離子液體萃取青黴素及酶促催化反應耦合製備半合成抗生素6－氨基青黴烷酸的方法
2023-10-22 15:31:27
專利名稱：離子液體萃取青黴素及酶促催化反應耦合製備半合成抗生素6－氨基青黴烷酸的方法
技術領域：
本發明涉及青黴素髮酵液萃取和酶促催化反應一體化製備半合成抗藥物中間體的工藝方法，特別涉及離子液體萃取青黴素及酶促催化反應耦合製備半合成抗生素6-氨基青黴烷酸的方法。
背景技術：
6-APA(6-氨基青黴烷酸)是製藥行業重要的中間體，它採用青黴素為原料，在青黴素醯化酶的催化下水解生成目標產物6-APA與副產物PAA(苯乙酸)， 而6-APA可以繼續合成其它類型的半合成抗生素。現有青黴素的生產方法是將青黴素髮酵液固液分離後，利用有機萃取溶劑從青黴素濾液中提取青黴素，經過反萃、結晶與乾燥等步驟得到產品青黴素，然後溶解於水溶液進行酶促催化反應。該工藝存在三大缺點一是萃取過程需要調低pH值，造成青黴素的效價降低以及蛋白質的乳化現象；二是有機溶劑汙染環境；三是青黴素提取與酶催化步驟不連續，浪費了能量(Process Biochemistry，vol 8，146～152，1989)。
針對以上問題，人們嘗試採用雙水相萃取青黴素，並直接在青黴素萃取相中進行酶催化反應。實驗發現，聚乙二醇(PEG)-鹽體系對青黴素的分配係數可達10以上，沒有環境汙染，而且酶在雙水相中能保證一定的活性。但PEG原料難以回收，導致純化產物非常困難，限制了工業的實際用途(Sep.Sci.Technol.，1996，131，2589～2594.)。
離子液體是新型綠色溶劑，具有結構可調、性質多變的特點，在溶劑萃取與有機催化方面已有廣泛的應用。劉慶芬等報導了用親水性離子液體形成的雙水相萃取青黴素，得到94％的萃取率(《科學通報》，Vol 50(4)，756～759，2005)。但該法沒有考慮青黴素水相與親水離子液體間的分離，導致青黴素水相中離子液體含量過高，降低了後續酶催化的活性，阻礙了青黴素萃取反應生產半合成藥物中間體6-APA耦合工藝的實現。本申請提出在離子液體雙水相萃取青黴素的基礎上，採用疏水離子液體進行二次萃取，將青黴素萃取相中的親水離子液體萃入到疏水離子液體相，大大減少了青黴素萃餘相的離子液體的含量，保證後續酶催化反應的活性(見附圖1)。如此，使青黴素萃取反應耦合一體化工藝得以實現。
發明內容
本發明的目的是實現離子液體雙水相-二次萃取青黴素及酶促催化反應製備半合抗藥物中間體耦合新工藝，利用親水-疏水離子液體之間吸引作用改善青黴素水相的酶催化效率的方法，提出離子液體萃取青黴素及酶促催化反應耦合製備半合成抗生素6-氨基青黴烷酸的方法。
本發明的離子液體萃取青黴素及酶促催化反應耦合製備半合成抗生素6-氨基青黴烷酸的方法，包括以下步驟(1).離子液體雙水相的製備與青黴素的萃取過程向青黴素髮酵液中加入親水離子液體和無機鹽，使混合液中的青黴素質量百分含量為0.5～8％，親水離子液體的質量百分含量為10～50％，無機鹽的質量百分含量為10～30％；攪拌混合後靜置出現平衡的兩相，青黴素進入離子液體輕相；(2).疏水離子液體二次萃取回收離子液體原料取步驟(1)含親水離子液體輕相的萃取水溶液，優選輕相中親水離子液體的濃度為20～70wt％，加入疏水離子液體，將疏水離子液體與親水離子液體的水溶液相比控制在1∶1～1∶30範圍內。振蕩離心後，90％以上的親水離子液體會被萃入到疏水離子液體相中，而萃餘相是含絕大部分青黴素與少量無機鹽的水溶液。
(3).處理後的青黴素水溶液進行酶促催化反應取步驟(2)二次萃取後含青黴素與無機鹽的水溶液，加入固定化青黴素醯化酶，固定化青黴素醯化酶在混合液中的濃度控制在5～25mg/ml之間，37℃振蕩反應，測定初始反應酶活，分離得到6-氨基青黴烷酸。
所述的步驟(2)得到的包含親水-疏水兩種離子液體的混合物，經純水洗脫有68％以上的親水離子液體分離析出，用於步驟(1)。
所述的步驟(2)得到的包含親水-疏水兩種離子液體的混合物，經升溫到70℃以上有83％以上的親水離子液體分離析出，用於步驟(1)。
所述的親水性離子液體的陽離子包括咪唑鹽、吡啶鹽以及季胺鹽等，親水性離子液體的陰離子類型可為四氟硼酸鹽[BF4]-、Br-或Cl-等。
所述的疏水性離子液體的陰離子類型可為六氟磷酸鹽[PF6]-或[(CF3SO2)2N]-等。疏水性離子液體的陽離子為咪唑鹽，優選疏水離子液體是[C4mim]PF6(1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽)。
所述的咪唑鹽選自1-乙基-3-甲基咪唑[C2mim]+、1-丁基-3-甲基咪唑[C4mim]+、1-辛基-3-甲基咪唑[C8mim]+、1-乙基-2，3-甲基咪唑[C2dmim]+或1-丁基-2，3-甲基咪唑[C4dmim]+中的一種等。
所述的吡啶鹽是1-乙基吡啶[C2py]+或1-丁基-3-甲基咪唑[C4py]+等。
所述的季胺鹽是1，2，3，4-四丁基胺[(C4H9)4N]+或1，2，3-三乙基-4-辛基胺[(C2H5)3NC8H17]+等。
所述的無機鹽是NaH2PO4、Na2HPO4或(NH4)SO4等。
本發明採用親水離子液體與無機鹽形成的雙水相，將青黴素萃取到離子液體上相。而該相經疏水離子液體二次萃取後，親水性離子液體會萃入到疏水離子液體，而青黴素保留在水溶液中，二者順利實現分離。含青黴素的萃餘水相可直接進行酶催化反應，而被萃入疏水相的親水離子液體可經水洗循環利用。如圖1所示。
從青黴素的酶催化過程可看出，萃取後水相中的青黴素經青黴素醯化酶在37℃催化3小時，得到產物6-APA與副產物PAA，產率達95％以上。
從圖2含親水性離子液體[C4mim]BF4與青黴素的水溶液被[C4mim]PF6二次萃取的效果圖看出，當疏水離子液體與親水性離子液體水溶液保持相比在1∶10，隨水溶液中無機鹽含量增加(離子液體雙水相需要一定量的無機鹽)，親水離子液體的二次萃取率逐漸升高，從沒有無機鹽時的35％上升到無機鹽濃度為20％鹽時90％萃取率，而青黴素的萃取率不超過10％，因此，水相中親水離子液體與青黴素實現分離。
本發明以離子液體雙水相與疏水性離子液體二次萃取結合的工藝替代傳統青黴素萃取工藝，實現青黴素萃取反應耦合製備半合抗藥物中間體的綠色新工藝。在採用離子液體雙水相萃取發酵液內青黴素的基礎上，其萃取液可利用疏水離子液體進行二次萃取，將所含的大部分親水離子液體從溶液中得以分離，而降低了離子液體含量的青黴素萃餘相水溶液可直接用於酶促催化反應，其酶活可達到水相80％以上。整個過程只採用離子液體與無機鹽，屬於綠色化過程，優於使用揮發性有機溶劑傳統工藝。
本發明二次萃取後的青黴素水溶液，在5～25mg/ml酶用量時酶活能超過純水的80％以上。
本發明具有以下特點(1)疏水性離子液體對青黴素輕相的萃取作用，可實現親水性離子液體與青黴素水溶液的分離，達到降低酶催化水相中親水離子液體含量的目的。
(2)疏水性離子液體對水相中青黴素萃取率很低，可保證90％青黴素停留在水相。
(3)二次萃取後萃餘相的青黴素水溶液可直接進行酶催化反應，酶活性可達純水的70％以上，優化達85％。
(4)整個過程只採用離子液體與無機鹽，是完全綠色化過程。
(5)可採用純水及高溫手段將親水離子液體從疏水離子液體中洗脫出來，洗脫率可達83％，實現離子液體原料的循環再生。
(6)可根據反應需要，設計不同結構的離子液體，保證整個萃取催化過程的優化。
圖1.本發明離子液體萃取青黴素及酶促催化反應製備半合抗藥物中間體耦合工藝流程示意圖。
圖2.本發明實施例1疏水離子液體[C4mim]PF6對親水離子液體與青黴素的萃取率。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明的技術方案作進一步的描述1，疏水離子液體二次萃取分離親水離子液體實施例1取10ml雙水相的離子液體輕相，含47％(w/w)[C4mim]BF4、18％(w/w)Na2HPO4·12H2O及青黴素1.4％，加入2ml[C4mim]PF6，振蕩2分鐘，靜置分層，可發現疏水相為5.8ml，80％的[C4mim]BF4被萃入疏水相，但少於4％的青黴素被萃取。上相水溶液體積6.2ml，含1.44％的青黴素以及少量Na2HPO4。取5ml含青黴素和Na2HPO4的水溶液加入15mg固定化青黴素醯化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青黴烷酸，測得酶活性為162IU/g，為純水中190IU/g活性的85％。取5ml離子液體萃取相，直接採用1∶1相比的純水洗滌，約52％的[C4mim]BF4從疏水相分離出來。
實施例2取10ml雙水相的離子液體輕相，含58％(w/w)[C4mim]BF4、9.3％(w/w)Na2HPO4·12H2O及青黴素1％，加入1ml[C4mim]PF6，振蕩2分鐘，靜置分層，疏水相為5.5ml，78％的[C4mim]BF4被萃入疏水相，6％的青黴素被萃取。上相體積5.5ml，含1.6％的青黴素以及少量Na2HPO4。取5ml含青黴素和Na2HPO4的萃餘液，加入15mg固定化青黴素醯化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青黴烷酸，測得酶活性為145IU/g，為純水中190IU/g活性的76％。取5ml離子液體萃取相，1∶1相比的純水70℃洗滌，約93％的[C4mim]BF4從疏水相分離出來。
實施例3取10ml雙水相的離子液體輕相，含34.5％(w/w)[C4mim]BF4及21.4％(w/w)Na2HPO4·12H2O，及青黴素0.8％，加入1ml[C4mim]PF6，振蕩2min，靜置分層，可發現疏水相為3.7ml，82％的[C4mim]BF4被萃入疏水相，但少於8％的青黴素被萃取。上相體積7.5ml，含0.9％的青黴素以及少量Na2HPO4。取5ml含青黴素和Na2HPO4的水溶液，加入15mg固定化青黴素醯化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青黴烷酸，測得酶活性為164IU/g，為純水中190IU/g活性的85％。取3.5ml離子液體萃取相，直接採用1∶1相比的純水洗滌，約56％的[C4mim]BF4從疏水相分離出來。
實施例4取10ml雙水相的離子液體輕相，含36％(w/w)[C2mim]BF4及14％(w/w)Na2HPO4·12H2O，及青黴素1％，加入1ml[C2mim]PF6，振蕩2min，靜置分層，可發現疏水相為3.8ml，73％的[C2mim]BF4被萃入疏水相，但少於4％的青黴素被萃取。上相體積7.2ml，含1.6％的青黴素以及少量無機鹽。取5ml含青黴素和Na2HPO4的水溶液，加入15mg固定化青黴素醯化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青黴烷酸，測得酶活性為132IU/g，為純水中190IU/g活性的70％。取4ml所得的離子液體下相，採用1∶1相比的純水，並升高溫度到70℃，約91％的[C2mim]BF4從疏水相分離出來。
實施例5取10ml雙水相的離子液體輕相，含58％(w/w)[C4mim]Br及24％(w/w)NaH2PO4·2H2O，及青黴素1％，加入1ml[C4mim]PF6，振蕩2min，靜置分層，可發現疏水相為5.3ml，74％的[C4mim]Br被萃入疏水相，但少於6％的青黴素被萃取。上相體積6.5ml，含1.5％的青黴素以及少量NaH2PO4。取5ml含青黴素和NaH2PO4的水溶液，加入15mg固定化青黴素醯化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青黴烷酸，測得酶活性為150IU/g，為純水中190IU/g活性的80％。取5ml離子液體萃取相，直接採用1∶1相比的純水洗滌，約72％的[C4mim]Br從疏水相分離出來。
實施例6取10ml雙水相的離子液體輕相，含58％(w/w)[C4mim]Br及24％(w/w)NaH2PO4·2H2O，及青黴素1％，加入1ml[C4mim][(CF3SO2)2N]，振蕩2min，靜置分層，可發現疏水相為5.9ml，85％的[C4mim]Br被萃入疏水相，但少於4％的青黴素被萃取。上相體積6.1ml，含1.5％的青黴素以及少量無機鹽。取5ml含青黴素和NaH2PO4的水溶液，加入15mg固定化青黴素醯化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青黴烷酸，測得酶活性為172IU/g，為純水中190IU/g活性的90％。取5ml離子液體萃取相，直接採用1∶1相比的純水洗滌，約63％的[C4mim]Br從疏水相分離出來。
實施例7取10ml雙水相的離子液體輕相，含43％(w/w)[C4py]BF4及24％(w/w)NaH2PO4·2H2O，及青黴素1％，加入1ml[C4mim]PF6，振蕩2min，靜置分層，可發現疏水相為4.1ml，72％的[C4py]BF4被萃入疏水相，但少於8％的青黴素被萃取。上相體積6.9ml，含1.5％的青黴素以及少量無機鹽。取5ml含青黴素和NaH2PO4的水溶液，加入15mg固定化青黴素醯化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青黴烷酸，測得酶活性為156IU/g，為純水中190IU/g活性的82％。取4ml離子液體萃取相，直接採用1∶1相比的純水洗滌，約67％的[C4py]BF4從疏水相分離出來。
實施例8取10ml雙水相的離子液體輕相，含52％(w/w)[(C4H9)4N]Br及20％(w/w)Na2HPO4·12H2O，及青黴素1％，加入1ml[C2mim][(CF3SO2)2N]，振蕩2min，靜置分層，可發現疏水相為5.1ml，79％的[(C4H9)4N]Br被萃入疏水相，但少於7％的青黴素被萃取。上相體積5.9ml，含1.7％的青黴素以及少量Na2HPO4。取5ml含青黴素和Na2HPO4的水溶液，加入15mg固定化青黴素醯化酶，37℃反應，分離得到6-氨基青黴烷酸，測得酶活性為142IU/g，為純水中190IU/g活性的75％。取5ml所得的離子液體下相，採用1∶1相比的純水，並升高溫度到70℃，約83％的[(C4H9)4N]Br從疏水相分離出來。
權利要求
1.一種離子液體萃取青黴素及酶促催化反應耦合製備半合成抗生素6-氨基青黴烷酸的方法，其特徵是該方法包括以下步驟(1).離子液體雙水相的製備與青黴素的萃取過程向青黴素髮酵液中加入親水離子液體和無機鹽，使混合液中的青黴素質量百分含量為0.5～8％，親水離子液體的質量百分含量為10～50％，無機鹽的質量百分含量為10～30％；攪拌混合後靜置出現平衡的兩相，青黴素進入離子液體輕相；(2).疏水離子液體二次萃取回收離子液體原料取步驟(1)含親水離子液體輕相的萃取水溶液，加入疏水離子液體，將疏水離子液體與親水離子液體的水溶液相比控制在1∶1～1∶30範圍內；振蕩離心後，親水離子液體會被萃入到疏水離子液體相中，而萃餘相為含青黴素與無機鹽的水溶液；(3).處理後的青黴素水溶液進行酶促催化反應取步驟(2)二次萃取後含青黴素與無機鹽的水溶液，加入固定化青黴素醯化酶，固定化青黴素醯化酶在混合液中的濃度控制在5～25mg/ml之間，37℃振蕩反應，測定初始反應酶活，得到6-氨基青黴烷酸；所述的親水性離子液體的陽離子是咪唑鹽、吡啶鹽或季胺鹽，親水性離子液體的陰離子類型為四氟硼酸鹽、Br-或Cl-；所述的疏水性離子液體的陰離子類型為六氟磷酸鹽或[(CF3SO2)2N]-；疏水性離子液體的陽離子為咪唑鹽。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的步驟(2)得到的包含親水-疏水兩種離子液體的混合物，經純水洗脫後的親水離子液體分離析出，用於步驟(1)。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的步驟(2)得到的包含親水-疏水兩種離子液體的混合物，經升溫到70℃以上後的親水離子液體分離析出，用於步驟(1)。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的六氟磷酸鹽是1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的咪唑鹽選自1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑、1-辛基-3-甲基咪唑、1-乙基-2，3-甲基咪唑或1-丁基-2，3-甲基咪唑中的一種。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的吡啶鹽是1-乙基吡啶或1-丁基吡啶。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的季胺鹽是1，2，3，4-四丁基胺或1，2，3-三乙基-4-辛基胺。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的無機鹽是NaH2PO4、Na2HPO4或(NH4)SO4。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的步驟(2)取含親水離子液體輕相的萃取水溶液中的親水離子液體的濃度為20～70wt％。
全文摘要
本發明涉及青黴素髮酵液萃取和酶促催化反應一體化製備半合成抗藥物中間體的工藝方法，特別涉及離子液體萃取青黴素及酶促催化反應耦合製備半合成抗生素6－氨基青黴烷酸的方法。利用親水性離子液體形成的雙水相，將青黴素萃取到含離子液體的上相，用疏水離子液體進行二次萃取，能使親水離子液體被萃取到疏水相中，而萃餘相的青黴素水溶液可直接進行酶促催化，酶活可達水相80％以上。本發明與傳統工業用有機溶劑從水相萃取青黴素，純化後再進行酶催化製備半合抗藥物的工藝相比，不採用有機溶劑，是完全綠色化過程，同時疏水離子液體的二次萃取能將親水性離子液體從青黴素水溶液中分離出來，保證後續水相酶催化工藝的效率。
文檔編號C12P37/00GK1948316SQ20051008661
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月14日 優先權日2005年10月14日
發明者夏寒松, 餘江, 胡雪生, 劉慶芬, 劉會洲 申請人:中國科學院過程工程研究所