一種免疫層析檢測方法及試紙的製作方法
2023-10-06 16:08:34 4
一種免疫層析檢測方法及試紙的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種免疫層析檢測方法及試紙，試紙是由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相當於將特異性抗體或抗原以二個或多個四邊形狀組合固定於反應膜上，結合物釋放墊上吸附有標記的特異性抗體或抗原，當待檢樣本滴加到樣本墊上後，待檢樣本在毛細管作用下向前移動，溶解結合物釋放墊上的標記物後相互反應，形成結合物，再移動至檢測區T和質控區C時，結合物與檢測塊和質控塊上的抗體或抗原發生結合而被截留，聚集在檢測塊和質控塊上。通過肉眼觀察或儀器掃描檢測塊和質控塊上不同的顯色結果，可實現對待檢樣本的定性、半定量或定量檢測。操作簡單、快速，廣泛應用於體外診斷試劑領域。
【專利說明】一種免疫層析檢測方法及試紙
【技術領域】
[0001]本發明屬於體外診斷試劑領域，具體涉及一種免疫層析檢測方法以及所使用的試紙和試紙盒。
【背景技術】
[0002]免疫層析法是九十年代興起的一種基於免疫膠體金技術的快速診斷技術，其原理是將特異性的抗體先固定於反應膜2上，當試紙的樣本墊4浸入待檢樣本後，由於毛細管作用，待檢樣本將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，待檢樣本中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，若用免疫膠體金可使該區域顯示一定的顏色，從而實現特異性的免疫診斷。
[0003]以膠體金試紙為主要代表的免疫層析檢測技術現已廣泛用於免疫檢測的各個方面，該技術主要是將特異性的抗體或抗原以條帶狀固定在反應膜2上，通過一條試紙條的顯色結果進行分析，或者將多條試紙條置於不同的卡槽內進行分析，尚未發現由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相鄰的單個免疫層析檢測試紙條的檢測塊6不在反應膜2的同一水平位置的免疫層析檢測方法及試紙。
[0004]申請號為CN200720005145的專利公開了一種內分泌激素四合一聯合檢測板，該檢測板板身內部設有4個與檢測試紙對應的凹槽，檢測試紙4條固定於板身內部。該方法通過凹槽隔開不同的檢測試紙，避免試紙之間的顯色幹擾。
[0005]目前，試紙由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相當於將特異性抗體或抗原以二個或多個四邊形狀組合固定於反應膜2上；檢測區T採用四邊形狀圖形作為檢測塊6，且檢測塊6的設定可以是同濃度或者不同濃度的同一種抗體或抗原，也可以是同濃度或者不同濃度的多種抗體或抗原。通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況進行定性、半定量檢測或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測的免疫層析檢測方法及試紙從未有報導過。
[0006]免疫層析技術包括但不限於雙抗體夾心法、間接法、競爭抑制法。
[0007]雙抗體夾心法，屬於非競爭結合測定，適用於檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。其基本工作原理是:利用連接於反應膜2上的抗體和標記抗體分別與待檢樣本中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結合，形成標記抗體-抗原-固相抗體免疫複合物。
[0008]間接法，測定抗體最常用的方法，屬非競爭結合測定。其原理是將抗原固化於反應膜2，待檢樣本中待測抗體首先與標記分子結合，形成複合物，再與反應膜2上的抗原結合，形成標記分子-待檢抗體-抗原複合物。
[0009]競爭法可用於抗原和抗體測定。以測定抗原為例，其基本原理是待檢樣本中的受檢抗原和固相的包被抗原競爭與標記抗體結合，當待檢樣本中的受檢抗原的量大於試劑的閾值，標記抗體則不會與固相的包被抗原結合；若待檢樣本中無受檢抗原，標記抗體直接與固相的包被抗原結合。
[0010]免疫層析檢測方法的測定方法包括用肉眼觀察確定檢測區T的檢測線8顏色的定性方法、用肉眼觀察檢測區T的多個檢測線8顯色情況的半定量方法和採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測線8的特徵信號進行定量方法。
【發明內容】
[0011]本發明的目的在於，針對現有技術，提供一種免疫層析檢測方法及試紙，可實現對待檢樣本的定性、半定量或定量檢測。
[0012]一種免疫層析檢測方法，採用如下步驟:
(1)反應膜2包被:根據待檢樣本中的待檢目標物確定包被抗體或抗原的種類，設定檢測塊6及質控塊7的濃度和數量；
(2)根據待檢樣本中的待檢目標物製備結合物釋放墊5；
(3)樣本墊4製備；
(4)組裝單個免疫層析檢測試紙條:試紙條由底板1，及依次設置在底板I上的樣本墊4、結合物釋放墊5、反應膜2、吸收墊3構成；
(5)組裝免疫層析檢測試紙:試紙是由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相當於將特異性抗體或抗原以二個或多個四邊形狀組合固定於反應膜2上；
(6)對待檢樣本進行檢測:在試紙樣本墊4中加入待檢樣本，通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。或者首先根據多個檢測塊6的顯色情況確定待檢樣本中的待檢目標物，再通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本中不同的待檢目標物進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。
[0013]一種免疫層析檢測方法，用於實現對待檢樣本的定性、半定量或定量檢測:試紙條由底板I，及依次設置在底板I上的樣本墊4、結合物釋放墊5、反應膜2、吸收墊3構成；試紙是由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相當於將特異性抗體或抗原以二個或多個四邊形狀組合固定於反應膜2上。
[0014]所述反應膜2分成兩個區域，一個是與結合物釋放墊5相鄰接的檢測區T，一個是與吸收墊3相鄰接的質控區C。
[0015]所述檢測區T設有2至15個四邊形狀檢測塊6，檢測塊6的設定可以是同濃度或者不同濃度的同一種抗體或抗原，通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。或者是檢測塊6包被有同濃度或者不同濃度的不同的抗體或抗原，首先根據多個檢測塊6的顯色情況確定待檢樣本中的待檢目標物，再通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本中不同的待檢目標物進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。
[0016]所述質控區C設有I至15個四邊形狀質控塊7，質控塊7包被有可與結合物釋放墊5上標記物結合的抗體或抗原。
[0017]所述結合物釋放墊5上標記有單一待檢目標物相關的特異性抗體或抗原,或標記有各待檢目標物相關的多個特異性抗體或抗原。
[0018]所述的免疫層析檢測方法，其標記方法包括但不限於量子點標記法、膠體金標記法、膠體硒標記法、有色或螢光乳膠標記法、磁性顆粒標記法。
[0019]所述的待檢樣本,是來自臨床或非臨床的血液、體液、尿液、唾液、生殖道分泌液或其他液態樣品或粘稠狀樣品。
[0020]所述底板I材料包括但不限於PVC (聚氯乙烯)板，反應膜2材料包括但不限於硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜，吸收墊3的材料包括但不限於濾紙，樣本墊4材料包括但不限於玻璃纖維和無紡布，結合物釋放墊5包括但不限於玻璃纖維或無紡布。
[0021]一種免疫層析檢測方法及試紙，包括權利要求1-10任一項的免疫層析方法及試紙。
[0022]技術效果
本發明是一種免疫層析檢測方法及試紙，試紙是由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相當於將特異性抗體或抗原以二個或多個四邊形狀組合固定於反應膜2上；檢測區T相當於設有2至15個四邊形狀檢測塊6，通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號，可實現對待檢樣本的定性、半定量或定量檢測。操作簡單、快速，廣泛應用於體外診斷試劑領域。
[0023]本發明的一種免疫層析檢測方法不同於現有的方法之處在於:
現有的免疫層析檢測方法只能通過一條試紙條的顯色結果進行分析，或者將多條試紙條置於不同的卡槽內進行分析，尚未發現由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相鄰的單個免疫層析檢測試紙條的檢測塊6不在反應膜2的同一水平位置的免疫層析檢測方法及試紙。
[0024]本發明的一種免疫層析檢測方法及試紙，試紙由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相鄰的單個免疫層析檢測試紙條的檢測塊6不在反應膜2的同一水平位置。檢測區T設有2至15個四邊形狀檢測塊6，檢測塊6的設定可以是相同濃度，亦可為不同濃度的同一種抗體或抗原。檢測塊6還可以設定為多種抗體或抗原。
[0025]本發明的一種免疫層析檢測方法，通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。或者首先根據多個檢測塊6的顯色情況確定待檢樣本中的待檢目標物，再通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本中不同的待檢目標物進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。
[0026]相比較現有的試紙本發明提供了一種由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相鄰的單個免疫層析檢測試紙條的檢測塊6不在反應膜2的同一水平位置的免疫層析檢測方法及試紙，本發明提供了更多的不同的檢測塊6和更好識別的圖形信息。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]附圖1是本發明的一種免疫層析檢測方法及試紙的示意圖。
[0028]附圖2是現有的免疫層析檢測方法及試紙的示意圖。
[0029]附圖3人絨毛膜促性腺激素檢測試紙(膠體金免疫層析法)示意圖。
[0030]附圖4尿微量白蛋白、尿@2微球蛋白、抑胱素C三項聯合檢測試紙(膠體金免疫層析法)示意圖。
【具體實施方式】
[0031]實施步驟:
(1)反應膜2包被:根據待檢樣本中的待檢目標物確定包被抗體或抗原的種類，設定檢測塊6及質控塊7的濃度和數量；
(2)根據待檢樣本中的待檢目標物製備結合物釋放墊5；
(3)樣本墊4製備；
(4)組裝單個免疫層析檢測試紙條:試紙條由底板1，及依次設置在底板I上的樣本墊4、結合物釋放墊5、反應膜2、吸收墊3構成；
(5)組裝免疫層析檢測試紙:試紙是由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相當於將特異性抗體或抗原以二個或多個四邊形狀組合固定於反應膜2上；
(6)對待檢樣本進行檢測:在試紙樣本墊4中加入待檢樣本，通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。或者首先根據多個檢測塊6的顯色情況確定待檢樣本中的待檢目標物，再通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本中不同的待檢目標物進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。
[0032]反應膜2分成兩個區域，一個是與結合物釋放墊5相鄰接的檢測區T，一個是與吸收墊3相鄰接的質控區C。
[0033]試紙由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相鄰的單個免疫層析檢測試紙條的檢測塊6不在反應膜2的同一水平位置。
[0034]所述檢測區T設有2至15個四邊形狀檢測塊6，檢測塊6的設定可以是同濃度或者不同濃度的同一種抗體或抗原，通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。或者是檢測塊6包被有同濃度或者不同濃度的不同的抗體或抗原，首先根據多個檢測塊6的顯色情況確定待檢樣本中的待檢目標物，再通過肉眼觀察多個檢測塊6和質控塊7的顯色情況對待檢樣本中不同的待檢目標物進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊6和質控塊7的特徵信號進行定量檢測。
[0035]所述質控區C設有I至15個四邊形狀質控塊7，質控塊7包被有可與結合物釋放墊5上標記物結合的抗體或抗原。
[0036]所述結合物釋放墊5上標記有單一待檢目標物相關的特異性抗體或抗原,或標記有各待檢目標物相關的多個特異性抗體或抗原。
[0037]在本發明中，標記試劑通常是在免疫層析檢測中可用作固定抗體或抗原的載體。例如，膠體金顆粒，膠體硒顆粒，有色或螢光乳膠顆粒和磁性顆粒，特別優選膠體金顆粒。
[0038]在本發明中，底板I支撐層為不吸水的材料，避免支撐材料吸收待檢樣本從而影響水平方向的移動。底板I的材料包括PVC (聚氯乙烯)板及其他塑料材料，優選PVC (聚氯乙烯)板。
[0039]在本發明中，反應膜2的材料包括但不限於硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜。優選硝酸纖維素膜。
[0040]在本發明中，吸收墊3指吸收通過反應膜2的待檢樣本以控制樣品擴散的液體吸收部分。吸收墊3的材料可以是但不限於濾紙。吸收墊3可以使用一層也可以使用多層。
[0041]在本發明中，樣本墊4是接收待檢樣本的部分，包含任何材料和形式，只要能讓液體和待檢目標物通過。適合於樣本墊4的材料的具體包括但不限於:玻璃纖維、丙烯酸纖維、親水聚乙烯材料、乾燥的紙、無紡布和纖維織物。優選使用玻璃纖維和無紡布。樣本墊4可以使用一層也可以使用多層。
[0042]在本發明中，適合於結合物釋放墊5的材料包括但不限於紙、纖維素混合物、硝酸纖維素、聚酯纖維、丙烯腈共聚物、玻璃纖維、和無紡布。優選使用無紡布。
[0043]在本發明中，除了一種免疫層析法檢測試紙，還包括塑料卡，可以將試紙安裝在塑料卡之內使用。所述的塑料卡與試紙的尺寸、樣本加入的方式和位置、抗體或抗原在反應膜2上固化的位置相吻合。
[0044]實施例1
本發明的免疫層析檢測試紙的製備實施例1，製備及檢測人絨毛膜促性腺激素(HCG)檢測試紙(膠體金免疫層析法)。
[0045]生物活性原料:a -HCG單克隆抗體、β -HCG單克隆抗體、IgG多克隆抗體均來自市場購買。
[0046]試劑:牛血清白蛋白來自市場購買。
[0047]硝酸纖維素膜來自市場購買。
[0048]試紙製備程序如下:
步驟1.反應膜2包被
根據待檢樣本中的待檢目標物確定包被抗體種類:a -HCG單克隆抗體、IgG多克隆抗體。
[0049]根據待檢樣本中的待檢目標物設定檢測塊10及質控塊11的濃度和數量:檢測塊10設置6個，4個不同濃度；質控塊11設置5個，I個濃度。
[0050]製備檢測塊10包被有不同濃度的單個免疫層析檢測試紙條反應膜2:將15.42mg/ml的a -HCG單克隆抗體、8.02mg/ml的IgG多克隆抗體根據設置的濃度稀釋後，按照附圖3的位置分別包被於硝酸纖維素膜上，乾燥24h，溫度為37°C，溼度=40%RH。
[0051]步驟2.結合物釋放墊5製備
取40nm的膠體金溶液，按1.2%比例加入0.2M的K2CO3 (碳酸鉀)調節PH值，按15 μ g/ml比例加入β -HCG單克隆抗體，製成標記物，放置室溫5min，按0.8%比例加入BSA (牛血清白蛋白)穩定劑。
[0052]4500r離心30min,取濃縮沉澱物；將上清液繼續6500r離心45min,取濃縮沉澱物；將上清液繼續9000r離心60min，取濃縮沉澱物；將三次離心濃縮沉澱物混合均勻。
[0053]將離心好的濃縮液稀釋好，鋪於90cmX30cm的無紡布上，加液量1-1lml/張，乾燥24h，溫度37°C，溼度含40%RH。
[0054]步驟3.樣本墊4的製備
將切割成83.5cmX30cm的玻璃纖維和無紡布用包含0.5%NaCl (氯化鉀)、0.5%蔗糖、0.1%BSA (牛血清白蛋白)和Tris-HCl緩衝液(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)(ρΗ7.4)工作液浸泡。在37 °C將所述墊乾燥24h，獲得樣本墊4。
[0055]步驟4.按以下步驟分別組裝4個濃度檢測塊10的單個免疫層析檢測試紙條將底板I平放在操作臺上，貼上雙面膠。
[0056]將包被好的反應膜2貼在底板I上。
[0057]將吸收墊3壓反應膜2的2mm貼上，另一端與底板I對齊。
[0058]將一層無紡布壓反應膜2的2mm處貼上。
[0059]將結合物釋放墊5齊壓於無紡布上面。
[0060]將玻璃纖維壓於結合物釋放墊5 —半位置，另一端與底板I對齊。
[0061]再將一層無紡布一端與結合物釋放墊5上端對齊,另一端與底板I對齊。
[0062]步驟5.組裝試紙:將5條檢測塊10包被有4個濃度的單個免疫層析檢測試紙條按附圖3無間隔組合固定成一個試紙。
[0063]步驟6.產品檢測:取含有HCG的待檢樣本尿液滴加到試紙樣本墊4上，5min時判讀結果，T1顯色，其它T塊無顯色，表示待檢樣本尿液中含HCG濃度為25-125mIU/ml
T3顯色，其它T無顯色，表示待檢樣本尿液中含HCG濃度為125-500mIU/ml ；T ^ T2, T3> T4, T5顯色，T6無顯色，表示待檢樣本尿液中含HCG濃度為500-2500mIU/ml ^全部顯色，則表示待檢樣本尿液中含HCG濃度為高於2500mIU/ml。
[0064]實施例2
本發明的免疫層析檢測試紙的製備實施例2，製備及檢測尿微量白蛋白、尿β2微球蛋白、抑胱素C三項聯合檢測試紙(膠體金免疫層析法)。
[0065]生物活性原料:人白蛋白單克隆抗體、鼠抗人白蛋白單克隆抗體、Cys-C(抑胱素C)單克隆抗體、鼠抗人Cys-C (抑胱素C)抗體、β2微球蛋白單克隆抗體、鼠抗人β 2微球蛋白抗體、IgG多克隆抗體均來自市場購買。
[0066]試劑:牛血清白蛋白來自市場購買。
[0067]硝酸纖維素膜來自市場購買。
[0068]試紙製備程序如下:
步驟1.反應膜2包被
根據待檢樣本中的待檢目標物確定包被抗體種類:人白蛋白單克隆抗體、Cys-C (抑胱素C)單克隆抗體、β 2微球蛋白單克隆抗體、IgG多克隆抗體。
[0069]根據待檢樣本中的待檢目標物設定檢測塊12及質控塊13的濃度和數量:檢測塊12設置3個，每塊為一種檢測抗體；質控塊13設置3個，I個濃度。
[0070]包被尿微量白蛋白反應膜:將1.2mg/ml的人白蛋白單克隆抗體、1.0mg/ml的IgG多克隆抗體根據附圖4的位置包被於硝酸纖維素膜上，乾燥24h，溫度為37°C，溼度芻 40%RH。
[0071]包被尿β 2微球蛋白反應膜:將1.5mg/ml的β 2微球蛋白單克隆抗體、1.0mg/ml的IgG多克隆抗體根據附圖4的位置包被於硝酸纖維素膜上，乾燥24h，溫度為37°C，溼度芻 40%RH。
[0072]包被抑胱素C反應膜:1.4mg/ml的Cys-C (抑胱素C)單克隆抗體、1.0mg/ml的IgG多克隆抗體根據附圖4的位置包被於硝酸纖維素膜上，乾燥24h，溫度為37°C，溼度芻 40%RH。
[0073]步驟2.結合物釋放墊5製備尿微量白蛋白金標結合物釋放墊製備
取40nm的膠體金溶液，按1.2%比例加入0.2M的K2CO3 (碳酸鉀)調節PH值，按12 μ g/ml比例加入鼠抗人白蛋白單克隆抗體，製成標記物，放置室溫5min，按0.8%比例加入BSA(牛血清白蛋白)穩定劑。
[0074]4500r離心30min,取濃縮沉澱物；將上清液繼續6500r離心45min,取濃縮沉澱物；將上清液繼續9000r離心60min，取濃縮沉澱物；將三次離心濃縮沉澱物混合均勻。
[0075]將離心好的濃縮液稀釋好，鋪於90cmX30cm的無紡布上，加液量1-1lml/張，乾燥24h，溫度37°C，溼度含40%RH。
[0076]尿β2微球蛋白金標結合物釋放墊製備
取40nm的膠體金溶液，按1.2%比例加入0.2M的K2CO3 (碳酸鉀)調節PH值，按10 μ g/ml比例加入鼠抗人β2微球蛋白抗體，製成標記物，放置室溫5min，按0.8%比例加入BSA(牛血清白蛋白)穩定劑。
[0077]4500r離心30min,取濃縮沉澱物；將上清液繼續6500r離心45min,取濃縮沉澱物；將上清液繼續9000r離心60min，取濃縮沉澱物；將三次離心濃縮沉澱物混合均勻。
[0078]將離心好的濃縮液按規定濃度稀釋好，鋪於90cmX30cm的無紡布上，加液量1-1lml/張，乾燥24h，溫度37°C，溼度蘭40%RH。
[0079]抑胱素C金標結合物釋放墊製備
取40nm的膠體金溶液，按1.2%比例加入0.2M的K2CO3 (碳酸鉀)調節PH值，按11 μ g/ml比例加入鼠抗人Cys-C (抑胱素C)抗體，製成標記物，放置室溫5min，按0.8%比例加入BSA (牛血清白蛋白)穩定劑。
[0080]4500r離心30min,取濃縮沉澱物；將上清液繼續6500r離心45min,取濃縮沉澱物；將上清液繼續9000r離心60min，取濃縮沉澱物；將三次離心濃縮沉澱物混合均勻。
[0081]將離心好的濃縮液按規定濃度稀釋好，鋪於90cmX30cm的無紡布上，加液量1-1lml/張，乾燥24h，溫度37°C，溼度蘭40%RH。
[0082]步驟3.樣本墊4的製備
將切割成83.5cmX30cm的玻璃纖維和無紡布用包含0.5%NaCl (氯化鉀)、0.5%蔗糖、0.1%BSA (牛血清白蛋白)和Tris- HCl緩衝液(三羥甲基氨基甲烷_鹽酸)(ρΗ7.4)工作液浸泡。在37 °C將所述墊乾燥24h，獲得樣本墊4。
[0083]步驟4.組裝單個免疫層析檢測試紙條組裝尿微量白蛋白檢測試紙條
將底板I放在操作臺上，貼上雙面膠。
[0084]將包被好的尿微量白蛋白反應膜貼在底板I上。
[0085]將吸收墊3壓尿微量白蛋白反應膜的2mm貼上，另一端與底板I對齊。
[0086]將一層無紡布壓尿微量白蛋白反應膜的2mm處貼上。
[0087]將尿微量白蛋白結合物釋放墊齊壓於無紡布上面。
[0088]將玻璃纖維壓於尿微量白蛋白結合物釋放墊一半位置，另一端與底板I對齊。
[0089]再將一層無紡布一端與尿微量白蛋白結合物釋放墊上端對齊，另一端與底板I對齊。
[0090]組裝尿β2微球蛋白檢測試紙條將底板I放在操作臺上，貼上雙面膠。
[0091]將包被好的尿β 2微球蛋白反應膜貼在底板I上。
[0092]將吸收墊3壓尿β 2微球蛋白反應膜的2mm貼上，另一端與底板I對齊。
[0093]將一層無紡布壓尿β 2微球蛋白反應膜的2mm處貼上。
[0094]將尿02微球蛋白結合物釋放墊齊壓於無紡布上面。
[0095]將玻璃纖維壓於尿β 2微球蛋白結合物釋放墊一半位置，另一端與底板I對齊。
[0096]再將一層無紡布一端與尿β2微球蛋白結合物釋放墊上端對齊，另一端與底板I對齊。
[0097]組裝抑胱素C檢測試紙條將底板I放在操作臺上，貼上雙面膠。
[0098]將包被好的抑胱素C反應膜貼在底板I上。
[0099]將吸收墊3壓抑胱素C反應膜的2mm貼上，另一端與底板I對齊。
[0100]將一層無紡布壓抑胱素C反應膜的2mm處貼上。
[0101]將抑胱素C結合物釋放墊齊壓於無紡布上面。
[0102]將玻璃纖維壓於抑胱素C結合物釋放墊一半位置，另一端與底板I對齊。
[0103]再將一層無紡布一端與抑胱素C結合物釋放墊上端對齊,另一端與底板I對齊。
[0104]步驟5.組裝試紙:將尿微量白蛋白檢測試紙條、尿β2微球蛋白檢測試紙條、抑胱素C檢測試紙條各I條及2條空白試紙條按附圖4無間隔組合固定成一個試紙。
[0105]步驟6.產品檢測:取待檢樣本尿液樣本墊4上，Smin時，判讀結果，T1顯色，表示待檢樣本尿液中尿微量白蛋白為陽性；Τ2顯色，表示待檢樣本尿液中含尿β 2微球蛋白為陽性；τ3顯色，表示待檢樣本尿液中含抑胱素C為陽性。
[0106]以上所述僅為本發明的實施例，並不限制本發明，凡在本發明基礎上，所作的任何修改、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種免疫層析檢測方法，用於實現對待檢樣本的定性、半定量或定量檢測；其特徵在於，採用如下步驟: 反應膜包被:根據待檢樣本中的待檢目標物確定包被抗體或抗原的種類，設定檢測塊及質控塊的濃度和數量； 根據待檢樣本中的待檢目標物製備結合物釋放墊； 製備樣本墊； 組裝單個免疫層析檢測試紙條:試紙條由底板，及依次設置在底板上的樣本墊、結合物釋放墊、反應膜、吸收墊構成； 組裝免疫層析檢測試紙:試紙是由二條或多條單個免疫層析檢測試紙條無間隔組合固定在一起，相當於將特異性抗體或抗原以二個或多個四邊形狀組合固定於反應膜上； (6 )對待檢樣本進行檢測:在試紙樣本墊中加入待檢樣本，通過肉眼觀察多個檢測塊和質控塊的顯色情況對待檢樣本進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊和質控塊的特徵信號進行定量檢測。
2.或者首先根據多個檢測塊的顯色情況確定待檢樣本中的待檢目標物，再通過肉眼觀察多個檢測塊和質控塊的顯色情況對待檢樣本中不同的待檢目標物進行定性或者半定量檢測，或採用具有信號檢測功能的儀器採集試紙上檢測塊和質控塊的特徵信號進行定量檢測； 根據權利要求1所述的免疫層析檢測方法，其特徵在於:試紙的反應膜分成兩個區域，一個是與結合物釋放墊相鄰的檢測區，一個是與吸收墊相鄰的質控區；檢測區設有2至15個四邊形狀檢測塊，檢測塊的設定可以是同濃度或者不同濃度的同一種抗體或抗原，也可以是同濃度或者不同濃度的多種抗體或抗原； 所述質控區設有1至15個四邊形狀質控塊，質控塊包被有可與結合物釋放墊上標記物結合的抗體或抗原。
3.根據權利要求1所述的免疫層析檢測方法，其特徵在於:相鄰的單個免疫層析檢測試紙條的檢測塊不在反應膜的同一水平位置。
4.根據權利要求1所述的免疫層析檢測方法，其特徵在於:所述結合物釋放墊上標記有單一待檢目標物相關的特異性抗體或抗原，或標記有各待檢目標物相關的多個特異性抗體或抗原。
5.根據權利要求1所述的免疫層析檢測方法，其特徵在於:所述標記方法包括量子點標記法、膠體金標記法、膠體硒標記法、有色或突光乳膠標記法、磁性顆粒標記法。
6.根據權利要求1所述的免疫層析檢測方法，其特徵在於:所述方法包括雙抗體夾心法、間接法、競爭抑制法。
7.根據權利要求1所述的免疫層析檢測方法，其特徵在於:所述待檢樣本是來自臨床或非臨床的血液、體液、尿液、唾液、生殖道分泌液或其他液態樣品或粘稠狀樣品。
8.根據權利要求1所述的免疫層析檢測試紙，其特徵在於:所述底板材料是？卩「聚氯乙烯)板，反應膜材料是硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，吸收墊的材料是濾紙，樣品墊材料為玻璃纖維和無紡布，結合物釋放墊材料是玻璃纖維或無紡布。
9.根據權利要求1-8所述的免疫層析檢測試紙，其特徵在於:試紙還可裝配在與試紙的尺寸、樣本加入的方式和位置、抗體或抗原在反應膜上固化的位置相吻合的塑料卡內成為試紙盒。
10.一種免疫層析檢測試紙製備方法，其特徵在於:準備生物活性原料:a -HCG單克隆抗體、β-HCG單克隆抗體、IgG多克隆抗體均來自市場購買；試劑:牛血清白蛋白來自市場購買；硝酸纖維素膜來自市場購買； 試紙製備程序如下: 步驟1.反應膜2包被 根據待檢樣本中的待檢目標物確定包被抗體種類:a -HCG單克隆抗體、IgG多克隆抗體； 根據待檢樣本中的待檢目標物設定檢測塊10及質控塊11的濃度和數量:檢測塊10設置6個，4個不同濃度；質控塊11設置5個，I個濃度； 製備檢測塊10包被有不同濃度的單個免疫層析檢測試紙條反應膜2:將15.42mg/ml的a -HCG單克隆抗體、8.02mg/ml的IgG多克隆抗體根據設置的濃度稀釋後，按照附圖3的位置分別包被於硝酸纖維素膜上，乾燥24h，溫度為37°C，溼度=40%RH ； 步驟2.結合物釋放墊5製備 取40nm的膠體金溶液，按1.2%比例加入0.2M的K2CO3 (碳酸鉀)調節PH值，按15 μ g/ml比例加入β -HCG單克隆抗體，製成標記物，放置室溫5min，按0.8%比例加入BSA (牛血清白蛋白)穩定劑；4500r離心30min，取濃縮沉澱物；將上清液繼續6500r離心45min，取濃縮沉澱物；將上清液繼續9000r離心60min，取濃縮沉澱物；將三次離心濃縮沉澱物混合均勻； 將離心好的濃縮液稀釋好，鋪於90cmX30cm的無紡布上，加液量1-1lml/張，乾燥24h，溫度37 °C，溼度含40%RH ； 步驟3.樣本墊4的製備 將切割成83.5cmX30cm的玻璃纖維和無紡布用包含0.5%NaCl (氯化鉀)、0.5%蔗糖、0.1%BSA (牛血清白蛋白)和Tris-HCl緩衝液(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)(ρΗ7.4)工作液浸泡； 在37 °C將所述墊乾燥24h，獲得樣本墊4 ； 步驟4.按以下步驟分別組裝4個濃度檢測塊10的單個免疫層析檢測試紙條 將底板I平放在操作臺上，貼上雙面膠； 將包被好的反應膜2貼在底板I上； 將吸收墊3壓反應膜2的2mm貼上，另一端與底板I對齊； 將一層無紡布壓反應膜2的2mm處貼上； 將結合物釋放墊5齊壓於無紡布上面； 將玻璃纖維壓於結合物釋放墊5 —半位置，另一端與底板I對齊； 再將一層無紡布一端與結合物釋放墊5上端對齊,另一端與底板I對齊； 步驟5.組裝試紙:將5條檢測塊10包被有4個濃度的單個免疫層析檢測試紙條按附圖3無間隔組合固定成一個試紙； 步驟6.產品檢測:取含有HCG的待檢樣本尿液滴加到試紙樣本墊4上，5min時判讀結果，T1顯色，其它T塊無顯色，表示待檢樣本尿液中含HCG濃度為25-125mIU/ml ；T ^ T2、T3顯色，其它T無顯色，表示待檢樣本尿液中含HCG濃度為125-500mIU/mlT5顯色，16無顯色，表示待檢樣本尿液中含濃度為500-250001^/1111 ；1全部顯色，則表示待檢樣本尿液中含濃度為高於250001 口加1。
【文檔編號】G01N33/558GK104502586SQ201410827069
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月26日 優先權日:2014年6月11日
【發明者】陳巖松 申請人:陳巖松