一種治療肝衰竭的藥物及其製備方法

2023-10-06 19:54:39 1

專利名稱：一種治療肝衰竭的藥物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域中的藥物及其製備方法，特別是涉及一種治療肝衰竭的 藥物及其製備方法。
背景技術：
肝臟是人體最大的內臟器官，也是功能最複雜的器官之一，它擔負著許多非常重 要的生理功能，如各種物質代謝的中樞、分泌膽汁、合成蛋白和凝血因子、以及解毒 等，對維持生命和內環境的穩定起到重要作用。目前，終未期肝病，如急性肝衰竭、 肝硬化和肝癌等均危及生命，且死亡率極高， 一直是醫學界難以解決的問題。據統計，
全世界約有3億多肝病患者，其中三分之一在我國，我國是肝病大國，是世界上終末 期肝病發病率最高的地區之一，每年因肝病而死亡者人數眾多。原位肝移植是肝功能 衰竭及先天性肝代謝疾病唯一成熟的治療方法。據美國UNOS報導，在過去十年裡， 全世界共實施26040例肝移植;據中華器官移植學會及全國肝移植協作組的統計，1976 年至2004年，我國內地共完成各種類型肝移植5000餘例。此外，供肝缺乏是世界各 國面臨的主要問題。儘管近年來發展了背馱式、劈離式和活體劈離式等多種肝移植術 式，以求最大程度地利用供肝，但仍不能解決等待肝移植患者與供肝者之間的巨大差 額，且因其具有操作複雜、患者常需終生免疫抑制和花費巨大等缺點，臨床應用受到 極大的限制。
隨著20世紀90年代生物人工肝概念的提出和不斷發展，體外生物型人工肝為肝 衰竭的治療開闢了一條新途徑。雖然近年來幾種以培養肝細胞為基礎的生物型人工肝 已進行了 I-ni期臨床試驗，且取得了令人鼓舞的療效，但這些系統要真正得到臨床 推廣應用，還必須獲得足夠數量，且具有高度活性及良好功能的肝細胞，這也成為限 制其發展的最主要因素。目前，研究的焦點主要集中在利用肝細胞來替代肝功能，但
免疫排斥是其發展的瓶頸。近幾年發展起來的微囊技術具有有效的免疫隔離屏障，隨 著該技術的發展，擴大了供肝細胞來源，解決了供體缺乏這一難題。微囊化肝細胞移 植在治療各種肝病中的研究正受到越來越多的關注，其臨床效果也更加值得期待。
微囊(Microcapsules)技術是一種利用天然的或合成的高分子成膜材料(囊材) 把液體或固體藥物(囊心物)包嵌形成直徑1-5000 um (通常為5-250 um)微小膠囊 的技術。囊膜具有透膜或半透膜性質，囊心物可藉壓力、pH值、溫度或提取等方法釋出。根據包囊技術和囊心物、囊材的性質不同，微囊的囊粒可以是囊心物外包囊材的 膜殼型或囊心物與囊材鑲嵌在一起的鑲嵌型。囊粒可以是球形、葡萄串形、表面平滑 或摺疊而不規則等各種形狀。目前製藥工業中常採用各種藥物的微囊製成各種劑型， 如散劑、膠囊劑、注射劑、混懸劑、咀嚼片、含片、洗劑、埋植片、軟膏劑、塗劑、 栓劑、膜劑、敷料等。
製備微囊的過程稱為微型包囊術(Microencapsulation)，簡稱微囊化。藥物微 囊化後具有許多優越性
1. 能減少複方製劑中藥物之間的配伍禁忌，隔絕藥物組分間的反應。
2. 遮蔽藥物的苦味或異味，如磺胺類藥物。
3. 控制藥物的釋放。
(1) 控釋或緩釋藥物，可採用惰性薄膜、可生物降解的材料等來達到控釋或 緩釋的作用。
(2) 使藥物在特定的部位釋放，對於治療指數比較低的藥物可製成靶向製劑， 提高藥物的療效。
4. 降低藥物的毒性。
5. 用微囊製備的藥物製劑具有以下優越性
(1) 控釋或緩釋藥物。用微囊配製散劑，流動性好，齊U量比較準確。可改善 藥物的易吸溼引溼性，粉末不易結塊。
(2) 用微囊灌注空心膠囊，流動性好，裝量準確。
(3) 可直接用微囊壓製片劑，可壓性良好。製得的顆粒流動性好，填入衝模 的量準確，片重差異較小；也可以減小壓片時粉末飛揚。
6. 保護藥物，如易氧化、對水氣敏感等藥物；使液態或揮發性藥物成為穩定的粉末。
7. 更利於藥物的貯存。
8. 可將活細胞或生物活性物質包裹，如酶、胰島素血紅蛋白等。

發明內容
本發明的目的是提供一種安全、療效確切的治療肝衰竭的藥物。
為實現上述目的，本發明採取以下設計方案 一種治療肝衰竭的藥物，它的有效 成分為採用微囊技術混合包裹的肝細胞和表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子
(rhbFGF)的人胎肝基質細胞。
所述肝細胞和表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的混合比 例可為10-1: 1，優選為7: 1。所述肝細胞的來源是廣泛的，如可工業獲取的大鼠、小鼠、豬或人等哺乳動物的 肝細胞，或經不同幹細胞誘導而來的肝細胞或肝樣細胞，優選為來自大鼠的肝細胞。
可採用生物技術領域的常規方法誘導幹細胞成為肝細胞或肝樣細胞。
所述表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞為轉染重組人鹼性 成纖維細胞生長因子基因的轉基因人胎肝基質細胞。
可按照常規方法將重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因轉染人胎肝基質細胞，如 通過含有重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組真核表達載體將重組人鹼性成 纖維細胞生長因子基因導入人胎肝基質細胞。
用於構建含有重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組真核表達載體的出發
載體可為pEGFP-Nl、 pCMV5、 pSilencel. 0-U6 (Ambion， Austin, TX， USA) 、 pEGFP-Nl、 pSV40、 pCI-neo (購於Promega公司)、pTEFl、 pPICZ a 、 pAM82或pAAh5等。
所述攜帶有重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組真核表達載體可通過脂 質體介導法、電轉、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒或慢病毒等常規的生物學方法 轉化人胎肝基質細胞。
本發明的第二個目的是提供一種製備上述治療肝衰竭的藥物的方法。
本發明所提供的製備方法，可包括以下步驟
1) 將肝細胞懸液與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合 形成混合物；
2) 將步驟1)獲得的肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質 細胞混合物微囊化，得到治療肝衰竭的藥物。
在上述藥物的製備方法中，步驟l)中的混合物中肝細胞和表達重組人鹼性成纖 維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的混合比例可為10-1: 1，優選為7: 1。
以上方法中，所述肝細胞的來源是廣泛的，如可工業獲取的大鼠、小鼠、豬或人 等哺乳動物的肝細胞，或經不同幹細胞誘導而來的肝細胞或肝樣細胞，優選為來自大 鼠的肝細胞。
以上方法中，所述表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞為轉染 重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因的轉基因人胎肝基質細胞。
以上方法中，可按照常規方法將重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因轉化人胎肝 基質細胞，如通過含有重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組真核表達載體將重 組人鹼性成纖維細胞生長因子基因導入人胎肝基質細胞。
以上方法中，用於構建含有重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組真核表達 載體的出發載體可為pEGFP-Nl、 pCMV5、 pSilencel. 0—U6 (Ambion， Austin, TX， USA)、
6pEGFP-Nl、 pSV40、 pCI-neo (購於Promega公司)、pTEFl、 pPICZ a 、 pAM82或pAAh5 等。
以上方法中，所述攜帶有重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組真核表達載 體可通過脂質體介導法、電轉、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒或慢病毒等常規的 生物學方法轉化人胎肝基質細胞。
以上方法中，可用改良的Seglen膠原酶/EGTA兩步灌注法(Seglen P0. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol 1976;13: 29)制 備肝細胞懸液將肝細胞重懸於含8-12%小牛血清(FBS)的1640培養液中，然後 測定細胞存活率，若存活率大於90%，得到肝細胞懸液。
以上方法中，步驟2)中將肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎 肝基質細胞混合物微囊化的方法可為對步驟l)獲得的細胞懸液進行離心，棄上清 液，將細胞沉澱重懸於質量/體積(W/V)百分濃度為1.0-2. 0%的藻酸鈉溶液中，然後 將細胞懸液置於氣流式微囊形成儀中，調整氣流量為2-6 L/min(氧氣)，用3-6號針 尖打出，滴入質量/體積(W/V)百分濃度為1.0_2.0%的氯化鈣溶液中，靜置20-30min 後，形成聚集，洗滌；然後，將混合細胞置入質量/體積百分濃度為0.05-0. 15%的 多聚賴氨酸溶液中靜置4-8min，洗滌；再將混合細胞置入質量/體積百分濃度為 0. 1-0.2%的藻酸鈉溶液中，靜置2-6min，洗滌；最後，將混合細胞加入質量/體積 百分濃度為1.0-2.0%的檸檬酸三鈉溶液中，靜置3-7min，洗滌，得到微囊化的肝細 胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合物，即本發明治療肝 衰竭的藥物。
在上述將肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合 物微囊化過程中所用的洗滌液均為生理鹽水。
此外，本發明治療肝衰竭的藥物可製成多種劑型，如注射液或冷凍注射劑等。上 述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法製備。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載 體包括藥學領域常規的稀釋劑、吸收促進劑、表面活性劑等。
上述肝衰竭的藥物的用量一般為10-100mL/kg體重/day (請提供常規劑量)，療 程一般為10-20天，並可根據實際情況調整。
為提高療效，本發明的藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑等進行組合治療。
本發明提供了一種治療肝衰竭的藥物及其製備方法。該藥物的有效成分為採用微 囊技術混合包裹的肝細胞和表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞。 實驗證明，本發明的藥物對大鼠肝細胞壽命和功能發揮起到支持作用，將其植入急性肝衰竭小鼠模型腹腔內，可見該藥物對肝衰竭小鼠的肝功恢復起到促進作用，移植後 的小鼠存活率得到顯著提高，且肝組織壞死程度明顯減輕。本發明為肝細胞移植及生 物人工肝等提供了一條新的途徑，在醫學和生物製藥領域，尤其是提高肝功能和遏制 肝衰竭藥物的製備領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1A為體外單獨培養的大鼠肝細胞的細胞形態
圖IB為體外混合培養的大鼠肝細胞與人胎肝基質細胞的細胞形態
圖1C體外混合培養的大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎
肝基質細胞的細胞形態
圖ID為螢光顯微鏡下的體外混合培養的大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細
胞生長因子的人胎肝基質細胞
圖IE為體外單獨培養的微囊化大鼠肝細胞的細胞形態
圖IF為體外混合培養的微囊化大鼠肝細胞與人胎肝基質細胞的細胞形態
圖1G為體外混合培養的微囊化大鼠肝細胞與表達鹼性成纖維細胞生長因子的人
胎肝基質細胞的細胞形態
圖1H為體外混合培養的微囊化大鼠肝細胞與表達鹼性成纖維細胞生長因子的人 胎肝基質細胞的螢光顯微鏡觀測結果
圖2A為I、 II、 III、 IV、 V組白蛋白含量檢測結果
圖2B為I、 II、 III、 IV、 V組谷丙轉氨酶含量檢測結果
圖2C為I、 II、 m、 IV、 V組肝細胞色素酶P450-CYP3A4的活性檢測結果檢測
結果
圖3A為I、 II、 III、 IV、 V組移植小鼠的存活率統計結果 圖3B和圖3C為IK III、 IV、 V組移植小鼠的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)及白蛋白 (ALB)含量統計結果
圖4為I、 II、 III、 IV、 V組移植小鼠肝組織的病理學觀察結果 圖5A至圖5E為I、 II、 III、 IV、 V組移植小鼠肝組織PCNA表達情況的檢測結
果
圖6為H、 III、 IV、 V組移植小鼠的微囊回收率統計結果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見以下文獻: 組織工程基礎與應用筏義人科學出版社，2007，
8組織工程原理(美)R. P.蘭扎，R.蘭格，J.瓦康提主編化學工業出版社2006， 組織工程方法(美)A.阿塔拉，R. P.蘭扎主編化學工業出版社2006， 細胞培養司徒鎮強，吳軍正世界圖書出版公司2007。
所述百分比濃度如無特別說明均為質量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V) 百分比濃度。
實施例1、製備治療肝衰竭的藥物
用本發明的方法製備治療肝衰竭的藥物，具體過程包括以下步驟
1) 大鼠肝細胞懸液的製備
選擇雄性Wistar大鼠(體重150g，由軍事醫學科學院動物中心提供)，用改良 的Seglen膠原酶/EGTA兩步灌注法(Seglen PO. Pr印aration of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol 1976;13: 29)製備肝細胞懸液將大鼠肝細胞按5X105 個/mL的濃度重懸於含10X(8-12X均可)小牛血清(FBS)的1640培養液(購自Gibcol) 中，然後用臺盼藍拒染法(細胞培養司徒鎮強，吳軍正世界圖書出版公司2007) 測定細胞存活率，結果存活率大於90%，符合要求，得到大鼠肝細胞懸液。
需要說明的是，上述以大鼠為例說明了獲得肝細胞懸液的其中一種途徑，是實驗 室獲取肝細胞的一種方式，但並非構成對本發明肝細胞來源的限制。工業應用中，所 述肝細胞的來源應該是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的肝細胞都可以 作為本發明的原料，如來源於大鼠、小鼠、豬或人等哺乳動物的離體肝細胞，也包括 從細胞庫中取得、或商業購買獲得的肝細胞，還包括經可以商業獲取的不同幹細胞用 已知方法誘導而來的肝細胞或肝樣細胞，目前可以誘導為肝細胞的幹細胞包括骨髓間 充質幹細胞、胚胎幹細胞和肝幹細胞等。
2) 表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的獲得
參考文獻(《慢病毒介導的穩定表達bFGF的胎兒肝臟基質細胞株的建立》，生 物化學與生物物理進展2007, 34(2): 207-214)中記載的方法獲得表達重組人鹼性 成纖維細胞生長因子(rhbFGF)的人胎肝基質細胞。
同樣，人胎肝基質細胞的獲取過程中的任何生物材料並不限於參考文獻介紹的來 源，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可作為其來源，其目標在於從 具有可應用來源的生物材料中按照參考文獻記載的方法獲得表達重組人鹼性成纖維 細胞生長因子(rhbFGF)的人胎肝基質細胞。
3) 將步驟l)提示得到的大鼠肝細胞懸液與步驟2)提示獲得的表達重組人鹼性 成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合，大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的混合比例為7 : 1，即使混合液中大鼠肝細胞的濃度為 5X105個/mL，表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的濃度為7X101 個/mL。
在具體實施中，大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質 細胞的混合比例可以在(10-1) : l均可，在此恕不一一羅列。
4)將步驟3)獲得的大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝 基質細胞混合物微囊化，方法為對步驟3)獲得的細胞懸液進行離心(500rpm， 5min), 棄上清液，將細胞沉澱重懸於質量/體積百分濃度為1.5% (1.0_2.0%均可)的藻酸 鈉溶液中，然後將細胞懸液置於氣流式微囊形成儀中，調整氣流量為4 L/min (2-6 L./min均可)(氧氣)，用4.5號(3-6號均可)針尖打出，滴入質量/體積百分濃度為 1.5% (1.0-2. 0%均可)的氯化鈣溶液中，靜置25min(20-30min均可)後，用生理鹽 水洗滌2遍，每遍5min;然後，將混合細胞置入質量/體積百分濃度為0. 1 %
(0.05-0. 15%均可)的多聚賴氨酸溶液中靜置6min (4-8min均可)，用生理鹽水洗 滌2遍，每遍5min;再將混合細胞置入質量/體積百分濃度為0. 15% (0. 1-0.2%均 可)的藻酸鈉溶液中，靜置4min (2-6min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min; 最後，將混合細胞加入質量/體積百分濃度為1.5% (1.0-2.0%均可)的檸檬酸三鈉 溶液中，靜置5min (3-7min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min，得到微囊化 的肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合物，即本發明 治療肝衰竭的藥物。
將本發明治療肝衰竭的藥物置於含10%小牛血清的DMEM培養液(Dulbecco' s modified Eagle's medium,購自Gibcol公司，配製方法將10g低糖DMEM粉末溶 於1L三蒸水中，再每升加入4g HEPES、 3. 7g Na2HCO:,及0. 3g谷胺醯銨，調pH值至 7.0-7.4，加入青黴素、鏈黴素至終濃度為100U/mL，用0.22Mm的微孔濾膜超濾除菌， 最後，每90mL加入10mL胎牛血清(fetal bovine serum, FCS))， 4'C保存，備用。
實施例2、微囊化混合共培養的大鼠肝細胞和表達重組人鹼性成纖維細胞生長因 子的人胎肝基質細胞的細胞形態觀察及其體外功能測定
一、微囊化混合共培養的大鼠肝細胞和表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人 胎肝基質細胞的體外培養和細胞形態觀察
觀察體外單獨培養的大鼠肝細胞(I組)、體外混合培養的大鼠肝細胞和人胎肝
基質細胞(n組)或表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞(m組)
(混合比例均為7:1)的細胞形態，方法為將大鼠肝細胞重懸於含10%小牛血清 的DMEM培養液中，製成濃度為2. 5X 1S個/mL的細胞懸液，然後將其接種於六孔板中，
10再按7: 1的比例接種人胎肝基質細胞或表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎 肝基質細胞(細胞濃度均為7X104個/mL，每種接種2孔)，以未接種的為對照，然 後將此六孔板置於37'C、 5% C02孵養箱中培養4周，在雷射共聚焦顯微鏡下觀察並 記錄各組細胞形態的變化。同時，用相同方法觀察體外單獨培養的微囊化大鼠肝細胞 (IV組)、體外混合培養的微囊化的大鼠肝細胞(V組)和人胎肝基質細胞或表達重 組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞(VI組)(混合比例均為7 : 1，混合 及微囊化方法與實施例1相同)的細胞形態。
觀察結果體外平面單獨培養大鼠肝細胞24小時後，可見30-50%的細胞粘附於 平皿表面，繼續培養24小時後，大鼠肝細胞的粘附率達70%，肝細胞開始鋪展，變 得扁平，在細胞中央可見細胞核透明易識別，但無聚集生長傾向；體外培養48小時 後，大鼠肝細胞變得更加扁平， 一小部分鄰近的細胞因鋪展而開始融合，形成索狀細 胞團(見圖1A);培養至2周時，已有細胞開始逐漸死亡。混合共培養的大鼠肝細胞， 接種即時就和人胎肝基質細胞或表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質 細胞己有相互粘附聚集傾，培養24小時後，大部分大鼠肝細胞和表達重組人鹼性成 纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞呈片狀相連。培養48小時後，混合培養的大鼠 肝細胞與人胎肝基質細胞進一步聚集成不規則的小片狀，細胞連接緊密，外周鬆散(見 圖1B)，並保持此形態約l周，l周后細胞狀態下降，開始出現死亡細胞。而混合培 養的大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞與前者相 比，不但聚集而成的不規則片狀區域更大，滿布視野，而且外周保持緊密，見圖1D 和圖1H，其中發綠色螢光的細胞(如圖中箭頭所指)為表達重組人鹼性成纖維細胞生 長因子的人胎肝基質細胞，並保持此形態直至終止培養，培養2周後，細胞才逐漸死 亡。
體外單獨培養微囊化大鼠肝細胞48小時後，在雷射共聚焦顯微鏡下可見微囊呈 圓球形，表面光滑，肝細胞呈圓形，均勻地分布於微囊內(見圖1E);微囊化混合共 培養的大鼠肝細胞與人胎肝基質細胞在微囊內均呈圓形，並有聚集趨勢，相互接觸呈 小團塊狀，但小團塊間未見接觸(見圖1F);在微囊化混合共培養的大鼠肝細胞與表 達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞在微囊內，表達重組人鹼性成纖 維細胞生長因子的人胎肝基質細胞圍繞肝細胞聚集生長，聚集趨勢非常明顯，相互接 觸形成類肝組織樣較大的團塊，並懸浮於微囊內呈三維生長(見圖1G)。在螢光顯微 鏡下清晰可見表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞在與大鼠肝細 胞形成的團塊中所發出的綠色螢光，見圖1H，其中發綠色螢光的細胞(如圖中箭頭所 指)為表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞。
11對於微囊化混合共培養的大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的 人胎肝基質細胞在10-1: 1範圍內混合形成的其它系列藥物進行同樣的體外培養和細 胞形態觀察，得到與圖1G類似的結果。
上述細胞形態觀測結果表明囊內轉rhbFGF人胎肝基質細胞對大鼠肝細胞維持壽 命和功能發揮有明顯的支持作用。
二、微囊化混合共培養的大鼠肝細胞和表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人 胎肝基質細胞的體外功能測定
用與步驟一相同的方法體外培養上述六組細胞(I組、II組、III組、IV組、V組、 VI組)，隔天換液時取細胞培養上清，培養4周後，用OLYMPUS AU2600全自動生化 儀分別檢測六組細胞培養上清中微量白蛋白和谷丙轉氨酶的含量，同時檢測肝細胞色 素酶P450-CYP3A4的活性，檢測方法為各組隔天換液後，將細胞用PBS洗滌3次， 加入睪酮(Testosterone)工作液(CYP3A4典型底物，Sigma 500nM， PBS稀釋)，在 37"C下與細胞共孵育2小時，分別取孵育0、 2小時點，加入等體積含5% (W/V)內 標非那西汀的乙腈終止反應，然後14000rpm離心5min，取上清液通過質譜儀(型號 為Agilent7600，購自Agilent Co.)進樣檢測細胞上清中睪酮的剩餘量，以此來評 價肝細胞色素酶P450-CYP3A4的活性(空白對照孔平行操作，復孔)。
微量白蛋白和谷丙轉氨酶的含量檢測結果用OLYMPUS AU2600全自動生化儀檢 測細胞培養上清後，發現各組肝細胞均產生一定量的白蛋白。在整個培養期間，III組 所產生的白蛋白量高於I、 II組，VI組所產生的白蛋白量高於IV、 V組，特別是VI組 所產生的白蛋白量明顯高於其它各組(屍<0.05，說明差異顯著)。培養至14天時， I、 II、 III、 IV、 V組白蛋白含量開始下降，並低於第O天水平，但VI組白蛋白含量 仍然高於初始水平，並且維持到實驗結束(見圖2A，圖中，從左至右的柱依次對應I 組、II組、III組、IV組、V組、VI組，圖2B至2C同)。此外，各組肝細胞均釋放一 定量的谷丙轉氨酶，第2天時，VI組細胞培養上清中的谷丙轉氨酶含量比第O天下降 約3倍。但培養至第14天時，各組的谷丙轉氨酶量無顯著性差異(見圖2B)。上述 檢測結果表明微囊內轉rhbFGF胎肝基質細胞對大鼠肝細胞維持壽命和功能發揮有明 顯的支持作用。
肝細胞色素酶P450-CYP3A4的活性檢測結果各組肝細胞均不同程度的代謝了部 分睪酮。第2天，VI組細胞培養上清中睪酮剩餘量已開始明顯低於其它各組(屍<0. 05， 說明差異顯著)，而其它各組間差異無統計學意義；第21天，I、 II、 III、 IV、 V 組培養上清中睪酮剩餘量已明顯接近孵育前的初始濃度500nM，而VI組睪酮剩餘量仍 明顯低於其它各組和初始濃度(屍<0.05，說明差異顯著)(見圖2C)。上述檢測結果表明微囊內轉rhbFGF人胎肝基質細胞對大鼠肝細胞維持P450-CYP3A4酶的活性有明顯的促進作用。
對於大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞在
10-1: l範圍內混合形成的其它系列藥物(如6: 1、 8: 1等)進行相同的功能檢測，
結果與上述實驗結論相同，在此不再一一羅列。
實施例3、本發明治療肝衰竭藥物的藥效檢測
用小鼠急性肝衰竭模型檢測本發明藥物的療效，檢測方法如下
一、 小鼠急性肝衰竭模型的建立
實驗前將100隻BALB/c系小鼠(購自軍事醫學科學院動物中心)飼養一周，然後將部分小鼠用乙醚麻醉、消毒後，行上腹正中橫行切口，暴露肝臟，依次結紮並切
除大鼠肝左葉和中葉(約佔全肝的70%)，僅保留右葉，方葉和尾狀葉；術後給飲IO
%葡萄糖水，標準鼠食飼養，不同時間監測動物的存活情況和血生化指標。
二、 體內移植方法和步驟
將步驟一獲得的急性肝衰竭模型小鼠於肝臟切除術後立即進行腹腔移植，將急性肝衰竭模型小鼠分成五組(每組i5隻，i組為空白對照，n組、in組、iv組為對照，
V組為實驗組)，在位於腹腔正中3腿處，用12號針頭，分別注入lmL空囊(II組)、微囊化大鼠肝細胞(III組)、微囊化大鼠肝細胞與人胎肝基質細胞(IV組)，以及微囊化大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞(V組，實施例一中7: l混合藥物)(m組、IV組、V組均含有大鼠肝細胞5X15個，IV組、V組中均含有7X104個人胎肝基質細胞或表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞)，術後常規肌注青黴素10萬單位，每日1次，連續注射3天。
三、 微囊化混合肝細胞移植對肝衰竭小鼠生存狀態及肝功能的影響步驟二中的I、 II、 III、 IV組移植小鼠在72小時均出現嚴重的肝功能衰竭狀態，
表現為活動障礙、嗜睡、昏迷，此時的存活率分別為40%、 40%、 46.70%、 60%;與之相比，植入本發明藥物(微囊化混合肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞)的V組移植小鼠未出現嚴重的肝衰竭症狀，存活率為86.70%。至7天時，V組小鼠的存活率是其它各組的兩倍。7天後，各組小鼠的存活率分別為20%、 20%、 26.70%、 40%和80%。與其它組相比，V組小鼠的存活率明顯優於其它各組(屍< 0.05，說明差異顯著)，其它組間無顯著差異(見圖3A)。
小鼠肝功能受損在切除術後48小時內達到高峰，以後逐漸下降；V組移植後24小時丙氨酸氨基轉移酶(ALT)較其它各組均有明顯好轉(屍<0.05，說明差異顯著)，而自移植48小時起，V組ALT及白蛋白(ALB)含量均較其它組明顯好轉，具有顯著性
13差異(屍< 0.05，說明差異顯著)；移植後第7天，各組間生化指標差異不明顯，無統計學意義(見圖3B和圖3C)。
上述檢測結果表明微囊化混合肝細胞與轉rhbFGF人胎肝基質細胞對肝衰竭小鼠肝功恢復有明顯的促進作用。
四、 腹腔移植後肝組織的病理學觀察
行肝大部切除術48小時後發現，步驟二中的I、 II、 III、 IV組移植小鼠殘存的肝臟呈黃白色、無光澤，肝組織腫脹明顯，失去彈性，邊緣圓鈍易碎裂；鏡下肝組織大片壞死(見圖4中的A)，失去正常肝小葉結構(見圖4中的D)，匯管區紊亂(見圖4中的B)，肝細胞嚴重變性，部分細胞溶解，細胞核碎裂，細胞界限不清，肝竇裂隙增大(見圖4中的C)，血管內皮細胞脫落，還可見到大片淡染區域，有明顯的炎性細胞浸潤。與之相比，V組肝臟也呈黃白色，略有光澤，肝組織輕度腫脹，但較其它組明顯減輕，中葉和尾葉輕度肥大；在光鏡下觀察肝組織，與其它組相比，V組肝組織壞死程度明顯減輕，肝小葉結構稍有紊亂，肝索間裂隙不規則增大，偶爾可見肝細胞變性壞死，有少量炎性細胞浸潤，匯管區肝細胞增生明顯，可見大量雙核或多核細胞(見圖4中的E)。上述病理學觀察結果表明微囊化混合肝細胞與轉rhbFGF人胎肝基質細胞對肝衰竭小鼠肝功恢復有明顯的促進作用。
同時，利用免疫組織化學方法檢測肝組織PCNA (增殖細胞核抗原)的表達情況，檢測方法參見《免疫組織化學實驗技術及應用》倪燦榮，馬大烈，戴益民化學工業出版社2006; —抗為小鼠抗大鼠PCNA (購自中山)，二抗為山羊抗小鼠IgG (購自中山)，以此來反映肝衰竭小鼠肝組織的增殖狀態。在光鏡下可見，肝切除術後24小時，V組(見圖5中的E)與其它組相比，陽性信號表達已開始迅速升高，48小時表達量最高，其後表達量逐漸下降；陽性細胞核表達區域從匯管區周圍逐漸向中央靜脈周圍區推進，24小時集中在匯管區周圍；至48小時，陽性表達除小葉中央靜脈周圍區外，其餘細胞核均為陽性；至96小時以後，從匯管區周圍向中央靜脈周圍逐漸轉為陰性。而其它組值(1、 II、 III、 IV組)(見圖5中的A、 B、 C禾nD)至72小時，陽性信號表達才逐漸開始表達，至實驗結束表達量一直很低。上述檢測結果表明微囊化混合肝細胞與轉rhbFGF人胎肝基質細胞對肝衰竭小鼠肝臟再生的促進作用。
五、 微囊的回收
移植4周後，對步驟二中的五組小鼠進行腹腔灌洗，收集腹腔內游離或附著於肝包膜的微囊。在光鏡下觀察回收的微囊後，發現II組中的空囊大多具有良好的外形，呈圓形，囊壁光滑、完整，囊外無纖維化現象，回收率達(89±52) %。 III、 IV組大部分在腹腔內呈游離狀態，腹腔衝洗可取出微囊，小部分微囊粘附於大網膜、腸繫膜間，回收率分別為(76±45) %、 (78±67) %，在光鏡下下觀察大部分細胞胞膜破裂、萎縮，胞漿渾濁不清，提示大部分細胞已經死亡。V組微囊小部分游離於腹腔，多在肝臟斷端周圍聚集成團或附著於肝組織表面，回收率為(77±94) %，在光鏡下觀察到微囊內大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞相互接觸成團，細胞膜均完整光滑，胞漿飽滿，表明仍有肝細胞存活。各組間回收率差異存在統計學意義(屍〈0.05，說明差異顯著)(見圖6)。上述回收率統計結果表明微囊有較好的回收率。
實施例4、製備治療肝衰竭的藥物及其療效檢測
一、製備治療肝衰竭的藥物.
用本發明的方法製備治療肝衰竭的藥物，具體過程包括以下步驟
1) 大鼠肝細胞懸液的製備
選擇雄性Wistar大鼠(體重150g)，用改良的Seglen膠原酶/EGTA兩步灌注法(Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol1976;13:29)製備肝細胞懸液將大鼠肝細胞按4X105個/mL的濃度重懸於含8X(8-12%均可)小牛血清的1640培養液中，然後用臺盼藍拒染法測定細胞存活率，結果存活率大於90%，符合要求，得到大鼠肝細胞懸液。
2) 表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的獲得
參考文獻(《慢病毒介導的穩定表達bFGF的胎兒肝臟基質細胞株的建立》，生物化學與生物物理進展2007， 34(2): 207-214)中記載的方法獲得表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞。
3) 將步驟l)製備的大鼠肝細胞懸液與步驟2)獲得的表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合，大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的混合比例為8 : 1 (10-1: l均可)，即使混合液中大鼠肝細胞的濃度為4X105個/mL，表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的濃度為5X104個/mL。
4) 將步驟3)獲得的大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合物微囊化，方法為對步驟3)獲得的細胞懸液進行離心(600rpm， 3min)，棄上清液，將細胞沉澱重懸於質量/體積百分濃度為1.0% (1.0-2.0%均可)的藻酸鈉溶液中，然後將細胞懸液置於氣流式微囊形成儀中，調整氣流量為6 L/min (2-6L/min均可)(氧氣)，用5號(3-6號均可)針尖打出，滴入質量/體積百分濃度為2.0% (1.0-2.0%均可)的氯化鈣溶液中，靜置30min(20-30min均可)後，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;然後，將混合細胞置入質量/體積百分濃度為0. 05%
15(0.05-0. 15%均可)的多聚賴氨酸溶液中靜置8min (4-8min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5niin;再將混合細胞置入質量/體積百分濃度為0. 2% (0. 1-0. 2%均可)的藻酸鈉溶液中，靜置2min (2-6min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;最後，將混合細胞加入質量/體積百分濃度為2.0% (1.0-2.0%均可)的檸檬酸三鈉溶液中，靜置7min (3-7min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min，得到微囊化的肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合物，即本發明治療肝衰竭的藥物。將本發明治療肝衰竭的藥物置於含10%小牛血清的DMEM培養液中備用。
二、本發明治療肝衰竭藥物的療效檢測
用與實施例三相同的方法檢測本發明藥物的療效，結果較其它組，移植有本發明藥物的肝衰竭模型小鼠的存活率及肝功能均得到顯著提高，肝組織壞死程度明顯減輕，肝小葉結構稍有紊亂，肝索間裂隙不規則增大，偶爾可見肝細胞變性壞死，有少量炎性細胞浸潤，匯管區肝細胞增生明顯，可見大量雙核或多核細胞；肝組織PCNA
(增殖細胞核抗原)的表達情況良好；此外，微囊小部分游離於腹腔，多在肝臟斷端周圍聚集成團或附著於肝組織表面，回收率為(77±94) %，在光鏡下觀察到微囊內大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞相互接觸成團，細胞膜均完整光滑，胞漿飽滿，表明仍有肝細胞存活。上述檢測結果表明本發明的藥物對肝衰竭具有較好的療效，可用於肝衰竭的治療，以及進一步用於肝細胞移植及生物人工肝的製備等。
實施例5、製備治療肝衰竭的藥物及其療效檢測
一、製備治療肝衰竭的藥物
用本發明的方法製備治療肝衰竭的藥物，具體過程包括以下步驟
1) 大鼠肝細胞懸液的製備
選擇雄性Wistar大鼠(體重150g)，用改良的Seglen膠原酶/EGTA兩步灌注法(Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol
1976:13:29)製備肝細胞懸液將大鼠肝細胞按6X 105個/1^的濃度重懸於含12%(8-12%均可)小牛血清的1640培養液中，然後用臺盼藍拒染法測定細胞存活率，
結果存活率大於90%，符合要求，得到大鼠肝細胞懸液。
2) 表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的獲得
參考文獻(《慢病毒介導的穩定表達bFGF的胎兒肝臟基質細胞株的建立》，生物化學與生物物理進展2007， 34(2): 207-214)中記載的方法獲得表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞。3) 將步驟l)製備的大鼠肝細胞懸液與步驟2)獲得的表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合，大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的混合比例為6 : 1 (10-1: l均可)，即使混合液中大鼠肝細胞的濃度為6Xl05個/mL，表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的濃度為1Xl。5個/mL。
4) 將步驟3)獲得的大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合物微囊化，方法為對步驟3)獲得的細胞懸液進行離心(500rpra， 5min)，棄上清液，將細胞沉澱重懸於質量/體積百分濃度為2.0% (1.0-2.0%均可)的藻酸鈉溶液中，然後將細胞懸液置於氣流式微囊形成儀中，調整氣流量為2 L/min (2-6L/min均可)(氧氣)，用3號(3-6號均可)針尖打出，滴入質量/體積百分濃度為1.0% (1.0-2. 0%均可)的氯化l丐溶液中，靜置20min(20-30rain均可)後，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;然後，將混合細胞置入質量/體積百分濃度為0. 15%
(0.05-0. 15%均可)的多聚賴氨酸溶液中靜置4min (4-8min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;再將混合細胞置入質量/體積百分濃度為0. 1% (0. 1-0. 2%均可)的藻酸鈉溶液中，靜置6min (2-6rain均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min;最後，將混合細胞加入質量/體積百分濃度為1.0% (1.0-2.0%均可)的檸檬酸三鈉溶液中，靜置3min (3-7min均可)，用生理鹽水洗滌2遍，每遍5min，得到微囊化的肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合物，即本發明治療肝衰竭的藥物。將本發明治療肝衰竭的藥物置於含10%小牛血清的DMEM培養液中備用。
二、本發明治療肝衰竭藥物的療效檢測
用與實施例三相同的方法檢測本發明藥物的療效，結果較其它組，移植有本發明藥物的肝衰竭模型小鼠的存活率及肝功能均得到顯著提高，肝組織壞死程度明顯減輕，肝小葉結構稍有紊亂，肝索間裂隙不規則增大，偶爾可見肝細胞變性壞死，有少量炎性細胞浸潤，匯管區肝細胞增生明顯，可見大量雙核或多核細胞；肝組織PCNA
(增殖細胞核抗原)的表達情況良好；此外，微囊小部分游離於腹腔，多在肝臟斷端周圍聚集成團或附著於肝組織表面，回收率為(77±94) %，在光鏡下觀察到微囊內大鼠肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞相互接觸成團，細胞膜均完整光滑，胞槳飽滿，表明仍有肝細胞存活。上述檢測結果表明本發明的藥物對肝衰竭具有較好的療效，可用於肝衰竭的治療，以及進一步用於肝細胞移植及生物人工肝的製備等。
1權利要求
1、一種治療肝衰竭的藥物，它的有效成分為採用微囊技術混合包裹的肝細胞和表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞。
2、 根據權利要求l所述的藥物，其特徵在於所述肝細胞和表達重組人鹼性成 纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的混合比例為10 1: 1。
3、 根據權利要求1或2所述的藥物，其特徵在於所述肝細胞來源於大鼠、小 鼠、豬或人，或經幹細胞誘導而來的肝細胞或肝樣細胞；所述表達重組人鹼性成纖維 細胞生長因子的人胎肝基質細胞為轉染重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因的重組 人胎肝基質細胞。
4、 一種製備權利要求1所述的治療肝衰竭的藥物的方法，包括以下步驟1 )將肝細胞製成懸液與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞 混合形成細胞混合物；2)將步驟l)獲得的細胞混合物微囊化，得到治療肝衰竭的藥物。
5、 根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述步驟l)中的細胞混合物中肝 細胞和表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞的混合比例為10-1: 1。
6、 根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述步驟l)中的肝細胞來源 於大鼠、小鼠、豬或人，或經幹細胞誘導而來的肝細胞或肝樣細胞；所述表達重組人 鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞為轉染攜帶重組人鹼性成纖維細胞生長 因子基因的重組人胎肝基質細胞。
7、 根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述步驟l)中用Seglen膠 原酶/EGTA兩步灌注法製備肝細胞懸液將肝細胞重懸於含8-12%小牛血清的1640 培養液中，然後測定細胞存活率，若存活率大於90%，得到肝細胞懸液。
8、 根據權利要求4或5所述的方法，其特徵在於所述步驟2)中將肝細胞與表 達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合物微囊化的方法為對步驟 1)獲得的細胞懸液進行離心，棄上清液，將細胞沉澱重懸於質量/體積百分濃度為 1.0-2.0%的藻酸鈉溶液中，然後將細胞懸液置於氣流式微囊形成儀中，調整氣流量 為2-6L/min，用3-6號針尖打出，滴入質量/體積百分濃度為1. 0-2. 0%的氯化鈣溶 液中，靜置20-30min後，洗滌;然後，將混合細胞置入質量/體積百分濃度為0. 05-0. 15 %的多聚賴氨酸溶液中靜置4-8min，洗滌；再將混合細胞置入質量/體積百分濃度為 0. 1-0.2%的藻酸鈉溶液中，靜置2-6min，洗滌；最後，將混合細胞加入質量/體積 百分濃度為1.0-2. 0%的檸檬酸三鈉溶液中，靜置3-7min，洗滌，得到微囊化的肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合物。
9、根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述洗滌液均為生理鹽水。
全文摘要
本發明公開了一種治療肝衰竭的藥物及其製備方法。該藥物的有效成分為採用微囊技術混合包裹的肝細胞和表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞。其製備方法包括以下步驟1)將肝細胞懸液與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合；2)將步驟1)獲得的肝細胞與表達重組人鹼性成纖維細胞生長因子的人胎肝基質細胞混合物微囊化，得到治療肝衰竭的藥物。本發明為肝細胞移植及生物人工肝等提供了一條新的途徑，在醫學和生物製藥領域，尤其是提高肝功能和遏制肝衰竭藥物的製備領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
文檔編號A61K9/50GK101496815SQ20081005754
公開日2009年8月5日 申請日期2008年2月2日 優先權日2008年2月2日
發明者雪 南, 偉 師, 越 滕, 王韞芳, 白慈賢, 裴雪濤 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所