一種來源於迷迭香的總二萜酚及其製備方法和用途的製作方法
2023-10-07 06:29:14 1
專利名稱：一種來源於迷迭香的總二萜酚及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種來源於中藥材的有效部位及其製備方法和用途，具體地說是涉及一種來源於迷迭香藥材的總二萜酚及其製備方法，和其在製備預防和治療心血管、緩解胸痺心痛症、以及治療子宮癌、宮頸癌、腸癌、乳腺癌等藥物中的用途。
背景技術：
迷迭香(Rosmarinas officinalis L.)為唇形科(Labiatae)迷迭香屬植物的全草，常綠小灌木，原產於地中海地區，並廣為栽培，主產西班牙、摩洛哥、前南斯拉夫、保加利亞和突尼西亞等南歐各國。近年來，我國西南部分省區(貴州，雲南)也有大量栽培。迷迭香主要利用部位為葉片，以花期採收的葉片為佳，呈細長形、綠色，氣味芳香，迷迭香葉中富含揮髮油。
迷迭香藥材中主要含有二萜酚類成分，另外還有黃酮類、三萜類、以及少量有機酸類成分。二萜酚類成分主要有鼠尾草酚、鼠尾草酸(Wenkekt et al J.Org.chem.，1965，30(9)2931)、迷迭香酚(Reiko I.et al Agric.Biol.Chem.，1982，46(6)1661-1666)、表迷迭香酚、異迷迭香酚(Nobuji N.et al Agric.Biol.Chem.，1994，48(8)2081-2085)迷迭香酸等，以鼠尾草酚和鼠尾草酸為主要成分的迷迭香總二萜酚類化合物具有良好的體內抗氧化作用，它可抑制黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統超氧化物離子的產生，還可抑制微粒體和線粒體脂質的過氧化。
以往的研究多集中在將迷迭香應用於抗氧化劑，將迷迭香的有效部位用於製備預防和治療心血管以及癌症等藥物中的用途尚未見報導。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種來源於迷迭香的總二萜酚類有效部位。
本發明的目的之二在於提供所述迷迭香的總二萜酚類的製備方法。
本發明的目的之三在於提供所述迷迭香的總二萜酚類的用途。
本發明提供的迷迭香的總二萜酚類，是從迷迭香藥材中提取的，其總酚類的含量在45％以上。其中主要以鼠尾草酚和鼠尾草酸兩個化合物為主，二者的含量之和在13％以上。
本發明提供的迷迭香的總二萜酚類由如下的方法得到1)預處理將採收後的迷迭香藥材曬乾後切段，得到的迷迭香生藥備用；2)提取加入5～12倍生藥量的50～90％(v/v)的提取液進行提取1～5次；將合併的提取液放涼至20～60℃，過濾除去不溶物，得到綠褐色的濾液；3)脫色向步驟2)得到的濾液中加入濾液體積重量百分比0.05～0.5％(g/ml)活性炭，在30～80℃脫色5～40min，過濾除去活性炭，得到澄清、透明的紅棕色的藥液；4)濃縮將步驟3)得到的濾液濃縮至相對密度為1.00～1.10的藥液，加入0.4～4倍生藥量的水，攪拌，過濾，水溶性的雜質溶於濾液中被除去，濾渣經乾燥、粉碎得到淡黃色粉末的迷迭香的有效部位——總二萜酚類。
所述步驟2)的提取液為甲醇、乙醇、丙酮，優選乙醇；所述步驟2)的提取方式為浸漬，滲漉或回流；選用回流提取方式時，提取1～4次，以70％乙醇提取3次時的效果為最佳；所述步驟2)的放涼溫度優選40℃；所述步驟3)的活性炭的加入量優選0.1％(g/ml)為最好，脫色溫度優選55℃。
本發明提供的迷迭香的總二萜酚在口服給藥途徑下能有效地緩解冠心病、心絞痛所引發的心肌缺血，可以用於製備預防和治療心血管、緩解胸痺心痛症的藥物。
本發明提供的迷迭香的總二萜酚在體外篩選試驗中對乳腺癌、大腸癌、黑色素瘤、胃癌、白血病等腫瘤細胞有抑制和殺傷作用，可以用於製備治療子宮癌、宮頸癌、腸癌、乳腺癌等癌症的藥物。
本發明提供的提取方法簡單、易行，以HPLC為檢測手段，以鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量為檢測指標，可以有效地對整個工藝流程進行質量控制，有效地降低了有效部位中有效成分自身的氧化，提高了有效成分的含量，得到的原料藥純度高，色澤好；另外，該提取方法使用常規提取設備，造價低廉，工藝中沒有用到有毒的有機溶劑，無汙染，有利於保護環境，適於工業化生產。
圖1為實施例1製備的迷迭香總二萜酚的高效液相檢測圖譜；其中峰1為鼠尾草酸，峰3為鼠尾草酚；圖2為實施例1製備的迷迭香總二萜酚的薄層層析檢測圖譜；其中，1為鼠尾草酸對照品，2為實施例1製備的迷迭香有效部位，3為鼠尾草酚對照品。
具體實施例方式
實施例1、迷迭香總二萜酚的製備將採收後的迷迭香藥材曬乾後切段，加入10倍生藥量的70％(v/v)的乙醇回流提取3次；將合併的提取液放涼至40℃，過濾除去不溶物，得到綠褐色的濾液；脫色向此濾液中加入濾液體積重量百分比0.1％(g/ml)的活性炭，在55℃脫色20min，過濾除去活性炭，得到澄清、透明的紅棕色的藥液；將此濾液濃縮至相對密度為1.10的藥液，加入2倍生藥量的水，攪拌，過濾，水溶性的雜質溶於濾液中被除去，濾渣乾燥、粉碎，得到本發明的迷迭香總二萜酚，其為淡黃色粉末，總酚類的含量為80％。如圖2的薄層層析檢測圖譜所示，其主要含有鼠尾草酸和鼠尾草酚兩個化合物，經HPLC檢測如圖1所示，二者的含量之和為40％。
實施例2、迷迭香總二萜酚的製備將採收後的迷迭香藥材曬乾後切段，加入5倍生藥量的90％(v/v)的甲醇滲漉提取1次；將合併的提取液放涼至60℃，過濾除去不溶物，得到綠褐色的濾液；脫色向此濾液中加入濾液體積重量百分比0.05％(g/ml)的活性炭，在30℃脫色40min，過濾除去活性炭，得到澄清、透明的紅棕色的藥液；將此濾液濃縮至相對密度為1.00的藥液，加入0.4倍生藥量的水，攪拌，過濾，水溶性的雜質溶於濾液中被除去，濾渣乾燥、粉碎，得到淡黃色粉術，即本發明的迷迭香總二萜酚，其為淡黃色粉末，總酚類的含量為45％。HPLC檢測鼠尾草酸和鼠尾草酚的含量之和為13％。
實施例3、迷迭香總二萜酚的製備將採收後的迷迭香藥材曬乾後切段，加入12倍生藥量的50％(v/v)的丙酮浸漬提取5次；將合併的提取液放涼至20℃，過濾除去不溶物，得到綠褐色的濾液；脫色向此濾液中加入濾液體積重量百分比0.5％(g/ml)的活性炭，在80℃脫色5min，過濾除去活性炭，得到澄清、透明的紅棕色的藥液；將此濾液濃縮至相對密度為1.05的藥液，加入4倍生藥量的水，攪拌，過濾，水溶性的雜質溶於濾液中被除去，濾渣乾燥、粉碎，得到淡黃色粉末，即本發明的迷迭香總二萜酚，其為淡黃色粉末，總酚類的含量為60％。其主要含有鼠尾草酸和鼠尾草酚兩個化合物，經HPLC檢測二者的含量之和為40％。
實施例4、MTT法體外檢測實施例1的迷迭香有效部位對不同細胞系的增殖抑制1、所用試劑DMEM培養基是在不完全培養基的基礎上加3％的Glutamine 1ml，青鏈黴素1萬單位/ml及10％的血清(用時加)；胎牛血清，小牛血清穀氨醯胺，青黴素、鏈黴素凍存液DMSO與胎牛血清的比例是1∶9MTT用pH 7.2PBS配成5mg/ml，避光保存，現用現配。
細胞裂解液用超純水配，含20％SDS，50％DMSO，調pH 4.52、所用的細胞系胃癌細胞(BGC823)、黑色素瘤細胞(WM451)、頜底癌細胞(KB)、白血病(HL60)、宮頸癌細胞(HeLa)、大腸癌細胞(HT29)、乳腺癌細胞(MCF7和MDA231)3、細胞培養均用含10％滅活的胎牛血清/小牛血清的RPMI1640或DMEM培養液，細胞培養於37℃、5％CO2孵箱中2-3天傳代一次。
4、實施例1製備的迷迭香有效部位(以下均簡稱迷迭香總二萜酚)對不同腫瘤細胞增殖指標的測定採用MTT法進行分析。分別收集常規培養的腫瘤細胞，按照2000cells/孔、4000cells/孔和5000cells/孔接種96孔板，每種細胞做6重複孔，培養在含10％胎牛血清的DMEM培養基中，培養24h以後，棄去上清，每孔再分別加入迷迭香總二萜酚(藥物濃度分別為100μg/ml，50μg/ml，10μg/ml，1μg/ml)DMEM 0.1ml，繼續培養至48-72hr開始進行檢測，每孔加入濃度為500μg/ml的MTT，培養4-6h以後，1900rpm15min離心棄上清，分別加入PBS pH 7.2的緩衝液及細胞裂解液各0.1ml，37℃孵育過夜後，在BioTek Elisa Reader上讀取OD570nm的吸收值。結果列於表1。
表1、迷迭香總二萜酚對腫瘤細胞生長抑制率(％)
由表1的結果可以看出，本發明提供的迷迭香有效部位在體外可抑制各類腫瘤細胞增殖，對於上述各個細胞系胃癌細胞(BGC823)、黑色素瘤細胞(WM451)、頜底癌細胞(KB)、白血病(HL60)、宮頸癌細胞(HeLa)、大腸癌細胞(HT29)、乳腺癌細胞(MCF7和MDA231)在濃度在100ug/ml時，對腫瘤生長均有顯著地抑制作用，抑制率都大於50％，其中對乳腺癌細胞MCF7濃度在10ug/ml時，腫瘤生長抑制率仍大於50％。
該實驗結果提示了本發明提供的迷迭香有效部位在製備抗腫瘤藥物中的應用。
實施例5、實施例1的迷迭香有效部位在心血管活性方面的試驗1、對麻醉犬血流動力學影響實驗方法雜種犬36隻，分為6組，每組6隻，均採用十二指腸給藥，給藥分組如下實驗組I迷迭香總二萜酚(即實施例1製備的迷迭香有效部位，以下簡稱迷迭香總二萜酚)50mg/kg；實驗組II迷迭香總二萜酚100mg/kg；實驗組III迷迭香總二萜酚200mg/kg；陽性對照組地奧心血康32mg/kg；對照組等容量溶媒；以戊巴比妥鈉30mg/kg i.v.麻醉雜種犬，背位固定，頸部皮膚切開，氣管插管，連接電動呼吸機，分離右頸動脈，連接AP-601G放大器，測定血壓。分離股動脈，連接AP-601G放大器，進行心室內插管，測定左室內壓，舒張期末壓，並經微分處理器EQ-601G測定左室內壓最大變化速率(±dp/dtmax)。於左側第四肋間施開胸術，暴露心臟，剪開心包，做心包術。分離冠狀動脈左旋支和主動脈根部，放置電磁流量計探頭，測定冠脈血流量和主動脈流量。四肢連接肢體導聯，測定標準II導心電圖，計算心率。分離十二指腸，以備給藥。上述各指標同步記錄於多導記錄儀。術畢，穩定15min，記錄給藥前及藥後、30、60、120、150、240min諸指標。於給藥前及藥後30、60、120、150、240min取動脈、冠狀靜脈竇血，以血氧儀(康尼-158，美國生產)測定血氧含量。並根據公式，計算二級指標平均動脈壓、心臟指數、心搏指數、左室作功指數、總外周阻力、冠脈阻力、心肌耗氧量、心肌耗氧指數、心肌氧攝取率、心肌血流量等。實驗數據實測值和變化百分率值與對照組比較，進行組間t檢驗統計分析。
實驗結果(1)對心肌血流量的影響列於表2，結果表明試藥迷迭香總二萜酚50mg/kg劑量組心肌血流量的變化百分率在60～150min顯著增加(P＜0.05)。100mg/kg劑量組心肌血流量的變化百分率在60～240min顯著增加(P＜0.05)，心肌血流量實測值在120min顯著增加(P＜0.05)。200mg/kg劑量組在45～180min變化百分率顯著增加(P＜0.01)，實測值在90～120min顯著增加(P＜0.05)。
(2)對冠脈阻力的影響列於表3，結果表明迷迭香總二萜酚50mg/kg劑量組使冠脈阻力變化百分率在90～150min顯著下降(P＜0.05)。100mg/kg劑量組變化百分率在60～150min顯著下降(P＜0.05)。200mg/kg劑量組在60～240min變化百分率顯著下降(P＜0.01)。
表2、迷迭香總二萜酚對犬心肌血流量(ml/100g.min)的影響(X±S，n＝6)
與生理鹽水組實測值比較*P＜0.05，**P＜0.01；
與生理鹽水組變化百分率比較△P＜0.05，△△P＜0.01(下同)表3、迷迭香總二萜酚對犬冠脈阻力(Kpa/ml/100/min)的影響(X±S，n＝6)
實驗結論以上實驗結果表明，迷迭香總二萜酚100-200mg/kg劑量可顯著增加心肌血流量、降低冠脈阻力。迷迭香總二萜酚這些作用，與直接擴張冠脈有關，使之心肌血流量增加，直接反映心臟泵血功能的提高和增加外周血管擴張。
2、對垂體後葉素引起的大鼠心肌缺血的影響取體重220～240g的健康SD大鼠60隻，雌雄各半，隨機分成6組，空白對照組，地爾硫卓組(合心爽，50mg/kg)，地奧心血康膠囊(200mg/kg)，迷迭香高、中、低劑量組(600、300、150mg/kg)。連續給藥7d，最後一天於給藥後30min用戊巴比妥鈉ip麻醉後，仰位固定於鼠臺上，肢體導聯，心電圖機選擇標準電壓1mv＝20mm，紙速50mm/s，描記正常II導聯心電後，舌下靜脈注射垂體後葉素(1U/kg)，5s內注完。分別描記5s、15s、30s、3min各時間點的心電圖ECGII。
統計方法計算每個時間點的J點、T波變化及變化率X±s，做組間t檢驗。
實驗結果(1)對大鼠ECG II J點變化及變化率的影響列於表4，結果表明迷迭香高劑量(600mg/kg)可在5s及15s顯著對抗J點的變化(P＜0.01)，從變化率來看，中劑量(300mg/kg)在5s及15s的變化率與空白對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)。這一結果表明迷迭香可減輕由心肌缺血而引起的的J點的抬高或降低，其效應與劑量相關。
(2)對大鼠ECGII T波變化的影響列於表5，結果表明從T波變化來看，迷迭香總二萜酚高劑量組(600mg/kg)和中劑量組(300mg/kg)在不同時間點對的T波變化有不同程度的抑制(P＜0.05或P＜0.01)，而低劑量不能有效抑制垂體後葉素引起的T波變化。這一結果表明迷迭香可減輕T波的變化，其效應與劑量相關。
表4、迷迭香對垂體後葉素引起大鼠ECGII J點高度變化的影響
表5、迷迭香對垂體後葉素致大鼠ECG II T波高度變化的影響
實驗結論本實驗結果顯示，迷迭香總二萜酚300-600mg/kg對垂體後葉素引起的大鼠ECG II J點及T波的抬高或降低有顯著抑制作用，表明能夠改善由冠狀動脈收縮，造成心肌供血不足，從而抑制心肌缺血。
該實驗結果提示了本發明提供的迷迭香有效部位迷迭香總二萜酚在製備預防和治療心血管、緩解胸痺心痛症藥物中的應用。
權利要求
1.一種從迷迭香藥材中提取的迷迭香總二萜酚類，其總酚類物質的含量達45％以上。
2.如權利要求1所述的迷迭香總二萜酚，主要是以鼠尾草酚和鼠尾草酸為主，二者的含量之和在13％以上。
3.如權利要求1或2所述的迷迭香總二萜酚，其為由如下的方法得到1)預處理將採收後的迷迭香藥材曬乾後切段，得到的迷迭香生藥備用；2)提取加入5～12倍生藥量的50～90 v/v％的提取液進行提取1～5次；將合併的提取液放涼至4～40℃，過濾除去不溶物，得到綠褐色的濾液；所述的提取液為甲醇、乙醇或丙酮；3)脫色向步驟2)得到的濾液中加入濾液體積重量百分比0.05～0.5％活性炭，在30～80℃脫色5～40min，過濾除去活性炭，得到澄清、透明的紅棕色的藥液；4)濃縮將步驟3)得到的濾液濃縮至相對密度為1.00～1.10的藥液，加入0.4～4倍於生藥量的水，攪拌，過濾，水溶性的雜質溶於濾液中被除去，濾渣經乾燥、粉碎得到迷迭香的有效部位。
4.如權利要求3所述的迷迭香總二萜酚的製備方法，其特徵在於，所述步驟2)的提取液為乙醇。
5.如權利要求3所述的迷迭香總二萜酚的製備方法，其特徵在於，所述步驟2)的提取方式為浸漬，滲漉或回流。
6.如權利要求5所述的回流提取方法是以70％乙醇提取3次。
7.如權利要求3所述的迷迭香總二萜酚的製備方法，其特徵在於，所述步驟2)的放涼溫度為25℃。
8.如權利要求3所述的迷迭香總二萜酚的製備方法，其特徵在於，所述步驟3)的活性炭的加入量為0.1％，脫色溫度為50℃。
9.一種權利要求1和2所述的迷迭香總二萜酚在製備預防和治療心血管、緩解胸痺心痛症的藥物中的應用。
10.一種權利要求1和2所述的迷迭香總二萜酚在製備治療子宮癌、宮頸癌、腸癌、乳腺癌等的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種迷迭香的有效部位及其製備方法和用途。該迷迭香的有效部位是從迷迭香藥材中提取的總二萜酚類，其總酚類物質的含量達45％以上，其中主要成分鼠尾草酚和鼠尾草酸的含量之和在13％以上。其製備方法為將迷迭香藥材曬乾後切段；加入提取液進行提取；將合併的提取液放涼後過濾；用活性炭脫色；將濾液濃縮後加水，過濾，濾渣經乾燥、粉碎而得到。該迷迭香有效部位可以用於製備預防和治療心血管、緩解胸痺心痛症的藥物。還可用於製備治療子宮癌、宮頸癌、腸癌、乳腺癌的藥物。本發明的提取方法簡單、易行，得到的原料藥純度高，色澤好；且造價低廉，無汙染，適於工業化生產。
文檔編號A61K31/045GK1698587SQ20041004271
公開日2005年11月23日 申請日期2004年5月21日 優先權日2004年5月21日
發明者屠鵬飛, 齊學兵, 逄劍, 李志新 申請人:北京華醫神農醫藥科技有限公司