一種兩面針愈傷組織的誘導培養基及誘導方法和應用與流程
2023-10-06 19:58:24 1
本發明涉及組織培養技術領域，更具體地，涉及一種兩面針愈傷組織的誘導培養基及誘導方法和應用。
背景技術：
兩面針（Zanthoxylum nitidum (Roxb.) DC.）為芸香科花椒屬植物，具有很高的藥用價值，其乾燥根入藥，為我國南方地區常見中藥，1977年開始被收入《中國藥典》。兩面針具有行氣止痛、活血化瘀、祛風通絡之功效。其中的氯化兩面針鹼可以抗肝癌和乳腺癌；兩面針還是牙膏工業的原料。兩面針分布於我國南方各省，生於山野坡地灌木叢中。兩面針分布雖然廣闊，但資源並不豐富。由於兩面針用量巨大，其野生資源幾近枯竭，市場上兩面針藥材的偽品因此也較多。恢復兩面針的資源首先需要種苗。可以通過種子萌發、扦插繁殖和組織培養獲得種苗。另外兩面針種質資源較為缺乏，隨著細胞融合技術和基因轉化技術的不斷發展，對植物在分子水平上改進可大大促進種質資源的擴大，對植物在分子水平的改進需要先對植物進行處理，一般是誘導形成愈傷組織，現有技術中還沒有兩面針的愈傷組織的培養方法。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種兩面針愈傷組織的誘導培養基。
本發明的第二個目的是提供一種兩面針愈傷組織的誘導方法。
本發明的第三個目的是提供上述誘導培養基或者愈傷組織的誘導方法的應用。
本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：
6-糠基氨基嘌呤在兩面針愈傷組織誘導中的應用，所述6-糠基氨基嘌呤在培養基中的濃度為0.2～6 mg/L。
發明人研究發現在兩面針中加入6-糠基氨基嘌呤（又名激動素，簡稱KT）可誘導出兩面針愈傷組織，利用愈傷組織進行組織培養或者細胞融合和基因轉化的材料，為兩面針種質資源的擴大提供基礎。
優選地，所述6-糠基氨基嘌呤在培養基中的濃度為1～4 mg/L。
本發明還提供一種兩面針愈傷組織誘導培養基，所述愈傷組織誘導培養基為MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA。
更優選地，所述愈傷組織誘導培養基為MS+4.0 mg/L KT＋2.0 mg/LNAA。
本發明還提供一種兩面針愈傷組織誘導的方法，是以兩面針無根苗的莖段為外植體，進行愈傷組織的誘導；所述愈傷組織誘導培養基為MS+1.0～4.0 mg/L KT＋1.0～2.0 mg/LNAA。
優選地，愈傷組織誘導培養條件為：溫度23～27℃，相對溼度40%～60%，光照強度為32.5～34.5 μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半。
優選地，兩面針無根苗的莖段是取帶腋芽的兩面針的幼嫩莖段，消毒後，再接種于于MS+1.0 mg/L～2.0 mg/L KT＋0.2 mg/L～0.4 mg/L NAA培養長成3～4cm的無根苗，再截取無根苗的莖段即可。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
本發明以兩面針無根苗的莖段為外植體，在含有適宜激素配比的MS培養基上誘導愈傷組織形成；所得到的愈傷組織可以為兩面針細胞融合或者基因轉化研究提供材料，建立技術平臺，為種子資源的改良打下基礎，利用本發明所述愈傷組織進行後續的組織培養，建立的組織培養體系，提高了繁殖係數（現有通過叢生芽的誘導來實現增殖的方法的增殖係數為2.4～3.6，而本發明方法的增殖係數可以達到5.0），為大量種植兩面針奠定基礎。
具體實施方式
下面結合具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬於本發明的範圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
植物材料：兩面針無根苗莖段。帶腋芽的兩面針幼嫩莖段採自廣州中醫藥大學藥用植物園，用70%乙醇浸泡30秒，再用0.1%HgCl2浸泡8分鐘，用0.5%NaClO浸泡10分鐘，最後用無菌水衝洗3次，接種於MS＋2.0 mg·L-1 KT＋0.4 mg·L-1 NAA中培養，12天後開始生長，約12周後可長成3～4 cm的無根苗。
以MS培養基為基礎培養基，添加蔗糖30 g·L-1，卡拉膠8.0 g·L-1，pH5.8～6.0作為基礎培養基。植物生長物質包括α－萘乙酸（α-naphthalene acetic acid，NAA）、吲哚丁酸（indole-3-butyric acid，IBA）、6-糠基氨基嘌呤（kinetin，KT）。
愈傷組織誘導率：分別在莖段愈傷誘導培養第10、20、30天，觀察愈傷組織生長情況，統計誘導率（誘導率=(出愈外植體數/接種外植體總數)×100%）。
愈傷組織分化率：愈傷組織分化培養4周或8周，統計愈傷組織分化率（分化率=(分化出芽的愈傷組織塊數/接種的愈傷組織總塊數)×100%）。
芽增殖係數：芽分化培養8周後，轉接至增殖培養基中培養。培養4周或8周統計芽增殖係數(芽增殖係數=全部增殖芽數/接種芽數)。
生根率：生根培養8周，統計生根率（生根率=(生根的芽數/接種的芽數)×100%）。
實施例1
一、愈傷組織誘導
在無菌條件下將無根苗的莖切成約6 mm的小段，水平放置在愈傷組織誘導培養基的表面（愈傷組織誘導培養基的組成具體見表1）；每瓶接種3段；每種培養基各接種25瓶。培養條件：溫度（25±2）℃，相對溼度40%～60%，光照強度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半，一個月繼代1次。
兩面針莖段在三種不同植物生長物質組合構成的誘導培養基（A1、A2、A3培養基由基礎培養基和表1中的植物生長物質組成，其中基礎培養基的含量相同）中都能產生愈傷組織，說明適當濃度的KT和NAA能夠誘導產生愈傷組織。比較三種培養基產生愈傷組織的效果，在A3培養基中的誘導率最高，達到74.84%；其次是A1培養基，誘導率為66.84%；最差的是A2培養基，誘導率只有58.76%。產生的愈傷組織的質量也有不同，在A3和A1上產生的愈傷組織的顏色是淡黃色、顆粒狀、質地疏鬆而且溼潤的；而在A2上產生的愈傷組織的顏色是淡黃色、塊狀、質地幹硬的；因此A3和A1培養基上產生的愈傷組織比較適宜作為愈傷組織分化的材料，由於A3培養基上的誘導率最高，所以選取A3培養基誘導的愈傷組織進行分化實驗。
二、愈傷組織的分化
將繼代1次，在A3培養基中誘導的愈傷組織塊切成5 mm×5 mm大小，接種於分化培養基中（表2，培養基B1、B2、B3由基礎培養基和表2的植物生長物質組成，其中基礎培養基的含量相同），每瓶接種4塊，每種培養基各接種50瓶。培養1個月後，將在培養基B3上產生的愈傷組織再轉移到另4種分化培養基中培養（表3），每個培養皿接種8塊，每種培養基各接種12個培養皿。培養條件：溫度（25±2）℃，相對溼度40%～60%，光照強度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半。
結果見表2。在培養基B1中沒有芽的分化。而在培養基B2和B3上可以分化出芽，但分化率低，只有4.50%和12.50%，每塊愈傷組織的芽平均數為1.00和1.30。在培養基B1上沒有分化出芽的原因可能是KT的濃度太低。從表2的結果可以看出，三種培養基中，含4 mg/L KT＋0.2 mg/L IBA的B3培養基對愈傷組織分化有一定的效果，但效果還不夠理想。為了進一步提高芽的分化率，將在B3進行過分化培養的不含芽的愈傷組織，轉移到其他四種分化培養基中繼續進行芽的分化培養（表3，B3、B4、B5、B6由基礎培養基和表3的植物生長物質組成，其中基礎培養基的含量相同）。
從表3結果可以看出，四種含植物生長物質組合的培養基都可以促進芽的分化，在培養基B4中的愈傷組織的分化效果較好，芽分化率為36.46%，顯著高於在其它三個培養基中的分化率，且每塊愈傷組織的平均芽數達到3.30。在培養基B3、B5和B6的中的愈傷組織芽分化率分別為20.83%、16.67%和23.96％，它們之間沒有顯著性差異。四種培養基中，B4的KT含量最高，分化出的芽較小、顏色偏黃、葉片細小，說明芽的質量較差。因此表3的結果表明，高濃度的KT對芽的分化有利，但KT的濃度太高，會使芽的質量變差。
綜合表2和表3的結果分析，在芽分化培養中，除了KT的濃度不能過低外，生長素的濃度對芽的分化率也有影響，在KT濃度相同的處理中，生長素濃度高，則有芽分化率高的趨勢。另外，表3的B3培養基的芽分化率高於表2中的B3培養基的芽分化率，原因可能是表3的愈傷組織的培養時間較長。
三、芽的增殖
將來自分化培養基B4的帶芽愈傷組織轉接到芽增殖培養基中（表4），每個培養皿接種6塊愈傷組織，每塊愈傷組織帶1～2個芽，每種培養基各接種8個培養皿。4周後繼代1次，接種到培養瓶中，每瓶接種3塊帶1～2個芽的愈傷組織，每種培養基各接種16瓶。培養條件：溫度（25±2）℃，相對溼度40%～60%，光照強度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半。
B4培養基中芽的分化率明顯高於其它培養基，但芽的質量較差，可能的原因是B4培養基的KT濃度過高。為了獲得高的芽分化率而又得到好質量的芽，將B4培養基上的芽重新轉接到低KT濃度的B3、B5和B6培養基中進行增殖培養。結果見表4。從表4可以看出，培養4周和8周後，芽增殖效果最好的是B6培養基，其芽增殖係數分別是3.33（培養4周）和5.00（培養8周）。其次是B3培養基，培養4周和8周後，芽增殖係數分別是2.66和3.50。增殖係數較高的這兩個培養基的KT濃度都是4.0 mg·L-1，它們的芽生長速度較慢，芽稍短，但芽的顏色較綠，說明芽的質量是好的。B5培養基上的增殖效果最差，它的KT濃度為2.0 mg·L-1。所以，在增殖培養中，KT的濃度過低不利於芽的增殖。
比較B5和B6培養基中的植物生長物質組成，它們的KT與NAA的濃度比值都是5，但兩者芽的增殖效果卻不同，這說明當細胞分裂素和生長素比值相同，而它們的絕對濃度不同時，芽的分化能力也有差異，也就是說，芽的分化能力不但受細胞分裂素與生長素的比值的影響，還受兩種激素的絕對濃度影響。4.0 mg·L-1 KT和0.8 mg·L-1 NAA的生長物質的組合更有利於芽的增殖。
四、生根培養
增殖培養後，將來自培養基B6的高於2 cm的芽塊（帶少量愈傷組織）轉接到1/2 MS培養基中進行生根誘導（表5），每瓶接種4塊愈傷組織，每塊帶1～3個芽，每種培養基接種20瓶。培養條件：溫度（25±2）℃，相對溼度40%～60%，光照強度為（33.6±0.7）μmol·m-2·s-1，光周期為光照與黑暗時間各半。
取生長在B6培養基中高於2 cm的芽進行生根培養。培養4周後發現芽下部開始分化形成根。培養8周後的生根情況見表5。三種生根誘導培養基（C1、C2、C3培養基由基礎培養基和表5的植物生長物質組成，其中基礎培養基的含量相同）中，生根效果較好的是C1和C2，它們的生根率分別是66.75%和46.85%，根多且長；而C3培養基的生根率較低，為25.30%，根也較短。表5的結果表明，隨著KT濃度的升高，生根率下降。生根誘導最好的培養基是C1。
五、煉苗與移栽
將在C1培養基中獲得的再生苗進行鍛鍊。把培養瓶放置在室內靠窗處接受散射的自然光照射3天，然後打開培養瓶蓋，在相同位置又放置3天。之後取出再生苗，用清水洗淨植株基部的培養基，移栽到含1/3砂、2/3土的培養基質中。除了注意在苗期時遮蔭外，不需要特別護理。移栽後的兩面針幼苗生長良好，移栽成活率為91%。
對比例1
實驗方法同實施例1，唯一不同的是，本對比例中培養基不含有KT，其愈傷組織誘導率只有1.34～5.31%。