL的研究顯示出組織或/和分化的表達特異性，然而總體來說，對ARL的功能仍不清楚。
本發明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼ARF家族的一個新成員，本發明的ARF家族成員被命名為人ARL5。
本發明的另一個目的是提供一種新的人的ARF家族成員，該蛋白被命名為人ARL5蛋白。
本發明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產所述的新的人的ARL5蛋白的方法。
本發明還提供了這種人ARL5蛋白多肽和核酸序列的用途。
在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離的人ARL5蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發明的另一方面，提供了一種產生具有人ARL5蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人ARL5蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人ARL5蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人ARL5蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人ARL5蛋白活性的多肽。
在本發明的一個具體實施方案中，本發明的分離的多核苷酸全長為849個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位於17-556位核苷酸。
在本發明中，「分離的」、「純化的」或「基本純的」DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語「人ARL5蛋白(或多肽)編碼序列」指編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中17-556位核苷酸序列及其簡併序列。該簡併序列是指，位於SEQ ID NO.3序列的編碼框17-556位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同胺基酸的簡併密碼子所取代後而產生的序列。由於密碼子的簡併性，所以與SEQ ID NO.3中17-556位核苷酸序列同源性低至約70％的簡併序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人ARL5相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5』和/或3』端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，「基本純的」蛋白質或多肽是指其至少佔樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按乾重或溼重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語「人ARL5蛋白多肽」指具有人ARL5蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。該術語還包括具有與人高效淋巴細胞趨化因子相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括人ARL5蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與人ARL5 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人ARL5多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含人ARL5多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了人ARL5多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人ARL5多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸，最佳地至少約100個連續胺基酸。
發明還提供人ARL5蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人ARL5多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、γ-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，「人ARL5保守性變異多肽」指與SEQ ID No.4的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行胺基酸替換而產生。
表1
本發明還包括人ARL5多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用於抑制細胞內人ARL5的表達。
本發明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人ARL5多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續核苷酸。該探針可用於檢測樣品中是否存在編碼人ARL5的核酸分子。
本發明還包括檢測人ARL5核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然後檢測探針是否發生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增後的產物，其中PCR擴增引物對應於人ARL5多肽的編碼序列，並可位於該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然後將編碼本發明多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發明還包括對人ARL5 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於人ARL5基因產物或片段。較佳地，指那些能與人ARL5基因產物或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合併抑制人ARL5蛋白的分子，也包括那些並不影響人ARL5蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的人ARL5基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈FV分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的人ARL5基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達人ARL5或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷人ARL5功能的抗體以及不影響人ARL5功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用人ARL5基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法製備或利用多肽合成儀合成。與人ARL5基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯後修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
本發明的人ARL5核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
在本發明的一個實施例中，人ARL5的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-GGTCCGCTGCCCGAGAATGGG-3′為正向引物，寡核苷酸A25′-GTCTTCCTCTCCCTTTGTACTTAC-3′為反向引物，進行PCR。測序後得到SEQID NO.3的全長cDNA序列。
ARF是一個別構激活因子，當ARF與GTP結合後即具有活性，激活PLD；水解GTP後，複合物失活變為ARF-GDP。ARF的功能可能涉及到從內質網到高爾基體順式面的蛋白質運輸過程(J.Biol.Chem.1992，267，13053-13061)、高爾基體順式面內部運輸(Cell，1992，70，69-79)、囊泡的外吐作用(FEBS Lett，1993，121-124)和核內囊泡運輸(Nature，1992，358，512-514)等方面。它不但調節分泌作用早期外被體(coatomer)的聚集過程(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，6408-6412；J.Biol.Chem，1993，268，12083-12089)，而且是聚集於高爾基體外側網絡的網格蛋白(clathrin coat)的有效調節物。
在附圖中，

圖1為本發明的人ARL5蛋白(hARL5)與小鼠ARL5蛋白(mARL5)的胺基酸序列的同源比較圖。其中，相同的胺基酸在兩個序列之間用「|」標出，相似的胺基酸用「」標出。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人ARL5的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴增以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-GGTCCGCTGCCCGAGAATGGG-3′(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸A25′-GTCTTCCTCTCCCTTTGTACTTAC-3′(SEQ ID NO2)為反向引物，進行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環，最後72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約850bp的目的片段。
2.PCR產物的測序將如上獲得的PCR擴增產物A1/A2與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然後用PCR對缺失子進行快速鑑定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最後用電腦軟體拼接順序，獲得全長cDNA序列，共849bp，詳細序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位於17-556位核苷酸。
根據得到的全長基因組序列推導出人ARL5的胺基酸序列，共179個胺基酸殘基，其胺基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實施例2同源比較將本發明的人ARL5的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB資料庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR資料庫中用BLAST進行核酸和蛋白同源檢索。結果發現它們與ARF家族基因及其編碼蛋白具有廣泛的同源性，用BLAST軟體比較，發現它與大鼠ARL5基因在蛋白水平上的同一性(也稱為相同性)高達99％(圖1)，與ARF家族的其它大多數成員的同一性和相似性也分別在50％和70％左右(數據未給出)。用ProSite軟體對胺基酸保守區分析表明，本發明的cDNA編碼的蛋白具有一ARF家族特徵性的序列。該序列在ARF家族中顯示為(H/R/Q/T)X(F/Y/W/I)X4AX2GX2(L/I/V/M)X2(G/S/A)(L/I/V/M/F)X(W/K)(L/I/V/M)，其中，(H/R/Q/T)等表示H、R、Q、T中的一種胺基酸，X表示任一胺基酸，下標表示胺基酸數。在已知的ARF家族成員中僅有4個沒有上述特徵性序列；在本發明的蛋白序列中，符合上述特徵的序列為150HQWHIQACCALTGEGLCQGLEWM。除此之外，在本發明的蛋白序列中還發現了兩個GTP結合位點---65WDIGGQ70和125NKQD129，這兩個GTP結合位點在ARF家族中也是高度保守的。綜合上述現象，本發明的基因被確定是人ARF家族的在人體中的又一新成員，並據此命名為人ARL5，並且依據結構決定功能，結構相似功能相近的生物學原理，可以從ARF家族其它成員的功能來推測本發明的人類ARL5的功能。
ARF1最初是作為一種對霍亂毒素的ADP核糖基轉移酶的活性有協同作用的激活劑被發現的。研究發現ARF是一個別構激活因子，當ARF與GTP結合後即具有活性，；水解GTP後，複合物失活變為ARF-GDP。鳥嘌呤核苷酸交換蛋白(GEPs)促使ARF與GTP結合。而GTP酶活化蛋白(GAPs)促進GTP水解。ARF通常影響與膜結合的磷酸化酶D(PLD)的活性，然而在酵母中似乎並不是這樣。在釀酒酵母中，PLD主要調控原孢子膜的形成--這是芽孢形成的先決條件，在ARF1羧基端增加一個C-myc表位，得到酵母的ARF1-myc ARF2突變型，雖然原孢子膜的形成受到削弱，但這並非是由於PLD的催化活性受到影響的緣故，事實上酵母中ARF並不激活PLD的活性(Mol.Biol.Cell.1998，9(8)，2025-2036)。ARF的功能可能涉及到從內質網到高爾基體順式面的蛋白質運輸過程(J.Biol.Chem.1992，267，13053-13061)、高爾基體順式面內部運輸(Cell，1992，70，69-79)、囊泡的外吐作用(FEBS Lett，1993，121-124)和核內囊泡運輸(Nature，1992，358，512-514)等方面。它不但調節分泌作用早期外被體(coatomer)的聚集過程(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，6408-6412；J.Biol.Chem，1993，268，12083-12089)，而且是聚集於高爾基體外側網絡的網格蛋白(clathrin coat)的有效調節物。體外實驗證實真菌布雷菲爾德菌素A(brefeldin A)能抑制AP-1(Trends Cell Biol，1992，2，293-297；J.Biol.Chem.1992，117，171-1179)和β-COP與高爾基體膜(Cell1991，64，1183-1195)的結合。已知AP-1是衣被的一部分，很可能通過與網格蛋白及三角蛋白體的相互作用而在衣被的聚集過程中起主要作用；而β-COP則是外被體的一個亞單位，它是早期分泌途徑中囊泡出芽所必須的。布雷菲爾德菌素A通過阻止ARF上GDP到GTP的轉換而抑制ARF的功能。(J.Biol.Chem.1996，271(4)，2162-2170)。
ARF被推測參與內質體-內質體的融合(J.Biol.Chem.1992，267，13047-13052)，然而同時一些實驗則否定了這種假設(Mol.Cell.Biolchem.1994，135，159-164)，同時有實驗發現ARF對內體小泡(endosomal vesicle)的融合併非必需，但是5′-O-(3-硫代三磷酸)(GTP gamma S)等對內體小泡融合的抑制必須依賴ARF的存在(J.Biol.Chem.1995 Jun 9，270(23)，13693-13697)ARL的作用目前還很不清楚。1991年，Tamkun，J.W.等報導稱，果蠅的ARL蛋白與ARF具有許多相似的性質，然而前者完全缺乏ARF的活性；基因突變研究發現了一個隱性突變的ARL基因，該突變導致了果蠅合子致死的表型，這暗示了果蠅中ARL可能是一重要功能基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88，3120-3124)。另一些研究表明了ARL表達上的特異現象。如大鼠ARL4在成纖維細胞系中無法被檢測到，而在已分化至脂肪細胞樣(adipocyte-like)表型的細胞中則含量豐富，ARL6的表達開始於3T3-L1細胞系分化的第6天(J.Biol.Chem.1994，269(22)，15683-15688)，這說明ARL4的功能可能與3T3-L1細胞的脂肪細胞樣表型有關。1996年，Lowe，S.L.等在大鼠中的研究發現，正常大鼠腎臟中ARL1與高爾基體相連(J.Cell Sci.1996，109(ptl)，209-220)，最近在對酵母ARF1(yARF1)研究中也發現了類似的現象(J.Biol.Chem.1997，272(49)，30998-31005)，這提示ARL也可能與ARF一樣在囊泡運輸中發揮作用。
1996年一個新的與Ras相關的GTP酶，通過運用PCR，從老鼠的脂肪細胞cDNA庫中克隆出來。這個蛋白有ARF的典型特徵，而且與ARL1(ARF樣蛋白)最相關，被命名為ARL5。對大鼠ARL5的研究尚不深入，有關報導稱其mRNA在大多數大鼠被檢測的組織(如心臟，骨骼肌，脂肪，肝，腎，肺，脾，腸，胸腺)中含量較低，而大腦，腸，胸腺中含量最高(Biochim Biophys Acta 1996 Jul31，1308(1)，1-6)。有關人的ARL5還未見公開報導。關於它們在生物體內所起的作用尚有待進一步研究。
綜上所述，本發明的新蛋白很可能在囊泡的運輸途徑(如外吐作用、內吞作用以及高爾基體內部的囊泡轉運等等)中，以及其它一些細胞功能中發揮作用。另外本發明還為進一步研究ARL在生物體(尤其人體)內的作用及機理提供了新的途徑。
本發明的人ARL5除了可作為該家族一員用於進一步的功能研究，還可用於與其他蛋白一起產生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產生融合蛋白。此外，本發明人ARL5還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產生新的蛋白。例如將本發明人ARL5的N端與其他動物的ARL5蛋白的N端進行交換，以產生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發明人ARL5的抗體，用於篩選該家族的其他成員，或者用於親和純化相關蛋白(如該家族的其他成員，比如小鼠的ARL5蛋白)。
此外，本發明人ARL5核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人ARL5的表達水平或者抑制人ARL5的過度表達。本發明的人ARL5蛋白或其活性多肽片段可以施用於病人，以治療或減輕因人ARL5缺失、無功能或異常而導致的有關病症。此外，還可以用基於本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預後判斷。
實施例3人ARL5在大腸桿菌中的表達在該實施例中，將編碼人ARL5的cDNA序列(實施例1中的PCR擴增產物)用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人ARL5cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGGGAATTCTCTTCACTAG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的人ARL5編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5i-TTGGgtcgacTCATCTAATCTTAAGTCGT-3i(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人ARL5的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌複製起點(ori)、一個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內切酶克隆位點。
用BamHI和SalI消化pQE-9載體及插入片段，隨後將插入片段連接到pQE-9載體並保持開放讀框在細菌RBS起始。隨後用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質粒pREP4，其表達lacI阻遏物並攜帶卡那黴素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養皿上篩選轉化子，抽提質粒，測序驗證人ARL5的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然後接種到大體積培養基中，培養細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(「異丙基硫代-β-D-半乳糖苷」)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續培養細胞3-4小時，隨後離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞並將細胞沉澱溶於6M的鹽酸胍中。澄清後，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人ARL5。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人ARL5。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉澱蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化後的蛋白質被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質變性，隨後用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最後，將可溶的蛋白質用PBS進行透析，然後將蛋白質保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為約21KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例4人ARL5在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，將編碼人ARL5的cDNA序列(實施例1中的PCR擴增片段)用對應於該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得人ARL5cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGGGAATTCTCTTCACTAG-3′(SEQ ID NO.5)該引物含有BamHI限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之後是由起始密碼子開始的人ARL5編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5i-TTGGGATATCTCATCTAATCTTAAGTCGT-3i(SEQ ID NO.7)該引物含有EcoRV限制性內切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和人ARL5的部分編碼序列。
引物上的限制性內切酶的酶切位點對應於CHO細胞表達載體pcDNA3上的限制性內切酶酶切位點，該質粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體複製起點(f1 ori)、一個病毒複製起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用BamHI和EcoRV消化pcDNA3載體及插入片段，隨後將插入片段連接到pcDNA3載體。隨後用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養基中過夜培養(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質粒，並測序驗證人ARL5的cDNA片段已正確插入了載體。
質粒轉染CHO細胞是採用脂轉染法，用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉染48小時後，經2-3周的持續G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達蛋白酶活力。去G418，連續傳代培養；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規方法大量培養上述陽性亞克隆。48小時後，開始收集細胞及上清，用超聲裂解方法破碎細胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然後以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最後凍幹保存。
用12％的SDS-PAGE膠進行電泳，鑑定表達蛋白的分子量大小為21KDa。
此外，用常規方法對達蛋白的N端和C端各10個胺基酸長度的胺基酸進行測序，發現與SEQ ID NO.4的序列一致。
實施例5製備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離後備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，並用等體積的完全Freundis佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天後，用非完全Freundis佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉澱人ARL5基因翻譯產物的能力加以評估。結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白特異性地發生沉澱。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復旦大學(ii)發明名稱一種新的人蛋白質及其編碼序列，及製法和用途(iii)序列數目7(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特徵(A)長度21鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GGTCCGCTGC CCGAGAATGG G 21(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GTCTTCCTCT CCCTTTGTAC TTAC 24(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特徵
(A)長度849bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3GGTCCGCTGC CCGAGAATGG GAATTCTCTT CACTAGAATA TGGAGACTGT TCAATCACCA 60GGAGCACAAA GTTATCATTG TTGGGCTGGA TAATGCAGGG AAAACTACCA TTCTTTACCA 120ATTTTCTATG AATGAAGTTG TACATACATC TCCTACAATA GGAAGTAATG TAGAAGAGAT 180AGTGATTAAT AATACACGTT TCCTAATGTG GGATATTGGT GGCCAAGAAT CTCTTCGTTC 240TTCCTGGAAC ACTTACTATA CTAACACAGA GTTTGTAATA GTTGTTGTGG ACAGTACAGA 300CAGAGAGAGG ATTTCTGTAA CTAGAGAAGA ACTCTATAAA ATGTTAGCGC ATGAGGACCT 360AAGAAAAGCT GGATTGCTGA TTTTTGCTAA TAAACAAGAT GTTAAAGAAT GCATGACTGT 420AGCAGAAATC TCCCAGTTTT TGAAGCTAAC TTCTATTAAA GATCACCAGT GGCATATCCA 480GGCATGCTGT GCTCTAACTG GCGAGGGATT GTGCCAAGGA CTTGAATGGA TGATGTCACG 540ACTTAAGATT AGATGATCTC TACTGACCTC TTCTCATAGA TTTTGTATAA ATGAAGTGCT 600GGACTTTACC TGAAAGCTGC AAAAATTAAT GGTTTAGATA TATTTATAAT AAACTGATTT 660AAACTTTTTC TATAAGAAGA AAAATTAAGA CCACTTATTT GAAAACAAAG ATGAAGTCTC 720ACCTTCCAGT TTGCTTTCTC ATTAGTTTTT TCCAAAGTAA GTTATTGAAG CTGTGATTGA 780CATTTTTCTC ATAATGAATC CTCTCAGGAC ATTGTGTAGC CTATGGTAAG TACAAAGGGA 840GAGGAAGAC 849(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特徵(A)長度179個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Gly Ile Leu Phe Thr Arg Ile Trp Arg Leu Phe Asn His Gln 15Glu His Lys Val Ile Ile Val Gly Leu Asp Asn Ala Gly Lys Thr 30Thr Ile Leu Tyr Gln Phe Ser Met Asn Glu Val Val His Thr Ser 45Pro Thr Ile Gly Ser Asn Val Glu Glu Ile Val Ile Asn Asn Thr 60Arg Phe Leu Met Trp Asp Ile Gly Gly Gln Glu Ser Leu Arg Ser 75Ser Trp Asn Thr Tyr Tyr Thr Asn Thr Glu Phe Val Ile Val Val 90Val Asp Ser Thr Asp Arg Glu Arg Ile Ser Val Thr Arg Glu Glu 105Leu Tyr Lys Met Leu Ala His Glu Asp Leu Arg Lys Ala Gly Leu 120Leu Ile Phe Ala Asn Lys Gln Asp Val Lys Glu Cys Met Thr Val 135Ala Glu Ile Ser Gln Phe Leu Lys Leu Thr Ser Ile Lys Asp His 150Gln Trp His Ile Gln Ala Cys Cys Ala Leu Thr Gly Glu Gly Leu 165Cys Gln Gly Leu Glu Trp Met Met Ser Arg Leu Lys Ile Arg 179(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特徵(A)長度30鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGGATCC ATGGGAATTC TCTTCACTAG 30(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGGTCGAC TCATCTAATC TTAAGTCGT 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGGGATATC TCATCTAATC TTAAGTCGT 29
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特徵在於，它包括編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特徵在於，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列。
4.一種分離的人ARL5蛋白多肽，其特徵在於，它包括具有SEQ ID NO.4胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特徵在於，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，該細胞是真核細胞。
10.一種產生具有人ARL5蛋白活性的多肽的方法，其特徵在於，該方法包括(a)將編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，形成人ARL5蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人ARL5蛋白的重組細胞；(c)在適合表達人ARL5蛋白多肽的條件下，培養步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有人ARL5蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位。
12.一種能與權利要求4所述的人ARL5蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特徵在於，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特徵在於，它含有權利要求1所述的DNA分子中8-100個連續核苷酸。
全文摘要
本發明提供一種新的人蛋白質及其核苷酸編碼序列。更具體地說,本發明涉及人ARL5的cDNA序列,該序列所編碼的蛋白是鼠ARL5的同系物。本發明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產方法。
文檔編號C12N15/12GK1257927SQ9812605
公開日2000年6月28日 申請日期1998年12月22日 優先權日1998年12月22日
發明者餘龍, 傅強, 趙勇, 屠強, 趙壽元 申請人:復旦大學